dennis ariel cisterna aguila valdivia – chile 2011 - Tesis Electrónicas ...
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Profesor Patrocinante<br />
Dra. Maria Isabel Niemeyer Marich<br />
Centro de Estudios Científicos<br />
IDENTIFICAR Y CARACTERIZAR UNA CONDUCTANCIA AL<br />
CLORURO ACTIVADA POR CALCIO INTRACELULAR EN<br />
EPITELIO INTESTINAL SILVESTRE DE RATÓN<br />
DENNIS ARIEL CISTERNA AGUILA<br />
VALDIVIA <strong>–</strong> CHILE<br />
<strong>2011</strong><br />
<strong>Tesis</strong> de Grado presentada como parte<br />
de los requisitos para optar al grado de<br />
Licenciado en Bioquímica y Título<br />
Profesional de Bioquímico
AGRADECIMIENTOS<br />
Agradezco en primer lugar a mi profesor patrocinante la Dra. Maria Isabel<br />
Niemeyer M., por aceptarme como integrante de su grupo de trabajo, y por su valiosa<br />
guía y apoyo en mi etapa de formación profesional.<br />
Agradezco de igual manera al Dr. Francisco Sepúlveda, por su excelente<br />
disposición en el momento de solicitar poder realizar mi tesis en el CECS.<br />
A mi profesor copatrocinante el Dr. José Sarmiento y a mi profesor informante,<br />
el Dr. Alejandro Reyes por formar parte de esta comisión.<br />
Al Director de Escuela Dr. Alejandro Claude, por su amabilidad, disposición y<br />
apoyo brindado durante este proceso.<br />
En forma muy especial a mis padres, por el apoyo y esfuerzo realizado,<br />
principales responsables de que esto se cumpliera.<br />
A Carolina por acompañarme desde el comienzo de este largo proceso y por su<br />
apoyo incondicional.<br />
De la misma forma agradezco a mis viejos amigo y a todos aquellos que<br />
conocí en el transcurso de mi carrera universitaria y en el laboratorio, por todo lo<br />
brindado y por eso geniales momentos que recordaré el resto de mi vida.<br />
Este trabajo fue realizado en el Laboratorio de Biofísica y Fisiología Molecular<br />
del Centro de Estudios Científicos, gracias al apoyo del proyecto FONDECYT<br />
Nº1061069.<br />
I
INDICE<br />
II<br />
Pág.<br />
1 RESUMEN.............................................................................................. 1<br />
1.1 SUMMARY.............................................................................................. 2<br />
2 INTRODUCCIÓN.................................................................................... 3<br />
2.1 El canal de cloruro activado por calcio………………............................. 4<br />
2.1.1 Rol fisiológico del los canales de cloruro activados por calcio............... 6<br />
2.2 Transporte de cloruro y agua en el intestino……………………………... 8<br />
2.3 Relación entre el canal CFTR y CaCC…………………………………… 11<br />
2.4 Candidatos moleculares para CaCCs……………………………………. 16<br />
2.5 Hipótesis……………............................................................................... 20<br />
2.6 Objetivos generales................................................................................ 20<br />
2.7 Objetivos específicos.............................................................................. 20<br />
3<br />
MATERIALES Y MÉTODOS..................................................................<br />
3.1 Materiales……….................................................................................... 21<br />
3.11 Reactivos…………………………........................................................... 21<br />
3.12 Manejo de animales de experimentación............................................... 21<br />
3.2 Métodos……………………………………………………………………… 22<br />
3.2.1 Medición de corriente de cortocircuito en cámara de Ussing………….. 22<br />
3.2.1.1 Preparación del tejido……………………………………………………… 22<br />
21
3.2.1.2 Medición de la diferencia de potencial transepitelial y las corrientes de<br />
cortocircuito……………………………………………………………….....<br />
3.2.2 Genotipificación……………………………………………………………... 26<br />
3.2.2.1 Extracción de DNA genómico……………………………………………… 26<br />
3.2.2.2 Reacción de la polimerasa en cadena PCR……………………………… 28<br />
3.2.3 RT-PCR………………………………………………………………………. 30<br />
3.2.3.1 Aislamiento celular………………………………………………………….. 30<br />
3.2.3.2 Reacción de la polimerasa inversa acoplada a reacción de polimerasa<br />
4<br />
en cadena<br />
RESULTADOS.......................................................................................<br />
4.1 Descripción de la colonia de ratones CFTR……………………………… 35<br />
4.2 Efecto de agonistas de calcio intracelular sobre la diferencia de<br />
potencial transepitelial y la corriente de cortocircuito en colon distal de<br />
ratones nativos<br />
4.2.1 Efecto del carbacol sobre Vte y Isc…………………………………………. 42<br />
4.2.2 Efecto del UTP sobre Vte y Isc................................................................. 52<br />
4.3 Efecto de agonistas de calcio intracelular sobre la diferencia de<br />
potencial transepitelial y la corriente de cortocircuito en colon distal de<br />
ratones KO para CFTR……………………………………………………..<br />
4.3.1 Efecto del carbacol sobre Vte y Isc.......................................................... 54<br />
4.3.2 Efecto del UTP sobre Vte y Isc................................................................. 57<br />
4.4 Identidad molecular de los posibles candidatos responzables de la 59<br />
III<br />
23<br />
31<br />
35<br />
42<br />
54
5<br />
6<br />
secreción de cloruro activada por calcio intracelular…………………….<br />
DISCUSIÓN............................................................................................<br />
BIBLIOGRAFIA......................................................................................<br />
IV<br />
64<br />
74
INDICE DE FIGURAS<br />
V<br />
Pág.<br />
1 Proceso secretor en epitelio intestinal…………………………………… 10<br />
2 Canal de cloruro activado por calcio…………………………………….. 15<br />
3 Curva de sobrevida de ratones CFTR…………………………………… 38<br />
4 Peso corporal de ratones CFTR…………………………………………. 40<br />
5 Secreción aniónica en colon distal de ratón nativo……………………. 43<br />
6 Efecto de carbacol sobre la secreción de cloruro en colon de ratón<br />
nativo………………………………………………………………………..<br />
7 Interacción de NFA con el canal CFTR en colon de ratón nativo……. 48<br />
8 Efecto del NFA sobre la secreción de cloruro inducida por carbacol<br />
en colon de ratón nativo…………………………………………………..<br />
9 Efecto de UTP sobre la secreción de cloruro en colon de ratón nativo 53<br />
10 Secreción de cloruro inducida por carbacol en colon distal de ratón<br />
nativo y KO para CFTR……………………………………………………<br />
11 Efecto de UTP sobre la secreción de cloruro en colon de ratón nativo<br />
y KO para CFTR<br />
12 Detección por RT-PCR del mRNA para los miembros de la familia<br />
mCLCA y VMD en tejido colónico………………………………………..<br />
13 Detección por RT-PCR del mRNA para los miembros de la familia<br />
TMEM en tejido colónico………………………..………………………..<br />
46<br />
51<br />
55<br />
58<br />
62<br />
63
INDICE DE TABLAS<br />
I Buffer de lisis para extracción de DNA genómico…………………….. 27<br />
II Partidores CFTR para genotipificación………………………………… 29<br />
III Partidores para transcritos de la proteína CLCA……………………… 32<br />
IV Partidores para transcritos de la proteína VMD………………………. 33<br />
V Partidores para transcritos de la proteína TMEM…………………….. 34<br />
VI Colonia de ratones CFTR……………………………………………….. 36<br />
VI
ABREVIATURAS<br />
CFTR Regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística<br />
CaCC Canal de Cloruro activado por calcio<br />
DIDS Diisotiocianatoestilbeno disulfonato<br />
NFA Ácido Niflúmico<br />
pS picoSimens<br />
NKCC1 Triple cotransportador Na + , K + , Cl -<br />
KCNQ1/KCNE3 Canal de Potasio basolateral (activado por cAMP)<br />
KCNN4 Canal de Potasio basolateral (activado por calcio)<br />
ENaC Canal de sodio apical<br />
CF Fibrosis Quística<br />
CLCA Proteína canal de cloruro activado por calcio<br />
VMD Visual Molecular Dynamics<br />
TMEM16 Proteína de Transmembrana 16<br />
TTX Tetradotoxina<br />
IBMX Isobutil metilsantino<br />
Vte<br />
Isc<br />
Rte<br />
R Resistencia<br />
Potencial eléctrico transepitelial<br />
Corriente de cortocircuito<br />
Resistencia transepitelial<br />
I Corriente macroscopica<br />
VII
PCR Reacción en cadena de la polimerasa<br />
RT-PCR Reacción de polimerasa inversa acoplada a reacción de polimerasa<br />
en cadena<br />
bl basolateral<br />
ap apical<br />
VIII
1. RESUMEN<br />
El colon de mamíferos participa en la mantención del balance hidrosalino y volumen<br />
plasmático a través de los procesos absortivos y secretorios que ocurren en este tejido.<br />
Para esto los enterocitos disponen de canales iónicos, bombas e intercambiadores<br />
ubicados estratégicamente en los dominios apicales y basolaterales de estas células.<br />
Ciertas mutaciones en el canal CFTR (Regulador de la conductancia de<br />
transmembrana de la CF) producen defectos en el transporte de cloruro, provocando<br />
en los epitelios secretorios la deshidratación de su contenido. En el caso del sistema<br />
digestivo pueden provocar obstrucción que puede ser letal. Sin embargo algunos<br />
pacientes afectados por la CF parecen tener una conductancia alternativa al cloruro la<br />
que se cree puede disminuir la ocurrencia de episodios obstructivos. Basados en estas<br />
observaciones hemos decidido estudiar la presencia de canales de cloruro activados<br />
por calcio (CaCC) que pudiesen participar de la secreción de cloruro en el colon y ser<br />
responsables de las diferencias en el curso clínico de la enfermedad.<br />
Para indagar esta hipótesis utilizamos un modelo animal para la CF, un ratón CFTR KO,<br />
y estudiamos la presencia de conductancias de cloruro activadas por calcio en el colon<br />
mediante técnicas de electrofisiología. Además realizamos una búsqueda de transcritos<br />
de los miembros de las hasta ahora descritas familias de CaCC.<br />
Pese a que en el colon se expresa una gran cantidad de CaCC de diferentes familias,<br />
nuestros datos funcionales demuestran que estos canales no participan de la secreción<br />
de cloruro en colon de animales normales o con CF. Estos datos sugieren que en el<br />
epitelio intestinal el canal CFTR es el único canal de cloruro que participa de la<br />
secreción aniónica.<br />
1
1.1 SUMMARY<br />
The mammalian colon is involved in maintaining sodium balance and plasma volume<br />
through absorptive and secretory processes that occur in this tissue. To this end, the<br />
enterocytes are endowed with ion channels, pumps and exchangers strategically<br />
located in the apical and basolateral domains of these cells.<br />
Mutations in the CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator) channel<br />
leads to defective transport of chloride in secretory epithelia resulting in dehydration of<br />
its contents. In the case of the digestive system it can cause intestinal obstructions,<br />
which can be lethal. However, patients affected by cystic fibrosis seem to have<br />
alternative chloride conductance which is believed can reduce the occurrence of<br />
obstructive events. Based on these observations we decided to study the presence of<br />
calcium activated chloride channels (CaCC) that could participate in chloride secretion in<br />
the colon and be responsible for the differences in the clinical course of the disease.<br />
To test this hypothesis we have used an animal model for cystic fibrosis, the CFTR null<br />
mouse, and studied the presence of chloride conductance activated by calcium in the<br />
colon using electrophysiological techniques. We also conducted a search of transcripts<br />
of members of the families described so far CACC.<br />
Although the colon is expressed various of CaCC from different families, our functional<br />
data show that these channels do not participate in chloride secretion in the colon of<br />
normal animals or those with cystic fibrosis. These data suggest that in the intestinal<br />
epithelium CFTR is the only chloride channel involved in anion secretion.<br />
2
2. INTRODUCCIÓN<br />
Las células del epitelio secretorio poseen canales iónicos, cotransportadores,<br />
intercambiadores y bombas que están asimétricamente distribuidos entre la membrana<br />
