«Fort potentiel antiseptique des citrates de diaryl butènes portant deux chaînes aminoalkyle

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Requête déposée
L’INNORPI
En l’obtention d’un brevet
D’invention
conformément a la loi
No.2000-84 Du 24-08-2000
Patent Application
Addressed to
INNORPI
In accordance with law
No.2000-840
Dated 24-8-2000
- 1 -
0222 توأ
ةعدوم ةضيرع
ينطولا دهعملل
ةءارب
ىلع لوصحلل تافصاوملل
نوناقلا قفو عارتخا
08 يف خرؤملا 0222-48
ددع
TITLE OF INVENTION : : عارتخلاا ناونع
TITRE DE L’INVENTION : «Fort potentiel antiseptique des citrates de diaryl butènes portant deux
chaînes aminoalkyle ».
PRIORITÉ : : ةيقبسلأا
PRORITY :
PAYS دلبلا
COUNTRY
TUNISIE
NUMERO ددعلا
DATE : خيراتلا
DATE :
TITULAIRE : Centre de biotechnologie de Sfax (Equipe de Procédés de Criblage Moléculaire et
Cellulaire, Laboratoire des Microorganismes et Biomolécules (LMB))
OWNER :
ADDRESS : :ناونعلا
ADRESSE :
Laboratoire de Recherche LMB, Centre de biotechnologie de Sfax (CBS), Route de Sidi Mansour
Km 6 – BP 1177, 3018 Sfax, Tunisie
INVENTEUR : : عرتخملا
INVENTOR :
Mehdi EL ARBI, Sami AIFA, Pascal PIGEON, Siden TOP, Meral GÖRMEN et Gérard
JAOUEN
MANDATAIRE : : ليكولا
REPRESENTATIVE :
M. Mohamed KERKENI, Directeur Général de Valorisation de la Recherche,
Ministère de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique
.
خيراتلاو ءاضملإا
SIGATURE ET DATE
DATE AND SIGNATURE

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DEMANDE DE BREVET
DEMANDE DÉPOSÉE AU NOM DU : Centre de biotechnologie de Sfax
(CBS)
INVENTEURS : Mehdi EL ARBI,
Sami AIFA,
Pascal PIGEON,
Siden TOP,
Meral GÖRMEN,
Gérard JAOUEN.
TITRE : « Fort potentiel antiseptique des citrates de diaryl butènes portant deux chaînes
aminoalkyle ».
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TITRE : « Fort potentiel antiseptique des citrates de diaryl butènes portant deux chaînes
aminoalkyle ».
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RESUME :
La présente invention concerne, des composés chimiques citrates de diaryl butènes
portant deux chaînes aminoalkyle dont la formule générale est la suivante :
R
( )n
( )n
n = 1 à 5
H
H
- 4 -
R =
L’excellente efficacité antimicrobienne démontrée de ces composés [1], a été approfondie par
l’essai du pouvoir antiseptique et désinfectant de l’un des produits de cette série et de son
dérivé formulé.
La confirmation du pouvoir antiseptique et désinfectant du produit a été menée conformément
aux spécifications des normes et pharmacopée européennes et a touché les phases 1 et 2 du
processus de validation de l’activité des antiseptiques.
(CO)3 (CO)3
(CO)3 (CO)3

