vantarakis - Εταιρεία Μελέτης Μικροβιολογικής Ποιότητας Υδάτων

watermicro.gr

vantarakis - Εταιρεία Μελέτης Μικροβιολογικής Ποιότητας Υδάτων

ΜICROBIAL SOURCE TRACKINGΚΑΙ ΕΚΤΙΜΗΣΗ ΚΙΝΔΥΝΟΥ ΤΗΣ ΠΟΙΟΤΗΤΑΣΤΟΥ ΝΕΡΟΥΑπόστολος Βανταράκης (avantar@med.upatras.gr)Πρόεδρος Εταιρείας Μελέτης Μικροβιολογικής Ποιότητας Υδάτων (www.watermicro.gr)Επικ. Καθηγητής ΥγιεινήςΙατρική Σχολή,Παν/μιο Πατρών


«Η βελτίωση της Δημόσιας Υγείας, μπορεί ναεπιτευχθεί, μέσω της πρόληψης αλλά και τουελέγχου των περιβαλλοντικών συνθηκών,γεγονός που θα οδηγήσει και στην πρόληψη τωννοσημάτων».


• Η ταυτοποίηση και τυποποίηση ενόςμικροοργανισμού είναι σημαντική για τηνπρόληψη, τη διάγνωση, και τη θεραπείατων μολυσματικών ασθενειών.• Ο προσδιορισμός των διαφορετικώνστελεχών ενός είδους είναι σημαντικός γιαεπιδημιολογικούς λόγους.


ΠρόληψηΚίνδυνος


Μετρήσεις Κοπρανώδους Μόλυνσης• Μικροβιακοί “Κοπρανώδεις δείκτες” .▫ Αντιπροσωπεύουν το γεγονός κοπρανώδους μόλυνσης.▫ Βακτήρια από το εντερικό περιεχόμενο των ζώων• Παραδοσιακές τεχνικές▫ Παρουσία /Απουσία▫ Αριθμός/όγκο νερού


Παραγωγή κοπράνων στις Η.Π.Α (EPA 2007)1x10 12 kg/year


Συνεισφορά από τα άγρια ζώα


Συνεισφορά από ζώα εκτροφής


Microbial Source Tracking _ΣτόχοςΑντιστοίχιση μικροβίου που απομονώθηκε από τονερό με μικρόβιο που απομονώθηκε από μιαζωική πηγή για να καθοριστεί η προέλευση τηςπεριττωματικής ρύπανσης.


Πότε είναι χρήσιμες οι τεχνικές MST;• Για να συμπληρωθούν υγειονομικές έρευνες:Ταυτοποίηση πηγών μόλυνσης σε αποδέκτες• Για ανάλυση κινδύνου:Ανθρώπινη εναντίον μη ανθρώπινηςΑνθρώπινη εναντίον οικιακών ζώων


Που βασίζεται η MST?Εντερικά μικρόβια ζωικών ομάδων έχουν διαφορές εξαιτίας :• Συνθήκες στον εντερικό σωλήνα• Θερμοκρασία• Δίαιτα• Πεπτικό Σύστημα• Φυσική Επιλογή• Θρεπτικά συστατικά


Απόφαση για MST• Είναι το πρόβλημα επαρκώς καθορισμένο?• Υπάρχει επαρκής υγειονομική παρακολούθηση?• Πόσες πηγές έχουν ταυτοποιηθεί?• Είναι η περιοχή μελέτης μεγάλη?• Ποιο είναι τό επίπεδο διάκρισης ?


“Δείκτες ταυτοποίησης πηγών μόλυνσης”• ΟρισμόςΜικροβιακοί πληθυσμοί που είναι χαρακτηριστικοί σε ένασυγκεκριμένο ζωικό ξενιστήΤα ιδανικά μικρόβια• Δείχνουν εξειδίκευση στο ξενιστή• Άφθονα στο ξενιστή• Σταθερότητα στο ξενιστή• Γεωγραφική συνέχεια


MST τεχνική• Ταξινόμηση• Ποιοτικά vs. Ποσοτικά χαρακτηριστικά• Φαινοτυπικές vs. Γενοτυπικές• Library-dependent vs. Library-independent