apical y basolateral. El movimiento vectorial de los iones a través de un subconjunto<br />
de estas proteínas produce una gradiente osmótica que conduce a movimiento de<br />
fluido hacia el lumen del epitelio (Loewen & Forsyth, 2005).<br />
Los canales aniónicos son poros proteicos en la membrana biológica, los que permiten<br />
la difusión de iones cargados negativamente. Estos canales pueden conducir otros<br />
aniones (I - , NO3 - ) mejor que el cloruro, pero aun así, se les denomina canales de<br />
cloruro, ya que éste es el anión permeante más abundante en el organismo en<br />
condiciones fisiológicas (Jentsch et al., 2002).<br />
Los canales pueden ser clasificados de acuerdo a su mecanismo de apertura, como<br />
canales dependiente de ligando, canales de cloruro dependientes de voltaje, canales de<br />
cloruro regulado por fosforilación, canales aniónicos regulado por volumen, y CaCCs.<br />
Estos últimos, tienen como característica aumentar su probabilidad de apertura ante<br />
aumentos de la concentración de calcio citosólico produciendo una depolarización de la<br />
membrana celular. Los canales de cloruro activados por calcio han sido encontrados en<br />
distintos tipos celulares, incluyendo células epiteliales, neuronas, células sanguíneas,<br />
células de músculo liso y cardíaco, estando relacionados con actividades fisiológicas<br />
tales como la secreción epitelial, la excitabilidad de membrana en músculo cardiaco y<br />
las neuronas, la transducción olfatoria, la regulación del tono vascular, la modulación de<br />
3
los fotorreceptores, así como probablemente otras funciones hasta ahora desconocidas.<br />
(Hartzell et al., 2005a).<br />
2.1 EL CANAL DE CLORURO ACTIVADO POR CALCIO<br />
Uno de los primeros estudios de la conductancia al cloruro activada por calcio fue<br />
realizado en glándulas lagrimales de rata aproximadamente hace 25 años atrás. Se<br />
demostró la presencia de corrientes aniónicas activadas por aumentos de calcio<br />
intracelular inducidos ya sea por ionóforos de calcio o por estimulación colinérgica<br />
muscarínica. Estas corrientes mostraban rectificación externa, activación a potenciales<br />
depolarizantes y una dependencia de calcio con un umbral de 500 nM y saturación a 2<br />
µM (Marty et al., 1984;Evans & Marty, 1986). Corrientes con similares caracteristicas<br />
fueron observadas más tarde en células acinares de la glándula parótida (Arreola et al.,<br />
1996).<br />
El calcio que activa estas corrientes puede provenir de la entrada del catión divalente<br />
desde el intracelular o por su liberación desde los almacenes intracelulares. Hay dos<br />
posibles mecanismos generales por los cuales el calcio puede activar el canal, uno es<br />
que el calcio se puede unir directamente al canal y el otro mecanismo propuesto es<br />
que actúe indirectamente sobre el canal vía proteínas de unión a calcio o enzimas<br />
dependientes de calcio. (Hartzell et al., 2005a).<br />
4
Estudios electrofisiológicos del CaCC, en diversos tipos celulares, incluyendo varias<br />
células epiteliales secretorias, mostraron tener propiedades similares. En general, estas<br />
corrientes eran sensibles a calcio y a voltaje; se activaban lentamente a potenciales<br />
despolarizantes; mostraban una rectificación hacia afuera; mayor permeabilidad al<br />
yoduro que al cloruro; y era parcialmente bloqueado por DIDS (4,4`-<br />
Diisotiocianatoestilbeno-2,2`disulfonato 100-500 µM), y NFA (acido niflúmico, 100 µM)<br />
(Jentsch et al., 2002;Hartzell et al., 2005a). Sin embargo, los estudios de conductancia<br />
unitaria, indican la existencia de distintos tipos de CaCCs en los diferentes tipos<br />
celulares. CaCC de baja conductancia (1-3 pS) como en ovocito de Xenopus<br />
(Takahashi et al., 1987); CaCC con una conductancia de 8-pS, como es el caso de<br />
hepatocitos (Koumi et al., 1994); CaCC de 15-pS descrito en colon (Morris & Frizzell,<br />
1993). Pese a la diversa información que describe estas conductancias, la identidad<br />
molecular de estos canales sigue siendo desconocida.<br />
5
2.1.1 ROL FISIOLÓGICO DE LOS CANALES DE CLORURO ACTIVADO POR<br />
CALCIO<br />
Como se mencionó anteriormente los CaCCs se encuentran en diferentes tipos<br />
celulares, participando así, en diversas funciones, de las cuales podemos mencionar:<br />
La contracción de músculo liso, por ejemplo, en aorta torácica de rata (Lamb & Barna,<br />
1998), en donde el calcio activa corrientes de cloruro, produciendo la salida de este.<br />
Esta salida de cloruro despolariza la membrana celular lo que activa canales de calcio<br />
dependientes de voltaje, aumentando la entrada de calcio y promoviendo la contracción<br />
del músculo liso.<br />
Otra función en la que participan CaCCs es la secreción de fluido por la glándula<br />
exocrina, como las glándulas salivares (Melvin et al., 2005), en las cuales la salivación<br />
ocurre en respuesta a agonistas que generan un incremento en el calcio intracelular.<br />
Muchos estudios en diferentes especies han mostrado que aumentos intracelulares de<br />
calcio pueden estimular una secreción de cloruro en las células del epitelio de la vía<br />
aérea. Este epitelio utiliza el mecanismo de transporte iónico para controlar el nivel de<br />
fluido en la superficie, el cual es importante para la correcta hidratación del mucus y la<br />
protección contra agentes infecciosos. En la membrana apical del epitelio de la vía<br />
aérea de humano y ratón, se ha descrito dos conductancias de cloruro: Una activada<br />
por cAMP (Adenosin monofosfato cíclico) que corresponde a CFTR, y otra activada por<br />
calcio. Este CaCC en particular es activado por calcio vía el receptor purinérgico P2Y<br />
6
que incrementa la producción de IP3 e induce la liberación de calcio de los almacenes<br />
intracelulares (Tarran et al., 2002).<br />
Otro ejemplo de la participación de CaCC ocurre en el epitelio secretorio del ducto<br />
pancreático. En este tejido la secreción de cloruro activada por calcio, estimulada por<br />
acetilcolina es la que produce la secreción de fluidos en células del ducto pancreático<br />
de ratas (Winpenny et al., 1998).<br />
7
2.2 TRANSPORTE DE CLORURO Y AGUA EN EL INTESTINO<br />
El intestino juega un importante rol en la absorción y secreción de nutrientes,<br />
electrolitos y fluido. El colon es el segmento final del tracto digestivo donde se<br />
recuperan electrolitos y agua, normalmente entre un 80%-90% del fluido que proviene<br />
del segmento ileal, participando de la mantención de la homeostasis electrolítica. Para<br />
que esto se cumpla es necesario que exista una compleja interacción entre los<br />
procesos secretorios (criptas de lieberkuhn) y absortivos (células de la superficie), para<br />
lo cual las células del epitelio colónico están equipadas con numerosos canales iónicos,<br />
transportadores y bombas, localizados en la membrana apical (lado interno) y<br />
basolateral (lado externo) de las células (Kunzelmann & Mall, 2002;Zachos et al., 2005).<br />
El aumento o disminución de uno de los procesos puede llevar a la pérdida de este<br />
equilibrio, lo cual trae como consecuencia trastornos fisiopatológicos que en algunos<br />
casos puede llevar a la muerte. Por ejemplo es sabido que la secreción de fluido en el<br />
intestino es un proceso altamente regulado cuyo mayor componente se debe a la<br />
secreción electrogénica de cloruro, cuyo aumento debido a infecciones bacterianas<br />
como el cólera y rotavirus resultan en diarrea secretoria produciendo grandes pérdidas<br />
de agua y sales. Por el contrario, la CF es una enfermedad que se caracteriza por el<br />
impedimento de la salida de cloruro al lumen intestinal, debido a mutaciones en el canal<br />
CFTR. Esta deficiencia secretoria puede provocar cuadros obstructivos (Grubb &<br />
Gabriel, 1997).<br />
8
Como se mencionó anteriormente la secreción de cloruro intestinal es a través del<br />
canal de cloruro CFTR ubicado en la membrana apical, el cual, una vez activado<br />
mediante aumentos de cAMP, permite el flujo de cloruro hacia el lumen. El cloruro es<br />
acumulado dentro de la célula por sobre su potencial de equilibrio electroquímico, por la<br />
actividad del triple cotransportador basolateral NKCC1, el cual incorpora en forma<br />
paralela 2 iones cloruro, 1 sodio, 1 potasio utilizando como energía la gradiente<br />
favorable al sodio establecida por la bomba de sodio, también ubicado en la membrana<br />
basolateral. (Barrett & Keely, 2000;Kunzelmann & Mall, 2002). (Figura 1).<br />
La presencia de canales basolaterales de potasio es central en la maquinaria de<br />
secreción aniónica, ya que su apertura permite mantener el potencial de membrana<br />
favorable a la continua salida de cloruro, por reciclar el potasio que ingresa a través del<br />
triple cotransportador NKCC1 y la bomba de sodio (Kunzelmann & Mall, 2002). Gracias<br />
al uso de algunas herramientas farmacológicas y a la incorporación de modelos<br />
animales modificados genéticamente, ha sido posible identificar los dos tipos de<br />
canales de potasio basolaterales que participan en la secreción de cloruro en el<br />
intestino. El primero corresponde al canal KCNQ1/KCNE3, responsable de la secesión<br />
de cloruro dependiente de aumentos de cAMP e inhibido específicamente por la<br />
molécula cromanol 293B (Mall et al., 2003;Vallon et al., 2005). El segundo corresponde<br />
al canal KCNN4, que participa en la secreción de cloruro en respuesta a el aumento de<br />
calcio intracelular (Flores et al., 2007).<br />
9
Figura 1. Proceso secretor en el epitelio intestinal. Esquema general de la secreción<br />
de cloruro en el colon, a través del canal CFTR, el cual es estimulado por incrementos<br />
cAMP. A la secreción de cloruro también ocurre en forma paralela la secreción de sodio<br />
vía paracelular. El cloruro hace ingreso a la célula por medio del triple cotransportador<br />
basolateral NKCC1. El transporte de cloruro es mantenido por los canales de potasio<br />
basolaterales KCNQ1/KCNE3 (activado por cAMP) y SK4 o KCNN4 (activado por<br />
Ca 2+ ).<br />
Apical<br />
Basolateral<br />
10
2.3 RELACIÓN ENTRE EL CANAL CFTR Y CaCC<br />
El canal CFTR es un canal de cloruro epitelial que se activa por aumentos en la<br />
concentración intracelular de cAMP, lo que induce la fosforilación de la proteína. Se<br />
localiza en la membrana apical de las células epiteliales, donde proporciona la vía para<br />
el flujo del anión, siendo una actor central en el mecanismo de transporte transepitelial<br />
de sales y agua (Sheppard & Welsh, 1999).<br />
Las mutaciones en CFTR producen la CF que corresponde a una enfermedad<br />
autosómica recesiva, asociada a complicaciones multisistémicas que en humanos<br />
comprometen la función pulmonar, intestinal y pancreática principalmente (Brouillard et<br />
al., 2005). En Europa, uno de cada 2500 nacidos vivos padece la enfermedad y una de<br />
cada 25 personas es portadora sana (Grubb & Gabriel, 1997;Perez-Aguilar &<br />
Berenguer, 1998). De las casi 2000 mutaciones reportadas para el canal CFTR la<br />
deleción de un aminoácido, la fenilalanina en la posición 508 (∆F508), es la causante de<br />
cerca del 70% de los casos de la enfermedad (Grubb & Gabriel, 1997).<br />
En el epitelio pulmonar la CF produce una deficiente secreción aniónica y una excesiva<br />
absorción de sodio a través del epitelio, produciendo una insuficiente hidratación del<br />
contenido del lumen, lo que causa la acumulación de mucosidad viscosa de difícil<br />
transito y que favorece la colonización de patógenos (Greger, 2000;Brouillard et al.,<br />
2005).<br />
11
La fisiopatologìa de la CF en el tracto gastrointestinal desemboca en la obstrucción<br />
intestinal producto del mucus viscoso que se forma por la disminuida secreción en este<br />
epitelio. Clínicamente este sindrome obstructivo se denomina meconium ileus en recién<br />
nacidos y síndrome obstructivo intestinal distal en los pacientes adultos (Russo et al.,<br />