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DESCRIPTION
La lutte contre les maladies infectieuses occupe une grande importance. Bien avant
que le mot antiseptique ne soit employé, de nombreuses substances ont été utilisées pour
éviter le risque de contamination.
Dès l’antiquité, de nombreuses substances (épices, essences, huiles végétales), étaient
utilisées pour empêcher la putréfaction des plaies et l’infection des blessures. Intuitivement
l’origine environnementale de certaines maladies était reconnue. Certaines précautions étaient
donc prises telles que l’eau bouillie, la fumigation des salles d’opération, … Ainsi, au cours
du temps, les traitements empiriques intuitifs et parfois surnaturels ont évolué pour atteindre
des bases scientifiques à la fin du XIV ème siècle. Mais, c’est en fait au XVIII ème siècle que le
mot antiseptique fut employé par PRINGLE. Ce médecin militaire écossais, classa un grand
nombre de substances appliquées sur la peau et les plaies (camphre, acides...). C’est
également à cette période que furent découvertes les principales molécules encore utilisées
actuellement.
1774 : SCHEELE (1749-1786), chimiste suédois découvrit le chlore.
1789 : BERTHOLLET (1748-1822), chimiste français, découvrit les
hypochlorites. Il les développa dans le petit village de JAVEL, aujourd’hui
quai de JAVEL dans le 15 ème arrondissement de PARIS. Ceci explique la
dénomination d’un produit chloré : eau de JAVEL.
1811 : BERNARD COURTOIS (1777-1838), chimiste français isola l’iode à
partir de cendres de plantes marines.
1929 : LUGOL, médecin français, utilisa ce produit dans le traitement des
maladies scrofuleuses (adénopathies cervicales chroniques). La teinture d’iode
a été utilisée en 1839 contre la goutte, l’anthrax, le panaris, puis largement
employée pour traiter les blessures de guerre.
Les fondements scientifiques de l’antisepsie et de la désinfection reposent sur les
découvertes de PASTEUR. La théorie des micro-organismes responsables d’un certain
nombre de maladies infectieuses marqua la rupture avec les pratiques antérieures. La
microbiologie, nouvelle discipline concourut à rendre plus performantes les mesures et
pratiques d’hygiène.
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A partir de 1970, l’élaboration par l’AFNOR (association française de normalisation)
de protocoles normalisés d’étude a permis une meilleure connaissance des propriétés
antimicrobiennes des antiseptiques et désinfectants. A la même période, la pharmacopée
française introduit en Juillet 1985 une note pro pharmacopée sur les préparations
antiseptiques. La monographie en vigueur actuellement date de 1990. Un comité européen de
normalisation CEN TC 216 « antiseptiques et désinfectants » a été créé dans le but
d'harmoniser les normes dans les différents pays européens.
Actuellement, les infections nosocomiales (IN) constituent un problème majeur en
santé publique. Les IN sont préoccupantes de par leur morbidité importante, la mortalité
associée, le surcoût hospitalier non négligeable et l’émergence de bactéries multirésistantes
(BMR).
Une enquête nationale sur la prévalence des IN a été menée en 2001 par le RAISIN
(Réseau d’alerte, d’investigation et de surveillance des infections nosocomiales) [2]. Cette
enquête a montré un taux de prévalence des IN de 6,9 % (nombre de patients infectés un jour
donné en fonction du nombre de patients hospitalisés présents le même jour). Cette
prévalence est comparable à celle retrouvée lors des enquêtes multicentriques réalisées dans
d’autres pays européens (Espagne 1990 : 9,9 % ; Norvège 1991 : 6,3 % ; Allemagne 1994 :
3,6 % ; Angleterre 1993–1994 : 9 %).
Les IN les plus fréquemment rencontrées sont les infections urinaires (40 %), les
infections respiratoires (18,7 %), les infections du site opératoire (10 %) et les infections de la
peau et des tissus mous (10 %). Parmi les germes responsables d’IN, les bactéries
apparaissent en première ligne. Les plus souvent en cause sont Escherichia coli (23 %),
Staphylococcus aureus (20 %), Pseudomonas aeruginosa (11 %), Enterococcus spp (6 %) [3].
De façon globale, le taux de résistance aux antibiotiques des bactéries responsables
d’IN est élevé et la proportion de BMR observée en France est parmi les plus importantes
d’Europe ; les pays d’Europe du Nord (Danemark, Pays Bas, Norvège…) étant caractérisés
par un très faible taux de multirésistance aux antibiotiques. Cette situation préoccupante est
liée à un usage excessif et souvent inadapté des antibiotiques : prescriptions inappropriées,
doses inadéquates, durée de traitement inadaptée… À l’heure actuelle, 64 % des souches de S.
aureus isolées au cours d’IN sont résistantes à la méticilline (on parle de Sarm :
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Staphylococcus aureus résistante à la méticilline) [3]. À cela s’ajoute l’émergence de souches
de Sarm résistantes à de nombreuses autres familles d’antibiotiques : macrolides, aminosides,
fluoroquinolones, voire glycopeptides [3]. D’autres germes hospitaliers multirésistants posent
un grand problème [3] :
- les entérobactéries résistantes aux β lactamines (11 %) (on parle de EBLSE :
Entérobactéries à β-Lactamase à spectre étendu) ;
- les entérocoques résistants aux glycopeptides (1,5 %) (on parle d’ERV : Entérocoques
résistants à la vancomycine) ;
- P. aeruginosa résistant aux céphalosporines de troisième génération (17 %)…
Le danger est de se retrouver face à une impasse thérapeutique :
- soit aucun antibiotique n’est plus disponible à des fins de traitement d’infections
nosocomiales bactériennes généralement graves puisque touchant des patients
fragilisés ;
- soit les antibiotiques restant à disposition présentant une toxicité telle que leur usage
est limité, voire non envisageable.
Du fait de l’importance des IN, et de la dissémination de bactéries présentant des
résistances aux antibiotiques utilisés en routine, la recherche de nouvelles molécules
antibactériennes est un sujet d’importance croissante.
Le mot ANTISEPTIQUE (du grec "anti" : contre et "septikos" dérivé de "sepein" :
corrompre) a été utilisé pour la première fois par PRINGLE en 1750 pour qualifier une
substance capable de prévenir la détérioration de la matière organique. Au milieu du XIX ème
siècle, il s'applique à des produits capables de détruire les microbes pathogènes [4].
La norme AFNOR (NF T 72-101, Mars 1981) [5], définit l’antisepsie comme une
"Opération au résultat momentané permettant au niveau des tissus vivants, dans la limite de
leur tolérance, d'éliminer ou de tuer les micro-organismes et/ou d'inactiver les virus, en
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fonction des objectifs fixés. Le résultat de cette opération est limité aux micro-organismes
et/ou virus présents au moment de l'opération"
Pour l’AFNOR, un antiseptique est un “produit ou procédé utilisé pour l’antisepsie
dans des conditions définies”.
Pour la X ème édition de la Pharmacopée française [6], les préparations antiseptiques
ont les propriétés citées par l’AFNOR et sont présentées “dans leurs formes d’utilisation et
utilisées telles quelles, sauf exception justifiée et autorisée”.
Pour le comité européen de normalisation (CEN/TC 216), un antiseptique est “une
substance ou une préparation qui permet le traitement des tissus vivants en tuant et/ou
inhibant les bactéries, les champignons ou les spores et/ou en inactivant les virus avec
l’intention de revenir ou de limiter la gravité d’une infection sur ces tissus». Elles présentent
une activité antibactérienne, antifongique, antivirale.
La destination d'emploi des préparations antiseptiques doit être précisée (peau saine,
muqueuses, plaies), ainsi que la durée d'application nécessaire à l'obtention de l'activité. En
fonction de l'indication, l'inactivation par d'éventuelles "substances interférentes" ainsi que les
incompatibilités doivent être indiquées.
La norme AFNOR (NF T 72-101, Mars 1981) [5], définit la désinfection comme une
"Opération au résultat momentané permettant d'éliminer ou de tuer les micro-organismes
et/ou d'inactiver les virus indésirables portés par des milieux inertes contaminés, en fonction
des objectifs fixés. Le résultat de cette opération est limité aux micro-organismes et/ou virus
présents au moment de l'opération".
La norme AFNOR (NF T 72-101, Mars 1981) [5], définit le désinfectant comme un
"Produit ou procédé utilisé pour la désinfection ou la décontamination dans des conditions
définies". La Société Française d'Hygiène Hospitalière (SFHH) définit la désinfection comme
une "Opération utilisant un produit détergent contenant au moins un principe actif reconnu
pour ses propriétés bactéricides, fongicides, sporicides ou virucides, c'est à dire un produit
détergent désinfectant".
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L'étude de l'activité des antiseptiques et des désinfectants a été standardisée par
l'Association Française de Normalisation (AFNOR) depuis 1975 [4]. Les normes AFNOR
décrivent des méthodes in vitro permettant d'évaluer la concentration minimale du produit
qui, dans des conditions déterminées de température et de temps de contact, provoque la
réduction, dans des proportions préalablement définies, d'une population initiale microbienne.
La réalisation de ces normes s'effectue en trois phases :
1. Mise en contact du produit à tester avec un inoculum microbien;
2. Annulation de l'activité du produit à l'issue du temps de contact selon deux
méthodologies possibles :
- par dilution/neutralisation du mélange (microorganismes / produit),
- par filtration du mélange sur une membrane.
3. Mise en culture des germes survivants par culture en milieu approprié.
Les normes européennes, en cours d'élaboration, comportent des normes de base
(norme dites de phase 1) et des normes d'application (normes de phase 2 et 3) adaptées au
domaine d'utilisation (par exemple : désinfection des surfaces en agro-alimentaire,
désinfection des dispositifs médicaux...) [4] :
Phase 1 : Essai en suspension pour évaluer l'activité de base du produit. Cette phase,
appliquée aux activités bactéricides (NF EN 1040 ou NF T 72-152) et fongicides (NF
EN 1275 ou NF T 72-202), correspond aux anciennes normes AFNOR NF T 72-
150/151 et NF T 72-200/201.
Phase 2 : Essai au laboratoire dans des conditions les plus représentatives possibles de
la pratique hospitalière pour déterminer la concentration efficace et l’indication. Cette
phase est divisée en 2 étapes :
- 1 ère étape : essai en suspension comme pour la phase 1, dans des conditions
plus proches de la pratique, par exemple des espèces de micro-organismes
spécifiques de l'application et/ou en présence de substances interférentes
définies (protéines, eau dure, etc ...).
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- 2 ème étape : essai simulant la pratique, par exemple sur porte-germes pour
les désinfectants de surface, sur des mains artificiellement contaminées pour
les produits destinés à la désinfection des mains par lavage ou friction.
Phase 3 : Essai sur le terrain, dans des conditions pratiques d'utilisation, afin de
confirmer la concentration efficace (par exemple, ces essais peuvent être pratiqués
avec des souches hospitalières).
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Description des résultats :
1. L’étape (a) de cette invention concerne la synthèse des composés chimiques de citrates
de diaryl butènes portant deux chaînes aminoalkyle :
R
S5
S1
( )n
( )n
H
H
( )n
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S2
( )n
S4
60°C
Figure 1 : Schéma de synthèse des produits objet du brevet
La synthèse du produit S5 (avec R= et n=3) a été déjà publiée [1], les produits (avec
R= et n=2), (avec R= et n=4), (avec R= et n=2), (avec R= et n=3), (avec R= et
n=4) et (avec R= et n=3) ont été nouvellement synthétisés alors que les autres ne le sont
pas encore.
S3
( )n
( )n
( )n
( )n

