HPLC-vejledning parabener

ANALYSE AF PARABENER I KOSMETISKE PRODUKTER
FORBEREDELSE TIL EKSPERIMENTET
Følgende materiale læses forud for eksperimentets udførelse:
Noter om kromatografi, noterne kan hentes på Kemisk Instituts hjemmeside.
Brug Århus Universitets kemikaliedatabase, Kiros 1 , til at undersøge risiko- og sikkerhedsforhold for
arbejde med methanol.
FORMÅL
BAGGRUND
at identificere forskellige parabener på basis af deres retentionstid ved en HPLCanalyse
at bestemme koncentrationen af forskellige parabener i et kosmetisk produkt og se om
produktet overholder grænseværdierne som angivet i Kosmetikbekendtgørelsen 2
Parabener er estre af 4-hydroxybenzoesyre, typisk methyl-, ethyl-, propyl- og butylestre. Disse
estre bruges som konserveringsmidler i kosmetisk produkter, medicin, drikkevarer og fødevarer.
De forskellige estre har forskellig mikrobiologisk effektivitet, derfor anvender man ofte en blanding
af parabenerne for at få den bedste effekt.
Methyl-4-hydroxybenzoat
Parabener har tidligere været anset for ikke at give anledning til bivirkninger for forbrugerne. Men
i de senere år er man blevet mere opmærksom på bl.a. allergiske reaktioner og hormonforstyrrende
virkninger af mange stoffer, herunder også parabener. Brugen af parabener reguleres af
1 http://www.kiros.dk
O O
C
OH
2 https://www.retsinformation.dk/Forms/R0710.aspx?id=12915
CH 3

Kosmetikbekendtgørelsen og af EU i ”Cosmetics Directive” 76/768/EEC 3 . Indholdet af methyl-,
ethyl-, propyl- og butylparabenerne må ikke overstige 0,4 masseprocent for den enkelte paraben
og 0,8 masseprocent for en blanding af parabener 4 . Masserne af de enkelte parabener som omregnes
til ækvivalent masseprocent af 4-hydroxybenzoesyre, da grænseværdierne er angive som
4-hydroxybenzoesyre.
ANALYSEPRINCIP
Parabenerne ekstraheres fra det kosmetiske produkt med en sur ethanol/vand-opløsning. Blandingen
opvarmes forsigtigt for at smelte fedtfasen og sikre, at alle parabenerne ekstraheres. Ekstrakterne
og en række standardopløsninger af parabener analyseres herefter på HPLC-systemet.
De enkelte parabener identificeres ved hjælp af retentionstiden i de fremkomne kromatogrammer
og ekstrakternes indhold af parabener beregnes afslutningsvis ved behandling af datamaterialet.
APPARATUR OG KEMIKALIER
HPLC
HPLC system, bestående af eluentflaske, pumpe, injektionsventil, evt. forkolonne, kolonne,
UV-detektor, PC med program samt 1 ml plastinjektionssprøjte med HPLC kanyle.
Kørselsparametre
Eluent: 9:1 methanol (hplc grade) : destilleret vand (v/v %)
Pumpe: flow 1,0 mL/min
Loop: 20 L
Kolonne: C-18 kolonne
Detektor: UV bølgelængde 254 nm
Gradient: 0 min –> 1 min: 60 % B
1 min –> 6 min: 60% B –> 100 % B
6 min –> 8 min: 100 % B
8 min –> 9,5 min: 100 % B –> 60 % B
Alle prøver analyseres med denne indstilling. Med denne gradient vil parabenerne eluere indenfor
ca 8 minutter.
Øvrigt apparatur
Vandbad (60 C)
3 http://ec.europa.eu/enterprise/cosmetics/cosing/
4 Grænserne kan finde både i Kosmetikbekendtgørelsen og i CosIng-databasen