2003). Al momento de nacer, las obstrucciones intestinales afectan a aproximadamente<br />
el 15-20% y el episodio de obstrucción intestinal distal en adultos afectan al 25% de los<br />
pacientes (Canale-Zambrano et al., 2007). Durante el primer año de vida,<br />
aproximadamente el 50% de los pacientes exhiben signos y síntomas de mal digestión<br />
de nutrientes debido a insuficiencias pancreáticas y bajo peso corporal (Wilschanski &<br />
Durie, 1998).<br />
Existe evidencia experimental que sugiere que un canal de cloruro activado por calcio,<br />
puede proporcionar una importante ruta alternativa de secreción de cloruro en células<br />
epiteliales. Dichas corrientes activadas por calcio han sido observadas, en la vía aérea<br />
así como también en el intestino, aunque aún no es muy claro cuál es el mecanismo<br />
celular y los canales involucrados. A diferencia del epitelio intestinal, es en el epitelio de<br />
la vía aérea, donde existe evidencia más acabada acerca de la presencia de CaCC.<br />
Mediante aproximaciones experimentales electrofisiológicas, se demostró la presencia<br />
de CaCC en el cultivo primario de células de la vía respiratoria (Anderson & Welsh,<br />
1991). Permeabilizando de manera selectiva la membrana basolateral de células<br />
epiteliales de la traquea de ratón se demostró la localización apical de este canal<br />
(Gabriel et al., 2000c). Estudios funcionales en este mismo epitelio demuestran que la<br />
activación de receptores P2Y activarían corrientes de este tipo (Tarran et al., 2002).<br />
12
La presencia de CaCCs en epitelio intestinal es controversial. Se ha demostrado que en<br />
el tejido intestinal de pacientes CF así como en el obtenido de animales CFTR KO no<br />
presentan secreción de cloruro en respuesta a aumentos de cAMP o calcio intracelular<br />
(Grubb & Gabriel, 1997). Estudios funcionales en células aisladas del epitelio del colon<br />
de ratón (Bohme et al., 1991) colon de humano obtenido de individuos normales y de<br />
pacientes con CF no demostraron presentar conductancias de cloruro dependiente de<br />
calcio. Estos estudios sugieren que la activación de la secreción de cloruro dependiente<br />
de calcio requiere la presencia funcional del canal CFTR (Mall et al., 1998;Mall et al.,<br />
2000). Por el contrario, tiempo después se han reportado análisis que demuestran la<br />
existencia de una conductancia tipo CaCC en la membrana apical de epitelio intestinal<br />
de rata (Schultheiss et al., 2005).<br />
En estudios comparativos de la capacidad de transporte iónico de la mucosa intestinal,<br />
entre ratones afectados por CF, se observó una conductancia del tipo CaCCs, más<br />
activa en los ratones con manifestaciones leves que en las severas (Wilschanski et al.,<br />
1996). Mientras que estudios electrofisiologicos en células aisladas del intestino de<br />
ratones que presentaban un fenotipo leve de CF, mostraron la presencia de una<br />
conductancia a cloruro dependiente de calcio, sugiriendo que la presencia de estas<br />
corrientes se correlacionaba con una manifestación intestinal menos severa (Rozmahel<br />
et al., 1996).<br />
13
Estudios donde se examinó la secreción de cloruro en pacientes afectados por la<br />
mutación ∆F508 también demostraron la presencia de una conductancia alternativa al<br />
cloruro distinta de CFTR y que es activada por agonistas de calcio como histamina y<br />
carbacol (Bronsveld et al., 2000).<br />
En base a estas observaciones, se propone un modelo de la secreción de cloruro,<br />
(figura 2), en el que los canales CaCCs existirían como vía paralela al CFTR para la<br />
salida de cloruro a través de la membrana apical de las células secretorias.<br />
14
Apical Basolateral<br />
X<br />
Figura 2. Canal de cloruro activado por calcio. Esquema general de la secreción de<br />
cloruro en el colon, en el cual frente a la deficiencia del canal CFTR postula una vía<br />
alternativa a la secreción de cloruro siendo esta activada por aumento de calcio<br />
intracelular, cuya identidad molecular es desconocida.<br />
15
2.4 CANDIDATOS MOLECULARES PARA CaCCs<br />
Existen diversos candidatos que podrían corresponder al canal o los canales tipo<br />
CaCCs que han sido descritos funcionalmente en el intestino. Algunos se agrupan en la<br />
familia de proteínas CLCA, que se constituye de seis miembros con sus respectivas<br />
características estructurales y diferentes patrones de expresión tisular. Estudios de la<br />
expresión de estas proteínas, en el intestino de ratones normales y con CF, postulan a<br />
mCLCA3 como candidato a la conductancia de cloruro dependiente de calcio (Brouillard<br />
et al., 2005). Estos datos son consistentes con lo encontrado en pacientes humanos<br />
(Ritzka et al., 2004), donde las observaciones apuntan a hCLCA4 y hCLCA1, la<br />
contraparte humana de mCLCA3, como moduladores del defecto gastrointestinal en la<br />
CF. Otro miembro de esta familia, mClCA6 fue aislado del intestino de ratón. Este al ser<br />
expresado en células HEK 293 mostró una corriente de cloruro en respuesta al<br />
tratamiento con ionomicina (ionóforo de calcio), así como sensibilidad al inhibidor de<br />
este tipo de corrientes, el ácido niflúmico (NFA) (Evans et al., 2004).<br />
Otra familia de canales de cloruro activados por calcio putativos corresponde a las<br />
llamadas Bestrofinas. Uno de ellos han sido identificado en el epitelio pigmentado<br />
retinal, que corresponde a una proteína codificada por el gen de la distrofia macular<br />
vitiliforme (VMD), y se localiza en la membrana basolateral de las células del epitelio<br />
retinal pigmentado. Mutaciones asociadas a VMD muestran una reducida o nula<br />
corriente de cloruro activada por calcio (Hartzell et al., 2005b). La expresion heteróloga<br />
de esta proteína en células HEK293, mostraron corrientes de cloruro activadas por<br />
16
calcio (Qu et al., 2003b). Un estudio reciente investigó el rol de Best2 como candidata a<br />
proteína CaCC, utilizando ratones KO para Best2. Se observó una gran reducción de<br />
corriente aniónica bajo una estimulación colinérgica, consistente con lo observado en<br />
CaCC. Sin embargo ensayos de inmunofluorescencia revelaron la localización de Best2<br />
en la membrana basolateral en células globet, no en la membrana apical,<br />
adicionalmente en ausencia de HCO3 - , la activación colinérgica de la corriente fue<br />
idéntica en el tejido control y Best2 KO, lo que sugiere que la mayor corriente de Best2<br />
es por HCO3 - . Finalmente proponen que Best2 es un posible canal de HCO3 - que<br />
trabaja en conjunto con el intercambiador Cl:HCO3 - (Yu et al., 2010).<br />
En el 2008 tres equipos independientes de investigadores (Yang et al., 2008;Caputo et<br />
al., 2008a;Schroeder et al., 2008b) identificaron a TMEM16A como un fuerte candidato<br />
a CaCCs, utilizando diferentes métodos experimentales y bioinformáticos obteniendo<br />
casi los mismos resultados. Se observó que la expresión heteróloga de TMEM16A en<br />
diferentes tipos celulares siempre generaban corrientes de cloruro con propiedades<br />
clásicas de CaCC, lenta activación a potenciales de membranas positivos e inhibición<br />
por NFA y otros bloqueadores de CaCC (Galietta, 2009a).<br />
De acuerdo con el importante rol de CaCC en células epiteliales, se ha determinado<br />
que a nivel protéico o mRNA de TMEM16A en epitelios secretorios, células acinares<br />
pancreáticas, células de bronquiolos pulmonares, tubo proximal de riñón, glándula<br />
mamaria y células de la retina. Sin embargo, de la presencia de TMEM16A en otro tipo<br />
17
de células epiteliales, como es el caso del intestino, requiere de mayor estudio (Yang et<br />
al., 2008;Rock et al., 2009a).<br />
Estudios funcionales in vitro e in vivo han demostrado que TMEM16A es de hecho<br />
necesario para la secreción de cloruro dependiente de calcio. El uso de siRNA para<br />
silenciar TMEM16A ha mostrado una inhibición de la secreción de cloruro dependiente<br />
de calcio en cultivos polarizados de células epiteliales bronquiales humanas (Caputo et<br />
al., 2008b) y en la secreción de fluidos por la glándula salivar (Yang et al., 2008).<br />
Posteriores análisis, consistentes con estos estudios, han demostrado que la secreción<br />
de cloruro en epitelios silvestre activados por agonistas de calcio desaparece por<br />
perdida de expresión de TMEM16A. Aquí el transporte de cloruro dependiente de calcio<br />
se vio muy disminuido o incluso ausente en epitelio colónico y traqueal así como en<br />
hepatocitos, células acinares pancreáticas, y glándulas submandibulares en animales<br />
TMEM16A -/- (Ousingsawat et al., 2009).<br />
Se ha observado que existen grandes similitudes entre las corrientes dependientes de<br />
TMEM16A y CaCCs, lo que sugiere que TMEM16A puede ser una proteína de canal.<br />
Varios escenarios son posibles con respecto a esta proteína: se debe considerar que<br />
TMEM16A puede ser la única proteína necesaria para formar el canal CaCC o quizás<br />
solo forma parte del este (Galietta, 2009b).<br />
18
En resumen, y basándonos en los antecedentes bibliográficos postulamos que el el<br />
intestino se expresa un canal tipo CaCC que determina una vía alternativa de secreción<br />
de cloruro a la mediada por CFTR.<br />
19
2.5 HIPOTESIS<br />
Existe una conductancia apical al Cl - en el epitelio del colon de ratón que es activada<br />
por un aumento en la concentración de Ca +2 intracelular.<br />
2.6 OBJETIVOS GENERALES<br />
Identificar a nivel funcional la presencia de estos canales en epitelio de colon distal.<br />
Identificar molecularmente los integrantes de este grupo de canales de Cl - activados por<br />
calcio, cuyos mensajeros estén presentes en estas células.<br />
2.7 OBJETIVOS ESPECIFICOS<br />
Utilizar epitelio intestinal de ratones para medir corrientes de cortocircuito utilizado<br />
como indicador del transporte iónico a través del epitelio para así dar cuenta de la<br />
presencia de corrientes de cloruro activadas por calcio en las células secretorias<br />
Averiguar mediante estudios de RT-PCR qué mensajeros para canales de cloruro<br />
activados por calcio se expresan en las criptas intestinales, específicamente miembros<br />
del ClCA, Bestrofinas, TMEM16a.<br />
20
3.1 MATERIALES<br />
3.1.1 Reactivos.<br />
3. MATERIAL Y METODOS<br />
El inhibidor Cromanol 293 B (10 µM) fue obtenido de Tocris Bioscience (USA). Carbacol<br />
(100µM), UTP (100µM), amilorida (10µM), indometacina (2µM), Tretodotoxina (TTX,<br />
4µM), IBMX (100µM), forskolina (1µM), acido niflúmico (150µM), DIDS (100µM-500µM)<br />
fueron adquiridos en Sigma (USA).<br />
3.1.2 Manejo de los animales de experimentación.<br />
Los ratones (Mus musculus) silvestre y CFTR KO endocriados de las cepas Black<br />
Swiss, fueron obtenidos mediante una colaboración establecida entre el laboratorio del<br />
Dr. James E. Melvin del University of Rochester Medical Center y nuestro laboratorio del<br />
Centro de Estudios Científicos de Valdivia. Los animales fueron mantenidos en nuestro<br />
bioterio bajo estándares internacionales de manejo de animales. Los animales se<br />
generaron a partir de apareamientos entre heterocigotos de la misma camada siempre<br />
que esto fuera posible. La identificación del genotipo de los animales se llevó a cabo<br />
por PCR como se explica más adelante.<br />
21
3.2 METODOS<br />
3.2.1 Medición de corriente de cortocircuito en cámara de Ussing.<br />
3.2.1.1 Preparación del tejido.<br />
Para los experimentos de cámara de Ussing se utilizó el colon distal de ratones machos<br />
(en su mayoría para evitar la influencia de modificaciones hormonales en la actividad y<br />
expresión de algunos canales) y hembras adultas (2-5 meses). Los animales tuvieron<br />
libre acceso a alimento y agua hasta el día del experimento y se sacrificaron por<br />
dislocación cervical, método aprobado por las disposiciones del comité de bioética de<br />
nuestro centro. El segmento de intestino fue lavado con abundante solución salina<br />
(NaCl 0,9%) y luego abierto longitudinalmente a lo largo del borde mesentérico.<br />