Method Advantages DisadvantagesFecal coliform/fecal streptococus ratioEasy to perform; may be useful for recentcontaminationVariable survival rates of fecalstreptococci can alter ratioBifidobacterium sp.B. fragilis HSP40 bacteriophageF RNA bacteriophageHuman enteric virusMARPFGEBOX-PCRRibotypingBacteroides-Prevotella molecularmarkerCaffeineFecal sterols and/or stanolsSorbitol fermenters may be human specificVery human specific; easy to performGroups are well-correlated with source; easy toperformHuman specific; Direct monitoring forpathogen circumvents need to use indicatorsRapid;Can be used to discriminate isolatesfrom multiple animal sourcesExtremely sensitive to minute geneticdifferencesRapid; easy to performHighly reproducible; some methods useful forclassifying isolates from multipleSourcesDoes not require culturing of organism;PCR method is rapid, easy to performUseful for assessing impact from humansewageSome sterols/stanols have greater specificityfor humans and/or animalsLow numbers present in environment; variablesurvival rates; culture methods not well-definedNot present in sewage in some areasUnreliable in marine and tropicalwaters due to variable survival ratesLow numbers in the environment; Labor intensive;more sensitive methods neededRequires reference database; may begeographically specific; isolates that show noantibiotic resistance cannot be typedMay be too sensitive to broadlydiscriminate for source trackingReproducibility a concern; referencedatabase required; may be geographically specificLabor-intensive; reference databaserequired; may be geographically specific;variations in methodology existLittle is known about survival anddistribution in water systems; currently notapplicable to all animalsMinute quantities in the environment makesensitivity an issue; requires expensive analysesPresent naturally in sediments; requires expensiveanalyses; Low prevalence makes sensitivity anissue


Τεχνικές που απαιτούν δημιουργία βιβλιοθήκηςΒιβλιοθήκη=“Fingerprint” database of E. coli ήάλλων κοπρανωδών εντεροκόκκωνΑπαιτεί 1,000 βακτήρια που να έχουν απομονωθείαπό το νερό και τις ύποπτες ζωικές πηγέςΕξαρτώνται από τις καλλιεργητικές τεχνικές


Τεχνικές που απαιτούν δημιουργία βιβλιοθήκης


Μέθοδος που εξαρτάται από τη δημιουργία βιβλιοθήκηςΑνάλυση ανθεκτικότητας σε αντιβιοτικά (MAR)


Πλεονεκτήματα της ARA• Εύκολη τυποποίηση• Εύκολη πραγματοποίηση• Εύκολη ερμηνεία αποτελεσμάτων• Όχι ακριβή


Μειονεκτήματα ARA• Χαρακτηριστικό που μεταφέρεται• Γεωγραφική ειδικότητα• Προσωρινά ειδική• Εξαρτάται από καλλιέργειες


Randomly Amplified Polymorphic DNA (RAPD)‣ Τεχνική που έχει χρησιμοποιηθεί σε περιβαλλοντικά δείγματα.‣ Χρησιμοποιούνται τυχαίοι εκκινητές (συνήθως 10μερήολιγονουκλεοτίδια) που μπορούν και υβριδίζονται σε διάφορασημεία του γενετικού υλικού.‣ Αποτέλεσμα είναι η δημιουργία ζωνών χαρακτηριστικών ανάλογαμε το στέλεχος.‣ Η ταυτοποίηση και τυποποίηση του στελέχους γίνεται ανάλογα μετο είδος και τον αριθμό των ζωνών που προκύπτουνΠλεονεκτήματα: Δεν απαιτείται γνώση της αλληλουχίας του DNA,μπορεί να εφαρμοστεί σε οποιοδήποτε μικροοργανισμό, ταχείατεχνική (48 ώρες), όχι ιδιαίτερα ακριβή, εύκολη στην εφαρμογήτης.Μειονεκτήματα: Επαναληψιμότητα των αποτελεσμάτων


RAPD στα είδη της Pseudomonas spp.


Ανίχνευση μυκοβακτηριδίωνFigure 1. PCR product (439 bp) with use of primers by the gene hsp65.Lane 1: φX174 x HaeIII (1353, 1078, 872, 603, 310, 281, 271, 234, 194, 118,72 bp),Lane 4: negative control, Lane 2,3,5,6,7 PCR products (439 bp) Lane 2: 10 2 cfu/ml, Lane3: 10 3 cfu/ml, Lane 5:10 4 cfu/ml, Lane 6: 10 cfu/ml Lane 7,8,9: PCR products after preenrichmentof the sample, 1 cfu/ ml, 10 cfu/ ml and 100 cfu/ ml correspondingly.


Περιβαλλοντικά μυκοβακτηρίδια που έχουν ανιχνευτεί στο νερόUpper Gel: PCR productsdigested by Bst EIIBottom Gel: PCR productsdigested by Hae IIILane 1:Marker φX174 x HaeIIILane 2: M. chelonaeLane 3: M. chelonaeLane 4: UnidentifiedLane 5: M. gordonaeLane 6: M. chelonaeLane 7: M. gastrii/M. kansasiiLane 8: M. chelonaeLane 9: M. gordonae


Αλγόριθμος για την ταυτοποίηση τωνμυκοβακτηριδίων (Adapted by Telenti et al.)


