Mikroskopet
Mikroskopet
Mikroskopet
You also want an ePaper? Increase the reach of your titles
YUMPU automatically turns print PDFs into web optimized ePapers that Google loves.
<strong>Mikroskopet</strong><br />
Sebastian Frische
Okularer<br />
(typisk 10x forstørrelse)<br />
Objektiver, forstørrer 4x, 10x el. 40x<br />
Her placeres objektet<br />
(det man vil kigge på)<br />
Kondensor, samler lyset på<br />
objektet<br />
Lampe
Oversigt<br />
Forstørrelse og opløsningsevne<br />
Lysbølger og lysmikroskopi<br />
Fluorescensmikroskopi<br />
Fasekontrastmikroskopi<br />
Elektronmikroskopi
Forstørrelse<br />
“Forstørrelse udtrykkes ved forholdet mellem<br />
billedstørrelse og objektstørrelse i lineært mål”<br />
(Geneser s 34)<br />
Forstørrelsen er et tal, der fortæller hvor mange<br />
gange større en ting vises på et billede
1 cm<br />
Afstand på billedet: 50 cm<br />
Afstand på musen: 1 cm<br />
Forstørrelse (50/1) = 50x
10 cm<br />
Ved at indtegne en målestok på billedet får beskueren et umiddelbart<br />
indtryk af motivets virkelige størrelse
Mikroskopiske længder<br />
millimeter (mm): 1/1000 meter<br />
mikrometer ( m): 1/1.000.000 meter<br />
n<br />
nanometer (nm): 1/1.000.000.000 meter
Mikroskopiske længder<br />
millimeter (mm): 1/1000 meter<br />
mikrometer ( m): 1/1000 millimeter<br />
n<br />
nanometer (nm): 1/1000 mikrometer
Opløsningsevne<br />
“Opløsningsevnen er den mindste afstand 2<br />
objektpunkter må have fra hinanden, når de<br />
endnu skal kunne ses adskilt”<br />
Geneser s 34
d<br />
Opløsningsevnen (d) fortæller<br />
hvor små ting man kan se med mikroskopet<br />
d
<strong>Mikroskopet</strong><br />
Forstørrelse og opløsningsevne<br />
Lysbølger og lysmikroskopi<br />
Fluorescensmikroskopi<br />
Fasekontrastmikroskopi<br />
Elektronmikroskopi
Lysmikroskopi er baseret på lys<br />
Lys er elektromagnetisk stråling og kan beskrives<br />
både som bølger og som partikler (fotoner)
Lys som bølger<br />
Amplitude<br />
Bølgelængde<br />
En lysbølge har en bølgelængde og en amplitude.<br />
Dem ser vi som henholdsvis farve og intensitet.
Bølgelængden stiger fra blåt til rødt lys<br />
Omvendt falder frekvensen....lysets hastighed er konstant
Lys som fotoner<br />
Fotoner er “lysklumper”<br />
En foton har en bestemt bølgelængde (“farve”)<br />
Mængden og bølgelængden af fotoner fra en<br />
lyskilde bestemmer farven og intensiteten<br />
Hvidt lys indeholder fotoner med mange (alle)<br />
synlige bølgelængder<br />
Laser-lys indeholder kun fotoner med en<br />
bølgelængde
Lyset fra forskellige lyskilder er forskellige<br />
blandinger af fotoner<br />
Xe-lampe<br />
Antal fotoner<br />
Hg-lampe<br />
200 400 600<br />
Bølgelængde (nm)<br />
532<br />
Laser
Opløsningsevnen (d) i lysmikroskopi:<br />
objektiv<br />
d =<br />
0.61 x bølgelængde<br />
Numerisk Apertur (NA)<br />
1<br />
NA = n* sin(u)<br />
præparat<br />
u: “den halve topvinkel i den<br />
lyskegle der opfanges af<br />
objektivet” og<br />
n: brydningsindekset mellem<br />
dækglas og mediet mellem<br />
dækglas og objektiv<br />
Dækglas<br />
0<br />
sin(u)<br />
1<br />
Objektglas
Optimal opløsningsevne (lille d) fås således hvis<br />
bølgelængden er lille og NA er stor<br />
d =<br />
0.61 x<br />
bølgelængde<br />
NA
Jo større topvinkel, jo mere lys ind i objektivet fra hvert punkt...<br />
.....og jo større bliver det numeriske apertur (NA):<br />
NA = n* sin(u)
Brydningsindekset (n) mellem dækglas og mediet mellem dækglas og<br />
objektiv har også indflydelse på NA:<br />
...men hvis mediet og glasset har samme brydningsindeks og den<br />
halve topvinkel er 90 o (umuligt i praksis!) er NA maksimal:<br />
NA = n* sin(u)<br />
NA = 1.51* sin(90 o ) = 1.51*1 = 1.51
Maksimal opløsningsevne for lysmikroskopi:<br />
d =<br />
0.61 x bølgelængde<br />
1.51<br />
.....og da bølgelængden for synligt lys typisk er<br />
500 nm er den mindst opnåelige d = 200 nm =<br />
0.2 mikrometer
Lyset og objektet interagerer<br />
Noget af lyset reflekteres, noget<br />
absorberes og noget passerer<br />
igennem objektet<br />
Objekt<br />
Amplituden er blevet mindre<br />
- lysintensiteten er mindre<br />
Bølgelængden er ændret<br />
- vi ser en farveændring<br />
Der sker fase-forskydning<br />
- det kan vi ikke se!
