Biochemie - 4., aktualisierte Auflage

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Biochemie - 4., aktualisierte Auflage

TEIL II

Struktur und Funktion

3 Aminosäuren und die Primärstruktur

von Proteinen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75

4 Proteine: Dreidimensionale Struktur

und Funktion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 115

5 Enzyme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 175

6 Enzymatische Mechanismen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 217

7 Coenzyme und Vitamine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 265

8 Kohlenhydrate . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 303

9 Lipide und Membranen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 341


Aminosäuren und die

Primärstruktur von Proteinen

3.1 Allgemeine Struktur von Aminosäuren . . . . . . . . . . . . . . 77

3.2 Strukturen der zwanzig Standard-Aminosäuren

in Proteinen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 80

3.3 Andere Aminosäuren und Aminosäurederivate . . . . . . 87

3.4 Ionisierung von Aminosäuren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89

3.5 Peptidbindungen zwischen Aminosäuren

in Proteinen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93

3.6 Techniken der Proteinreinigung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95

3.7 Analysetechniken . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 98

3.8 Aminosäurenzusammensetzung von Proteinen . . . . . . 102

3.9 Bestimmung der Aminosäuresequenz . . . . . . . . . . . . . . . . 103

3.10 Strategien zur Proteinsequenzierung . . . . . . . . . . . . . . . . 106

3.11 Bestimmung von evolutionären Beziehungen

durch den Vergleich der Sequenz von Proteinen . . . . . 108

Zusammenfassung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 111

Übungsaufgaben . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 112

Ausgewählte Literatur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 114

ÜBERBLICK

3


3

76

Aminosäuren und die Primärstruktur von Proteinen

Das Studium von Proteinen beschäftigt Biochemiker seit mehr als 100 Jahren. Das

Verständnis der Zusammensetzung, der dreidimensionalen Gestalt und der chemischen

Aktivität von Proteinen kann der Schlüssel für die Klärung zentraler wissenschaftlicher

Fragen sein. Der Prozess der Photosynthese ist zum Beispiel wegen seiner

Rolle beim Einfangen der Sonnenenergie einer der wichtigsten biochemischen Stoffwechselwege.

Die detaillierte Untersuchung der Strukturen der vielen Proteine, die an

der Photosynthese beteiligt sind, führt zu einem immer tieferen Verständnis dieses

fundamentalen Prozesses. Ein anderes aktives Forschungsgebiet ist das Studium der

Proteine von thermophilen Bakterien. Diese Bakterien gedeihen bei hohen Temperaturen,

die in manchen Fällen über 100°C liegen, aber sie führen die gleiche Art von

biochemischen Reaktionen durch, die in allen Zellen vorkommen. Worin unterscheiden

sich die Proteine thermophiler Bakterien von denen anderer Organismen, so dass

sie bei Temperaturen aktiv sein können, die zur Zerstörung der meisten anderen

Proteine führen würden?

Die Lösung vieler medizinisch relevanter Fragestellungen erfordert das Verständnis

von Proteinen und ihrer Funktionsweise. Ein bekanntes Beispiel ist das humane

Immunschwächevirus 1 (HIV-1, engl. human immunodeficiency virus 1), dem

Erreger des erworbenen Immunschwächesyndroms AIDS (engl. acquired immune

deficiency syndrome). Wie die meisten Retroviren weist dieses Virus eine hohe Mutationsrate

auf. Infolgedessen entstehen immer wieder neue Virusstämme, die sich

gegenüber den Standardbehandlungen als resistent erweisen. Eine Wirkstoffklasse,

die von solchen Mutationen betroffen ist, umfasst die Inhibitoren der viralen Reversen

Transkriptase. Die Struktur und die Funktion der Reversen Transkriptase des

HI-Virus sind im Detail untersucht worden. Wir kennen außerdem die Strukturen der

viralen Hüllproteine, deren Gene in neuen Stämmen mutiert sind. Wissenschaftler

erforschen, auf welche Weise es diese Mutationen den Viren ermöglichen, auch die

besten Verteidigungsstrategien der modernen Medizin zu überwinden. Es bleibt zu

hoffen, dass die dabei gewonnenen Erkenntnisse zu immer besseren Behandlungsmethoden

gegen AIDS und andere Krankheiten führen, die von Retroviren verursacht

werden.

Es gibt viele verschiedene Arten von Proteinen. Auch wenn sie keine erschöpfende

Auskunft geben kann, umfasst die folgende Liste doch die meisten der wichtigen

biologischen Funktionen von Proteinen:

1

2

3

4

5

Viele Proteine fungieren als Enzyme, die biologischen Katalysatoren. Fast alle

Reaktionen, die in lebenden Organismen ablaufen, werden durch Enzyme katalysiert.

Einige Proteine binden andere Moleküle zum Zweck der Speicherung und des

Transports. Myoglobin bindet zum Beispiel Sauerstoff in Skelett- und Herzmuskelzellen,

während Hämoglobin Sauerstoff (O2) und Kohlendioxid (CO2) in roten Blutkörperchen (Erythrocyten) bindet und transportiert.

Einige Proteine, wie zum Beispiel Tubulin, Actin und Kollagen, verleihen Zellen

und somit auch Geweben und Organismen ihre Formstabilität und Gestalt.

Komplexe Aggregate von Proteinen können mechanische Arbeit verrichten, wie

zum Beispiel die Bewegung von Geißeln (Flagellen), die Trennung von Chromosomen

während der Mitose oder die Kontraktion von Muskeln.

Viele Proteine spielen eine Rolle bei der Entschlüsselung von Informationen in

der Zelle. Einige sind an der Translation (Proteinbiosynthese) beteiligt, während

andere in die Regulation der Genexpression eingreifen, indem sie an Nucleinsäuren

binden.


6

7

Manche Proteine fungieren als Hormone, die biochemische Aktivitäten in ihren

Zielzellen regulieren.

Schließlich weisen einige Proteine hoch spezialisierte Funktionen auf. Antikörper

sind zum Beispiel ein wichtiges Glied in der Verteidigung von Wirbeltieren

gegen bakterielle und virale Infektionen. Toxine, die von Bakterien produziert

werden, können größere Organismen töten.

Wir beginnen unser Studium der Proteine, die auch Polypeptide genannt werden,

mit der Beschreibung der Strukturen und chemischen Eigenschaften ihrer Bausteine,

den Aminosäuren. In diesem Kapitel werden wir außerdem die Isolierung und Reinigung,

die Analyse sowie die Sequenzierung von Polypeptiden besprechen. Die dreidimensionale

Struktur von Polypeptidketten werden wir in Kapitel 4 behandeln,

während die Eigenschaften von Enzymen das Thema der Kapitel 5 und 6 darstellen.

Allgemeine Struktur von Aminosäuren 3.1

Alle Organismen verwenden den gleichen Standardsatz von 20 Aminosäuren für den

Aufbau von Proteinmolekülen. Trotz der begrenzten Anzahl von Aminosäuren kann

eine enorme Vielfalt von unterschiedlichen Polypeptiden produziert werden, indem

die 20 Standard-Aminosäuren in verschiedenen Kombinationen zu langen, linearen

Ketten verknüpft werden.

Aminosäuren werden deshalb so genannt, weil sie Aminoderivate von Carbonsäuren

darstellen. In den 20 Standard-Aminosäuren sind die Amino- und die Carboxylgruppe

an dasselbe Kohlenstoffatom gebunden, das so genannte α-Kohlenstoffatom

(α-C-Atom). Der griechische Buchstabe α kennzeichnet die Position des Kohlenstoffatoms

direkt neben der Carboxylgruppe. Alle Aminosäuren, die in Proteinen vorkommen,

sind α-Aminosäuren. An das α-C-Atom sind zwei weitere Substituenten gebunden,

ein Wasserstoffatom und eine Seitenkette (R), in der sich die verschiedenen

Aminosäuren unterscheiden. In den chemischen Namen von Aminosäuren werden

Kohlenstoffatome mit Nummern gekennzeichnet, die die relative Position zur Carboxylgruppe,

deren C-Atom die Nummer 1 trägt, angeben. Der korrekte chemische

Name oder systematische Name folgt Regeln, die von der International Union of Pure

and Applied Chemistry (IUPAC) und der International Union of Biochemistry and

Molecular Biology (IUBMB) aufgestellt wurden. Der systematische Name der α-Aminosäure,

die eine Methylgruppe (¬CH3) als Seitenkette besitzt, lautet 2-Aminopropansäure,

H3C¬CH(NH2)¬COOH (Propansäure ist H3C¬CH2¬COOH). Sie ist

aber unter ihrem gebräuchlicheren Trivialnamen, Alanin, bekannter. Eine alternative

Nomenklatur verwendet griechische Buchstaben, um das α-C-Atom und die C-Atome

der Seitenkette zu identifizieren. Gemäß dieser Nomenklatur werden die C-Atome

bezüglich ihrer Position relativ zur Carboxylgruppe spezifiziert, so dass das C-Atom

der Carboxylgruppe im Gegensatz zur systematischen Nomenklatur nicht durch einen

griechischen Buchstaben beziehungsweise eine Positionsnummer gekennzeichnet

wird. Biochemiker verwenden traditionell die alte, alternative Nomenklatur und

die Trivialnamen.

Weil ihr pKS-Wert ca. 9 beträgt, liegt die Aminogruppe von (freien) Aminosäuren

unter normalen physiologischen Bedingungen innerhalb von Zellen protoniert vor,

also als positiv geladene Ammoniumgruppe (¬NH 3 ). Die Carboxylgruppe ist eben-

falls ionisiert, weist aber einen pK S-Wert von unter 3 auf (Abschnitt 2.9). Deswegen

3.1 Allgemeine Struktur von Aminosäuren

H 2N

H 2N

R

CH COOH

α

R

CH COOH

2

1

Konventionen zur Nummerierung von C-Atomen

in Aminosäuren. In der traditionellen Nomenklatur

werden die C-Atome in Abhängigkeit von

ihrem Abstand vom Carboxyl-C-Atom mit den

griechischen Buchstaben α, β, γ etc. gekennzeichnet.

In den offiziellen systematischen Namen gemäß

IUPAC und IUBMB erhält das Carboxyl-C-Atom die

Nummer 1 und die benachbarten C-Atome werden

sequenziell weiternummeriert. Somit entspricht

das α-C-Atom im traditionellen Namen dem C-2-

Atom im systematischen Namen.

77


3

78

Aminosäuren und die Primärstruktur von Proteinen

(a) (b)

H 3N

1

COO

C

2 α

R

H

α-Aminogruppe

β-Kohlenstoffatom

α-Carboxylatgruppe

α-Kohlenstoff

Kohlenstoff

Wasserstoff

Stickstoff

Sauerstoff

α-Kohlenstoffatom

Seitenkette

Abbildung 3.1: Zwei Darstellungen einer L-Aminosäure bei neutralem pH-Wert. (a) Allgemeine

Struktur einer Aminosäure in perspektivischer Darstellung. Eine Aminosäure besitzt eine Carboxylatgruppe,

deren C-Atom die Positionsnummer 1 erhält, sowie eine Aminogruppe, ein H-Atom und eine Seitenkette

(R), die alle an das C-2-Atom (das α-C-Atom) gebunden sind. Die massiven Keile repräsentieren Bindungen,

die nach vorn aus der Papierebene herausragen, während die gestrichelten, keilförmigen Bindungen

hinter die Papierebene zeigen. Die breiten Enden der Keile befinden sich immer näher zum Betrachter als

die spitzen Enden. (b) Kugel-Stab-Modell (engl. ball-and-stick model ) der Aminosäure Serin, die die Seitenkette

¬CH 2OH aufweist. Beachten Sie die unterschiedlichen Nomenklaturen bezüglich der Kennzeichnung

beziehungsweise Nummerierung der Kohlenstoffatome.

tritt sie in der deprotonierten Form als negativ geladene Carboxylatgruppe (¬COO )

auf. Im physiologischen pH-Bereich existieren Aminosäuren somit als dipolare Ionen,

so genannte Zwitterionen, auch wenn ihre Nettoladung null beträgt. In Abschnitt 3.4

werden wir feststellen, dass auch einige der Seitenketten der Standard-Aminosäuren

in ionischer Form vorkommen können. Biochemiker präsentieren die Strukturen von

Aminosäuren immer in der biologisch relevanten Form, so dass Sie in den folgenden

Abbildungen Zwitterionen vorfinden werden.