Posteriormente, la mucosa debe ser desprendida, para esto el segmento de intestino se<br />
fija manualmente en uno de sus extremos utilizando un portaobjetos, a continuación la<br />
serosa y musculares propia se separó de la mucosa-submucosa por medio de un<br />
desplazamiento mecánico de esta última con otro portaobjetos.<br />
22
3.2.1.2 Medición de la diferencia de potencial transepitelial y las corrientes de<br />
cortocircuito.<br />
Para realizar los experimentos en la cámara de Ussing (Physiological Instruments, USA)<br />
se procedió a montar las dos hemicamaras P-2300, que conforman la cámara de<br />
Ussing, en ausencia del tejido, con el fin de poder calibrar el sistema. A cada<br />
hemicámara se le instalaron dos electrodos (del tipo puentes de agar al 4% y se<br />
mantienen en solución KCl 150 mM) uno de voltaje y otro de corriente, los cuales se<br />
conectaron a un amplificador EVC 4000 (World Precision Instruments, EEUU). La<br />
ubicación de los electrodos depende de lo que se desea registrar. En el caso de la<br />
diferencia de potencial transepitelial, los electrodos de voltaje deben estar en posición<br />
más próxima al tejido.<br />
Una vez instalada la cámara, se agregó a ambos lados 4 ml de solución de baño de la<br />
siguiente composición: NaCl 120 mM, NaHCO3 25 mM, KH2PO4 3,3 mM, K2HPO4<br />
0,8 mM, MgCl2 1,2 mM y CaCl2 1,2 mM.<br />
La cámara se debe mantener a 37º C, lo cual se realiza por medio de un baño<br />
termorregulado (HAAKE-FJ), el cual bombea y hace circular agua por un costado de la<br />
cámara.<br />
Luego, se procedió a abrir el circuito y corrigió cualquier asimetría entre los electrodos<br />
que miden el voltaje, así como también se compensó la resistencia en serie del fluido.<br />
23
A continuación se desconectó la cámara, se descartó la solución de baño y la<br />
preparación de tejido se montó en la cámara utilizando sujetadores de tejido<br />
P-2303 de apertura de 0,1 cm 2 de área (Physiological Instruments, USA), la que se<br />
introduce como membrana divisoria entre las dos hemicámaras. Inmediatamente<br />
después de montado el tejido se agregó nuevamente a ambos lados 4 ml de solución<br />
de baño, cuya composición se describió anteriormente. Esta solución es suplementada<br />
con D-glucosa 10 mM. La temperatura se mantiene a 37º C y ambas cámaras son<br />
burbujeadas de manera continua con mezcla de O2 95% y CO2 5%.<br />
La diferencia de potencial eléctrico transepitelial (Vte), definida como el potencial del<br />
lado mucoso con respecto al lado basolateral de la preparación, es medida de manera<br />
continua, bajo configuración current clamp (corriente mantenida) utilizando el<br />
amplificador anteriormente mencionado. El tejido es mantenido a corriente de 0 µA y<br />
sometido a pulsos de 10 µA de 4 s de duración. La corriente (I) registrada se digitalizó a<br />
200 Hz por medio de una interfase análoga-digital modelo TL-1 (Axon Instruments,<br />
USA). Luego con los datos de ∆Vte y ∆I, y utilizando la ley de Ohm, se calculó la<br />
resistencia transepitelial (Rte):<br />
Rte = ∆Vte/∆I<br />
24
A continuación se calcularon las corrientes de cortocircuito equivalentes (Isc), definida<br />
como la corriente que se debe inyectar al sistema para mantener la diferencia de<br />
potencial transepitelial igual a cero. Este cálculo se realizo a partir de los valores de<br />
resistencia y diferencia de potencial transepitelial:<br />
Isc= Vte/R<br />
Los cambios en Isc a consecuencia de los diferentes estímulos (∆Isc) fueron calculados<br />
como se indica a continuación:<br />
� ∆Isc inducida por cAMP: Isc después menos Isc antes de agregar IBMX /<br />
forskolina.<br />
� ∆Isc inducida por carbacol: Isc después menos Isc antes de agregar carbacol.<br />
� ∆Isc inducida por UTP: Isc después menos Isc antes de agregar UTP.<br />
25
3.2.2 Genotipificación<br />
3.2.2.1 Extracción de DNA genómico de cola.<br />
Procedimiento :<br />
1) Agregar 400 µl de buffer lisis a cada trozo de cola, (Tabla I).<br />
2) Digerir toda la noche a 55 °C<br />
3) Centrifugar 5 minutos a 14000 rpm<br />
4) A un tubo conteniendo 800 µl de ETOH frío traspasar 320 µl de sobrenadante y<br />
mezclar por inversión.<br />
5) Centrifugar 5 minutos a 14000 rpm<br />
6) Eliminar todo el líquido sobrenadante invirtiendo una vez y escurrir en una toalla<br />
nova.<br />
7) Dejar secar el precipitado<br />
8) Resuspender en 100 µl de buffer TE (20 µl EDTA 0.25 M y 100 µl de Tris-HCl<br />
500 mM en 5 ml finales)<br />
9) Incubar 30 minutos a 55°C agitando<br />
26
Tabla I. Buffer de lisis para extracción de DNA genómico<br />
Tabla resumen indica las concentraciones correspondientes a cada uno de los reactivos<br />
tanto para el formato de almacenamiento (stock) como para el formato de trabajo. De<br />
igual manera, el resumen del protocolo de preparación para 10 y 5 ml de buffer de lisis<br />
a partir del formato de trabajo.<br />
Stocks Trabajo 10 mL 5 mL<br />
Tris-HCl 500 mM 100 mM 2 ml 1ml<br />
EDTA 0.25 M 10 mM 400 µl 200 µl<br />
NaCl 5 M 200 mM 400 µl 200 µl<br />
SDS 10% 0.2% 200 µl 100 µl<br />
DOW --- --- 7 ml 3.5 ml<br />
Proteinasa K --- --- 7.4 mg 3.7 mg<br />
27
3.2.2.2 Reacción de la polimerasa en cadena PCR<br />
Las reacciones de amplificación fueron llevadas a cabo mediante PCR. Se fijaron los<br />
siguientes parámetros: un paso previo de denaturación a 94°C por 5 minutos, 35 ciclos<br />
con una temperatura de denaturación de 94°C por 30 segundos, de alineamiento de<br />
60°C por 30 segundos y de elongación de 72°C por 30 segundos y finalmente una<br />
etapa de 7 minutos a 72°C.<br />
Los partidores se muestran en la (Tabla II). Cada reacción de PCR contiene, 12,5 µl<br />
Buffer 2X Go taq flexi (Promega), 6,5 µl de agua libre de nucleasas, 1 µl de primers<br />
(CFTR 26, 27, 28), en un volumen total de 25 µl.<br />
28
Tabla II. Partidores CFTR para genotipificación.<br />
CFTR 26 5´ TTCAAGCCCAAGCTTTCGCGAG 3´<br />
CFTR 27 5´ CTCCCTTCTTCTAGTCACAAGCG 3´<br />
CFTR 28 5´ CATCTTGATAGAGCCACGGTGC 3´<br />
Secuencia nucleotídica correspondiente a los partidores 26, 27, 28 para CFTR<br />
utilizados en la reacción de la polimerasa en cadena.<br />
29
3.2.3 RT-PCR<br />
3.2.3.1 Aislamiento celular<br />
Para este propósito se extrae el colon de ratón, de este los 3 cm distales serán<br />
utilizados para obtener las células de la cripta. El colon se lava 3 veces con suero<br />
fisiológico (NaCl 0,9 %) a 37 ºC. Luego se lava con la solución A que contiene (en mM)<br />
7 K2SO4, 44 K2HPO4, 180 Glucosa, 10 HEPES, 10 citrato de sodio, pH 7,4, a 37 ºC. Se<br />
ligan los extremos, con la solución A en su interior, y se sumerge en esta solución por<br />
10 minutos a 37 ºC. A continuación se descarta el contenido apical y se reemplaza por<br />
la solución B que contiene (en mM) 7 K2SO4, 44 K2HPO4, 180 Glucosa, 10 HEPES, 10<br />
EDTA, 0,5 DTT, pH 7,4 y se incuba por 3 min a 37 ºC. Las células superficiales se<br />
liberaron por un palpado manual de la porción distal del colon por aproximadamente 3<br />
min a temperatura ambiente, la fracción obtenida se suspende en la solución A y se<br />
mantiene a 4 ºC. Este paso se repitió 6 veces obteniendo fracciones 1 <strong>–</strong> 6. A partir de la<br />
fracción 5 se obtienen de células de la cripta (Del Castillo & Sepulveda, 1995;Catalan et<br />
al., 2002).<br />
30
3.2.3.2 Reacción de polimerasa inversa acoplada a reacción de polimerasa en<br />
cadena.<br />
A partir de las criptas obtenidas, se procedió a aislar el RNA total utilizando la<br />
extracción con TRIZOL (Invitrogen, USA). La reacción de polimerasa inversa se realizó<br />
a partir de 3 µg de RNA total utilizando el Kit SuperScript II system (Invitrogen, USA),<br />
utilizando partidores hexaméricos al azar y oligo dT bajo las condiciones establecidas<br />
por el fabricante. Los partidores utilizados fueron para transcritos de las familias mClCA<br />
(Tabla III), Vmd (Tabla IV), TMEM16 (Tabla V). La mezcla de reacción contiene,<br />
alícuota de templado, 0,2 µM de cada partidor, 2.5 unidades de DNA Taq polimerasa<br />
(Promega), 2mM dNTPs, y 1,5 mM MgCl2 en un volumen total de reacción de 25 µl. Se<br />
fijaron los siguientes parámetros como sigue: Una denaturación inicial a 95 ºC por 2<br />
minutos, 30 ciclos a 95 ºC por 30 segundos, alineamiento a 58 ºC por 30 segundos,<br />
elongación a 74 ºC por 30 segundos, y un paso final de 5 minutos a 74 ºC.<br />
Transcurrida la reacción, 10 µl del volumen total (25 µl) son cargados en un gel de<br />
agarosa al 1% de con tampón de corrida TAE 1X para verificar amplificación.<br />
31
Tabla III. Partidores para transcritos de la familia mCLCA.<br />
Gen Partidor sentido Partidor antisentido<br />
mClCa1 5' GTTCCACCAGGATCACTGGCACCA 3' 5' GGCAAATTGAAGTTCCACCAGAA 3'<br />
mClCa2 5' GCTCCGCCAGCATCACAGGCAAGA 3' 5' GCGTCGATAAGGCTGCTTACATGTT 3'<br />
mClCa3 5' CAAGCAGTGAGGTGTTCAGCAGCC 3' 5' CCTCCCCATCGGTCAGCAGCACAA 3'<br />
mClCa4 5' CAAACAAATCCCAGACTGCGAG 3' 5' AGGGTCAGACGAGTGATGGG 3'<br />
mClCa5 5' GTTCTCCCTCTTGCAGGCTGGTGA 3' 5' TCTGCGTCAGTGGACACGGCGGTC 3'<br />
mClCa6 5' GCTACAGATGAAGCCCAGAACAAT 3' 5' CCTGAGATAAATGGCAGGGGCTTG 3'<br />
Secuencia nucleotídica correspondiente a los partidores sentido y antisentido utilizados<br />
en la reacción de polimerasa inversa acoplada a reacción de polimerasa en cadena<br />
para la amplificación de los transcritos para la familia mCLCA.<br />
32
Tabla IV. Partidores para transcritos de la familia VMD.<br />
Gen Partidor sentido Partidor antisentido<br />
Vmd2l1 5' AGGGTCTGCACAAGCTAGCTAG 3' 5' CATGAGGTAGGCCGTCAATTCC 3'<br />
Vmd2l3 5' CCACCTCAAATCGCCTCATCTG 3' 5' CCTTCCGATCAGGCACGCAAAG 3'<br />
Vmd2 5' TGGAGCCAGTACGAGAACTTGC 3' 5' GTAGGCCCAACTTCTGCAACTG 3'<br />
Secuencia nucleotídica correspondiente a los partidores sentido y antisentido utilizados<br />
en la reacción de polimerasa inversa acoplada a reacción de polimerasa en cadena<br />
para la amplificación de los transcritos para la familia VMD.<br />
33
Tabla V. Partidores para transcritos de la familia TMEM.<br />
Proteína Partidor sentido Partidor antisentido<br />
TMEM16A 5' TTCGTCAATCACACGCTCTC 3' 5' CTCACGCATAAACAGCTCCA 3'<br />
TMEM16B 5' CGGATATCCCCACTGACATC 3' 5' CTTAAGCCAGTTCCCAGCAG 3'<br />
TMEM16CV1 5' CATCTGGTGCTGCTGTCTGT 3' 5' ATTTGTGACCCCCATTCTCA 3'<br />
TMEM16CV2 5' ATATGGCCCTTGTGCAAATC 3' 5' CCAAGTATTTCTCTCGCCGT 3'<br />
TMEM16D 5' CGACTTCATCCCTCGCTTAG 3' 5' TTGTCATGGCCACTCATTGT 3'<br />
TMEM16E 5' GCCTGGCTGATACCAGATGT 3' 5' CATCCAGCCTGAAACCCAGA 3'<br />
TMEM16F 5' CTGGGCACCCACAAGAGTAT 3' 5' TAGGAGTTCCAATGCCATCC 3'<br />
TMEM16G 5' ATGGCTTCCTCAATTTCACG 3' 5' GTATTCCCGCTTCACCTTGA 3'<br />
TMEM16J 5' CTTCAATGACCACAGCAGGA 3' 5' TTATGGATAGGGGCAAGCTG 3'<br />
TMEM16H 5' CTGAAGCAGATCATCCCGTT 3' 5' GGTTAAGGCCTGTGACCTGC 3'<br />
TMEM16K 5' CATGCACTCTTGGCTCTGAA 3' 5' GAGCTAGACCTTGGTGTGCC 3'<br />
Secuencia nucleotídica correspondiente a los partidores sentido y antisentido utilizados<br />
en la reacción de polimerasa inversa acoplada a reacción de polimerasa en cadena<br />
para la amplificación de los transcritos para la familia TMEM.<br />
34
4. RESULTADOS<br />
4.1 DESCRIPCIÓN DE LA COLONIA DE RATONES CFTR.<br />
El uso de modelos animales modificados genéticamente ha proporcionado grandes<br />
avances en la investigación y comprensión de enfermedades humanas como el caso<br />
del modelo murino de CF KO para CFTR (Snouwaert et al., 1992;Delaney et al.,<br />
1996). Su uso ha facilitado el estudio de la enfermedad, y ofrece la oportunidad de<br />
poder realizar pruebas farmacológicas u otro tipo de terapia que permitiría modificar la<br />
severidad de la enfermedad.<br />
Este trabajo de tesis se realizó utilizando una colonia de ratones KO en cepa híbrida<br />
Balb C/Black Swiss, utilizando ratones silvestres y KO para CFTR, los cuales se<br />
clasificaron por genotípificación y sexo. De acuerdo al sexo contamos con una<br />
proporción aproximada de 1:1 entre machos y hembras. Según la identificación<br />
genotípica esperaríamos contar con una típica proporción 1:2:1 en la colonia, pero en<br />
este caso la proporción CFTR KO está muy por debajo de los silvestres (Tabla VI).<br />
