Quantitativer Nachweis von Lawsonia intracellularis mittels real-time ...
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Literaturübersicht<br />
2.5 Polymerasekettenreaktion (PCR)<br />
Die PCR ist eine in vitro Technik, die es ermöglicht ausgewählte DNA-Sequenzen<br />
gezielt zu vervielfältigen. Dieser DNA-Abschnitt kann separat oder auch als Teil<br />
eines komplexen DNA-Moleküles zur Verfügung stehen. Es ist nicht zwingend<br />
notwendig, die Zielsequenz selbst zu kennen. Es ist ausreichend, wenn ca. 15 bis 20<br />
Basenpaare zweier flankierender DNA-Sequenzen bekannt sind. Komplementär zu<br />
diesen flankierenden DNA-Sequenzen können kurze gegenläufig orientierte<br />
Oligonukleotide synthetisiert werden, die dann in der folgenden zyklischen Reaktion<br />
als Startermoleküle (Primer) verwendet werden (MULLIS u. FALOONA 1987):<br />
Im ersten Schritt wird der zu amplifizierende DNA-Abschnitt (template, Matrize) zu<br />
einzelsträngiger DNA (ss-DNA) denaturiert. Um sicherzustellen, dass komplex<br />
strukturierte genomische DNA vollständig denaturiert, wird häufig vor dem ersten<br />
Zyklus eine initiale Denaturierung (first denaturation) bei ca. 95 °C durchgeführt, die<br />
in der Regel drei bis fünf Minuten dauert. Im Zyklus wird das Reaktionsgemisch zur<br />
Denaturierung für 30 bis 60 Sekunden auf etwa 90 °C bis 94 °C erhitzt. Danach folgt<br />
der Schritt des annealing, der ebenfalls 30 bis 60 Sekunden dauert. Die annealing-<br />
Temperatur ist abhängig <strong>von</strong> der Sequenz der eingesetzten Primer. Hier<br />
hybridisieren die Primer mit der einzelsträngigen template-DNA, so dass der dritte<br />
Schritt, die Amplifikation (extension), beginnen kann. In diesem Reaktionsschritt<br />
synthetisiert eine DNA-Polymerase vom 3´-Ende der Primer aus den neuen<br />
komplementären DNA-Strang aus Desoxyribonukleotidtriphosphaten (dNTP´s).<br />
Diese Amplifikation findet, abhängig <strong>von</strong> der verwendeten Polymerase, bei<br />
Temperaturen <strong>von</strong> etwa 72 °C statt und benötigt in d er Regel etwa 60 Sekunden für<br />
500 bp (ARNHEIM u. ERLICH 1992).<br />
Diese drei Schritte werden als ein Zyklus zusammengefasst. Die in jedem Zyklus<br />
entstehenden DNA-Fragmente stehen im folgenden Zyklus wiederum als template-<br />
DNA zur Verfügung (MULLIS u. FALOONA 1987). Es sind auch einfachere<br />
Protokolle mit einer Phase der Denaturierung bei 95 °C und einer Phase des<br />
annealing sowie der extension bei 60 °C beschrieben, die zu guten Ergebnissen<br />
führen (ARNHEIM u. ERLICH 1992). In der Regel werden 20 bis 30 Zyklen der PCR<br />
durchgeführt (LORKOWSKI u. THIEMANN 2006). Nach dem letzten Zyklus wird<br />
dann eine weitere Phase der Amplifikation (final extension) angefügt, um alle<br />
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