Abbildung 3.1a zeigt die allgemeine Struktur einer Aminosäure in perspektivischer

Darstellung, während Sie in Abbildung 3.1b ein Kugel-Stab-Modell (engl.

ball-and-stick model) der Aminosäure Serin mit der Seitenkette ¬CH2OH sehen.

Die C-Atome der Seitenkette einer Aminosäure werden sequenziell mit den griechischen

Buchstaben β, γ, δ und ε gekennzeichnet, die den Positionsnummern 3, 4, 5

und 6 in der systematischen Nomenklatur entsprechen. Der systematische Name von

Serin lautet 2-Amino-3-hydroxypropansäure.

In 19 der 20 Standard-Aminosäuren, die für die Biosynthese von Proteinen verwendet

werden, ist das α-C-Atom asymmetrisch substituiert (es ist ein Stereozentrum),

da es vier verschiedene Substituenten trägt, und diese Aminosäuren sind infolgedessen

chiral. Die einzige Ausnahme bildet Glycin, dessen Seitenkette nur aus einem

einfachen Wasserstoffatom besteht. Glycin ist deswegen nicht chiral, weil an das

α-C-Atom zwei H-Atome und somit nicht vier verschiedene Substituenten gebunden

sind. Die 19 chiralen Aminosäuren können aber in Form von verschiedenen Stereoisomeren

vorkommen. Stereoisomere sind Verbindungen, deren Molekülformel

beziehungsweise Konstitution übereinstimmt (entsprechende Atome in den Stereoisomeren

sind mit den gleichen Atomen kovalent verbunden), die aber eine unterschiedliche

räumliche Anordnung ihrer Atome oder Konfiguration aufweisen. Stereoisomere

sind verschiedene Moleküle, die nicht ohne Weiteres ineinander überführt


werden können, weil zur Änderung der Konfiguration der Bruch (und die anschließende

Neubildung) von kovalenten Bindungen erforderlich wäre. Die Stereoisomere

von Aminosäuren sind nicht deckungsgleich, sondern verhalten sich wie Bild und

Spiegelbild zueinander. Solche Stereoisomere heißen Enantiomere. Zwei der 19 chiralen

Aminosäuren, nämlich Isoleucin und Threonin, weisen jeweils ein zusätzliches,

asymmetrisch substituiertes C-Atom in der Seitenkette auf und besitzen somit

jeweils zwei Stereozentren. Isoleucin und Threonin können infolgedessen jeweils in

Form von vier verschiedenen Stereoisomeren (Diastereomeren) vorkommen, die

zwei Enantiomerenpaare darstellen.

Konventionsgemäß werden die Aminosäuren eines Enantiomerenpaares, die sich

in ihrer Konfiguration am α-C-Atom unterscheiden, mit den etwas kleiner geschriebenen

Großbuchstaben D (lat. dexter, rechts) und L (lat. laevus, links) gekennzeichnet.

Die Aminosäure in Abbildung 3.1a besitzt L-Konfiguration, ihr Enantiomer (Spiegelbild)

weist D-Konfiguration auf. Um die Konfiguration einer Aminosäure zu bestimmen,

zeichnet man die perspektivische Strukturformel der Aminosäure wie in

Abbildung 3.1a in der Weise, dass die Carboxylatgruppe oben und die Seitenkette

unten steht und beide vom Betrachter wegweisen. In dieser Form zeigen die α-Aminogruppe

und das α-H-Atom in Richtung des Betrachters. Befindet sich die α-Aminogruppe

in dieser Schreibweise auf der linken Seite der senkrechten Grundkette,

handelt es sich um das L-Isomer, steht sie auf der rechten Seite um das D-Isomer

(Abbildung 3.2). Beachten Sie, dass die vier an das α-C-Atom gebundenen Atome,

ähnlich wie die maximale Anzahl von vier Wasserstoffatomen in der Umgebung des

Sauerstoffatoms in Wasser (Abbildung 2.4), die vier Ecken eines Tetraeders besetzen.

Die 19 chiralen Aminosäuren, die zum Aufbau von Proteinen verwendet werden,

weisen alle L-Konfiguration (am α-C-Atom) auf, obwohl in der Natur auch ein paar

D-Aminosäuren vorkommen. Konventionsgemäß setzt man in der Biochemie bei

Aminosäuren eine L-Konfiguration voraus, wenn die Stereochemie nicht explizit

(a)

Spiegelebene

α α

L-Serin D-Serin

α-Kohlenstoff

Kohlenstoff

Wasserstoff

Stickstoff

Sauerstoff

(b)

H 3N

O O

C

L-Serin

Spiegelebene

H

CH 2OH

H

O O

C

C

D-Serin

NH 3

CH 2OH

Abbildung 3.2: Enantiomerenpaare (Spiegelbildpaare) von Aminosäuren. (a) Kugel-Stab-Modell

(engl. ball-and-stick model ) von L-Serin und D-Serin. Beachten Sie, dass die beiden Moleküle nicht identisch

sind. Sie können nicht zur Deckung gebracht werden. (b) Perspektivische Strukturformeln von L-Serin

und D-Serin.

C

3.1 Allgemeine Struktur von Aminosäuren

79


3

80

Aminosäuren und die Primärstruktur von Proteinen

Einige seltenere Aminosäuren werden in Abschnitt

3.3 beschrieben.

durch den Buchstaben D spezifiziert ist. Oft ist es bequemer und nicht schädlich, die

Struktur von L-Aminosäuren in einer stereochemisch unkommentierten Form zu

schreiben. Dies gilt besonders, wenn die korrekte Stereochemie für eine Diskussion

keine entscheidende Rolle spielt.

Die Tatsache, dass alle lebenden Organismen denselben Satz von Standard-Aminosäuren

für die Proteinbiosynthese verwenden, ist ein Beleg für die Existenz eines

gemeinsamen Vorfahren aller Lebewesen auf der Erde. Wie die modernen Organismen,

muss auch der letzte gemeinsame Vorfahre L- und nicht D-Aminosäuren genutzt

haben. In Mischungen, die die Bedingungen auf der Erde vor vier Milliarden Jahren,

als das erste Leben entstand, nachahmen, bilden sich L- und D-Aminosäuren. Auch in

Meteoriten sind beide Enantiomere gefunden worden. Es ist nicht bekannt, wie und

warum die primitiven Lebensformen aus der Mischung von Enantiomeren, die zur

Zeit der Entstehung des Lebens vermutlich vorgelegen hat, die L-Aminosäuren für eine

weitere Verwendung selektiert haben. Wahrscheinlich war die Bildung der ersten

Proteine, die aus einer kleinen Anzahl einfacher Aminosäuren aufgebaut waren, ein

Zufallsereignis, ebenso wie die damit verknüpfte Selektion zwischen L- und D-Aminosäuren.

Moderne lebende Organismen müssen die L-Aminosäuren nicht erst aus

einer Enantiomerenmischung selektieren, weil sowieso nur die L-Aminosäuren in

ausreichenden Mengen synthetisiert werden. Die vorherrschende Stellung der L-Aminosäuren

ist somit eine Folge der Evolution der entsprechenden Stoffwechselwege,

die zur Produktion von L- und nicht D-Aminosäuren geführt hat (Kapitel 17).

Strukturen der zwanzig

Standard-Aminosäuren in Proteinen 3.2

Die Strukturen der 20 Aminosäuren, die gewöhnlich in Proteinen vorkommen, werden

in den folgenden Abbildungen als Fischer-Projektionen dargestellt. In der Fischer-

Projektion (Abschnitte 1.1 und 1.3.2) zeichnet man die Struktur der Aminosäure

ähnlich wie in Abbildung 3.1a und mit der gleichen Anordnung der einzelnen Gruppen.

Die Bindungen werden jedoch nicht keilförmig und nicht gestrichelt dargestellt,

sondern als einfache, gerade, durchgehende Linien. Die Fischer-Projektion impliziert

aber die in Abbildung 3.1a gezeigte Ausrichtung der Bindungen. Horizontale Bindungen

ragen also nach vorn aus der Papierebene heraus, während senkrechte Bindungen

hinter die Ebene zeigen. Die Untersuchung der Strukturen offenbart erhebliche

Unterschiede in den Seitenketten der 20 Aminosäuren. Einige Seitenketten sind

unpolar und somit hydrophob, wohingegen andere polare Gruppen aufweisen oder

bei neutralem pH-Wert in ionischer Form vorliegen und deshalb hydrophil sind.

Die Eigenschaften der Seitenketten beeinflussen die dreidimensionale Gestalt, also

die Konformation des gesamten Proteins in hohem Maße. Ein wasserlösliches Protein

ist zum Beispiel so gefaltet, dass die meisten seiner hydrophoben Seitenketten im

Inneren des Moleküls zusammengelagert sind, während die hydrophilen Seitenketten

bevorzugt an der Oberfläche liegen. Infolgedessen besitzen diese Proteine meist

eine eher kompakte, globuläre (kugelförmige) Gestalt.

In den Abbildungen ist sowohl der Drei-Buchstaben-Code als auch der Ein-

Buchstaben-Code für jede Aminosäure angegeben. Der Zusammenhang zwischen

dem Drei-Buchstaben-Code und dem Trivialnamen ist leicht zu erkennen. Dagegen

erscheint der Ein-Buchstaben-Code weniger offensichtlich, weil die Trivialnamen

mehrerer Aminosäuren mit dem gleichen Buchstaben beginnen. Deswegen müssen


EXKURS

Eine alternative Nomenklatur zur Benennung der Konfiguration

Auch die in der organischen Chemie sehr verbreitete R,S-Nomenklatur zur Benennung

der absoluten Konfiguration an einem Stereozentrum wird zur Beschreibung der Stereochemie

von Aminosäuren manchmal verwendet. Die R,S-Nomenklatur basiert auf der

Festlegung einer Prioritätenreihenfolge der vier Substituenten, die an ein Stereozentrum

gebunden sind. Auf der Grundlage dieser Prioritätenreihenfolge und der räumlichen

Anordnung der Substituenten wird die absolute Konfiguration an diesem Stereozentrum

entweder als R oder als S bezeichnet. Ein Beispiel für solche Stereozentren sind die

α-C-Atome in den 19 chiralen Standard-Aminosäuren. Die Prioritäten werden von 1

(höchste Priorität) bis 4 (niedrigste Priorität) durchnummeriert und nach den folgenden,

hier etwas vereinfacht dargestellten, so genannten Cahn-Ingold-Prelog-Regeln oder CIP-

Regeln, festgelegt:

1

2

3

Von den vier Atomen, die direkt an das Stereozentrum gebunden sind, wird demjenigen

die niedrigste Priorität (Nummer 4) zugeordnet, welches die kleinste Atommasse

besitzt. Die Priorität der restlichen drei Atome steigt mit deren Atommasse.