Συγκριτικός πίνακας μεθόδων τυποποίησηςΜέθοδοι τυποποίησηςΙκανότητατυποποίησηςΑναπαραγωγιμότηταΕυκολίαεφαρμογήςΦαινοτυπικές μέθοδοιΒιότυποιΑνθεκτικότητα σε αντιβιοτικάΕύρεση ορότυπουΤυποποίηση με βακτηριοφάγουςΗλεκτροφόρηση με Multi-locus EnzymeΌλαΌλαΤα πιο σημαντικάΠοικίληΤέλειαΜέτριαΜέτριαΚαλήΜέτριαΚαλήΤέλειαΤέλειαΚαλήΜέτριαΚαλήΓονοτυπικές τεχνικές‣Plasmid profile analysis‣Ανάλυση με ένζυμα περιορισμού‣Ανάλυση ριβότυπου‣Ηλεκτροφόρηση μεταβαλλόμενου πεδίου‣PCR-Ribotyping‣PCR-REA‣RAPD‣SequencingΚαλήΌλαΌλαΌλαΌλαΌλαΌλαΌλαΚαλήΚαλήΚαλήΆριστηΚαλήΚαλήΠολύ καλήΚαλήΆριστηΆριστηΚαλήΚαλήΠολύ καλήΠολύ καλήΠολύ καλήΜέτρια


Library Dependent Method: rep-PCR DNA FingerprintPatterns (Dombek et al.,2000)


Τεχνικές ανεξάρτητες από την παρουσία Βιβλιοθήκης• Phage typing• Gene specific PCR• Total community analysis• Host-specific PCR


Πλεονεκτήματα Host-Specific PCR• Ανεξάρτητη από καλλιέργεια• Δεν απαιτείται βιβλιοθήκη• Ταχεία• Ευαίσθητη• Καθορισμός στόχου• Απομόνωση στόχου σε ένα σύνθετο περιβάλον• Αυτοματοποιημένη ανάλυση


Περιορισμοί Host-Specific PCR• Αναστολή PCR .• Στόχος ένα γονίδιο.• Στόχος μόνο μια βακτηριακή ομάδα .• Οι οργανισμοί στόχοι βρίσκονται σε μικρό αριθμό .• Περιορισμένος αριθμός παραδειγμάτων .• Μικρές γονιδιακές αλληλουχίες στόχοι .• Τα γονίδια δεν έχουν σχέση με την αλληλεπίδρασηξενιστών μικροβίων


Host-Specific PCR: Bacteroides 16S rDNA• Primer sets που διαχωρίζουν μεταξύ ανθρώπινωνυπολλειμμάτων, αλόγων και ρύπανσης• Target 16S rDNA από Bacteroides• Επιτυχημένη στα φρέσκα και θαλασσινά νερά


Bacteroides για χρήση σε MST• Ανιχνεύεται σε κόπρανα, υπολλείμματα καικοιλότητες του σώματος• Υποχρεωτικά αναερόβια• Περιορισμένη επιβίωση στο περιβάλλον.• Host-specific: ποικιλία σε ζωικούς ξενιστές


Τι είναι το HACCP?• Hazard• Analysis• Critical• Control• Point• Μια συστηματική, προληπτική προσέγγιση στηνταυτοποίηση, αξιολόγηση και έλεγχο των σημαντικώνκινδύνων


HACCP επισκόπηση- ένα θεωρητικό μοντέλο1. Whatis thehazard?3. How do weknowthe hazardis fixed?2. How do wefix thehazard?Source:Annette Davison, Ministryof Utilities, NSW, Australia, 2002


Θετικά• Ανάλυση κινδύνου▫ Πρόβλεψη της παρουσίας κινδύνων πριν συμβούν▫ Παρέχει την ώθηση για σημαντική επένδυση &συστηματικές αλλαγές• Μετρήσεις▫ Για έλεγχο κινδύνων▫ Μετρησιμότητα