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2. L’étape (b) a porté sur l’estimation de l’effet antimicrobien du produit S5 (avec R= et
n=3), de sa formulation et du produit commercial « Cytéal ® » contre la souche
Staphylococcus aureus (ATCC 6538) par la méthode des puits.
3. L’étape (c) a consisté à la détermination de la CMI et de la CMB du produit S5 (avec
R= et n=3) pour les souches de référence Escherichia coli (ATCC 10536), Pseudomonas
aeruginosa (ATCC 15442), Staphylococcus Aureus (ATCC 6538), Enterococcus hirae
(ATCC 10541) et Candida albicans (ATCC 10231) ainsi que la souche d’Acinetobacter
baumannii isolée cliniquement.
4. L’étape (d) : Formulation du produit S5 (avec R= et n=3) en antiseptique. Ayant
démontré son activité antimicrobienne, le produit S5 (avec R= et n=3) a été formulé en une
solution antiseptique ayant une composition identique au produit commercial « Cytéal ® » tout
en y remplaçant les principes actifs par notre produit.
5. L’étape (e) : Estimation de l’effet antiseptique et désinfectant du produit S5 (avec R= et
n=3) et du produit formulé conformément aux normes NFT 72-152 [7] et NF T 72-171 [8].
6. L’étape (f) : Essai de l’efficacité du produit S5 (avec R= et n=3) formulé sur une souche
d’Acinetobacter baumannii isolée cliniquement.
7. L’étape (g) : Essai de l’efficacité du produit S5 (avec R= et n=3) formulé pour le lavage
hygiénique des mains conformément à la norme EN 1499 [9].
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EXEMPLES
Exemple 1 : Synthèse et caractérisation des composés
Certaines réactions ont été effectuées sous atmosphère d’argon. Le THF a été distillé sur
sodium/benzophénone. Le dichloromethane a été distillé sur P2O5. Les autres réactifs et
solvants utilisés, sont des produits commerciaux. Les chromatographies sur colonne ont été
réalisées sur gel de silice Merck 60. Les points de fusion des produits ont été mesurés à l’aide
d’un banc Köfler. Les spectres infra-rouges ont été enregistrés sur un spectromètre IR-FT
BOMEM Michelson-100. Les analyses RMN 1 H et 13 C ont été effectuées sur un appareil
Bruker 300 MHz. Les déplacements chimiques () sont mesurés en parties par millions (ppm)
et les constantes de couplage (J) sont calculées en Hertz (Hz). Les analyses élémentaires des
nouveaux produits ont été effectuées au Service de Microanalyse de l’I.C.S.N. à Gif sur
Yvette.
1,1-Bis[4-(3-dimethylaminopropoxy)phenyl]-2-ferrocenyl-but-1-ene (S4 avec R= et
n=3)
La synthèse du composé S4 s’est faite à partir du composé S1 (Siden Top et al., 2003)
dont la production a été faite au sein de l’UMR 7223 et ses étapes sont résumées dans la
figure 1. Les composés S2 et S3 ont été produits par O-alkylation de phénols par RX après le
traitement par NaH. Pour ce faire le S1 (1,08 g, 2,56 mmol, 1eq) est dissout dans du THF et
du DMF puis le sodium hydride (0,368 g, 15,3 mmol, 6 eq) est ajouté et le mélange est laissé
en agitation pendant 10 minutes. Le 1,3-dibromopropane (3,098 g, 1,56 ml, 15,3 mmol, 6 eq)
est ajouté et le mélange est chauffé à reflux pendant une nuit. De l’éthanol est ajouté au
mélange réactionnel puis la phase aqueuse est extraite avec 3 x 25 ml de CH2Cl2. Les phases
organiques rassemblées, séchées sur MgSO4 et concentrées sous vide puis fractionnées par
colonne de silice en utilisant comme éluant un mélange de dichlorométhane et d’éther de
pétrole (90/10) puis on termine l’extraction par du dichlorométhane pur. Trois fractions ont
été récupérées et ont été analysées par RMN. Il s’est avérée que la fraction 1 correspond au
produit S2 avec un rendement de 5% et la fraction 2 est constituée par le produit S3 avec un
rendement de 73%. Pour la production du S4 (1,1-bis[4-(3-Diméthylaminopropoxy)phényl]-
2-ferrocényl-but-1-ène), dans un tube pour réaction sous pression on dissout S3 (0,33 g, 0,5
- 13 -