Wenn zwei gleiche Atome direkt mit dem Stereozentrum verknüpft sind, ergeben

sich deren Prioritäten entsprechend aus den Atommassen der nächsten mit ihnen verbundenen

Atome. Eine ¬CH 3-Gruppe besitzt demnach also eine niedrigere Priorität

als eine ¬CH 2Br-Gruppe, weil Brom eine größere Atommasse aufweist als Wasserstoff.

Ist ein Atom durch eine Doppel- oder Dreifachbindung gebunden, wird es entsprechend

doppelt oder dreifach gezählt. Eine ¬CHO-Gruppe mit einem doppelt gebundenen

Sauerstoffatom besitzt somit eine höhere Priorität als eine ¬CH 2OH-Gruppe.

Die Reihenfolge einiger der häufigsten Gruppen in der Biochemie, geordnet von der

niedrigsten zur höchsten Priorität, lautet: ¬H, ¬CH 3, ¬C 6H 5, ¬CHO, ¬COOH,

¬COOR, ¬NH 2, ¬NHR, ¬OH, ¬OR und ¬SH.

Stellen Sie sich das Molekül mit diesen Regeln im Gedächtnis als Lenkrad eines Autos vor,

bei dem die Gruppe mit der niedrigsten Priorität (Nummer 4) in Richtung der Lenksäule

vom Fahrer wegzeigt, während die übrigen drei Gruppen auf dem Lenkradkranz angeordnet

sind. Folgen Sie nun dem Lenkradkranz, ausgehend von der Gruppe mit der höchsten

Priorität (1) über die Gruppe der zweithöchsten Priorität (2) bis zur Gruppe mit der niedrigsten

Priorität (3). Sind diese drei Gruppen aus der Sicht des Betrachters (Autofahrers) im

Uhrzeigersinn angeordnet, weist das Stereozentrum R-Konfiguration auf (lat. rectus,

rechts). Resultiert aber eine Anordnung entgegen dem Uhrzeigersinn, besitzt das Stereozentrum

S-Konfiguration (lat. sinister, links). Die Abbildung demonstriert die Feststellung

der S-Konfiguration von L-Serin gemäß der R,S-Nomenklatur. Für L-Cystein ergibt sich

dagegen die entgegengesetzte R-Konfiguration. Die R,S-Nomenklatur und die D,L-Nomenklatur

stehen also offensichtlich in keinem direkten Zusammenhang. In der Biochemie

wird das D,L-System häufiger verwendet, weil alle Aminosäuren, die in Proteinen vorkommen,

nach dem D,L-System dieselbe Konfiguration aufweisen, nach dem R,S-System

aber nicht.

als Ein-Buchstaben-Code für diese Aminosäuren auch noch andere Buchstaben

des Alphabets verwendet werden. So lautet zum Beispiel der Ein-Buchstaben-

Code für Threonin T, aber für Tyrosin Y und für Tryptophan W. Die Ein-Buchstaben-

Codes müssen einfach auswendig gelernt werden.

Es ist wichtig, sich die Strukturen der Standard-Aminosäuren einzuprägen, weil

wir deren Kenntnis in den Kapiteln zu den Proteinstrukturen, den Enzymen und zur

Proteinbiosynthese noch oft voraussetzen werden. In den folgenden Abschnitten

haben wir die Aminosäuren nach ihren allgemeinen Eigenschaften und der Struktur

ihrer Seitenketten in Gruppen eingeteilt. Die Seitenketten können einer der folgenden

chemischen Klassen zugeordnet werden: aliphatisch, aromatisch, schwefelhaltig,

alkoholisch, basisch, sauer und amidhaltig. Außerdem können von den 20

3.2 Strukturen der zwanzig Standard-Aminosäuren in Proteinen

(a)

1

(b)

H 3N

2

3

2

COO

C

CH 2OH

3

L-Serin

4

H

1

1

S-Konfiguration

Bestimmung der absoluten Konfiguration

nach dem R,S-System. (a) Jeder Gruppe, die

an das Stereozentrum gebunden ist, wird auf der

Grundlage der Atommassen der direkt mit dem

Stereozentrum verbundenen Atome eine Priorität

zugeordnet. Dem Substituenten mit der niedrigsten

Priorität wird die Nummer 4 gegeben.

(b) Wenn man das Molekül so ausrichtet, dass

der Substituent mit der kleinsten Priorität hinter

die Papierebene, also vom Betrachter weg,

zeigt, kann die absolute Konfiguration des Stereozentrums

bestimmt werden. Sind die Substituenten

in der Prioritätenreihenfolge 1, 2 und 3

vom Betrachter aus gesehen im Uhrzeigersinn

angeordnet, besitzt das Stereozentrum R-Konfiguration,

sind sie entgegen dem Uhrzeigersinn

angeordnet, S-Konfiguration. Das hier dargestellte

L-Serin weist S-Konfiguration auf.

4

2

3

4

81


3

82

Aminosäuren und die Primärstruktur von Proteinen

Standard-Aminosäuren fünf als sehr hydrophob (blau) und sieben als sehr hydrophil

(rot) klassifiziert werden. Das Verständnis der Klassifizierung der Seitenketten wird

Ihnen das Auswendiglernen der Strukturen und Namen vereinfachen.

EXKURS

Trivialnamen von Aminosäuren

Trivialname Herkunft des Namens

Alanin Wahrscheinlich von Aldehyd + an (als geeignetes Bindeglied) +

Amin (1849)

Arginin Kristallisiert als Silbersalz; vom lateinischen Wort argentum

(Silber) abgeleitet (1886)

Asparagin Wurde zuerst aus Spargel (botanisch asparagus) isoliert

(1813)

Aspartat Ähnlich wie Asparagin (1836)

Glutamat Wurde zuerst im Pflanzenprotein Gluten gefunden

(1866)

Glutamin Ähnlich wie bei Glutamat (1866)

Glycin Vom griechischen Wort glykys (süß) abgeleitet;

schmeckt süß (1848)

Cystein Vom griechischen Wort kystis (Blase) abgeleitet;

wurde in Blasensteinen entdeckt (1882)

Histidin Wurde zuerst aus Störsperma isoliert; vom griechischen

Wort histos (Netz, Stoff, Gewebe) abgeleitet (1896)

Isoleucin Isomer von Leucin

Leucin Vom griechischen Wort leukos (weiß) abgeleitet;

bildet weiße Kristalle (1820)

Lysin Produkt der Proteinhydrolyse; vom griechischen

Wort lysis (Auflösung) abgeleitet (1891)

Methionin Die Seitenkette enthält ein Schwefelatom (griech. theion, Schwefel)

und eine Methylgruppe (1928).

Phenylalanin Alanin mit einer Phenylgruppe (1883)

Prolin Verunstaltete Form des Namens Pyrrolidin, weil Prolin einen

Pyrrolidinring enthält (1904).

Serin Vom lateinischen Wort sericum (Seide) abgeleitet; häufiger

Bestandteil von Seide (1865)

Threonin Ähnelt dem C 4-Zucker Threose (1936)

Tryptophan Isoliert aus dem Produkt der Trypsinverdauung von Proteinen +

griech. phanein, sich zeigen (1890)

Tyrosin Kommt in Käse vor; vom griechischen Wort tyros (Käse)

(1890)

Valin Derivat der Valeriansäure aus der Pflanzenfamilie Valeriana

(1906)

(Quellen: (1) Oxford English Dictionary, 2. Auflage. (2) Leung, S.H. 2000. Amino Acids, Aromatic Compounds,

and Carboxylic Acids: How Did They Get Their Common Names? J. Chem. Educ. 77:48–49.)


3.2.1 Aliphatische Seitenketten

Glycin (Gly, G) ist die kleinste Aminosäure, da seine Seitenkette nur aus einem

Wasserstoffatom besteht. Das α-C-Atom von Glycin trägt also zwei Wasserstoffatome

und nicht vier verschiedene Substituenten. Infolgedessen ist das α-C-Atom nicht

asymmetrisch substituiert und Glycin ist nicht chiral. Die beiden Wasserstoffatome

am α-C-Atom verleihen dem Glycinmolekül einen geringfügigen hydrophoben Charakter.

Wir werden sehen, dass Glycin eine einzigartige Rolle für die Struktur von

vielen Proteinen spielt, weil seine Seitenkette aufgrund ihrer geringen Größe in

Nischen passt, die keine andere Aminosäure besetzen kann.

H 3N

Glycin [G]

(Gly)

COO

C H

H

H 3N

COO

C H

CH 3

Alanin [A]

(Ala)

H 3N

H 3C

COO

C H

CH

Valin [V]

(Val)

Die vier Aminosäuren Alanin (Ala, A), Valin (Val, V), Leucin (Leu, L) und Isoleucin

(Ile, I), ein Strukturisomer von Leucin, besitzen gesättigte, aliphatische Seitenketten.

Während die Seitenkette von Alanin nur aus einer Methylgruppe besteht,

weist Valin eine verzweigte C3-Seitenkette auf. Leucin und Isoleucin enthalten jeweils

eine verzweigte C4-Seitenkette. Im Isoleucin ist neben dem α-C-Atom noch ein C-Atom

asymmetrisch substituiert, das β-C-Atom. Da Isoleucin somit zwei Chiralitätszentren

enthält, kann es in Form von vier möglichen Stereoisomeren auftreten. Das Stereoisomer,

das in Proteinen vorkommt, wird L-Isoleucin genannt. Die Aminosäure, die

sich von diesem nur durch die absolute Konfiguration am β-C-Atom unterscheidet,

heißt L-Alloisoleucin (Abbildung 3.3). Die Namen der beiden anderen Stereoisomere

lauten D-Isoleucin und D-Alloisoleucin.

Alanin, Valin, Leucin und Isoleucin spielen eine wichtige Rolle bei der Ausbildung

und Aufrechterhaltung der dreidimensionalen Struktur von Proteinen, weil sie dazu

tendieren, sich vom Wasser abgewandt zusammenzulagern. Wegen der Verzweigung

in der Kohlenstoffkette der Seitenkette sind Valin, Leucin und Isoleucin auch als verzweigtkettige

Aminosäuren bekannt. Diese drei Aminosäuren sind sehr hydrophob.

Prolin (Pro, P) unterscheidet sich von allen anderen 19 Aminosäuren durch die

Verknüpfung der Seitenkette sowohl mit dem α-C-Atom als auch mit dem Stickstoffatom

der α-Aminogruppe, so dass ein cyclisches Molekül entsteht. Prolin enthält

deswegen keine primäre, sondern eine sekundäre Aminogruppe. Der heterocyclische

H 3N

H 3C

O

C

C

C

CH 2

CH 3

L-Isoleucin

O

H

H

H C

H

O O

C

C

CH 2

CH 3

D-Isoleucin

CH 3

CH 3

H 3N

H 3C

COO

C H

CH 2

CH

CH 3

Leucin [L]

(Leu)

3.2 Strukturen der zwanzig Standard-Aminosäuren in Proteinen

H 3N

H 3C

NH3 H3N C H

H C

H

O

C

C

O

CH 2

CH 3

CH 3

L-Alloisoleucin

H3C

COO

C H

C H

CH 2

CH 3

Isoleucin [I]

(Ile)

O O

C

C

CH 2

CH 3

NH 3

H

D-Alloisoleucin

Abbildung 3.3: Stereoisomere von Isoleucin.

83


3

84

H 2N

H 2C

H 3N

CH 2

Aminosäuren und die Primärstruktur von Proteinen

COO

C H

CH 2

Prolin [P]

(Pro)

Phenylalanin [F]

(Phe)

H 3N

COO

C H

CH 2

Tryptophan [W]

(Trp)

H 3N

COO

C

CH 2

N

H

COO

H

C H

CH 2

CH 2

S

CH 3

Methionin [M]

(Met)

H 3N

H 3N

COO

C H

CH 2

OH

Tyrosin [Y]

(Tyr)

COO

C

CH 2

SH

H

Cystein [C]

(Cys)

Pyrrolidinring von Prolin schränkt die Geometrie von Polypeptiden ein. Manchmal

führt der Einbau eines Prolinrestes zu einer abrupten Richtungsänderung der Polypeptidkette.