Lyset og objektet interagerer<br />
Noget af lyset reflekteres, noget<br />
absorberes og noget passerer<br />
igennem objektet<br />
Objekt<br />
Amplituden er blevet mindre<br />
- lysintensiteten er mindre<br />
Bølgelængden er ændret<br />
- vi ser en farveændring<br />
Der sker fase-forskydning<br />
- det kan vi ikke se!
I påfaldende lys ser vi den del af det hvide lys, der reflekteres, hvilket<br />
afhænger af objektets overflade og indhold af pigmenter
Normal lysmikroskopi, gennemfaldende lys.<br />
Strukturer er synlige, da de absorberer forskellige dele af det hvide lys<br />
og derfor fremstår med forskelle i farve og intensitet (oftest skabt ved<br />
farvning af præparatet)
<strong>Mikroskopet</strong><br />
Forstørrelse og opløsningsevne<br />
Lysbølger og lysmikroskopi<br />
Fluorescensmikroskopi<br />
Fasekontrastmikroskopi<br />
Elektronmikroskopi
Normal lysmikroskopi<br />
En del af det hvide lys er blevet<br />
absorberet, og vi ser de bølgelængder,<br />
der slipper igennem<br />
Hvad sker der med det absorberede lys <br />
- omdannes til varme i objektet<br />
- genudsendes som lys i andre bølgelængder...fluorescens!
Fluorescens mikroskopi<br />
Filter<br />
Fluorescens opstår, når et stof efter at have absorberet<br />
en foton, udsender en anden foton (større bølgelængde)<br />
Ved brug af passende filtre, kan man nøjes med at se på<br />
det udsendte lys og på den måde udelukkende se<br />
fluorescensen.
Et fluorescerende stof exciteres i eet<br />
bølgelængdeområde og udsender lys i et andet.<br />
Excitationsspektrum<br />
Emissionsspektrum<br />
450<br />
500 550<br />
Bølgelængde (nm)
fluorescens mikroskop<br />
laser konfokal mikroskop<br />
Kviksølv-lampe<br />
laser<br />
dikroisk spejl<br />
blænde<br />
excitationsfilter<br />
emmissionsfilter<br />
okular<br />
dikroisk spejl<br />
pinhole<br />
pinhole<br />
emmissionsfilter<br />
PMT<br />
objektiv<br />
præparat<br />
objektiv<br />
Dækglas<br />
Objektglas
Fluorescensmikroskopi<br />
(inkl. konfokal mikroskopi)<br />
Kun stoffer, der udsender fluorescenslys<br />
med det valgte excitationslys er synlige<br />
Man må altså få fluorescerende stoffer<br />
bunder til bestemte dele af præparatet<br />
Metoder:<br />
- kemiske prober<br />
- antistoffer bundet til fluorescerende<br />
stoffer<br />
- genetisk manipulation af den<br />
organisme vævet kommer fra
Objektglas
To-foton laser konfokalmikroskopi: LIVE in vivo<br />
Interdigiterende dendritiske celler<br />
Th (CD4+) lymfocytter<br />
Figur fra Bousso: Nature Reviews Immunology, 8, September 2008
<strong>Mikroskopet</strong><br />
Forstørrelse og opløsningsevne<br />
Lysbølger og lysmikroskopi<br />
Fluorescensmikroskopi<br />
Fasekontrastmikroskopi<br />
Elektronmikroskopi
Mørkefeltsmikroskopi
Det afbøjede lys er faseforskudt<br />
Objekt<br />
faseforskydning<br />
Et fasekontrastmikroskop kan oversætte forskydning af<br />
fase til ændringer i amplitude, altså intensitetsforskelle.<br />
Nobel-prisen i fysik i 1953 gik til hollænderen Fritz<br />
Zernike for opdagelsen af fasekontrast og opfindelsen<br />
af fasekontrastmikroskopet
Princippet bag fasekontrast<br />
Lys fra lampen på<br />
objektet<br />
Noget af lyset afbøjes og ændrer<br />
fase efter kontakt med objektet.<br />
Dette er dog den mindste del, og<br />
faseskiftet er oftest meget lille<br />
Det upåvirkede lys dæmpes og<br />
forskydes 1/2 bølgelængde. Dette<br />
forøger effekten p.g.a interferens<br />
Objekt<br />
faseforskydning<br />
faseplade<br />
faseforskydning<br />
Interferens mellem de to lysstråler skaber kontrasten, der viser hvor<br />
meget lys, der er blevet faseforskudt de forskellige steder i præparatet.