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mmol ; 1eq) dans du diméthylamine, en solution dans du méthanol, (0,27 g, 3 ml, 2M, 6 eq) et
on maintient la réaction à la température de 60°C pendant 24 heures. Le mélange réactionnel
est versé dans 30 ml d’eau puis extrait avec 3 x 25 ml de CH2Cl2. Les phases organiques sont
rassemblées, séchées sur MgSO4 et concentrées sous vide. Le composé S4 est obtenu avec un
rendement de 57%.
IR (KBr, /cm -1 ): 3093, 3032, 2947, 2866, 2816, 2765 (CH2, CH3). 1 H NMR (CDCl3): 0.94
(3 H, t, J 7.4 Hz, CH3), 1.79-1.95 (4 H, m, 2 CH2), 2.18 (6 H, s, NMe2), 2.19 (6 H, s, NMe2),
2.37 (2 H, t, J 7.2 Hz, CH2N), 2.40 (2 H, t, J 7.2 Hz, CH2N), 2.50 (2H, q, J 7.4 Hz, CH2), 3.83
(2 H, t, J 1.9 Hz, C5H4), 3.89 (2 H, t, J 6.6 Hz, CH2O), 3.91 (2 H, t, J 6.6 Hz, CH2O), 3.98 (2
H, t, J 1.9 Hz, C5H4), 4.02 (5 H, s, Cp), 6.66 (2 H, d, J 8.7 Hz, C6H4), 6.77 (2 H, d, J 8.7 Hz,
C6H4), 6.86 (2 H, d, J 8.7 Hz, C6H4), 7.02 (2 H, d, J 8.7 Hz, C6H4). 13 C NMR (CDCl3): 15.5
(CH3), 27.5 (CH2), 27.6 (CH2), 27.9 (CH2), 45.5 (2 NMe2), 56.5 (2 CH2N), 66.1 (2 CH2O),
67.9 (2 CH C5H4), 69.1 (5 CH, Cp), 69.3 (2 CH, C5H4), 87.2 (Cipso), 114.1 (2 CH, C6H4),
114.2 (2 CH, C6H4), 130.4 (2 CH, C6H4), 130.9 (2 CH, C6H4), 136.5 (C), 137.2 (C), 137.3
(C), 137.4 (C), 157.3 (2 C). MS (EI, 70 eV) m/z : 594 [M] +. , 121 [CpFe] + , 86
[CH2CH2CH2NMe2] + , 58 [CH2NMe2] + . HRMS (ESI, C36H47FeN2O2: [M+H] + ) calcd:
595.29815, found: 595.29681.
Un même protocole synthétique est applicable si, au lieu de l’aromatique ferrocénique
de S4, un groupe aryl purement organique ou un autre groupement métallique est utilisé.
Afin de rendre le dérivé diaminé S4 soluble dans l’eau et faciliter son utilisation, il a
été transformé en sel citrique. L’addition de l’acide citrique dissout dans du THF à la solution
du S4 dissout dans un mélange éther éthylique/THF produit immédiatement le sel citrate S5
(Figure 1).
1,1-bis[4-(3-diméthylamoniumpropoxy)phényl]-2-ferrocényl-but-1-ène citrate (S5 avec
R= et n=3)
Pour la synthèse du S5 (1,1-bis[4-(3-diméthylamoniumpropoxy)phényl]-2-ferrocényl-
but-1-ène citrate), le produit S4 (0,835 g, 1,4 mmol, 1 eq) est dissout dans un ballon contenant
250 ml d’éther. L’acide citrique (0,27 g, 1, 3 mmol, 0,9 eq), préalablement dissout dans du
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THF est ajouté goutte à goutte à la solution du S4. Un précipité jaune du sel se forme
immédiatement. Après arrêt de l’agitation, le produit est récupéré par filtration sur verre fritté
puis séché à la pompe à vide. Le produit est obtenu avec un rendement de 84 %.
IR (KBr, /cm -1 ): 3421 (OH), 3032, 2962, 2877, (CH2, CH3), 1720 (CO). 1 H NMR (CD3OD):
0.99 (3 H, t, J 7.4 Hz, CH3), 1.86 (4 H, broad m, 2 CH2), 2.61 (2 H, q, J 7.4 Hz, CH2), 2.66
(2 H, d, J 15.3 Hz, CH2), 2.75 (2 H, d, J 15.3 Hz, CH2), 2.86 and 2.87 (12 H, 2 s, 2 NMe2H + ),
3.30 (4 H, broad m, 2 CH2N), 3.87 (2 H, m, C5H4), 4.02 (6 H, m, 2 CH2O + C5H4), 4.08 (5 H,
s, Cp), 6.75 (2 H, d, J 8.1 Hz, C6H4), 6.90 (4 H, m, J 8.1 Hz, C6H4), 7.08 (2 H, d, J 8.1 Hz,
C6H4). 13 C NMR (CD3SOCD3): 15.3 (CH3), 24.3 (2 CH2), 42.8 (2 NMe2H + ), 44.3 (2 CH2
citrate), 54.5 (2 CH2N), 66.9 (2 CH2O), 67.8 (2 CH, C5H4), 68.6 (2 CH, C5H4), 69.0 (5 CH,
Cp), 71.4 (Cq, citrate), 86.0 (Cipso C5H4), 114.1 (2x2 CH, C6H4), 129.9 (2 CH, C6H4), 130.3 (2
CH, C6H4), 136.2 (C), 136.4 (C), 136.9 (C), 137.1 (C), 156.6 (2 C), 171.5 (2xCO), 176.9
(CO).
Exemple 2 : Prospection de l’activité antimicrobienne
Prospection de l’activité antimicrobienne in vitro
Le produit S5 (avec R= et n=3) a fait l’objet d’une estimation de son effet
antimicrobien contre la souche Staphylococcus Aureus (ATCC 6538) par la méthode des puits
(Figure 2) décrite par Tagg et Mc Given en 1971 (dose testée était de 300 µg /ml d’eau).
La Figure 2 illustre l’activité in vitro de notre produit de synthèse S5 (avec R= et
n=3) (1), du produit commercial « Cytéal ® » (2) et de la formulation (3) de notre produit (1)
contre la souche Staphylococcus aureus (ATCC 6538).
Il ressort de cette figure que notre produit (1) a une activité antimicrobienne qui se
préserve et qui s’accentue après formulation et qui se promet égale à celle du produit
commercial « Cytéal ® ».
- 15 -