Infolge der cyclischen Struktur ist Prolin viel weniger hydrophob als

Valin, Leucin und Isoleucin.

3.2.2 Aromatische Seitenketten

Die Seitenketten von Phenylalanin (Phe, F), Tyrosin (Tyr, Y) und Tryptophan (Trp, W)

weisen aromatische Gruppen auf. Phenylalanin besitzt eine hydrophobe Benzyl-

Seitenkette. Tyrosin ähnelt strukturell Phenylalanin, unterscheidet sich von diesem

aber durch eine para-Hydroxygruppe (¬OH) am Phenylring. Tyrosin ist also ein

Phenol. Die Hydroxylgruppe von Tyrosin kann ionisiert (deprotoniert) werden. Unter

physiologischen Bedingungen liegt sie aber in nichtionischer, protonierter Form vor.

Die Seitenkette von Tryptophan enthält eine bicyclische Indolgruppe. Tyrosin und

Tryptophan sind nicht so hydrophob wie Phenylalanin, weil ihre Seitenketten polare

Gruppen aufweisen.

Alle drei aromatischen Aminosäuren absorbieren ultraviolettes Licht (UV-Licht),

da sie im Gegensatz zu den aliphatischen Aminosäuren delokalisierte π-Elektronen

besitzen. Bei neutralem pH-Wert liegen die Absorptionsmaxima von Tryptophan

und Tyrosin bei 280 nm, während Phenylalanin UV-Licht bei 280 nm kaum und bei

seinem Absorptionsmaximum von 260 nm schwach absorbiert. Die meisten Proteine

absorbieren UV-Licht mit einer Wellenlänge von 280 nm, da sie Tryptophan

und Tyrosin enthalten. Die Extinktion bei 280 nm wird routinemäßig genutzt, um

die Konzentration von Proteinen in Lösung abzuschätzen.

3.2.3 Schwefelhaltige Seitenketten

Methionin (Met, M) und Cystein (Cys, C) sind die beiden einzigen schwefelhaltigen

Standard-Aminosäuren. Die Seitenkette von Methionin enthält eine Methylthioether-Gruppe,

die Methionin einen eher hydrophoben Charakter verleiht. Methionin

spielt bei der Proteinbiosynthese eine spezielle Rolle, weil es fast immer die

erste Aminosäure bei der Synthese einer Polypeptidkette darstellt.

Die Struktur von Cystein ergibt sich formal aus der Struktur von Alanin, wenn

man ein Wasserstoffatom der Seitenkette durch eine Sulfhydrylgruppe (¬SH) ersetzt.

Auch wenn die Seitenkette von Cystein leicht hydrophob ist, besitzt sie dennoch

eine hohe Reaktivität. Wegen der Polarisierbarkeit des Schwefelatoms kann

die Sulfhydrylgruppe Wasserstoffbrücken zu Sauerstoff- und Stickstoffatomen bilden.

Darüber hinaus ist die Sulfhydrylgruppe eine schwache Säure, so dass sie durch

die Abspaltung eines Protons in ein negativ geladenes Thiolat-Ion umgewandelt

werden kann.

Nach der Hydrolyse mancher Proteine kann eine Verbindung isoliert werden, die

Cystin genannt wird. Cystin entsteht durch die oxidative Verknüpfung von zwei

Cysteinmolekülen über eine Disulfidbindung (Abbildung 3.4). Die Oxidation der

Sulfhydrylgruppen von Cystein läuft am leichtesten bei schwach alkalischen pH-

Werten ab, weil die Sulfhydrylgruppen im Alkalischen in deprotonierter, ionischer

Form vorliegen. Um eine Disulfidbindung bilden zu können, müssen sich die beiden

beteiligten Cystein-Seitenketten in unmittelbarer räumlicher Nachbarschaft

zueinander befinden, aber sie können in der Aminosäuresequenz der Polypeptidkette

trotzdem weit auseinanderliegen. Disulfidbindungen, die auch Disulfidbrücken

genannt werden, können die dreidimensionale Struktur von Proteinen durch die


OOC

CH

NH 3

Cystein

CH 2

SH

Oxidation

kovalente Vernetzung von Cysteinresten in Peptidketten stabilisieren. Die meisten

Proteine enthalten keine Disulfidbrücken, weil die reduktiven Bedingungen innerhalb

von Zellen Oxidationen nicht begünstigen und die Stabilität der Disulfidbrücken

vermindern. In vielen extrazellulären Proteinen findet man dagegen Disulfidbrücken.

Dort dienen sie offensichtlich der Stabilisierung der Proteinstruktur gegenüber

wechselnden Bedingungen mit weniger kontrollierten Temperaturen und pH-

Werten.

3.2.4 Seitenketten mit alkoholischen Gruppen

Serin (Ser, S) und Threonin (Thr, T) besitzen ungeladene, polare Seitenketten mit

β-Hydroxygruppen. Diese alkoholischen Gruppen verleihen den aliphatischen Seitenketten

einen hydrophilen Charakter. Im Gegensatz zur phenolischen Hydroxylgruppe

von Tyrosin können der primäre und der sekundäre Alkohol Serin und

Threonin nur wesentlich schwerer deprotoniert und somit ionisiert werden. Die

Hydroxymethylgruppe (¬CH2OH) von Serin liegt in wässriger Lösung kaum in

ionischer Form vor. Trotzdem zeigt dieser Alkohol im aktiven Zentrum einer Vielzahl

von Enzymen nucleophile Eigenschaften, die denen der ionischen Form ähneln.

Threonin weist wie Isoleucin zwei Chiralitätszentren auf, das α- und β-C-Atom. Das

einzige der vier möglichen Stereoisomere von Threonin, das in Proteinen vorkommt,

ist L-Threonin. Die übrigen drei Stereoisomere heißen D-Threonin, L-Allothreonin

und D-Allothreonin.

3.2.5 Basische Seitenketten

+ HS CH2 CH COO

Cystein

OOC CH CH2 S S CH

NH 3

Cystin

Histidin (His, H), Lysin (Lys, K) und Arginin (Arg, R) besitzen hydrophile Stickstoffbasen

in ihren Seitenketten, die bei einem pH-Wert von 7 protoniert und somit

positiv geladen sind. Die Seitenkette von Histidin enthält einen Imidazolring,

dessen protonierte Form Imidazolium-Ion genannt wird (Abschnitt 3.4). Lysin ist

eine Diaminosäure, die sowohl eine α- als auch eine δ-Aminogruppe aufweist. Die

ε-Aminogruppe liegt bei neutralem pH-Wert als Alkylammonium-Ion (¬CH 2¬NH 3 )

vor und verleiht Proteinen somit eine positive Ladung. Von den 20 Standard-Aminosäuren

ist Arginin diejenige mit der größten Basizität. Infolgedessen kommt seine

Seitenkette unter den Bedingungen, die normalerweise in Zellen gefunden werden,

nur in der protonierten Form als Guanidinium-Ion vor. Jede Arginin-Seitenkette trägt

deswegen eine positive Ladung zur Gesamtladung des Proteins bei.

NH 3

−2 e , −2 H (A + 2 e + 2 H " H A)

2

CH 2

NH 3

COO

3.2 Strukturen der zwanzig Standard-Aminosäuren in Proteinen

Abbildung 3.4: Bildung von Cystin. Wenn die

Sulfhydrylgruppen zweier Cysteinmoleküle durch

Oxidation verknüpft werden, entsteht ein Disulfid,

das Cystin genannt wird. Dabei werden insgesamt

zwei Elektronen von den Cysteinmolekülen auf

einen Akzeptor A (Oxidationsmittel) übertragen.

H 3N

COO

C

CH 2

OH

Serin [S]

(Ser)

H

H 3N

H

COO

C H

C

CH 3

Threonin [T]

(Thr)

OH

85


3

86

Aminosäuren und die Primärstruktur von Proteinen

H 3N

HN

COO

C H

CH 2

N

Histidin [H]

(His)

..

H 3N

COO

C H

CH 2

CH 2

CH 2

CH 2

NH 3

Lysin [K]

(Lys)

C H

H 2N NH 2

Arginin [R]

(Arg)

3.2.6 Saure Seitenketten und ihre Amidderivate

Aspartat (Asp, D) und Glutamat (Glu, E) stellen Aminodicarbonsäuren, deren hydrophile

Seitenketten bei einem pH-Wert von 7 negativ geladen vorliegen. Zusätzlich

zur α-Carboxylgruppe besitzt Aspartat noch eine β-Carboxylgruppe und Glutamat

eine γ-Carboxylgruppe. Da ihre Seitenketten bei einem pH-Wert von 7 ionisiert sind,

tragen Aspartat und Glutamat mit je einer negativen Ladung zur Gesamtladung des

Proteins bei. Aspartat und Glutamat werden manchmal auch Asparaginsäure und

Glutaminsäure genannt, aber unter den meisten physiologischen Bedingungen

kommen sie in Form ihrer konjugierten Basen, den Carboxylat-Anionen, vor, deren

Namen durch die Endung -at gekennzeichnet werden. Das Mononatriumsalz von

Glutamat (Natriumglutamat) ist Ihnen wahrscheinlich als Geschmacksverstärker in

Nahrungsmitteln vertraut.

Asparagin (Asn, N) und Glutamin (Gln, Q) sind die Monoamide von Asparaginsäure

und Glutaminsäure, in denen jeweils die Carboxylgruppe in der Seitenkette

amidiert vorliegt. Obwohl die Seitenketten von Asparagin und Glutamin ungeladen

auftreten, sind diese Aminosäuren sehr polar und werden häufig auf der Oberfläche

von Proteinen gefunden, wo sie mit den Wassermolekülen in der Umgebung des

Proteins in Wechselwirkung treten können. Die polaren Amidgruppen von Asparagin

und Glutamin können außerdem Wasserstoffbrücken zu Atomen in den Seitenketten

anderer polarer Aminosäuren bilden.

COO

H3N C H

CH 2

COO

Aspartate [D]

(Asp)

H 3N

COO

C H

CH 2

CH 2

COO

Glutamat [E]

(Glu)

H 3N

COO

CH 2

CH 2

CH 2

NH

C

COO

H3N C H

CH 2

C

H 2N O

Asparagin [N]

(Asn)

H 3N

3.2.7 Die Hydrophobie der Seitenketten von Aminosäuren

COO

C H

CH 2

CH 2

C

H 2N O

Glutamin [Q]

(Gln)

Die unterschiedlichen Eigenschaften der Seitenketten von Aminosäuren reichen

von sehr hydrophob über schwach polar bis sehr hydrophil. Die relative Hydrophobie

oder Hydrophilie einer Aminosäure wird auch ihre Hydropathie genannt.


Es gibt mehrere Wege die Hydropathie von Aminosäuren zu messen. Die meisten

dieser Methoden stützen sich auf die Berechnung der Tendenz einer Aminosäure,

eine hydrophobe oder eine hydrophile Umgebung zu bevorzugen. Eine häufig verwendete

Hydropathie-Skala finden Sie in Tabelle 3.1. Aminosäuren mit stark

positiven Hydropathie-Werten gelten als hydrophob, während diejenigen mit großen

negativen Hydropathie-Werten als hydrophil angesehen werden. Die Bestimmung

der Hydropathie-Werte mancher Aminosäuren, die in der Nähe des Zentrums

der Skala liegen, erweist sich als schwierig. Es existieren zum Beispiel Meinungsverschiedenheiten

über die Hydrophilie der Indolgruppe von Tryptophan, so dass

Tryptophan in einigen Skalen viel niedrigere Hydropathie-Werte aufweist.