Como se mencionó en la introducción, la CF es una enfermedad multisistémica, siendo<br />
uno de los órganos afectados el intestino, cuyo fenotipo clínico es la obstrucción<br />
intestinal (Russo et al., 2003). Como ha sido previamente demostrado en estos modelos<br />
animales, una gran cantidad de crías CF mueren siendo neonatos y luego son<br />
canibalizados por las madres (Grubb & Boucher, 1999) lo que impide su identificación y<br />
puede explicar el bajo número de CFTR KO obtenidos.<br />
35
Tabla VI. Colonia de ratones CFTR.<br />
+/+ +/- -/- Total<br />
M 38 46 6 90<br />
F 34 58 9 101<br />
Total 72 104 15 191<br />
% 38 54 8 100<br />
Resumen de la cantidad de ejemplares disponibles de acuerdo al sexo (M) masculino,<br />
(F) femenino y clasificación de la colonia de acuerdo a genotipificación en donde se<br />
muestra porcentajes de (+/+) homocigoto o silvestre, (+/-) heterocigoto, (-/-) CFTR KO.<br />
36
Además un número importante de crías CFTR KO muere por este tipo de<br />
complicaciones intestinales antes del destete y después del destete, debido al consumo<br />
de alimento sólido, lo cual dificulta aún más su tránsito (Grubb & Boucher, 1999).<br />
Con el fin de obtener una estadística y un seguimiento de la colonia se realizó una<br />
curva de sobrevida para ratones silvestres y KO para CFTR (Figura 3). En nuestro caso<br />
los ratones, no importando el genotipo, son destetados a los 21 días, luego disponen de<br />
una dieta normal de comida y agua. Se hizo un seguimiento durante 60 días,<br />
registrando una mortalidad de aproximadamente un 40 % a la fecha del destete y al<br />
final del monitoreo alcanzó aproximadamente un 80 % para el caso de los animales KO<br />
para CFTR. En los animales silvestre y heterocigotos no se registraron muertes.<br />
La creación de un modelo en ratón modificado genéticamente que tiene la proteína<br />
CFTR no funcional desarrolla un fenotipo muy similar al ileo meconial y al síndrome<br />
obstructivo intestinal distal (Canale-Zambrano et al., 2007). Histológicamente, la<br />
mayoría de estos ratones sufren de hiperplasia de las células caliciformes, acumulación<br />
de mucus y dilatación y elongación de las criptas (Greger, 2000). En adición al fenotipo<br />
que reflejan los ratones CF, en parte relaciona este defecto intestinal con un bajo peso<br />
corporal. En pacientes CF esto está dado por una serie de factores, incluyendo el nivel<br />
nutricional y entorno, así como una mala absorción de grasas. La causa del bajo peso<br />
corporal de los ratones CF es desconocida, pero estudios lo relacionan con una mala<br />
absorción de grasas, posiblemente por una alteración en el pH intestinal , así como<br />
también ha sido reportada la presencia de bacterias intestinales las cuales estarían<br />
afectando el crecimiento de los ratones con CF (Canale-Zambrano et al., 2007).<br />
37
Figura 3. Curva de sobrevida de ratones CFTR. Se presenta una curva de sobrevida<br />
en el tiempo (días) de los ratones control (CFTR silvestre) y KO para CFTR.<br />
38
En conjunto al monitoreo de la sobrevida realizado a la colonia, se registró el peso<br />
corporal en el tiempo graficado en la figura 4. Básicamente de este ensayo logramos<br />
identificar y clasificar nuestra colonia en tres tipos, CFTR silvestre, CFTR KO tipo I,<br />
CFTR KO tipo II, esto en base a las diferencias en la ganancia de peso corporal al paso<br />
del tiempo.<br />
Lo que pudimos observar es que durante el primer periodo de alimentación,<br />
correspondiente a los primeros 21 días de nacidos, en el cual su dieta se basa<br />
solamente en leche materna, existían dos grupos de ejemplares, diferentes en cuanto al<br />
promedio del peso corporal, pero semejantes en cuanto a la ganancia de este hasta la<br />
fecha del destete (0,48 gr/día; 0,59 gr/día; 0,55 gr/día). Una vez que se realiza el<br />
destete, la dieta se basa en alimentación sólida y es en esta etapa en donde podemos<br />
observar mayores diferencias. Por ejemplo, el grupo que presentó un mayor promedio<br />
de peso durante los primeros 21 días se disgregó en dos grupos más, uno que<br />
continuo aumentando de peso normalmente (0,44 gr/día), el que se clasificó como<br />
CFTR silvestre y un segundo grupo que mostró una disminución de peso corporal,<br />
posiblemente por una adaptación al cambio de alimentación, con una posterior<br />
recuperación y un continuo aumento de peso corporal (0,38 gr/día), clasificándose<br />
como CFTR KO tipo I.<br />
Con respecto al grupo que presentó un menor promedio de peso corporal en la primera<br />
etapa de la alimentación, tras el cambio al alimento sólido observamos una continua<br />
pérdida de peso hasta el punto de causar la muerte (-0,21 grs/día), este grupo fue<br />
clasificado como CFTR KO tipo II. Esto nos da cuenta de las variaciones fenotípicas<br />
que pueden existir debido a un defecto debido a una mutación determinada,<br />
39
Figura 4. Peso corporal de ratones CFTR. Gráfica del peso (en gramos) en el tiempo<br />
(días) para ratones silvestres ( +/+ ) y KO para CFTR (tipo I y II). Línea punteada marca<br />
día 21, donde se produce el destete. La pendiente de cada recta determina el promedio<br />
de ganancia de peso por día para los ratones silvestres, CFTR tipo I y CFTR tipo II<br />
antes del destete (0,48 gr/día; 0,59 gr/día; 0,55 gr/día) respectivamente y después del<br />
destete (0,44 gr/día, 0,38 gr/día, -0,21 grs/día).<br />
CFTR (silvestre)<br />
CFTR tipo I<br />
CFTR tipo II<br />
40
Esto coincide con estudios clínicos que han establecido que el curso de la CF es<br />
altamente variable, las enfermedades intestinales causadas por esta están<br />
determinadas en parte por la naturaleza de la mutación de CFTR (Canale-Zambrano et<br />
al., 2007).<br />
41
4.2 EFECTO DE AGONISTAS DE CALCIO INTRACELULAR SOBRE LA<br />
DIFERENCIA DE POTENCIAL TRANSEPITELIAL Y LA CORRIENTE DE<br />
CORTOCIRCUITO EN COLON DISTAL DE RATONES SILVESTRES.<br />
4.2.1 EFECTO DE CARBACOL SOBRE Vte Y Isc.<br />
En la figura 5, se presenta un registro representativo de Vte del segmento distal de colon<br />
de ratón silvestre. El Vte inicial, que es la diferencia de potencial transepitelial referido<br />
al lado basolateral de la preparación, es de <strong>–</strong> 5 ± 0,7 mV. Para el caso de la resistencia<br />
transepitelial se observó un registro cercano a 77 ± 3 Ohm cm 2 (promedio ± error<br />
estándar, n=16)<br />
En primer lugar se realiza un tratamiento con indometacina (2 µM, bilateral) por<br />
aproximadamente 20 minutos, para Inhibir la actividad de la enzima ciclooxigenasa así<br />
impidiendo la formación de precursores de prostaglandinas producto de la manipulación<br />
del tejido. De esta forma disminuye la formación de cAMP estimulada por<br />
prostaglandinas que podría interferir en la activación de manera no predecible de la<br />
secreción de cloruro vía este segundo mensajero (Carew & Thorn, 2000). Luego a esto<br />
se adiciona en forma conjunta amilorida más TTX. La adición de amilorida (10 µM) por<br />
el lado apical del tejido provocó una deflexión en dirección positiva del Vte. Esto es<br />
consistente con una inhibición de las corrientes de sodio absortivas, como<br />
consecuencia de la acción de la amilorida sobre la actividad del canal de sodio ENaC<br />
presente en la membrana apical de las células superficiales de este epitelio.<br />
42
-2<br />
-4<br />
-6<br />
-8<br />
-10<br />
-12<br />
-14<br />
Figura 5. Secreción aniónica en colon distal de ratón silvestre. La figura muestra<br />
un registro continuo de Vte obtenido de un experimento en la cámara de Ussing. Al<br />
aumentar el cAMP tisular (IBMX 100µM + forskolina1µM) se produce un cambio<br />
negativo de Vte consistente con secreción de cloruro. Este proceso es revertido al<br />
utilizar el inhibidor del canal de potasio KCNQ1/KCNE3, cromanol 293 (10µM) por el<br />
lado basolateral (bl). La aplicación de carbacol (100µM) produce una deflexión negativa<br />
de Vte consistente con secreción de de cloruro. La adición de amilorida (10µM) apical<br />
(ap) al inicio del experimento evidencia la existencia de absorción de sodio por canales<br />
ENaC. Todos los experimentos fueron realizados en presencia de indometacina (2µM)<br />
y TTX (4µM).<br />
Amilorida(ap)<br />
IBMX/Forskolina (bl)<br />
0 Carbacol (bl)<br />
Cromanol 293 (bl)<br />
5 min<br />
43
Por otro lado, la adición de (TTX, 4µM) por el lado basolateral tiene como objetivo<br />
bloquear la actividad espontánea de neuronas subepiteliales. En el ratón muchas<br />
neuronas entéricas están localizadas a micrómetros de la superficie serosa del intestino<br />
(Bjerknes & Cheng, 2001) y podrían liberar mediadores de la secreción. Luego, se<br />
procedió a agregar por el lado basolateral del epitelio IBMX (100 µM) más forskolina (1<br />
µM) con el fin de elevar las concentraciones de cAMP intracelular mediante el efecto<br />
inhibitorio de fosfodiesterasas por IBMX y la activación de adenilato ciclasa por<br />
forskolina. Se sabe que este aumento de cAMP produce la activación de canales de<br />
cloruro CFTR apicales y canales KCNQ1/KCNE3 de potasio basolaterales, lo que lleva<br />
a una secreción neta de cloruro. El efecto hiperpolarizante de la adición de<br />
IBMX/forskolina es consistente con este proceso secretorio electrogénico. La<br />
participación de los canales basolaterales de potasio KCNQ1/KCNE3 en la secreción de<br />
cloruro se exploró agregando al lado basolateral su inhibidor específico cromanol 293 B<br />
(10 µM). La adición del inhibidor abolió la hiperpolarización estimulada por<br />
IBMX/forskolina, confirmando que estos canales son centrales en este proceso (Diener<br />
et al., 1996).<br />
Como se mencionó en la introducción, los receptores muscarínicos en el epitelio<br />
colónico, una vez siendo activados, pueden provocar un aumento en la concentración<br />
del calcio intracelular. Esto tiene como consecuencia una secreción aniónica<br />
dependiente de calcio. Para causar este efecto nos ayudamos del agonista de<br />
receptores muscarínicos carbacol (100 µM) (Haberberger et al., 2006). Como es posible<br />
observar, la adición de carbacol al lado basolateral del tejido indujo un cambio negativo<br />
del Vte consistente con la secreción aniónica.<br />
44
Con el fin de descartar una posible desensibilización de los receptores muscarínicos o<br />
vaciamiento de los almacenes intracelulares de calcio, se realizaron dos adiciones<br />
consecutivas de carbacol (100 µM) separadas por un lavado posterior a la primera<br />
adición, (figura 6A). Como resultado se pudo observar que la adición de carbacol por el<br />
lado basolateral del tejido indujo un cambio negativo reproducible de Vte. En la figura<br />
6B, se muestra las corrientes de cortocircuito calculadas, que corresponden a corrientes<br />
negativas, inducida por carbacol, donde la diferencia es no significativa (-80 ± 28 µA cm -<br />
2 y -71 ± 28 µA cm -2 para el estímulo I y II respectivamente).<br />
45
A<br />
Vte ( mV)<br />
B<br />
-4<br />
-6<br />
-8<br />
-10<br />
-12<br />
-14<br />
��Isc (���cm -2 )<br />
Carbacol (bl)<br />
-20<br />
-40<br />
-60<br />
-80<br />
-100<br />
-120<br />
Figura 6. Efecto de carbacol sobre la secreción de cloruro en colon de ratón<br />
silvestre. En la figura A después de aplicar IBMX/forskolina e inhibir la secreción de<br />
cloruro inducida por cAMP con cromanol 293 basolateral, se estimuló el tejido con<br />
carbacol. La adición consecutiva produjo una secreción aniónica de manera<br />
reproducible. Esto en presencia de amilorida y TTX. En B se resumen las corrientes de<br />
cortocircuito calculadas para las corrientes de cloruro activadas por carbacol. valores<br />
son promedio ± error estándar significativa (-80 ± 28 µA cm -2 y -71 ± 28 µA cm -2 para el<br />
estímulo I y II respectivamente), con un n=3.<br />
0<br />
Carbacol Basolateral<br />
I II<br />
5 min<br />
46
Las herramientas farmacológicas son muy útiles en el estudio de canales iónicos, por lo<br />
cual hemos querido hacer uso de éstas para nuestro propósito. El NFA es un agente<br />