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Figure 2 : Inhibition de Staphylococcus aureus par les produits testés
Détermination de la Concentration Minimale Inhibitrice (CMI) et de la Concentration
Minimale Bactéricide (CMB).
Suite à la présence de zones d’inhibitions significatives, aussi importantes que celle du
produit commercial de référence (Figure 2), on est passé à la détermination de la
Concentration Minimale Inhibitrice « CMI » et de la Concentration Minimale Bactéricide
« CMB », du produit S5 (avec R= et n=3), par la méthode de macro dilutions, contre les
pathogènes à l’homme Escherichia coli (ATCC 10536), Pseudomonas aeruginosa (ATCC
15442), Staphylococcus aureus (ATCC 6538), Enterococcus hirae (ATCC 10541), Candida
albicans (ATCC 10231) et la souche Acinetobacter baumannii isolée cliniquement, pour une
caractérisation plus poussée de son effet antimicrobien.
Une solution dans l’eau, de concentration 2 mg/ml du produit à tester a été préparée.
Dans le premier tube, contenant 1,6 ml de milieu de culture liquide, d’une série de 5 tubes à
effectuées par transfert de 1ml du premier tube au second, puis de ce dernier au suivant et
ainsi de suite.
2
- 16 -
1
3

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Une fois les dilutions des produits à tester effectuées, on introduit dans chaque tube 1
ml de l’inoculum de la souche à tester préalablement préparé.
Un témoin négatif (tube non ensemencé) et un témoin positif (Tube ensemencé) sont
incubés avec les tubes de dilution pendant 20 heures à 37°C.
La détermination de la concentration minimale inhibitrice est effectué par estimation
visuelle de l’apparition ou non de trouble dans les tubes incubé et la CMI correspond à la plus
petite concentration restée limpide.
Un ensemencement par strie est effectué dans une boite de Pétri à partir des tubes des
différentes dilutions qui sera par la suite incubé à 37°C pendant 24 heures.
Cette étape va nous permettre de déterminer la CMB qui correspond à la dilution qui
arrive à tuer les microorganismes présents dans le tube (se manifeste par l’absence de
biomasse sur la strie), et de confirmer les résultats de CMI.
Le tableau 1, illustre les résultats de la détermination de la CMI et de la CMB du
produit objet de notre étude.
CMB/CMI
2
4
2
2
2
4
Tableau 1 : Résultats des CMI et CMB du produit S5 (avec R= et n=3)
12.5 CMI µg/ml
25 CMB µg/ml
3.12 CMI µg/ml
12,5 CMB µg/ml
6.25 CMI µg/ml
12.5 CMB µg/ml
12.5 CMI µg/ml
25 CMB µg/ml
6.25 CMI µg/ml
12.5 CMB µg/ml
62.5 CMI µg/ml
250 CMB µg/ml
- 17 -
Escherichia coli (ATCC 10536)
Pseudomonas aeruginosa (ATCC 15442),
Staphylococcus Aureus (ATCC 6538)
Enterococcus hirae (ATCC 10541)
Candida albicans (ATCC 10231)
Acinetobacter baumannii