100 mL reagensglas med skruelåg
Fuldpipetter, 1 mL og 40 mL med sugebold
50 mL målekolbe
5 mL plastiksprøjte
Nylonfiltre, 0,45 μm
Pimpsten
Kemikalier
9:1 blanding af ethanol/vand, (9 dele 99,9 % ethanol og 1 del vand)
2 M svovlsyre
Der udleveres følgende rene standarder som alle er opløst i en blanding af methanol og vand i
forholdet 9:1. De præcise koncentrationer af parabenerne vil stå på flaskerne.
methyl-4-hydroxybenzoat (MHB) ca. 25 ppm (= mg/L)
ethyl-4-hydroxybenzoat (EHB) ca. 25 ppm
propyl-4-hydroxybenzoat (PHB) ca. 25 ppm
butyl-4-hydroxybenzoat (BHB) ca. 25 ppm
Desuden udleveres opløsninger til fremstilling af en standardkurve. Der er fire forskellige opløsninger.
Hver opløsning indeholder alle fire parabener, og hver opløsning indeholder samme
koncentration af hver af parabenerne.
Opløsning 1 indeholder methyl-, ethyl-, propyl- og butylparaben - hver med en koncentration
på 10 ppm.
Opløsning 2: 20 ppm af hver paraben
Opløsning 3: 30 ppm af hver paraben
Opløsning 4: 50 ppm af hver paraben
PRØVEFORBEREDELSE
1. Afvej (med 3 decimaler) ca 1 g af det kosmetiske produkt i et 100 mL reagensglas (med
skruelåg).
2. Afpipetter 1,0 mL 2 M svovlsyre og overfør dette til reagensglasset.
3. Afpipetter 40,0 mL af ethanol/vand-blandingen og overfør også dette til reagensglasset.
4. Tilsæt ca 1 g pimpsten.
5. Luk reagensglasset, og ryst kraftigt i mindst 1 minut, indtil der er en homogen blanding.
6. Sæt reagensglasset i et 60 C vandbad, hvorved parabenerne ekstraheres over i ethanol/vand-fasen.
7. Afkøl straks reagensglasset under den kolde vandhane, og sæt det i køleskabet i 1 time.

8. Overfør ekstraktet til en 50 mL målekolbe, og fyld op til 50 mL med ethanol/vandblandingen.
9. Udtag 2-3 mL af ekstraktet med en 5 mL plastik sprøjte, sæt et filter på sprøjten, og
overfør lidt ekstrakt til et prøveglas.
HPLC-ANALYSE
Eluenten og HPLC-systemet er klargjort af laboranten.
Alle prøver skal filtreres inden injektion i HPLC-systemet.
De rene standarder, dvs. de opløsninger som kun indeholder én paraben, injiceres først. De
fremkomne kromatogrammer anvendes til fastlæggelse af retentionstiderne for hver af parabenerne.
Standardrækkens opløsninger injiceres enkeltvis. Analyser altid opløsninger med lave koncentrationer
før opløsninger med høje koncentrationer. Disse kromatogrammer anvendes til
fremstilling af standardkurver, én kurve for hver paraben.
Ekstraktet kromatograferes 2 gange.
Efter analysen kontrolleres at programmet har integreret alle toppe korrekt, og ellers tilrettelægges
det i samarbejde med instruktor. Alle kromatogrammer gemmes på en USB-nøgle.
DATABEHANDLING
1. Tegn de fire standardkurver for de fire parabener, læg lineære tendenslinjer ind og find
forskrifterne for tendenslinjerne.
2. Identificer hvilke parabener, der findes i ekstraktet.
3. Beregn, ved hjælp af tendenslinjernes ligninger, koncentrationerne i mg/L af forekommende
parabener i ekstraktet. Brug gennemsnitsarealet fra de to kromatogrammer.
4. Omregn koncentrationerne fra punkt 3 til indhold i det kosmetiske produkt udtrykt i
mg/g.
5. Beregn stofmængden af de enkelte parabener ud fra masserne beregnet i punkt 4.
6. Beregn den molare masse for 4-hydroxybenzoesyre.

7. Antag at stofmængderne beregnet i punkt 5 er 4-hydroxybenzoesyre og beregn herudfra
masserne af 4-hydroxybenzoesyre, Dette svarer til den ækvivalente masse 4hydroxy-benzoesyre,
som hver paraben repræsenterer.
8. Udtryk facit beregnet i punkt 7 som masse af 4-hydroxybenzoesyre i gram pr. 100 g
produkt (dvs. masseprocenten) for hver paraben. Læg dine facits som du har beregnet
for hver paraben sammen, så du får den samlede masseprocent af parabener.
9. Overholder dit kosmetiske produkt lovkravet?