Αρχή 1:-Ταυτοποίηση & εκτίμηση κινδύνωνΚίνδυνος:Ένας βιολογικός, χημικός, φυσικόςή ραδιενεργός παράγοντας σεσυνθήκες σε τρόφιμα ή νερά πουμπορεί να είναι ανασφαλή (μηαποδεκτά) για κατανάλωσηΕπικίνδυνο γεγονός:Μια κατάσταση, πρακτική, σενάριοή γεγονός που οδηγεί στηνπαρουσία του κινδύνουΠαραδείγματα :Βιολογικός:E.coli, Giardia, CryptosporidiumΧημικός : Αρσενικό, ΜόλυβδοςΦυσικός - pH, θερμοκρασία,ΔιαλυμένασωματίδιαΡαδιενεργός – ουράνιοΠαραδείγματα:Αντίστροφή ροή, αποτυχία κατά τηνεπεξεργασία,χρήση μη εγκεκριμένωνπροϊόντων


Αρχή 1:-Ταυτοποίηση & εκτίμηση κινδύνων• Ταυτοποίηση/επαλήθευση κινδύνων(επικίνδυνων γεγονότων) που μπορούν νασυμβούν και να δημιουργήσουν πρόβλημα:▫ Τυχαία μόλυνση (π.χ. Κόπρανα πτηνών, ανάστροφηροή)▫ Ασυνήθη φυσικά συμβάντα (π.χ. φωτιά, πλημμύρακ.λ.π.)▫ Ενέργειες κατασκευής /συντήρησης▫ Επιμόλυνση▫ Χειρισμός συστήματος (π.χ. πίεση)


Αρχή 1:-Ταυτοποίηση & εκτίμηση κινδύνων▫ Σχεδιασμός συστήματος (π.χ. Ανάμιξη δεξαμενών,χαμηλέςταχύτητες ροής )▫ Υλικά και προϊόντα (π.χ. διαπερατότητα)▫ Ανθρώπινο λάθος, υγιεινή• Καταγραφή όλων των κινδύνων (επικίνδυναγεγονότα)▫ Στην πηγή▫ Στους μηχανισμούς/διαδικασίες▫ Στο προϊόν


Αρχή 1:-Ταυτοποίηση & εκτίμηση κινδύνων• Χρησιμοποιώντας ποιοτικές, ημιποσοτικές ήποσοτικές τεχνικές• Ποιοτικά▫ Π.χ. Σπάνιο x Ασήμαντο = Χαμηλός κίνδυνος• Ημι-ποσοτικά▫ Risk score/factor e.g. 3(P) x 5(C) =15(RS)• Ποσοτικά▫ Π.χ. Κίνδυνος θνησιμότητας = Αριθμός θανάτων/ έτοςαπό δραστηριότητα/ Εκτεθειμένο πληθυσμό


ΠΑΡΑΔΕΙΓΜΑΠΟΣΟΤΙΚΗ ΕΚΤΙΜΗΣΗ ΚΙΝΔΥΝΟΥ ΤΡΟΦΙΜΟΓΕΝΩΝΝΙΟΓΕΝΩΝ ΜΟΛΥΝΣΕΩΝQMRA για ιούς στο πόσιμο νερό σαν μοντέλοΠρόγραμμα VITAL (FP7)Μάρτιος 2008-Φεβρουάριος 2011


Risk modelling1. Εκτίμηση κινδύνου• Ταυτοποίηση κινδύνου: Ταυτοποίηση τροφιμογενών ιών• Χαρακτηρισμός κινδύνων: Μολυσματική δόση σε σχέση με το ξενιστή• Αξιολόγηση έκθεσης: Κατανάλωση ιών στα τρόφιμα• Ανάλυση κινδύνου: Υπολογισμός κινδύνου μόλυνσης2.Διαχείριση κινδύνου• Ανάλυση κόστους-επίπτωσης: Αξιολόγηση πιθανών παρεμβάσεων• Εφαρμογή επιλεγμένων παρεμβάσεων• Επιτήρηση: Αποτελεσματικότητα επιλεγμένων παρεμβάσεων3. Ενημέρωση κινδύνου• Ενημέρωση στα εμπλεκόμενα μέρη


Ταυτοποίηση κινδύνου-Risk profile• Ταυτοποίηση υδατογενών παθογόνων– Προέλευση πληροφοριών– Ασθένεια και αποτέλεσμα που συνδέεται με το παθογόνο– Αναφορά στις αναδυόμενες μολυσματικές ασθένειες– Συμπτωματικοί και ασυμπτωματικοί ξενιστές εκκρίνουνπαθογόνα– Αριθμός παθογόνων που εκκρίνονται στο χρόνο– Πιθανή υδατογενή μετάδοση– Παθογόνο που σχετίζεται με υδατογενείς επιδημίες• Κριτήρια για να ελέγξουμε και να βάλουμε προτεραιότητες σταπαθογόνα


To μέλλον της MST

More magazines by this user
Similar magazines