Die Hydropathie ist ein wichtiger Faktor bei der Faltung von Proteinketten, weil

hydrophobe Seitenketten dazu neigen, sich im Inneren eines Proteins zusammenzulagern,

während hydrophile Aminosäurereste meistens auf der Oberfläche des Proteins

gefunden werden. Allerdings ist es noch nicht möglich genau vorherzusagen,

ob sich ein gegebener Aminosäurerest im nichtwässrigen Inneren eines Proteins oder

auf dessen Oberfläche, die mit der Umgebung in Kontakt steht, befindet. Hydropathie-

Messwerte von freien Aminosäuren, wie sie in Tabelle 3.1 zu finden sind, werden

genutzt, um vorherzusagen, welche Segmente von Membranproteinen wahrscheinlich

in die hydrophobe Lipiddoppelschicht (Kapitel 9) eingebettet sind.

Andere Aminosäuren

und Aminosäurederivate 3.3

In lebenden Organismen kommen mehr als 200 verschiedene Aminosäuren vor.

Zusätzlich zu den Standard-Aminosäuren, die in Proteine eingebaut werden, enthalten

alle Spezies eine Vielfalt von L-Aminosäuren, die entweder Vorstufen von

Standard-Aminosäuren oder Zwischenprodukte bei anderen biochemischen Stoffwechselwegen

darstellen. Beispiele für solche Aminosäuren sind Homocystein, Homoserin,

Ornithin und Citrullin (Kapitel 17). S-Adenosylmethionin (SAM) stellt

einen häufigen Methylgruppen-Donator in vielen biochemischen Stoffwechselwegen

dar (Abschnitt 7.2). Viele Spezies von Bakterien und Pilzen synthetisieren auch

D-Aminosäuren, die in Zellwänden oder in komplexen Peptidantibiotika, wie zum

Beispiel Actinomycin D, Verwendung finden.

Mehrere Standard-Aminosäuren werden chemisch modifiziert, um wichtige biologisch

aktive Amine zu produzieren. Diese Amine entstehen in enzymatisch katalysierten

Reaktionen, die Decarboxylierungen beinhalten. Im Gehirn von Säugetieren

wird zum Beispiel Glutamat in den Neurotransmitter γ-Aminobutyrat umgewandelt

(GABA; engl. γ-aminobutyric acid, γ-Aminobuttersäure, Abbildung 3.5a). Säugetiere

können außerdem Histamin (Abbildung 3.5b) aus Histidin synthetisieren.

Histamin ist eine der Substanzen, die die Konstriktion bestimmter Blutgefäße und die

Sekretion von Salzsäure im Magen steuern. Im Nebennierenmark wird Tyrosin zu

Epinephrin (Abbildung 3.5 c) verstoffwechselt, das im deutschen Sprachraum

besser unter dem Namen Adrenalin bekannt ist. Adrenalin und sein Vorläufer, Noradrenalin

(unterscheidet sich von Adrenalin durch die fehlende N-Methylgruppe),

sind Hormone, die bei Säugetieren an der Regulation des Stoffwechsels beteiligt sind.

Tyrosin stellt auch die Vorstufe der Schilddrüsenhormone Thyroxin und Triiodthyronin

dar (Abbildung 3.5d). Weil für die Biosynthese der Schilddrüsenhormone

Iodid erforderlich ist, werden dem gewöhnlichen Tafelsalz häufig kleine Mengen

3.3 Andere Aminosäuren und Aminosäurederivate

Aminosäure Änderung der

Freien Enthalpie

beim Transfer a

(kJ mol –1 Stark hydrophob

)

Isoleucin 3,1

Phenylalanin 2,5

Valin 2,3

Leucin 2,2

Methionin

Weniger hydrophob

1,1

Tryptophan 1,5 b

Alanin 1,01

Glycin 0,67

Cystein 0,17

Tyrosin 0,08

Prolin –0,29

Threonin –0,75

Serin

Stark hydrophil

–1,1

Histidin –1,7

Glutamat –2,6

Asparagin –2,7

Glutamin –2,9

Aspartat –3,0

Lysin –4,6

Arginin –7,5

a Die Änderung der Freien Enthalpie bezieht sich auf den

Transfer des jeweiligen Aminosäurerestes aus dem Inneren

einer Lipiddoppelschicht in Wasser.

b In anderen Hydropathie-Skalen weist Tryptophan einen

niedrigeren Hydropathie-Wert auf. (Aus: Eisenberg, D.,

Weiss, R.M., Terwilliger, T.C., Wilcox, W. 1982. Hydrophobic

moments in protein structure. Faraday Symp.

Chem. Soc. 17:109–120.)

Tabelle 3.1: Hydropathie-Skala für Aminosäurereste.

87


3

88

H 3N

Aminosäuren und die Primärstruktur von Proteinen

COO

C

CH 2

SeH

H

Selenocystein

H 3N

H 3C

COO

C

CH 2

CH 2

CH 2

CH 2

N

H

H

C O

N

Pyrrolysin

(a)

(c)

OOC CH2 CH2 CH2 NH3 HO

γ-Aminobutyrat

OH

HO CH CH2 NH2 CH3 Epinephrin

(Adrenalin)

(b)

(d)

HO

N NH

I

(I)

Histamin

O CH COO

Thyroxin / Triiodthyronin

Abbildung 3.5: Von Standard-Aminosäuren abgeleitete Verbindungen. (a) γ-Aminobutyrat ist ein

Derivat von Glutamat. (b) Histamin stellt ein Histidinderivat dar. (c) Das Tyrosinderivat Epinephrin ist im

deutschsprachigen Raum besser als Adrenalin bekannt. (d) Die Schilddrüsenhormone Thyroxin und Triiodthyronin

sind ebenfalls Derivate von Tyrosin. Thyroxin unterscheidet sich von Triiodthyronin durch ein

zusätzliches, viertes Iodatom (in Klammern).

Natriumiodid zugemischt, um Kropfbildung zu vermeiden. Ein Kropf ist die Folge

einer Schilddrüsenunterfunktion, die durch einen Mangel an Iodid in der Nahrung

verursacht wird.

Manche Aminosäuren werden chemisch modifiziert, nachdem sie in Polypeptide

eingebaut wurden. Einige Prolinreste im Protein Kollagen werden zum Beispiel zu

Hydroxyprolinresten oxidiert (Abschnitt 4.11). Eine weitere häufige Modifizierung

besteht in der Anknüpfung von komplexen Kohlenhydratketten. Dieser Prozess wird

Glycosylierung (Kapitel 8 und 22) genannt. Viele Proteine werden durch die Addition

von Phosphorylgruppen an die Seitenketten von Serin, Threonin oder Tyrosin

phosphoryliert. Auch die Bildung von Cystinresten durch die oxidative Verknüpfung

von Paaren von Cysteinresten findet nach der Synthese einer Polypeptidkette statt.

In Bakterien beginnen Polypeptidketten von Proteinen meistens mit einem Methioninrest,

der durch die Addition eines Formylrestes in N-Formylmethionin umgewandelt

wurde (Kapitel 22).

Es war eine überraschende Entdeckung, dass zusätzlich zu den 20 Standard-Aminosäuren

eine weitere Aminosäure in einige Proteine vieler Spezies eingebaut

wird. Dabei handelt es sich um Selenocystein, bei dem im Vergleich zu Cystein das

Schwefelatom gegen ein Selenatom ausgetauscht worden ist. Selenocystein wird als

Selenocysteinylrest durch die enzymatische Umwandlung von Seryl-AminoacyltRNA

Sec in Selenocysteinyl-tRNA Sec gebildet, die dann als Substrat für die Proteinbiosynthese

dient (Kapitel 22). Eine 22. Aminosäure, die in einigen Spezies von

Archaeen vorkommt, heißt Pyrrolysin. Pyrrolysin stellt eine modifizierte Form von

Lysin dar, deren Synthese vor dem Einbau in die wachsende Polypeptidkette stattfindet.

Selenocystein und Pyrrolysin werden durch eigene Codons codiert. Deswegen

werden sie als zusätzliche Mitglieder des Standardrepertoires der proteinogenen

Aminosäuren betrachtet. Infolge posttranslationaler Modifizierungen enthalten viele

Proteine mehr als die 22 Standard-Aminosäuren, die bei der Proteinbiosynthese

verwendet werden.

CH 2

CH 2

I

I

NH 3

CH 2

NH 3


Ionisierung von Aminosäuren 3.4

Die physikalischen und chemischen Eigenschaften von Aminosäuren werden von

den ionischen Zuständen der α-Carboxylgruppe, der α-Aminogruppe sowie jeder

ionisierbaren Gruppe in der Seitenkette beeinflusst. Jede ionisierbare Gruppe ist

mit einem spezifischen pKS-Wert verbunden, der dem pH-Wert entspricht, bei dem

die Konzentrationen der protonierten und der deprotonierten Form der jeweiligen

Gruppe gleich sind (Abschnitt 2.9). Wenn der pH-Wert einer Lösung unterhalb des

pKS-Wertes mindestens einer der ionisierbaren Gruppen liegt, existiert die Aminosäure

überwiegend als echte Säure, die ein Proton abgeben kann. Liegt der pH-Wert

einer Lösung oberhalb des pKS-Wertes einer ionisierbaren Gruppe, überwiegt die

deprotonierte, konjugierte Base dieser Gruppe, die in dieser Form ein Proton aufnehmen

kann. Jede Aminosäure zeigt mindestens zwei pKS-Werte, die den Protolysegleichgewichten

der α-Carboxyl- und der α-Aminogruppe zuzuordnen sind. Außerdem

besitzen sieben der Standard-Aminosäuren ionisierbare Seitenketten mit

zusätzlichen, messbaren pKS-Werten. Diese pKS-Werte variieren in Abhängigkeit

von der jeweiligen Aminosäure. Bei einem gegebenen pH-Wert weisen Aminosäuren

somit häufig unterschiedliche Nettoladungen auf.

Die ionischen Zustände der Seitenketten von Aminosäuren beeinflussen die

dreidimensionale Struktur von Proteinen. Außerdem ist die Kenntnis der ionischen

Zustände von Aminosäuren für das Verständnis von enzymatischen Mechanismen

von Bedeutung, weil an der Enzymkatalyse häufig ionisierbare Aminosäurereste

direkt beteiligt sind (Kapitel 6).

Die pKS-Werte von Aminosäuren werden mithilfe von Titrationskurven bestimmt,

die wir bereits im letzten Kapitel kennen gelernt haben. In Abbildung 3.6 finden

Sie zum Beispiel die Titrationskurve von Alanin. Alanin besitzt zwei ionisierbare

Gruppen, die α-Carboxylgruppe und die α-Aminogruppe. Die Titrationskurve von

Alanin zeigt deswegen zwei pKS-Werte bei pH-Werten von 2,4 und 9,9. Jeder pKS-Wert ist mit einer Pufferzone verbunden, in der sich der pH-Wert der Lösung durch die

Zugabe von Base (oder Säure) nur wenig ändert.

Der pKS-Wert einer ionisierbaren Gruppe entspricht einem Wendepunkt in einem

flachen Bereich der Titrationskurve. Bei diesem pH-Wert sind die Konzentrationen

pH

12

10

8

6

4

2

pK 1

pI Ala

pK 2

0

0 0,5 1,0 1,5 2,0

Äquivalente OH

H2N CH

(Anion)

COO

CH 3

H3N CH COO

(Zwitterion)

H 3N

CH 3

H H

H H

CH 3

CH COOH

(Kation)

3.4 Ionisierung von Aminosäuren

Abbildung 3.6: Titrationskurve von Alanin.