antiinflamatório no esteroidal y es considerado un bloqueador específico que ha sido<br />
utilizado para identificar corrientes aniónicas como los CaCCs en diferentes tejidos,<br />
tales como células endoteliales de arteria pulmonar de rata (Kato et al., 1999), células<br />
epiteliales de la vía aérea de ratón (Gabriel et al., 2000b) y ovocito de Xenopus (White<br />
& Aylwin, 1990). Como ya se mencionó, el NFA es un bloqueador de los CaCCs. Existe<br />
evidencia que lo vinculan con una posible interacción con el canal CFTR, por ejemplo,<br />
como antiinflamatorio no esteroidal funciona inhibiendo la enzima ciclooxigenasa 2<br />
para prevenir la formación de prostaglandinas, por lo que se ve disminuida la formación<br />
de cAMP. Por otro lado la estructura química del NFA está cercanamente relacionada al<br />
agente inhibidor de CFTR arylaminobenzoato difeniyl-amino-2-carboxylato (DPC). En<br />
base a estos datos se realizó el experimento de la figura 7 con el objeto de verificar si<br />
existe alguna relación entre la función del NFA y el canal CFTR que pudiera interferir en<br />
la identificación de una conductancia al cloruro dependiente de calcio intracelular (Scott-<br />
Ward et al., 2004).<br />
47
Vte ( mV)<br />
A<br />
-2<br />
-4<br />
-6<br />
-8<br />
-10<br />
-12<br />
Figura 7. Interacción de NFA con el canal CFTR en colon de ratón silvestre. En la<br />
figura A, luego de la activación de la secreción de cloruro inducida por IBMX/forskolina<br />
se procedió a agregar en forma consecutiva NFA hasta alcanzar una concentración de<br />
600 µM, no presentando ningún cambio en el Vte. En B se resumen las corrientes de<br />
cortocircuito calculadas para las 4 aplicaciones de NFA. (Forskolina + IBMX -138 ± 22<br />
µA cm -2 ), NFA (153 ± 34 µA cm -2 , 150 ± 36 µA cm -2 , 143 ± 35 µA cm -2 , 130 ± 25 µA cm -2<br />
para 150, 300, 450 y 600 µM respectivamente. Valores son promedio ± error estándar,<br />
con un n=3.<br />
0<br />
B<br />
��Isc (���cm -2 )<br />
IBMX + Forskolina (bl)<br />
Ac. Niflúmico NFA (ap) 150 µM<br />
(ap)<br />
150 µM<br />
150<br />
50<br />
0<br />
-50<br />
-100<br />
-150<br />
-200<br />
Ac. Niflúmico NFA<br />
µM<br />
150<br />
5 min<br />
600µM<br />
450 µM<br />
300 µM<br />
150 µM<br />
µM<br />
293 B<br />
48<br />
IBMX/Forskolina<br />
IBMX/Forskolina + NFA
En la figura 7A, se presenta un registro de Vte, en el cual, seguida la adición de<br />
amilorida (10 µM apical) se procedió a agregar por el lado basolateral del epitelio<br />
(IBMX, 100 µM) más forskolina (1 µM) con el fin de elevar las concentraciones de cAMP<br />
intracelular. Una vez activada esta corriente de cloruro se procedió a agregar NFA a<br />
concentraciones crecientes (150 µM - 600 µM) por el lado mucoso del epitelio. Esta<br />
maniobra no produjo cambios en el Vte, sugiriendo de que el NFA no interfiere en la<br />
corriente de cloruro activada por aumento en el cAMP intracelular. En la figura 7B, se<br />
muestra los cálculos de la corriente de corto circuito para la activación de la corriente<br />
de cloruro por forskolina + IBMX (-138 ± 22 µA cm -2 ) y para las distintas<br />
concentraciones de NFA (150 µM, 300 µM, 450 µM, 600 µM) que fueron 153 ± 34 µA<br />
cm -2 , 150 ± 36 µA cm -2 , 143 ± 35 µA cm -2 , 130 ± 25 µA cm -2 respectivamente.<br />
Según los resultados obtenidos anteriormente en la figura 6, en la cual se demostró que<br />
bajo estímulos consecutivos al epitelio con carbacol no se observaba una<br />
desensibilización de la secreción aniónica, y en la figura 7 en la cual se mostró que el,<br />
NFA, no tenía efecto sobre la corriente de cloruro activada por el aumento de cAMP<br />
intracelular, quisimos probar el efecto del NFA sobre el estimulo inducido por carbacol al<br />
epitelio.<br />
49
La figura 8A, muestro el registro de Vte , el que se obtuvo siguiendo el protocolo<br />
realizado en la figura 6, luego de la primera aplicación de carbacol basolateral para<br />
aumentar el calcio intracelular y el posterior lavado del compartimiento basolateral para<br />
volver a alcanzar el estado basal de Vte, se procedió a adicionar NFA (150 µM, en<br />
ninguno de os experimentos mostro cambios en el Vte), al cabo de unos minutos se<br />
adicionó nuevamente carbacol basolateral. Como se puede apreciar no hubo cambio en<br />
el efecto carbacol manteniendose el mismo cambio negativo característico del Vte. La<br />
corriente de cortocircuito de la figura 8B muestra de igual manera que no se produjo<br />
cambio en la corriente negativa antes y después del tratamiento con NFA (-73 ± 24 µA<br />
cm -2 y -81 ± 21 µA cm -2 respectivamente).<br />
50
Vte ( mV)<br />
-4<br />
-6<br />
-8<br />
-10<br />
-12<br />
-14<br />
��Isc (���cm -2 )<br />
20<br />
0<br />
-20<br />
-40<br />
-60<br />
-80<br />
-100<br />
-120<br />
NFA (ap)<br />
Carbacol (bl) Carbacol (bl)<br />
Carbacol Basolateral<br />
NFA<br />
150<br />
5 min<br />
Carbacol<br />
Figura 8. Efecto del NFA sobre la secreción de cloruro inducida por carbacol en<br />
colon de ratón silvestre. En la figura A después de aplicar el primer estímulo con<br />
carbacol se adicionó el inhibidor NFA seguido de un segundo estímulo con carbacol, no<br />
observando ningún cambio en el Vte. En B resumen de las corrientes de cortocircuito<br />
calculadas para los dos estímulos con carbacol (-73 ± 24 µA cm -2 y -81 ± 21 µA cm -2<br />
para I yII respectivamente),valores son promedio ± error estándar, con un n=3.<br />
51<br />
NFA + Carbacol
4.2.2 EFECTO DEL UTP SOBRE Vte Y Isc.<br />
El efecto de los agonistas purinergicos como el ATP o UTP producen una rápida<br />
acumulación de inositol fosfato en células epiteliales de las vías respiratorias de los<br />
seres humanos, siendo UTP el agonista más potente (Brown et al., 1991). El efecto de<br />
estos agonistas se debe a su interacción con los receptores purinergicos (P2). En<br />
mamíferos los receptores P2 se subdividen en P2X y P2Y. Este último se expresa en<br />
tejidos epiteliales, siendo los receptores P2Y2 y P2Y4 los responsable de la interacción<br />
con el agonista UTP (Matos et al., 2005).<br />
Existe evidencia de que pone de manifiesto la interacción del agonista UTP con el<br />
receptor P2Y2 provoca la activación de conductancias de cloruro dependientes de<br />
calcio intracelular en el epitelio de la vía respiratoria (Paradiso et al., 2001).<br />
En el epitelio intestinal se ha demostrado la expresión del receptor P2Y4 y siguiendo los<br />
antecedentes recopilados se utilizó el agonista purinergico UTP para provocar una<br />
activación de la conductancia de cloruro dependiente del aumento de calcio intracelular.<br />
Los resultados de las figura 9A muestran el comportamiento del Vte bajo el estímulo del<br />
UTP. La figura 9B muestra un experimento semejante pero en un tejido previamente<br />
tratado con NFA. En ambos casos hay una pequeña deflexión negativa en el Vte<br />
consistente con una secreción aniónica. El resumen de la corriente de cortocircuito,<br />
(figura 9C), mostró para ambos casos un pequeña corriente negativa no registrando<br />
diferencias para el tratamiento sólo con UTP (-5 ± 1 µA cm -2 ) o habiendo incubado con<br />
NFA (-5 ± 1 µA cm -2 ).<br />
52
V te ( mV)<br />
1<br />
0<br />
-1<br />
-2<br />
��Isc (���cm -2 )<br />
Figura 9. Efecto de UTP sobre la secreción de cloruro en colon de ratón<br />
silvestre.. En la figura A registro del Vte después de aplicar UTP basolateral. En B se<br />
aplicó NFA apical previo al estímulo con UTP no mostrando diferencias en el Vte. En C<br />
resumen de las corrientes de cortocircuito calculadas para los dos estímulos con UTP,<br />
(-5 ± 1 µA cm -2 ) o (-5 ± 1 µA cm -2 ) para I y II respectivamente, valores son promedio ±<br />
error estándar, con un n=3.<br />
2<br />
0<br />
-2<br />
-4<br />
-6<br />
-8<br />
UTP (bl)<br />
2 min<br />
Vte ( mV)<br />
1<br />
0<br />
-1<br />
-2<br />
UTP Basolateral<br />
I<br />
II<br />
NFA (ap)<br />
UTP (bl)<br />
UTP<br />
2 min<br />
NFA + UTP<br />
53
4.3 EFECTO DE AGONISTAS DE CALCIO INTRACELULAR SOBRE LA<br />
DIFERENCIA DE POTENCIAL TRANSEPITELIAL Y LA CORRIENTE DE<br />
CORTOCIRCUITO EN COLON DISTAL DE RATONES KO PARA CFTR.<br />
4.3.1 EFECTO DE CARBACOL SOBRE Vte Y Isc.<br />
Los experimentos anteriormente realizados mostraron la acción de del agonista<br />
muscarínico carbacol sobre el epitelio colónico de ratones silvestre. En la figura 10 se<br />
sigue el protocolo establecido en la figura 5, para comparar las respuestas secretorias<br />
del tejido epitelial del colon de ratones silvestres y ratones KO para CFTR. La figura<br />
10A muestra un registro representativo de Vte del segmento distal de colon de ratón<br />
silvestre. Cuando se repitió este experimento utilizando tejido de colon de animales KO<br />
para CFTR (figura 10B), la aplicación de IBMX/forskolina para aumentar el cAMP tisular<br />
y el bloqueo de la secreción aniónica con cromanol 293 B no produjo ningún cambio en<br />
el Vte, lo cual es consistente con la ausencia de la conductancia de cloruro dependiente<br />
de CFTR. Luego se procedió a estimular el tejido con carbacol basolateral. A diferencia<br />
del colon de animal silvestre, en este tejido se observó una total ausencia del cambio de<br />
Vte negativo (secreción aniónica) y en su lugar aparece un transitorio cambio positivo de<br />
la Vte. Este cambio positivo en Vte corresponde a una corriente secretoria de potasio.<br />
54
Vte ( mV)<br />
Vte ( mV)<br />
-3<br />
-7<br />
-11<br />
-15<br />
6<br />
2<br />
-2<br />
-6<br />
-10<br />
1<br />
��Isc (���cm -2 )<br />
IBMX / Forskolina (bl)<br />
100<br />
50<br />
-50<br />
-100<br />
-150<br />
Figura 10. Secreción de cloruro inducida por carbacol en colon distal de ratón<br />
silvestre y KO para CFTR. En la figura A y B se muestran registros de Vte en colon de<br />
ratón silvestre y KO para CFTR respectivamente, mostrando en B la ausencia de<br />
secreción de cloruro y la presencia de secreción de potasio. En C se resumen las<br />
corrientes de cortocircuito calculada para la aplicación IBMX/forskolina y carbacol en<br />
tejido de animales silvestre y KO para CFTR. Valores (detallados en pag. 56) son<br />
promedio ± error estándar, n=3 para cada grupo.<br />
0<br />
Cromanol 293 B (bl)<br />
Carbacol (bl)<br />
5 min<br />
IBMX / Forskolina (bl)<br />
Cromanol 293 B (bl)<br />
Carbacol (bl)<br />
5 min<br />
IBMX/<br />
Forscolina Carbacol<br />
55<br />
Silvestre (WT)<br />
Knockout (KO)
En la figura 10C se resumen las diferencias de la corriente de cortocircuito calculadas<br />
donde se puede observar que la secreción de cloruro es activada por IBMX/forskolina<br />
en animales silvestre (-105 ± 32 µA cm -2 ) y en el caso de los animales KO no se registra<br />
activación (0 ± 0 µA cm -2 ). Para el caso de la activación de la secreción aniónica con<br />
carbacol, los animales silvestre mostraron una robusta secreción de cloruro (-114 ±<br />
30 µA cm -2 ), a diferencia de los animales KO, los cuales mostraron corrientes positivas<br />
asociadas a secreción de potasio (44 ± 20 µA cm -2 ).<br />
56
4.3.2 EFECTO DEL UTP SOBRE Vte Y Isc.<br />
Como en todos los demás ensayos el tejido epitelial se trató previamente con<br />
(amilorida, indometacina, TTX), con el fin de proporcionar los mismas condiciones<br />
experimentales. En la figura 11 se presentan los resultados de este experimento. En<br />
primer lugar, la figura 11A muestra el efecto del UTP por el lado basolateral del tejido<br />
epitelial silvestre. Se aprecia un pequeño cambio negativo en el Vte, lo que es<br />
consistente con una secreción aniónica.<br />
La figura 11B, se procedió a repetir el mismo procedimiento descrita en la figura 9A<br />
pero en epitelio de ratones KO para el canal CFTR. Como se puede apreciar no existe<br />
ninguna variación en el Vte una vez que se adicionó el agonista purinérgico. El resumen<br />
de las diferencias de corriente de cortocircuito calculadas de la figura 11C muestra, en<br />
los animales silvestre, una pequeña corriente negativa debido al estímulo con UTP (-5 ±<br />