Page 18 sur 26
Les résultats du tableau précédant confirment ceux trouvés lors de la détermination de
l’inhibition de la souche contre la souche Staphylococcus aureus et confirment la nature
bactéricide de notre produit (rapport CMB/CMI≤4 pour toutes les souches testées). De ce fait
nous avons décidé de tester son effet antiseptique et ce en appliquant la procédure dictée par
la normalisation européenne.
Exemple 3 : Formulation du composés S5 (avec R= et n=3)
Une solution antiseptique ayant une composition identique au produit commercial
« Cytéal ® » a été préparée tout en y remplaçant les principes actifs par notre produit.
Tableau 2 : Composition du produit commercial « Cytéal ® » et de notre formulation analogue
Composants communs Cytéal ® Formulation
Cocamidopropyl Betaine
Acide Edétique
Diéthanolamide de Coprah
- 18 -
Hexamidine
(2500 mg/l)
Digluconate chloroxedine
(12882,5 mg/l)
Chlorochrésol
(7500 mg/l)
( )n
( )n
H
(300 mg/l)
Total Principe actif 22882,5 300
Principe actif « Cytéal ® »/ Principe actif « Formulation »
76,275
H

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Exemple 4 : Estimation de l’activité antiseptique du produit (S5 avec R= et n=3) et de la formulation duquel est issu
Le milieu liquide utilisé pour la préparation des cultures microbiennes, des inoculums et la détermination de la CMI, est un milieu
reconstitué à partir des constituants du milieu LB (Peptone (10g), extrait de levure (5g), NaCl (5g)).
Le milieu de culture solide utilisé pour ces essais est le milieu LB dont la composition pour un litre est la suivante : Peptone (10g), extrait
de levure (5g), NaCl (5g) et agar bactériologique (18g).
Pour cet essai nous avons appliqué les normes NFT 72-152 et NF T 72-171 et nous avons opéré comme suit :
- Préparation des suspensions microbiennes à tester
- Contact avec la solution désinfectante à tester
- Filtration et lavage des filtres pour éliminer les substances actives
- Incubation des filtres à la température de 37°C pendant 24h
- Lecture et calcul du taux de réduction microbienne
Pour chacune des souches testées différentes proportions des solutions antiseptique (1 /9 ; 4/5 et 9/1) et différents temps de contact (5min,
30min et 24h) ont été utilisés.
- 19 -

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- Effet antiseptique in vitro du 1,1-bis[4-(3-diméthylamoniumpropoxy)phényl]-2-ferrocényl-but-1-ène citrate (S5 avec R= et n=3)
Tableau 3 : Effet antiseptique avec et sans substances interférentes
Souches
Escherichia coli
ATCC 10536
Pseudomonas aeruginosa
ATCC 15442
Staphylococcusaureus
ATCC 6538
Enterococcus hirae
ATCC 10541
Candida albicans
ATCC 10231
Inoculum
N:1.75 10 8
N:1.25 10 7
N:1.4 10 8
N:5.6 10 7
N:7 10 6
- 20 -
Avec substances interférentes Sans substances interférentes
Concentration 9/1 4/5 1/9 9/1 4/5 1/9
Temps 5 min 30 min 24 h 5 min 30 min 24 h 5 min 30 min 24 h 5 min 30 min 24 h 5 min 30 min 24 h 5 min 30 min 24 h
Na 58 0 0 >3 10 2 200 150 >3 10 2 >3 10 2 >3 10 2 4 3 0 46 9 0 >3 10 2 >3 10 2 0
R 3 10 6
1.75
10 8
1.75
10 8
--
8.7
10 4
N : Contamination initiale ; Na : Contamination après traitement ; R : Taux de réduction
1.16
10 5
-- -- --
4.4
10 6
5.8
10 6
1.75
10 8
3.8
10 5
1.9
10 6
1.75
10 8
-- --
Na 0 0 0 0 0 0 >3 10 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
R
1.25
10 7
1.25
10 7
1.25
10 7
1.25
10 7
1.25
10 7
1.25
10 7
--
1.25
10 7
Na 10 2 0 >3 10 2 180 80 >3 10 2 >3 10 2 >3 10 2 2 1 0 65 3 0 >3 10 2 >3 10 2 >3 10 2
R
1.4
10 6
7
10 7
1.4
10 8
--
7
10 4
1.7
10 5
1.25
10 7
-- -- --
1.25
10 7
7
10 6
1.25
10 7
1.4
10 7
1.25
10 7
1.4
10 8
1.25
10 7
2
10 5
1.25
10 7
4.6
10 6
1.25
10 7
1.4
10 8
1.25
10 7
1.25
10 7
1.75
10 8
1.25
10 7
-- -- --
Na 0 0 0 0 0 0 20 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
R
5.6
10 7
5.6
10 7
5.6
10 7
5.6
10 7
5.6
10 7
5.6
10 7
2.8
10 5
5.6
10 7
Na 0 0 0 1.8 10 2 0 0 >3 10 2 >3 10 2 >3 10 2 0 1 1 >3 10 2 100 0 >3 10 2 >3 10 2 1
R
7
10 6
7
10 6
7
10 6
3.8
10 4
7
10 6
7
10 6
5.6
10 7
-- -- --
5.6
10 7
7
10 6
5.6
10 7
7
10 6
5.6
10 7
7
10 6
5.6
10 7
23
10 1
5.6
10 7
7
10 4
5.6
10 7
7
10 6
5.6
10 7
5.6
10 7
-- --
5.6
10 7
7
10 6