Der erste pK S-Wert beträgt 2,4 und der zweite

9,9. pI Ala repräsentiert den isoelektrischen Punkt

von Alanin.

89


3

90

Aminosäuren und die Primärstruktur von Proteinen

der Säure (Protonendonator) und der konjugierten Base (Protonenakzeptor) genau

gleich. Bei dem Beispiel in Abbildung 3.6 stimmen bei einem pH-Wert von 2,4 die

Konzentrationen der positiv geladenen Form und des Zwitterions von Alanin exakt

überein. Der zugehörige pKS-Wert beschreibt das folgende Gleichgewicht:

ƒ ƒ

CH3 CH3 NH3 ¬ CH ¬ COOH IRJ NH3 ¬ CH ¬ COO + H (3.1)

Bei einem pH-Wert von 9,9 sind die Konzentrationen des Zwitterions und der negativ

geladenen Form von Alanin gleich. Die beiden Spezies stehen folgendermaßen

im Gleichgewicht:

CH 3 CH 3

ƒ ƒ

NH 3 ¬ CH ¬ COOH IRJ NH 2 ¬ CH ¬ COO + H (3.2)

Beachten Sie, dass das Zwitterion im ersten Protolysegleichgewicht (Reaktions-

gleichung 3.1) die konjugierte Base zur Säureform von Alanin darstellt, während es

im zweiten Protolysegleichgewicht (Reaktionsgleichung 3.2) den Protonendonator

beziehungsweise die konjugierte Säure zur basischen Form von Alanin repräsentiert,

die bei höheren pH-Werten überwiegt.

Aus den Konzentrationsverhältnissen und den Nettoladungen der einzelnen Formen

von Alanin ergibt sich bei einem pH-Wert von 2,4 eine durchschnittliche Nettoladung

eines Alaninmoleküls von +0,5 und bei einem pH-Wert von 9,9 eine durchschnittliche

Nettoladung von –0,5. In der Mitte zwischen diesen beiden pH-Werten

von 2,4 und 9,9 liegt, bei einem pH-Wert von 6,15 im steilen Abschnitt der Titrationskurve,

ein weiterer Wendepunkt. An diesem Punkt beträgt die durchschnittliche

Nettoladung eines Alaninmoleküls null. Deswegen wird dieser Punkt isoelektrischer

Punkt (pI) oder auch isoelektrischer pH-Wert genannt. Wenn eine Alaninlösung mit

einem pH-Wert unterhalb von pI in einem elektrischen Feld positioniert wird, wandern

die Alaninmoleküle zur Kathode (negativ geladene Elektrode), weil die Alaninmoleküle

eine positive Nettoladung tragen. Bei einem pH-Wert oberhalb von pI

bewegen sich die Alaninmoleküle im elektrischen Feld aufgrund ihrer negativen

Nettoladung in Richtung Anode (positiv geladene Elektrode). Entspricht der pH-Wert

der Lösung genau dem pI-Wert von Alanin, findet wegen der fehlenden Nettoladung

der Alaninmoleküle keine Nettowanderung im elektrischen Feld statt.

Histidin besitzt eine ionisierbare Seitenkette. Die Titrationskurve von Histidin

weist deswegen einen weiteren Wendepunkt auf, der dem pKS-Wert der Seitenkette

entspricht ( Abbildung 3.7a). Wie im Fall von Alanin repräsentiert der erste,

niedrigste pKS-Wert (1,8) das Protolysegleichgewicht der α-Carboxylgruppe und

der größte pKS-Wert (9,3) das der α-Aminogruppe. Der mittlere pKS-Wert (6,0) in

der Titrationskurve entspricht der Deprotonierung des Imidazolium-Ions der Seitenkette

des Histidins (Abbildung 3.7b). Bei einem pH-Wert von 7,0 beträgt das Verhältnis

der Imidazolform (konjugierte Base) zum Imidazolium-Ion (konjugierte

Säure) 10:1. Somit treten sowohl die protonierte, positiv geladene als auch die neutrale

Form der Seitenkette von Histidin in der Nähe der physiologischen pH-Werte

in signifikanten Konzentrationen auf. Die Seitenkette eines bestimmten Histidinrestes

kann in Abhängigkeit von ihrer unmittelbaren Umgebung im Protein entweder

protoniert oder deprotoniert vorliegen. Mit anderen Worten: Der tatsächliche


(a)

pH

12

10

8

6

4

2

pK 1

pK 2

0

0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0

Äquivalente OH

pK 3

pK S-Wert einer Histidin-Seitenkette innerhalb eines Proteins kann sich von dem

pK S-Wert der freien Aminosäure in wässriger Lösung unterscheiden. Infolge dieser

Eigenschaften ist Histidin sehr gut als Protonenüberträger im aktiven Zentrum von

Enzymen geeignet.

Der isoelektrische Punkt einer Aminosäure, die nur zwei ionisierbare Gruppen

(die α-Carboxyl- und die α-Aminogruppe) enthält, ergibt sich aus dem arithmetischen

Mittel ihrer beiden pKS-Werte: pI = (pK1 + pK2)/2. Für eine Aminosäure mit drei

ionisierbaren Gruppen, wie zum Beispiel Histidin, muss man jedoch die Nettoladung

aller ionischen Spezies berücksichtigen. Der isoelektrische Punkt von Histidin liegt

zum Beispiel zwischen den pKS-Werten auf beiden Seiten der Spezies ohne Nettoladung.

Dieser Punkt entspricht dem Wendepunkt der Titrationskurve im zweiten

steilen Abschnitt, der auch den Endpunkt der Titration der Seitenkette repräsentiert

und bei einem pH-Wert von 7,65 in der Mitte zwischen 6,0 und 9,3 liegt.

Wie man der Tabelle 3.2 entnehmen kann, weisen die pKS-Werte der α-Carboxylgruppen

freier Aminosäuren Werte zwischen 1,8 und 2,5 auf. Diese Werte

sind niedriger als die einer typischen Carbonsäure wie Essigsäure (pKS = 4,8), weil

die benachbarte ¬NH 3 -Gruppe Elektronendichte aus der α-Carboxylgruppe ab-

zieht, wodurch die O¬H-Bindung noch stärker polarisiert wird. Infolgedessen wird

die heterolytische Abspaltung des Protons zusätzlich erleichtert. Heterolytisch heißt:

Das Bindungselektronenpaar verbleibt vollständig am Sauerstoffatom. Die α-Carboxylgruppen

der verschiedenen Aminosäuren zeigen unterschiedliche pKS-Werte, weil diese auch durch die Seitenketten beeinflusst werden. Wir haben gerade im

Beispiel gesehen, dass die Werte von Histidin und Alanin nicht übereinstimmen.

Die α-Carboxylgruppe einer Aminosäure stellt eine relativ schwache Säure dar.

Der Anteil der Gruppe, der bei einem gegebenen pH-Wert in ionischer Form vorliegt,

kann mithilfe der Henderson-Hasselbalch-Gleichung (Abschnitt 2.9) berechnet werden:

[Protonenakzeptor]

pH = pK S + log

[Protonendonator]

(3.3)

Für eine typische Aminosäure, deren α-Carboxylgruppe einen pKS-Wert von 2,0

aufweist, erhält man das Verhältnis von Protonenakzeptor (Carboxylat-Anion) zu

Protonendonator (Carbonsäure) bei einem pH-Wert von 7,0, indem man die folgende

pI His

(b)

H 3N

COO

C

CH 2

H

N H

N

H

Imidazolium-Ion

(protonierte Form)

der Histidin-Seitenkette

Abbildung 3.7: Ionisierung von Histidin. (a) Titrationskurve von Histidin. Die drei pK S-Werte betragen

1,8, 6,0 und 9,3. pI His repräsentiert den isoelektrischen Punkt von Histidin. (b) Protolysegleichgewicht des

Imidazolrings in der Seitenkette von Histidin.

3.4 Ionisierung von Aminosäuren

H

pKS = 6,0

H

Aminosäure pK S-Wert

H 3N

HN

COO

C

CH 2

N

H

..

Imidazol

(deprotonierte Form)

der Histidin-Seitenkette

Carboxyl- Amino- Seitengruppe

gruppe kette

Glycin 2,4 9,8

Alanin 2,4 9,9

Valin 2,3 9,7

Leucin 2,3 9,7

Isoleucin 2,3 9,8

Methionin 2,1 9,3

Prolin 2,0 10,6

Phenylalanin 2,2 9,3

Tryptophan 2,5 9,4

Serin 2,2 9,2

Threonin 2,1 9,1

Cystein 1,9 10,7 8,4

Tyrosin 2,2 9,2 10,5

Asparagin 2,1 8,7

Glutamin 2,2 9,1

Asparaginsäure

2,0 9,9 3,9

Glutaminsäure

2,1 9,5 4,1

Lysin 2,2 9,1 10,5

Arginin 1,8 9,0 12,5

Histidin 1,8 9,3 6,0

Tabelle 3.2: pK S-Werte der sauren und basischen

Gruppen von freien Aminosäuren bei

25°C.

91


3

92

Aminosäuren und die Primärstruktur von Proteinen

Henderson-Hasselbalch-Gleichung nach dem logarithmischen Term auflöst und

dann delogarithmiert:

[RCOO ]

7,0 = 2,0 + log

[RCOOH]

(3.4)

In diesem Fall ergibt sich ein Verhältnis von Carboxylat-Anionen zu Carbonsäuremolekülen

von 100.000:1. Unter den normalerweise innerhalb von Zellen herrschenden

Bedingungen liegen die Carboxylgruppen von freien Aminosäuren also fast

ausschließlich als Carboxylat-Anionen vor.

Die α-Aminogruppe einer freien Aminosäure kann als ungeladenes, freies Amin,

¬NH2 (Protonenakzeptor), oder in ihrer protonierten Form als Ammonium-Kation,

¬NH 3 (Protonendonator), auftreten. Die pKS-Werte der Ammonium-Ionen der

Standard-Aminosäuren variieren von 8,7 bis 10,7 (Tabelle 3.2). Bei einem pH-Wert

von 7,0 beträgt das Verhältnis von Protonenakzeptor zu Protonendonator für eine

Ammoniumgruppe, die einen pKS-Wert von 10,0 aufweist, 1:1000. Unter physiologischen

Bedingungen liegen die Aminogruppen von freien Aminosäuren somit

hauptsächlich als protonierte, positiv geladene Ammonium-Ionen vor. Diese Berechnungen

bestätigen unsere frühere Behauptung, dass freie Aminosäuren bei neutralem

pH-Wert vorwiegend als Zwitterionen auftreten. Sie zeigen auch die Realitätsferne

der Strukturformeln von Aminosäuren, die sowohl eine ¬COOH-Gruppe als auch

eine ¬NH2-Gruppe zeigen. Denn bei keinem pH-Wert existiert eine signifikante

Anzahl von Molekülen, die gleichzeitig eine neutrale, protonierte Carboxylgruppe

und eine neutrale, unprotonierte Aminogruppe besitzen. Beachten Sie, dass auch die

sekundäre Aminogruppe von Prolin (pKS = 10,6) bei neutralem pH-Wert protoniert

ist, auch wenn die Seitenkette zusätzlich an die Aminogruppe gebunden ist. Auch

freies Prolin liegt bei einem pH-Wert von 7,0 somit als Zwitterion vor.

Die sieben Standard-Aminosäuren mit leicht ionisierbaren Gruppen in ihren

Seitenketten sind Aspartat, Glutamat, Histidin, Cystein, Tyrosin, Lysin und Arginin.