1 µA cm -2 ), en el caso de los animales KO no se registraron corrientes posterior al<br />
estímulo (0 ± 0 µA cm -2 ).<br />
57
V te ( mV)<br />
1<br />
0<br />
-1<br />
-2<br />
��Isc (���cm -2 )<br />
UTP (bl)<br />
2<br />
0<br />
-2<br />
-4<br />
-6<br />
-8<br />
2 min<br />
Figura 11. Efecto de UTP en la secreción de cloruro en colon de ratón silvestre y<br />
KO para CFTR. En A y B se muestra el registro de Vte en colon silvestre y KO para<br />
CFTR respectivamente, en tejidos tratados previamente con indometacina, amilorida,<br />
TTX, que fueron estimulados con UTP. En C se resumen las corrientes de cortocircuito<br />
calculadas para las corrientes de cloruro. Valores (detallados en la pag. Anterior) son<br />
Vte ( mV)<br />
promedio ± error estándar, n=3 para cada grupo.<br />
2<br />
1<br />
0<br />
-1<br />
-2<br />
-3<br />
UTP Basolateral<br />
silvestre<br />
Knockout<br />
(KO)<br />
UTP (bl)<br />
2 min<br />
58
4.4 IDENTIDAD MOLECULAR DE LOS POSIBLES CANDIDATOS RESPONSABLES<br />
DE LA SECRECIÓN DE CLORURO ACTIVADA POR CALCIO INTRACELULAR.<br />
Como se mencionó anteriormente, la conductancia al cloruro activada por calcio ha sido<br />
caracterizada fisiológicamente en varios tipos celulares incluyendo epitelios, poco es lo<br />
que se conoce acerca de la identidad molecular de estos canales. La potencial ventaja<br />
de esta identificación incluye, entre otras, el estudio del rol fisiológico y patofisiológico,<br />
un estudio en detalle de la función estructural y una identificación de potenciales<br />
inhibidores específicos. Al menos tres proteínas han sido propuestas como candidatos<br />
moleculares homólogos de CaCCs:<br />
La familia de genes CLCA es una familia heterogénea de multigenes con patrones de<br />
expresión específicos del tipo celular, diversidad de procesamientos y estructuras<br />
proteicas en los diferentes miembros de la familia (Loewen & Forsyth, 2005).<br />
La evidencia que la familia CLCA se postule como candidato proviene de las<br />
expresiones heterólogas de un número de isoformas de CLCA en sistemas celulares,<br />
registrando el primer clonamiento en el año 1995 desde una genoteca traqueal de<br />
bovino, mostrando como resultados conductancias activadas por calcio, y estas a su<br />
vez sensibilidad a bloqueadores de canales de cloruro como por ejemplo en NFA<br />
(Cunningham et al., 1995;Gruber et al., 1998a).<br />
A la fecha, la familia CLCA comprende 18 miembros conocidos de los cuales 6 están<br />
presentes en el ratón (mCLCA) (Bothe et al., 2008).<br />
59
Existe un segundo candidato al cual se le atribuye la responsabilidad de activar<br />
conductancias de cloruro dependientes de calcio, denominado Bestrofinas, una proteína<br />
involucrada en la enfermedad macular viteliforme (VMD). En contraste a otros<br />
candidatos moleculares, no existe un conocimiento detallado sobre las propiedades<br />
biofísicas ni se dispone de su estructura molecular.<br />
Las Bestrofinas parecen comportarse como canales de cloruro en sistemas de<br />
expresión heteróloga. Así, las de varias especies forman canales que se activan en<br />
EC50 de calcio de 200 nM (Tsunenari et al., 2003;Qu et al., 2003a). La evidencia más<br />
convincente de que las bestrofinas son efectivamente canales de cloruro proviene de<br />
experimentos de mutagénesis sitio-dirigidas que demuestran una alteración de la<br />
selectividad y la conductancia de los canales asociados a la expresión de mBest-2 (Qu<br />
et al., 2004;Qu & Hartzell, 2004).<br />
Recientemente, ha sido propuesta la familia de proteínas de membrana<br />
Anoctamina/TMEM16 como canales de cloruro activados por calcio, donde al menos<br />
tres publicaciones reportan a la proteína TMEM16A como un buen candidato (Yang et<br />
al., 2008;Schroeder et al., 2008a;Caputo et al., 2008b). Yang y colaboradores<br />
describieron una proteína con 8 segmentos de transmembrana, la cual co-expresada<br />
con receptor de endotelina A en células HEK293, obtuvo una corriente típicamente<br />
selectiva de canales de cloruro activados por calcio, la cual fue inhibida por<br />
bloqueadores de canales de cloruro, como NFA.<br />
60
El silenciamiento por siRNA o sobreexpresión por transfección del cDNA de la proteína<br />
TMEM16A, demostró una disminución y aumento, respectivamente, de la corriente de<br />
membrana, encontrando que esta propiedad biofísica se asemeja a la clásica corriente<br />
de cloruro activada por calcio en varios tipos celulares (Caputo et al., 2008b).<br />
De acuerdo a esta información, se procedió a identificar los distintos transcritos<br />
correspondientes a la familia CLCA, Bestrofinas y TMEM16 en el epitelio colónico de<br />
ratón. Los resultados obtenidos mostraron para el caso de la familia CLCA los<br />
transcritos correspondientes a mCLCA1, mCLCA2, mCLCA3, mCLCA4 y mCLCA6<br />
(figura 12). La figura 12 muestra la expresión de los transcritos correspondientes a la<br />
familia de las Bestrofinas, en donde se aprecia la expresión de Vmd2, Vmd2/1 y<br />
Vmd2/3. En el caso de la familia de los TMEM16, se determinó la expresión de siete<br />
transcritos, TMEMs A, B, E, F, G, J y K (figura 13).<br />
61
750<br />
50<br />
500<br />
250<br />
Figura 12. Detección por RT-PCR del mRNA para los miembros de la familia<br />
mCLCA y VMD en tejido de colon distal. Se utilizaron los partidores específicos<br />
detallados en la table III para familia mCLCA y IV para familia VMD. Ladder<br />
corresponde a 1-kb, luego mCLCA1 (606 bp), mCLCA2 (855 bp), mCLCA3 (699 bp),<br />
mCLCA4 (290 bp), mCLCA5 (263 bp), mCLCA6 (221 bp), Vm2/1 (249 bp), Vm2/3 (249<br />
bp), Vm2 (249 bp).<br />
750<br />
50<br />
500<br />
250<br />
62
TMEM16<br />
Figura 13. Detección por RT-PCR del mRNA para los miembros de la familia<br />
TMEM16 en tejido colónico. Se utilizaron los partidores específicos detallados en la<br />
table V. Ladder corresponde a 1-kb, luego TMEM16A (324 bp), TMEM16B (330 bp),<br />
TMEM16C1 (341 bp), TMEM16C2 (320 bp), TMEM16D (493 bp), TMEM16E (226 bp),<br />
TMEM16F (380 bp), 1-kB ladder, TMEM16G (248 bp), TMEM16H (296 bp), TMEM16J<br />
(374 bp), and TMEM16K (329 bp). Control de los experimentos se llevaron a<br />
cabo utilizando muestras de cerebro y de epitelio olfativo para comprobar la habilidad<br />
de los partidores de amplificar el producto esperado.<br />
Ladder<br />
63<br />
500 pb<br />
250 pb
5. DISCUSIÓN<br />
El colon de mamífero interviene en diversos procesos homeostáticos, tales como el<br />
balance hidrosalino, la osmorregulación y la regulación del volumen plasmático. Para<br />
éstas funciones fisiológicas el epitelio colónico cuenta con la maquinaria celular<br />
necesaria para absorber y secretar electrolitos. Sus células, polarizadas, disponen de<br />
canales iónicos y diversos tipos de bombas e intercambiadores ubicados<br />
estratégicamente en los dominios apical y basolateral. Defectos en la regulación de sus<br />
funciones puede producir estados patológicos como diarrea, estreñimiento o<br />
enfermedades, como la CF (mutaciones en canal CFTR) (Grubb & Gabriel,<br />
1997;Kunzelmann & Mall, 2002).<br />
La alteración del tracto gastrointestinal debido a la CF transforma la superficie epitelial.<br />
El déficit de la secreción produce una insuficiente hidratación apical que favorece la<br />
formación de un contenido mucoso viscoso, lo que como consecuencia puede generar<br />
una severa obstrucción intestinal (Greger, 2000;Brouillard et al., 2005). Estas<br />
obstrucciones intestinales se presentan en aproximadamente un 15 <strong>–</strong> 20% de los<br />
pacientes recién nacidos y en un 25% de los pacientes adultos con CF (Canale-<br />
Zambrano et al., 2007).<br />
Obstrucción intestinal con resultado de muerte es característica que se observa en los<br />
ratones con mutación en CFTR. En muchos casos, la caracterización de ratones<br />
mutantes para CFTR han revelado anormales perfiles electrofisiológicos (Donald J.<br />
Davidson et al., 2001)<br />
64
En nuestro trabajo el uso de uno de estos modelos nos muestra la severidad con la<br />
que se presenta la CF. De acuerdo a lo observado durante el análisis de la sobrevida<br />
realizado a nuestra colonia de ratones (figura 3), un gran porcentaje de los ratones<br />
CFTR KO murieron entre los 10 y los 30 días de edad, donde aproximadamente un<br />
40% de los ejemplares CFTR KO murieron antes de producirse el destete (día 21),<br />
manifestando a temprana edad complicaciones en el sistema digestivo, pese a basar su<br />
alimentación en una dieta líquida. Posteriormente al periodo de destete se vuelven a<br />
registrar decesos en aproximadamente un 40% para estos mismos ejemplares.<br />
Estos datos nos indican tanto la corta sobrevida como la severidad de las deficiencias<br />
sistémicas ocasionadas por la CF, entre las cuales, la obstrucción intestinal tiene la<br />
principal participación en la causa de muerte, sin importar el tipo de alimentación que<br />
estos reciban.<br />
Por otro lado, un pequeño porcentaje de los ratones CFTR KO (20% aproximadamente)<br />
mostraron una sobrevida por un periodo superior a los 60 días después de nacidos.<br />
Esta información nos indica que pese a que estos animales poseen una alteración<br />
genotípica potencialmente letal, presentan factores desconocidos que logran en algún<br />
grado compensar este defecto.<br />
Un fenotipo adicional de CF se observó en esta colonia de ratones, el cual involucra el<br />
defecto intestinal, este es el bajo peso corporal en comparación a la población CFTR<br />
nativa (figura 4). Estudios clínicos relacionan el porcentaje ideal del peso corporal con<br />
un pronóstico de aumento de sobrevida para los pacientes con CF.<br />
65
Al analizar en conjunto el peso corporal con la sobrevida de estos ejemplares,<br />
obtuvimos datos que nos permitieron diferenciar dentro de la colonia ratones silvestres<br />
de los CFTR KO, siendo este último grupo los que además mostraron diferentes<br />
características entre sí.<br />
Durante la evaluación pudimos notar que en el periodo previo al destete la totalidad de<br />
los ratones observados tenían una respuesta normal con respecto al aumento del peso<br />
corporal, no obstante, se logró percibir diferencias en el peso entre los ejemplares<br />
CFTR KO, mostrando algunos pesos similares al de los silvestres, mientras otros un<br />
peso notoriamente menor, proporcionando la idea de una condición fisiológica<br />
aparentemente normal.<br />
Sin embargo la respuesta al aumento de peso corporal posterior al paso de una<br />
alimentación líquida a una alimentación sólida se vio drásticamente afectada, estos<br />
resultados nos permitieron clasificar en tres distintos tipos nuestra colonia, en donde los<br />
animales silvestres continuaron con una esperada respuesta de aumento de peso<br />
corporal. En cuanto a los ejemplares que mostraron un pequeño tamaño corporal desde<br />
un comienzo, manifestaron grandes complicaciones para aumentar su peso corporal en<br />
esta segunda etapa dietética (CFTR KO tipo II), no logrando revertir la situación,<br />
llevándolos finalmente a la muerte, esto producto de la grave obstrucción intestinal.<br />
A la luz de estos resultados podemos sugerir que una causa adicional de esta<br />
deficiencia en la ganancia de peso corporal se trate de un problema de mala absorción<br />
como consecuencia de la obstrucción intestinal, lo cual se correlaciona con los datos<br />
obtenidos por (Rozmahel et al., 1996) Rozmahel et al., 1996, donde se menciona que<br />
el incremento de células goblet, en ratones con CF, producen y secretan cantidades<br />
66
alteradas de mucus hacia el lumen intestinal, lo cual puede influir en el peso corporal a<br />
través de la creación de una barrera física extra para la absorción de nutrientes.<br />
Estudios adicionales con respecto a la sobrevida de estos ratones CFTR KO podrían<br />
proporcionar nueva información. Tal vez modificando su dieta posterior al periodo de<br />
destete y basándola en una dieta líquida, se podría reducir la incidencia de esta letal<br />