Page 21 sur 26
- Effet antiseptique in vitro du produit formulé et du produit commercial « Cytéal ® » (Avec substances interférentes)
Tableau 4 : Effet antiseptique du produit formulé en présence de substances interférentes
Souches Inoculum
Escherichia coli
ATCC 10536
Pseudomonas aeruginosa
ATCC 15442
Staphylococcus aureus
ATCC 6538
Enterococcus hirae
ATCC 10541
Candida albicans
ATCC 10231
N:
1.75 10 10
N:
1.25 10 7
N:
1.4 10 10
N:
5.6 10 7
N:
7 10 10
- 21 -
N : Contamination initiale ; Na : Contamination après traitement ; R : Taux de réduction
- Effet antiseptique in vitro du produit formulé sur une souche d’Acinetobacter baumannii (Avec substances interférentes)
Tableau 5 : Effet antiseptique sur Acinetobacter baumannii
Produit formulé Cytéal ®
Concentration 9/1 4/5 1/9 9/1 4/5 1/9
Temps 5 min
Souches Inoculum
30
min
24 h 5 min
30
min
24 h 5 min
N : Contamination initiale ; Na : Contamination après traitement ; R : Taux de réduction
30
min
24 h 5 min
30
min
24 h 5 min
30
min
24 h 5 min
Na >3 10 2 240 0 >3 10 2 >3 10 2 >3 10 2 >3 10 2 >3 10 2 >3 10 2 >3 10 2 200 0 >3 10 2 167 0 >3 10 2 >3 10 2 >3 10 2
R --
Acinetobacter baumannii N:6.39 10 8
7.3
10 6
1.75
10 10
-- -- -- -- -- -- --
8.7
10 6
1.75
10 10
--
1.04
10 7
1.75
10 10
30
min
24 h
-- -- --
Na 3 0 0 51 2 0 >3 10 2 79 56 -- -- -- -- -- -- -- -- --
R
4.1
10 5
1.25
10 7
1.25
10 7
2.5
10 4
6.2
10 5
1.25
10 7
--
1.6
10 4
2.2
10 4
-- -- -- -- -- -- -- -- --
Na 250 240 0 >3 10 2 >3 10 2 >3 10 2 >3 10 2 >3 10 2 >3 10 2 69 0 0 112 140 2 >3 10 2 >3 10 2 40
R
5.6
10 6
5.8
10 6
1.4
10 10
-- -- -- -- -- --
2
10 7
1.4
10 10
1.4
10 10
1.25
10 7
1
10 7
7
10 8
-- --
Na 1 2 0 >3 10 2 20 4 >3 10 2 16 11 -- -- -- -- -- -- -- -- --
R
5.6
10 6
2.8
10 6
5.6
10 7
--
2.8
10 5
1.4
10 6
--
3.5
10 5
5.1
10 5
-- -- -- -- -- -- -- -- --
Na 25 29 0 97 50 0 >3 10 2 200 110 80 0 0 98 2 0 200 53 29
R
2.8
10 8
2.41
10 8
7
10 10
7.2
10 7
1.4
10 8
7
10 10
--
3.5
10 7
6.36
10 7
8.7
10 7
7
10 10
Produit formulé
Concentration 9/1 4/5 1/9
Temps 5 min 30 min 24 h 5 min 30 min 24 h 5 min 30 min 24 h
Na >3 10 2 >3 10 2 24 >3 10 2 >3 10 2 >3 10 2 >3 10 2 >3 10 2 >3 10 2
R -- -- 2.66 10 6 -- -- -- -- -- --
7
10 10
7.1
10 7
3.5
10 9
7
10 10
3.5
10 7
1.32
10 7
3.5
10 7
2.4
10 8

Page 22 sur 26
Il ressort du tableau 3 que notre produit a une excellente activité antiseptique et
répond bien à l’exigence de la norme (NF T 72-171) de réduction du nombre de germe de 5
log.
Il ressort du même tableau que le produit, en absence de substances interférentes, est
efficace à la dose de 4/5, et perd un peu de son efficacité en leur présence.
Il ressort du tableau 4, regroupant les résultats de l’effet antiseptique que malgré la
présence de substances interférentes, notre produit est aussi efficace que le produit
commercial Cytéal ® ,
Notre produit formulé s’avère plus intéressant que le produit de référence utilisé
surtout si on prend en considération les proportions de principes actifs incluses dans chacun
d’eux (Principe actif « Cytéal ® »/ Principe actif formule =76,275).
Même si on a enregistré dans le tableau 5 une légère baisse de l’activité antiseptique
de notre produit, qui prend plus de temps pour tuer les germes testés (on ne décèle l’activité
qu’après 24 heures), ce déclin est mineur si on prend en considération la résistance connue
d’Acinetobacter baumannii, aux antibiotiques et aux antiseptiques. Acinetobacter baumannii
est une bactérie opportuniste responsable d’IN multi-résistantes, difficiles à traiter et souvent
associées à une létalité élevée. Elle est une cause croissante de d’IN, notamment de
pneumopathies en réanimation. Sa transmission se fait à partir d’une source commune ou de
patient à patient et elle est facilitée par une colonisation importante des patients, la
contamination des surfaces environnantes et une survie prolongée sur des surfaces sèches ou
les mains [10].
- Essai de l’efficacité du produit formulé pour le lavage hygiénique des mains
conformément à la norme EN 1499 : Nous nous sommes référés à la norme EN 1499
(Lavage Hygiénique Des Mains) et nous avons opéré comme suit :
1. Dénombrement des germes sur mains contaminées artificiellement
- Préparation d’une suspension d’Escherichia coli (ATCC 10536)
- lavage des mains au savon
- trempage des bouts des doigts dans cette suspension pendant 5 secondes
- 22 -

Page 23 sur 26
- séchage des mains pendant 3 minutes
- trempage des bouts des doigts dans un milieu de culture liquide
- dénombrement des microorganismes
2. Dénombrement des germes sur mains contaminées artificiellement (fait pour le produit
antiseptique et un produit non bactéricide)
- Préparation d’une suspension d’Escherichia coli (ATCC 10536)
- lavage des mains au savon
- trempage des bouts des doigts dans cette suspension pendant 5 secondes
- séchage des mains pendant 3 minutes
- friction des mains avec le produit à tester et laisser agir 60 secondes
- trempage des bouts des doigts dans un milieu de culture liquide
- dénombrement des microorganismes
Pour qu’il soit considéré comme efficace, le produit doit réduire considérablement la
contamination des mains.
Tableau 6 : Résultats de l’essai de lavage hygiénique des mains (Phase 2, étape 2)
Formule sans principe actif Formule avec principe actif
Exp. Prè-traitement Post traitement Réduction Prè-traitement Post traitement Réduction
1 1,5 10 8 1 ,3 10 6 1.15 10 2 1,5 10 8 4 10 4 0.38 10 4
2 1,4 10 8 2,5 10 6 0.56 10 2 1,4 10 8 3,3 10 5 0.42 10 4
3 6 10 8 5 10 6 1.2 10 2 6 10 8 9 10 4 0.66 10 4
4 8,6 10 8 3 10 6 2.86 10 2 8,6 10 8 2 ,5 10 4 3.44 10 4
Il ressort du tableau précédent que notre produit réduit la contamination des mains par
Escherichia coli (ATCC 10536) de 4 log. Cette réduction confirme l’efficacité de notre
produit et encourage son utilisation comme antiseptique.
- 23 -