Fasekontrast kræver ikke farvning og kan<br />
derfor bruges til levende celler
<strong>Mikroskopet</strong><br />
Forstørrelse og opløsningsevne<br />
Lysbølger og lysmikroskopi<br />
Fluorescensmikroskopi<br />
Fasekontrastmikroskopi<br />
Elektronmikroskopi
Elektronmikroskopi er baseret<br />
på elektronstråler<br />
Elektronstråler har en meget kort bølgelængde<br />
(0,005 nm, hvor lys typisk har 500 nm, altså<br />
100000x kortere bølgelængde)<br />
......hvad betyder det for opløsningsevnen ved<br />
elektronmikroskopi<br />
Tyskeren Ernst Ruska konstruerede i 1933 som den<br />
første et elektronmikroskop....27 år gammel!<br />
- I 1986 fik han Nobel-prisen i fysik for det.
To typer elektronmikroskopi<br />
Transmission (TEM)<br />
Scanning (SEM)
Opløsningsevnen ved elektronmikroskopi er<br />
langt bedre end ved lysmikroskopi på grund af den<br />
langt mindre bølgelængde<br />
Optimal TEM opløsningsevne: 0.2 nm<br />
...men præparater skaber også støj, så:<br />
Typisk TEM opløsningsevne: 2 nm
Opløsningsevne<br />
Det blotte øje: 0,2 millimeter<br />
Lysmikroskopi : 0,2 mikrometer<br />
Elektronmikroskopi 0,2 nanometer<br />
(2 nanometer i praksis)
Transmissions elektronmikroskopi (TEM)<br />
Elektroner frigives fra katoden og accelleres<br />
med 70 - 300 kV mod anoden<br />
Elektromagnetiske linser (spoler) styrer<br />
strålen i en lufttom cylinder<br />
Objektet skal være meget tyndt (50 nm) for<br />
at elektronerne kan trænge igennem<br />
Billedet vises på en fluorescerende skærm,<br />
optages på film eller med CCD-kamera.<br />
Det viser objektets gennemtrængelighed for<br />
elektroner.
TEM giver meget<br />
detaljerede oplysninger<br />
om cellers indre struktur<br />
Tynde snit nødvendige,<br />
- og farvning for at opnå<br />
god kontrast<br />
Maunsbach, FG fig. 2:19
Scanning elektronmikroskopi (SEM)<br />
En system af elektromagnetiske linser får<br />
elektronstrålen til at scanne hen over objektet<br />
En detektor opfanger elektroner, der reflekteres<br />
af overfladen.<br />
Signalet fra detektoren forstærkes og vises på<br />
en skærm, der scanner i takt med elektronstrålen<br />
på objektet.<br />
Dette resulterer i et billede af objektets overflade
SEM giver detaljerede billeder af cellers<br />
overflader<br />
Verlander et al. 1987, AJP-Renal 253:1142-1156
<strong>Mikroskopet</strong><br />
Forstørrelse og opløsningsevne<br />
Lysbølger og lysmikroskopi<br />
Fluorescensmikroskopi<br />
Fasekontrastmikroskopi<br />
Elektronmikroskopi
Tak for idag
Change language