complicación intestinal.<br />
Con respecto al tercer grupo de ejemplares, los CFTR KO tipo I, manifestaron un<br />
fenotipo distinto al CFTR KO tipo II. Observamos una respuesta fisiológica totalmente<br />
diferente (figura 4), muy similar a los ejemplares silvestre en cuanto a lograr ganar peso<br />
corporal en el tiempo así como al tiempo de sobrevida, pese a los cambios en el tipo de<br />
alimentación. Sin embargo los días iniciales sometidos a la dieta sólida provocaron una<br />
disminución de su peso, lo cual lograron superar aparentemente tras un periodo de<br />
adaptación.<br />
Una inhabilidad por parte del ratón CFTR KO tipo II de eliminar la obstrucción posterior<br />
al destete puede dar cuenta de sus niveles de mortalidad. Por otro lado, la posible<br />
habilidad de los ratones CFTR KO tipo I de eliminar esta obstrucción en momentos<br />
críticos pueda explicar su prolongada sobrevida.<br />
En primer lugar esto nos refleja que la CF puede ocurrir con grados de agresividad que<br />
van desde la sintomatología leve hasta la letalidad temprana, de acuerdo a esto<br />
podríamos estar ante la posible presencia de ciertos factores que ayudarían a<br />
compensar esta deficiencia.<br />
67
La pérdida de la funcionalidad del canal CFTR debido a mutaciones ha llevado a<br />
indagar en vías alternativas las cuales permitirían mejorar el fenotipo clínico presente en<br />
pacientes con CF. Una compensación para el anormal transporte iónico en este<br />
periodo quizás puede proporcionar una explicación para este estado, pero el factor<br />
modulador que confiere este leve fenotipo aún no han sido identificado.<br />
Estudios electrofisiológicos han señalado que la protección de estos ratones, de<br />
severas patologías intestinales, puede estar relacionada con el aumento de la expresión<br />
o actividad localizada apicalmente en este tejido, de una conductancia de cloruro<br />
activada por calcio, en donde se utilizaron animales modificados genéticamente, como<br />
es el caso de ratones KO para CFTR así como también en humanos (Wilschanski et al.,<br />
1996;Rozmahel et al., 1996;Bronsveld et al., 2000). La localización apical de esta<br />
conductancia sugiere que podrían cumplir una función protectora, a través de la<br />
modulación de la composición del fluido mucoso.<br />
La existencia de evidencias tanto a favor como en contra permite que aún persista la<br />
controversia con respecto a la participación de otros canales en la secreción de cloruro<br />
en el epitelio intestinal. Es así como autores sostienen que la activación de la secreción<br />
de cloruro dependiente del aumento de calcio intracelular necesita la activación del<br />
canal CFTR en la membrana apical (Grubb & Gabriel, 1997;Mall et al., 1998;Flores et<br />
al., 2007), esto en rata y ratón, así como también de la actividad de canales de potasio<br />
basolaterales dependientes de calcio (Strabel & Diener, 1995).<br />
68
El objetivo que se perseguía en este estudio era lograr identificar una conductancia al<br />
cloruro activada por calcio en epitelio intestinal silvestre de ratón, la cual actuaría como<br />
vía alternativa a la salida de cloruro de las células secretoras intestinales en la CF.<br />
Para poder identificar esta conductancia al cloruro dependiente del aumento de calcio<br />
intracelular utilizamos fármacos que se conoce puede activar este tipo de canales,<br />
como es el caso del agonista muscarínico carbacol y el agonista purinérgico UTP. En<br />
nuestros experimentos el estímulo producido por carbacol en epitelio de ratones<br />
silvestre, demostró una activación de secreción aniónica (figura 5) al igual que lo<br />
obtenido al estimular el epitelio con UTP (figura 9). Datos insuficientes para atribuirlos a<br />
un canal de cloruro activado por calcio.<br />
Debemos tener presente que en este tejido el canal CFTR se encuentra funcional y<br />
según datos previos la secreción intestinal de cloruro activada por calcio requiere de la<br />
activación simultánea del canal dependiente de cAMP , CFTR, en la membrana apical<br />
(Mall et al., 1998;Matos et al., 2005). Evidencia obtenida en nuestro laboratorio<br />
demostró que los canales de potasio activados por calcio (KCNN4) son responsables<br />
de la conductancia al potasio esencial para la secreción de cloruro activada por<br />
aumentos del calcio intracelular por estímulos de carbacol o histamina en el epitelio<br />
intestinal de ratón pero la secreción de aniones precisa de una activación previa del<br />
CFTR por cAMP (Flores et al., 2007).<br />
Un problema muy común en el análisis de respuestas electrofisiológicas en epitelio es<br />
que estas pueden contener contribuciones de otras corrientes aparte de la que a uno le<br />
interesa. El uso de estímulos apropiados en conjunto con una conveniente solución de<br />
69
egistro y bloqueadores de canales permite, en muchos casos, aislar la corriente de<br />
interés. Aunque hay muchos bloqueadores de canales catiónicos, existen relativamente<br />
pocos inhibidores de canales aniónicos.<br />
El uso de ovocitos de Xenopus ha proporcionado una útil herramienta en el estudio de<br />
propiedades moleculares en canales iónicos. Es en este sistema en el cual se describió<br />
por primera vez el bloqueo de canales de cloruro activados por calcio por compuestos<br />
(Fenamatos), dentro de los cuales se encontraba el NFA (White & Aylwin, 1990).<br />
Estudios en epitelio de las vías respiratorias han mostrado que aumentos intracelulares<br />
de calcio pueden estimular una secreción de cloruro transepitelial (Tarran et al., 2002).<br />
Para este epitelio, el uso del NFA ha mostrado ser un buen inhibidor (Gabriel et al.,<br />
2000a).<br />
Verificamos si la secreción aniónica activada por calcio en epitelio silvestre de ratón,<br />
correspondía al canal de cloruro dependiente de este catión por intermedio del inhibidor<br />
NFA, lo cual no mostró cambios en el Vte (figura 7 y 8), que nos llevaría a pensar que<br />
los CaCCs no se encontrarían presentes en el lado apical del epitelio intestinal.<br />
Como muchos de estos compuestos pueden tener efectos secundarios inespecíficos<br />
que pueden alterar una correcta interpretación de los resultados observados, la<br />
utilización del animal CFTR KO, como una aproximación alternativa al estudio de este<br />
canal en el intestino era una oportunidad que ofrecía muchas ventajas.<br />
Los experimentos realizados en ratones CFTR KO mostraron una completa ausencia<br />
de la secreción de cloruro dependiente de cAMP (figura 10), así como también una<br />
70
absoluta ausencia de secreción aniónica dependiente del aumento de calcio<br />
intracelular, ya sea mediante el estímulo con carbacol o UTP (figura 10 y 11<br />
respectivamente), lo que entonces nos estaría indicando que la secreción de cloruro<br />
observada en el epitelio silvestre es la correspondiente a la vía CFTR.<br />
El cambio positivo en el Vte, a consecuencia del estímulo con carbacol, en ausencia del<br />
canal CFTR, sugiere que un proceso secretor de potasio habría sido desenmascarado,<br />
la secreción catiónica observada en la (figura 10 B), correspondiente a secreción<br />
electrogénica de potasio dependiente de calcio, es atribuida totalmente a la actividad de<br />
canales KCNMA1 apicales (Sausbier et al., 2006), según estos reportes este canal de<br />
igual forma sería activado por UTP apical, datos que apoyan lo observado<br />
anteriormente en nuestro laboratorio.<br />
De acuerdo a estos datos, aparentemente la salida de cloruro desde los enterocitos por<br />
otra vía distinta a la proporcionada por CFTR se encontraría ausente. Esto en conjunto<br />
a los datos previos existentes en nuestro laboratorio, apoyarían la idea de que para el<br />
epitelio intestinal, la secreción de cloruro estaría mediada primeramente por la<br />
activación de canales de potasio dependientes de calcio lo que proporcionaría una<br />
hiperpolarización de la membrana favoreciendo indirectamente el flujo de cloruro por el<br />
incremento de la fuerza de conducción de este vía, apertura espontánea del canal<br />
CFTR, lo cual quiere decir que el canal CFTR no solamente es esencial para la<br />
secreción de cloruro dependiente de cAMP, sino que también para la secreción de<br />
cloruro dependiente del aumento de calcio intracelular, lo que concuerda con lo<br />
observado por otros autores (Clarke et al., 1994;Mall et al., 1998).<br />
71
Como se ha hecho notar en la introducción, desde el punto de vista molecular, existen<br />
evidencias en las que se demuestra la expresión de algunos miembros de la familia de<br />
proteínas CLCA (mCLCA3, mCLCA 6 en ratón) (Evans et al., 2004;Brouillard et al.,<br />
2005) y (hCLCA 1, hCLCA 4 en humanos) (Gruber et al., 1998a;Ritzka et al., 2004) en<br />
el epitelio intestinal. Pero existe gran escepticismo sobre la función de CLCAs como<br />
canales de cloruro (Eggermont, 2004).<br />
Sin embargo, en este trabajo se identificó la presencia de los transcritos<br />
correspondientes a la familia CLCA, Bestrofinas y TMEM16A en el epitelio intestinal de<br />
ratón por medio de RT-PCR. Estudios previos han demostrado, en el caso de la familia<br />
CLCA, la expresión de los transcritos en el intestino: mCLCA1/2 localizado en las<br />
criptas epiteliales (Gruber et al., 1998b), mCLCA 3 en granulos secretorios de las<br />
células caliciformes (Leverkoehne & Gruber, 2002), mCLCA 4 en células del músculo<br />
liso (Elble et al., 2002), para el caso de mCLCA 5 su expresión en el intestino hasta<br />
ahora es desconocida, mientras que mCLCA 6 se expresaría en las criptas del intestino<br />
grueso (Bothe et al., 2008) lo cual concuerda con la detección de los mismos<br />
transcritos en nuestro modelo de estudio.<br />
Para el caso de las Bestrofinas existen cuatro isoformas en el ratón, las que están<br />
codificadas por los genes Vmd2, Vmd2l1 hasta -3, con Vmd2l2 aparentemente<br />
correspondiendo a un pseudogen. Hay evidencia para la expresión de Vmd2 y Vmd2l1<br />
en el colon (Kramer et al., 2004), lo cual coincide con nuestros datos.<br />
La familia de proteínas TMEM16A actualmente es uno de los candidatos que corre con<br />
mayor ventaja para adjudicarse la función de canal de cloruro activado por calcio<br />
intracelular, numerosos estudios de expresión en diferentes epitelios apoyan esta<br />
72
candidatura. En nuestros ensayos de RT-PCR obtuvimos la expresión de varias<br />
isoformas en el epitelio intestinal (figura 13), sin embargo aún hay autores que<br />
sostienen que la expresión de esta proteína en este epitelio requiere mayores estudios<br />
(Yang et al., 2008;Rock et al., 2009b). Pese a toda la información disponible con<br />
respecto a esta familia de proteínas aún hay muchas interrogantes sin resolver, como la<br />
relación estructura-función, mecanismos de regulación y el significado fisiológico de<br />
cada una de las isoformas.<br />
La evidencia molecular proporcionada por los análisis de expresión nos llevaría a<br />
pensar que existe la posibilidad que el canal de cloruro dependiente de calcio pueda<br />
estar presente en el epitelio intestinal y cumplir una función fisiológica. La evidencia<br />
funcional acumulada apunta a que estos canales no participarían de la secreción de<br />
cloruro, esto debido a que probablemente su contribución a la secreción transepitelial<br />
sea muy pequeña o transiente y la razón por la cual no fue determinada su presencia<br />
en nuestros experimentos se deba al enmascaramiento sufrido por una fuerte activación<br />
del canal secretor de potasio (KCNMA1). Por otro lado no se puede descartar que la<br />
presencia de los canales CaCCs esté en el lado basolateral, por lo cual no cumpliría el<br />
hipotético rol altersilvestre en la deficiente secreción de cloruro en la CF.<br />
En conclusión, el colon del ratón no parece contar con canales aniónicos altersilvestres<br />
al CFTR disponibles para la secreción, lo que es consistentes con la gravedad de la<br />
enfermedad intestinal en esta especie.<br />
73
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