Page 24 sur 26
REVENDICATIONS :
1. La présente invention concerne des composés chimiques de citrates diaryl butènes dont la
formule générale est la suivante :
1 à 5.
R
- 24 -
( )n
( )n
R peut être , , , . ,
H
H
(CO)3
,
(CO)3 (CO)3 et n peut varier de
Dans la mesure où, dans les composés ci-dessus, le ferrocène intervient par son
aromaticité, une approche identique mais avec un groupe aryl purement organique ou autre
groupe métallique, au lieu et à la place du ferrocène conduit à des résultats sensiblement
équivalents, le reste de la structure demeurant inchangé.
2. Les composés objets de notre brevet, sont actifs aussi bien contre les bactéries Gram+ et
Gram- ainsi que les champignons pathogènes à l’Homme et fixés par les normes NFT 72-152
et NF T 72-171.
3. Les composés objets de notre brevet, ont une excellente activité antiseptique qui répond à
l’exigence de réduction de 5 log fixée par les normes NFT 72-152 et NF T 72-171 (Phase 1 de
la procédure de validation de l’activité d’un antiseptique).

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4. Les composés objets de notre brevet, conservent leur activité antiseptique après formulation
avec un composé tensioactif (Cocamidopropyl Betaine), d’un agent complexant (Acide
Edétique) et d’un agent stabilisateur de mousse (Diéthanolamide de Coprah).
5. Les composés objets de notre brevet, arrivent à tuer Acinetobacter baumannii réputée
comme résistante aux antibiotiques. Ils répondent donc aux exigences de l’étape 1 de la phase
2 de la procédure de validation de l’activité d’un antiseptique.
6. Les composés objets de notre brevet, arrivent à réduire considérablement (4 log) la
contamination artificielle des mains en 60 secondes. Ils répondent donc aux exigences de
l’étape 2 de la phase 2 de la procédure de validation de l’activité d’un antiseptique.
7. Les composés objets de notre brevet, peuvent être formulés avec d’autres composés
tensioactifs, d’autres agents complexant, d’autres agents stabilisateurs de mousse ou d’autres
produits chimiques qui peuvent s’avérer nécessaires à leur activité et utilisation. Nous
revendiquons, donc, toutes autres formulations possibles de nos composés.
8. Les composés objets de notre brevet, sont donc utilisables en tant qu’antiseptiques,
désinfectants ou détergents désinfectants. Nous revendiquons pour ces composés et les
formulations qui en découlent les applications déjà citées.
9. Les composés objets de notre brevet sont revendiqués pour une utilisation
pharmacologique, vétérinaire ou industrielle.
10. Les composés objets de notre brevet ont d’autre vertus : nous les revendiquons,
également, toute autre application thérapeutique (antibiotique, chimiothérapie, …).
- 25 -

Page 26 sur 26
Références citées
1. Mehdi El Arbi, Pascal Pigeon, Siden Top, Ali Rhouma, Sami Aifa, Ahmed Rebai,
Anne Vessières, Marie-Aude Plamont et Gérard Jaouen. Evaluation of bactericidal and
fungicidal activity of ferrocenyl or phenyl derivatives in the diphenyl butene series.
Journal of Organometallic Chemistry 696 (2011) 1038-1048
2. Enquête de prévalence des infections nosocomiales 2001, groupe Raisin, résultats
publiés le 28/10/2003, www.invs.sante.fr/surveillance/raisin/.
3. M. Grare, M. Mourer, J.-B. Regnouf de Vains, C. Finance, R.-E. Duval. Vers de
nouvelles molécules antibactériennes. Intérêt du para-guanidinoéthylcalix[4]arène.
Pathologie Biologie 54 (2006) 470–476
4. Antiseptiques et désinfectants. Centre de Coordination de la Lutte contre les Infections
Nosocomiales de l’Interrégion Paris-Nord (C.CLIN Paris-Nord). Mai 2000
5. NF T 72 101 (mars 1981) Antiseptiques et désinfectants Vocabulaire.
6. Pharmacopée française. Hrsg. v. Agence française de sécurité sanitaire des produits de
santé. 10 ème édition.
7. NF EN 1040 Indice de classement T 72-152 (avril 1997) Antiseptiques et
désinfections chimiques Activité bactéricide de base Méthode d'essai et prescriptions
(Phase 1).
8. NF T 72-l71 (novembre 1988) Antiseptiques et désinfectants utilisés à l'état liquide,
miscibles à l'eau. Détermination de l'activité bactéricide en présence de substances
interférences de référence (méthode par filtration sur membranes).
9. NF EN 1499 / NF T 72-501 / lavage hygiénique des mains (test in vivo). Antiseptiques
et désinfectants chimiques. Lavage hygiénique des mains. Méthode d'essai et
prescriptions (phase 2 / étape 2). 20/06/1997
10. Epidémie d’infection & colonisation à Acinetobacter baumannii BLSE. Région Nord
Pas-de-Calais. Recommandations. C.CLIN Paris-Nord. Octobre 2003.
- 26 -