Die Protolysegleichgewichte dieser Gruppen folgen denselben Prinzipien wie diejenigen

der α-Carboxyl- und α-Aminogruppen. Deswegen kann die Henderson-

Hasselbalch-Gleichung auch auf diese Gleichgewichte angewandt werden. Die Ionisierung

der γ-Carboxylgruppe von Glutamat (pKS = 4,1) ist in Abbildung 3.8a

illustriert. Beachten Sie die geringere Beeinflussung der γ-Carboxylgruppe durch

das Ammonium-Ion, was eine Folge der größeren Entfernung im Molekül darstellt,

die zu einem für eine Carbonsäure typischen pKS-Wert einer schwachen Säure von

4,1 führt. Die Säurestärke der γ-Carboxylgruppe ähnelt somit der Säurestärke von

Essigsäure (pKS = 4,8), während die α-Carboxylgruppe als eine stärkere Säure

(pKS = 2,1) auftritt. Abbildung 3.8b zeigt das Protolysegleichgewicht der Guanidiniumgruppe

in der Seitenkette von Arginin in stark basischer Lösung. Die Stabilisierung

des Guanidinium-Ions durch die Delokalisierung der Ladung trägt zu dem

hohen pKS-Wert von 12,5 bei.

Wie wir bereits erwähnt haben, können sich die pKS-Werte der ionisierbaren

Seitenketten von Aminosäuren in Proteinen von denen der entsprechenden freien

Aminosäuren unterscheiden. Diese Abweichungen in den Ionisierungskonstanten

werden hauptsächlich durch zwei Faktoren hervorgerufen. Wenn die α-Carboxylund

die α-Aminogruppen bei der Synthese von Proteinen durch Peptidbindungen

verknüpft werden, verlieren sie ihre Ladungen. Infolgedessen werden ihre induktiven

Effekte auf die benachbarten Seitenketten schwächer. Außerdem kann der

pKS-Wert einer ionisierbaren Seitenkette durch ihre Position innerhalb der drei-


(a)

H 3N

COO

α

C

β CH2 γ CH2 H

C

O OH

Carbonsäure

(protonierte Form)

der Glutamat-Seitenkette

(b)

H 2N

H 2N

COO

C

CH 2

CH 2

CH 2

NH

C

H

NH 2

Guanidinium-Ion

(protonierte Form)

der Arginin-Seitenkette

H

= 4,1

pK S

H

H

pKS = 12,5

H

H 3N

O

COO

α

C

β CH2 γ CH2 dimensionalen Struktur des Proteins beeinflusst werden. Das Enzym Ribonuclease

A besitzt zum Beispiel vier Histidinreste, deren Seitenketten aufgrund unterschiedlicher

unmittelbarer Umgebungen (Mikroumgebungen) im Protein leichte Differenzen

in ihren pKS-Werten aufweisen.

Peptidbindungen zwischen Aminosäuren

in Proteinen 3.5

Die lineare Sequenz (Reihenfolge) der Aminosäuren in der Polypeptidkette wird die

Primärstruktur eines Proteins genannt. Die Sekundärstruktur, Tertiärstruktur und

Quartärstruktur sind weitere, höhere Organisationsebenen von Proteinstrukturen.

Die Struktur von Proteinen wird im nächsten Kapitel näher besprochen, aber es ist

an dieser Stelle für das Verständnis einiger der verbleibenden Themen in diesem

Kapitel bereits notwendig, die Grundlagen von Peptidbindungen und Primärstrukturen

zu erläutern.

Aminosäuren können durch Amidbindungen verknüpft werden, die man bei

Polypeptiden auch Peptidbindungen nennt (Abbildung 3.9). Eine Peptidbindung

kann man sich formal vorstellen als Ergebnis der Kondensation einer α-Carboxylgruppe

einer Aminosäure mit der α-Aminogruppe einer anderen Aminosäure. Beachten

Sie, dass bei der Kondensationsreaktion zwischen zwei Aminosäuren ein

Wassermolekül freigesetzt wird. Wie in Abschnitt 2.6 bereits erklärt wurde, ist die ein-

C

H

O

Carboxylat-Ion

(deprotonierte Form)

der Glutamat-Seitenkette

H 2N

HN

COO

C

CH 2

CH 2

CH 2

NH

C

H

NH 2

Guanidinogruppe

(deprotonierte Form)

der Arginin-Seitenkette

3.5 Peptidbindungen zwischen Aminosäuren in Proteinen

Abbildung 3.8: Ionisierung von Aminosäureseitenketten.

(a) Protolysegleichgewicht der

γ-Carboxylgruppe von Glutamat. Die negative

Ladung des Carboxylat-Anions ist delokalisiert.

(b) Protolysegleichgewicht der Guanidiniumgruppe

in der Seitenkette von Arginin. Die positive Ladung

des Guanidinium-Ions ist stark delokalisiert.

Die Struktur von Peptidbindungen wird in

Abschnitt 4.3 genauer beschrieben.

Die Proteinbiosynthese (Translation) wird in

Kapitel 22 behandelt.

93


3

94

Aminosäuren und die Primärstruktur von Proteinen

Abbildung 3.9: Peptidbindung zwischen zwei

Aminosäuren. Die Struktur einer Peptidbindung

ist formal das Ergebnis einer Kondensationsreaktion

zwischen der α-Carboxylgruppe einer Aminosäure

und der α-Aminogruppe einer anderen

Aminosäure. Durch die Kondensation wird ein

Dipeptid gebildet, in dem die Aminosäuren über

die Peptidbindung verknüpft sind. In dem hier

gezeigten Beispiel kondensiert Alanin mit Serin zu

Alanylserin.

CH 3

CH 3

H 2O

N-Terminus H3N CH C N CH COO C-Terminus

Peptidbindung

O

H

CH 2OH

CH 2OH

H3N CH COO + H3N CH COO

fache Kondensationsreaktion in wässriger Lösung wegen des riesigen Überschusses

von Wassermolekülen sehr stark benachteiligt. Der tatsächliche Reaktionsweg in der

Proteinbiosynthese überwindet beziehungsweise umgeht diese Einschränkung. Im

Gegensatz zu den α-Carboxyl- und α-Aminogruppen von freien Aminosäuren in

wässriger Lösung tragen die in Peptidbindungen eingebundenen Carboxyl- und

Aminogruppen der Aminosäuren in Proteinen keine Ladungen.

Die in einer Polypeptidkette verknüpften Aminosäuren werden Aminosäurereste

genannt. Bei der Benennung von Oligo- oder Polypeptiden werden die Namen der

einzelnen Reste durch den Ersatz der Endungen -in, -an und -at gegen die Endung -yl

gebildet. Ein Glycinrest erhält im Namen eines Polypeptids zum Beispiel die Bezeichnung

Glycyl- und ein Glutamatrest wird durch den Namensbestandteil Glutamylvertreten.

Bei Asparagin, Glutamin und Cystein bleibt die Silbe in erhalten und die

Endung -yl wird am Ende hinzugefügt, woraus sich die Namensbestandteile Asparaginyl-,

Glutaminyl- und Cysteinyl- ergeben. Die Endung -yl deutet an, dass der Rest

eine Acyleinheit darstellt, also einen Carbonsäurerest, bei dem der Hydroxylanteil

der Carboxylgruppe durch eine andere Gruppe substituiert wurde. Das Dipeptid in

Abbildung 3.9 heißt Alanylserin, weil der Alaninrest als Acylgruppe vorliegt, während

der Serinrest am Ende der Kette seine Carboxyl- beziehungsweise Carboxylatgruppe

behält.

Die freie Aminogruppe und die freie Carboxylgruppe an den entgegengesetzten

Enden einer Polypeptidkette werden N-Terminus (Amino-Terminus) und C-Terminus

(Carboxyl-Terminus) genannt. Bei neutralem pH-Wert trägt jeder Terminus eine Ionenladung.

Konventionsgemäß werden die Aminosäurereste in einer Polypeptidkette

vom N-Terminus zum C-Terminus durchnummeriert und in der Regel von links nach

rechts hintereinandergeschrieben. Diese Übereinkunft spiegelt die Richtung der

Proteinbiosynthese wider (Abschnitt 22.6). Die Synthese beginnt mit der N-terminalen

Aminosäure, bei der es sich fast immer um Methionin handelt (Abschnitt 22.5),

und wird sequenziell in Richtung des C-Terminus durch Addition einer Aminosäure

nach der anderen fortgesetzt.

Zur Beschreibung der Sequenzen von Aminosäureresten in Peptiden und Polypeptiden

können sowohl die Drei-Buchstaben-Codes der Aminosäuren (zum Beispiel

Gly-Arg-Phe-Ala-Lys) als auch die Ein-Buchstaben-Codes (zum Beispiel GRFAK)

verwendet werden. Es ist wichtig, beide Codesysteme zu kennen. Die Begriffe Dipeptid,

Tripeptid, Oligopeptid und Polypeptid beschreiben Peptidketten mit zwei, drei,

mehreren (bis zu ca. 20) beziehungsweise vielen (in der Regel mehr als 20) Aminosäureresten.

Ein Dipeptid enthält eine, ein Tripeptid zwei Peptidbindungen usw.

Im Allgemeinen besitzt jede Peptidkette, egal wie lang sie ist, eine freie α-Amino-


gruppe und eine freie α-Carboxylgruppe. Ausnahmen von dieser Regel bilden Ketten

mit kovalent modifizierten, terminalen Resten sowie cyclische Peptidketten. Beachten

Sie, dass durch die Bildung von Peptidbindungen die ionisierbaren α-Aminound

α-Carboxylgruppen, die in freien Aminosäuren vorkommen, ihre Ionisierbarkeit

verlieren.

Die meisten Ionenladungen, die ein Protein trägt, werden durch die Seitenketten

der Aminosäuren beigesteuert. Folglich werden die Löslichkeit und die ionischen

Eigenschaften eines Proteins weitgehend durch seine Aminosäurenzusammensetzung

bestimmt. Außerdem wechselwirken die Seitenketten der Aminosäurereste

miteinander und tragen damit zur dreidimensionalen Gestalt und zur Stabilität eines

Proteins bei (Kapitel 4).

Einige Peptide sind wichtige biologische Verbindungen und die Chemie von

Peptiden stellt ein aktives Forschungsgebiet dar. Manche Hormone sind Peptide.

Endorphine sind zum Beispiel natürlich vorkommende Moleküle, die als Schmerzmodulatoren

in Wirbeltieren wirken. Einige sehr einfache Peptide werden als Nahrungsmittelzusätze

verwendet. Der Süßstoff Aspartam ist zum Beispiel der Methylester

von Aspartylphenylalanin (Abbildung 3.10). Aspartam ist ca. 200-mal süßer

als normaler Tafelzucker und wird verbreitet Diätgetränken zugesetzt. Viele Peptide,

wie sie zum Beispiel in Schlangengiften und giftigen Pilzen gefunden werden, stellen

hochpotente Toxine dar.

Techniken der Proteinreinigung 3.6

Um ein bestimmtes Protein im Labor zu untersuchen, muss man es in der Regel von

allen anderen Zellkomponenten abtrennen, einschließlich anderer, ähnlicher Proteine.

Nur wenige analytische Techniken können direkt auf die Rohmischung zellulärer

Proteine angewandt werden, weil diese hunderte (oder sogar tausende) von

verschiedenen Proteinen enthält. Die zur Reinigung erforderlichen Schritte sind

für jedes Protein unterschiedlich. Sie werden durch Ausprobieren einer Anzahl

von verschiedenen Techniken ausgearbeitet, bis eine Prozedur entwickelt werden

kann, die reproduzierbar hohe Ausbeuten des aufgereinigten und biologisch aktiven

Proteins liefert. Die Reinigungsschritte nutzen in der Regel kleine Unterschiede in

den Löslichkeiten, den Nettoladungen, den Größen und den Bindungsspezifitäten

der verschiedenen Proteine. In diesem Abschnitt betrachten wir einige der gebräuchlichsten

Methoden der Proteinreinigung. Die meisten Reinigungstechniken werden

zwischen 0 °C und 4 °C durchgeführt, um störende, temperaturabhängige Prozesse,

wie den Abbau und die Denaturierung (Entfaltung) der Proteine, während der Reinigung

zu minimieren.

Der erste Schritt bei der Proteinreinigung besteht in der Herstellung einer Proteinlösung.

Die Quelle dafür sind häufig ganze Zellen, in denen der Anteil des Zielproteins

an der Trockenmasse der Zelle normalerweise weniger als 0,1 Prozent beträgt.

Für die Isolierung eines intrazellulären Proteins ist es erforderlich, die Zellen in

einer Pufferlösung zu suspendieren und zu homogenisieren beziehungsweise in Zellfragmente

zu zerschlagen. Unter diesen Bedingungen bleiben die meisten cytosolischen

Proteine gelöst. Dies gilt für viele Membranproteine nicht, weil sie aufgrund

ihrer Einbettung in eine hydrophobe Membran eine überwiegend hydrophobe Oberfläche

aufweisen und deswegen nicht wasserlöslich sind. Zur Aufreinigung solcher

Proteine sind spezielle Reinigungstechniken erforderlich. Lassen Sie uns im Folgen-

H

NH 3

C

C O

NH

O

3.6 Techniken der Proteinreinigung

CH 2

H C CH2 C O

CH 3

COO

Abbildung 3.10: Aspartam (Aspartylphenylalaninmethylester).

95


3

96

Aminosäuren und die Primärstruktur von Proteinen

den aber annehmen, das gewünschte Protein sei eines der in der wässrigen Pufferlösung

gelösten Proteine.

Der nächste Schritt der Proteinreinigung ist häufig eine relativ grobe Trennung

oder Fraktionierung, die die unterschiedlich guten Löslichkeiten der Proteine in

Salzlösungen ausnutzt. Für solche Fraktionierungen wird oft Ammoniumsulfat eingesetzt.

Zu diesem Zweck wird zunächst gerade so viel Ammoniumsulfat zur Proteinlösung

gegeben, dass die schlecht wasserlöslichen Verunreinigungen ausgefällt werden.

Diese werden dann durch Zentrifugation entfernt. Das Zielprotein und andere,

besser lösliche Proteine verbleiben dabei in der Lösung, die man Überstand nennt.

Anschließend wird mehr Ammoniumsulfat zum Überstand hinzugefügt, bis sich ein

Niederschlag des gewünschten Proteins bildet. Die Mischung wird erneut zentrifugiert,

aber diesmal wird die überstehende Flüssigkeit entfernt und der Niederschlag

in einer möglichst kleinen Menge einer geeigneten Pufferlösung wieder gelöst. Typischerweise

kann durch die Fraktionierung mit der Hilfe von Ammoniumsulfat

eine zwei- bis dreifache Aufreinigung erreicht werden. Das bedeutet: Die Hälfte bis

zwei Drittel der unerwünschten Proteine konnten aus der resultierenden aufkonzentrierten

Proteinfraktion entfernt werden. An diesem Punkt wird nun die Pufferlösung,

welche das Zielprotein und niedermolekulare Verunreinigungen, wie Reste

des Ammoniumsulfats, enthält, durch Dialyse gegen eine Pufferlösung ausgetauscht,

die für die folgende Chromatographie geeignet ist. Zur Dialyse wird die Proteinlösung

in einen auf einer Seite verschlossenen Cellophanschlauch gegeben. Im

Anschluss wird auch das andere Ende des Dialyseschlauchs verschlossen und der

Schlauch wird in ein großes Volumen einer Pufferlösung gehängt. Die Cellophanmembran

ist semipermeabel, so dass Proteine aufgrund ihrer hohen Molekülmasse

nicht durch die Poren der Membran wandern können und somit im Inneren

des Dialyseschlauchs verbleiben. Gleichzeitig diffundieren die gelösten Substanzen

mit einer niedrigen Molekülmasse, in diesem Fall also auch die Ammonium- und

Sulfat-Ionen, heraus und werden durch die gelösten Substanzen des Puffers ersetzt

(Konzentrationsausgleich bezüglich aller gelösten Substanzen, die durch die Membran

wandern können, auf beiden Seiten; Abschnitt 2.3.3).

Die Proteinmischung, die man durch die Ammoniumsulfatfällung und die anschließende

Dialyse erhält, kann nun mithilfe der Säulenchromatographie weiter

aufgetrennt werden. Dazu wird eine zylinderförmige Säule mit einem unlöslichen

Material, wie zum Beispiel mit substituierten Cellulosefasern oder einem synthetischen

Säulenmaterial, dicht gefüllt und mit Puffer gespült. Die Proteinmischung

wird dann oben auf das Säulenmaterial aufgetragen. Nach dem Öffnen des Hahns

am unteren Ende der Säule wird das Proteingemisch durch die Matrix des unlöslichen

Säulenmaterials getrieben. Dies geschieht mithilfe der Schwerkraft und der kontinuierlichen,

von oben erfolgenden Zugabe von Lösungsmittel, das in diesem Fall

auch Laufmittel genannt wird. Solange Laufmittel durch die Säule fließt, wird das

Eluat (die Lösung, die unten aus der Säule herausläuft) auf Fraktionen aufgeteilt, von

denen einige in Abbildung 3.11a dargestellt sind. Die Geschwindigkeit, mit der die

Proteine durch die Matrix wandern, hängt von den für jedes Protein unterschiedlichen

Wechselwirkungen zwischen den Proteinen und der Matrix ab. Die verschiedenen

Proteine werden also mit ungleichen Geschwindigkeiten beziehungsweise

nach unterschiedlichen Zeiten eluiert und befinden sich daher in getrennten Fraktionen.

Um den Verlauf der chromatographischen Trennung während der Prozedur

zu verfolgen, kann die Proteinkonzentration im Eluat durch Messung der Extinktion

bei einer Wellenlänge von 280nm näherungsweise bestimmt werden (Abbil-


dung 3.11b). Wie in Abschnitt 3.2.2 bereits erwähnt wurde, absorbieren Tyrosin

und Tryptophan bei einem neutralen pH-Wert UV-Licht mit einer Wellenlänge von

280 nm. Um das gewünschte Zielprotein zu lokalisieren, müssen schließlich die biologischen

Aktivitäten oder andere charakteristische Eigenschaften der proteinhaltigen

Fraktionen untersucht werden. Die Säulenchromatographie ist technisch zur sehr

leistungsfähigen so genannten HPLC (engl. high-performance liquid chromatography)

weiterentwickelt worden. Bei der HPLC wird das Laufmittel heute in der Regel

computergesteuert unter hohem Druck durch eine kleine, dicht gepackte Säule mit

einem Metallmantel und einem sehr feinkörnigen Matrixmaterial gepumpt. Die hohe

Trennleistung ergibt sich dabei hauptsächlich aus der großen Oberfläche des Matrixmaterials,

die mit den zu trennenden Probemolekülen in Wechselwirkung treten kann.

Chromatographische Techniken werden bezüglich der Struktur und Funktion der

verwendeten Matrix klassifiziert. Bei der Ionenaustausch-Chromatographie trägt die

Matrix positive (Anionenaustauscher-Harz) oder negative (Kationenaustauscher-Harz)

Ladungen. Ein Anionenaustauscher bindet negativ geladene Proteine und hält sie bis

zur nachfolgenden Elution zurück. Im Gegensatz dazu binden Kationenaustauscher

positiv geladene Proteine. Die gebundenen Proteine können anschließend durch allmähliche

Steigerung der Salzkonzentration des Laufmittels nach und nach eluiert

werden. Im Verlauf des Konzentrationsgradienten des Salzes im Laufmittel wird

irgendwann eine ausreichend große Salzkonzentration erreicht, um einen Austausch

der Proteine an den Bindungsstellen der Matrix gegen die Ionen des Salzes zu bewirken.

Das abgelöste Protein wird eluiert und aufgefangen. Die Trennung beruht darauf,

dass die verschiedenen gebundenen Proteine bei unterschiedlichen Salzkonzentrationen

eluiert werden. Wegen des guten Trenneffektes ist die Ionenaustausch-Chromatographie

ein wirksames Werkzeug zur Proteinreinigung.

3.6 Techniken der Proteinreinigung

(a) kontinuierlicher Fluss eines Elutionsmittels

Abbildung 3.11: Säulenchromatographie.

(a) Eine Proteinmischung wird oben auf eine Säule,

Protein-

die mit einer festen Matrix dicht gepackt ist, aufmischunggetragen.

Anschließend fließt das Laufmittel aus

einem Vorratsbehälter kontinuierlich durch die

Säule. Durch das Laufmittel und die Schwerkraft

angetrieben, wandern die verschiedenen Proteine

(dargestellt als blaue und orangefarbene Banden)

mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten, die von

den Wechselwirkungen der jeweiligen Proteine mit

der festen Matrix abhängen, durch die Säule. Das

Eluat wird in einer Reihe von Fraktionen, von denen

nur einige gezeigt sind, getrennt aufgefangen.

(b) Der Proteingehalt in den einzelnen Fraktionen

wird während der Chromatographie durch Messung

der Extinktion bei 280nm näherungsweise

bestimmt. Die Signale entsprechen der Elution der

in (a) gezeigten Proteinbanden. Die Fraktionen werden

schließlich auf die Anwesenheit des Zielpro-

sequenziell gesammelte Fraktionen

teins getestet.

(b)

A 280

Fraktionsnummer

97


3

98

Aminosäuren und die Primärstruktur von Proteinen

Bei der Gelfiltrations-Chromatographie werden Proteine auf der Grundlage ihrer

molekularen Größe getrennt. Das Gel ist eine Matrix aus porösen Kügelchen. Proteine,

die kleiner sind als der durchschnittliche Porendurchmesser, dringen leicht und

häufig in das Innere der Kügelchen ein und werden auf diese Weise durch die Matrix

aufgehalten, während die Pufferlösung durch die Säule fließt. Für größere Proteine

sind entsprechend weniger Poren zugänglich. Infolgedessen wandern die größten

Proteine praktisch ungebremst zwischen den Kügelchen hindurch und werden zuerst

eluiert.

Die Affinitätschromatographie ist die selektivste Art der Säulenchromatographie.

Sie beruht auf spezifischen, bindenden Wechselwirkungen zwischen dem Zielprotein

und einem anderen Molekül, das kovalent an die Matrix der Säule gebunden ist. Das

an die Matrix gebundene Molekül kann ein kleiner Ligand sein, der auch in vivo an

das Protein bindet, oder ein Antikörper, der das Zielprotein spezifisch erkennt, oder

ein anderes Protein, das mit dem Zielprotein innerhalb der Zelle bekanntermaßen in

spezifische Wechselwirkung tritt. Wenn eine Proteinmischung durch eine solche

Säule wandert, wird nur das Zielprotein spezifisch an die Matrix gebunden. Die

Säule wird dann mehrmals mit Pufferlösung gewaschen, um nichtspezifisch gebundene

Proteine auszuspülen. Schließlich kann das Zielprotein mit einer hochkonzentrierten

Salzlösung, die die bindenden Wechselwirkungen zwischen dem Protein und

der Säulenmatrix aufhebt, eluiert werden. In manchen Fällen kann das Zielprotein

auch von der Affinitätsmatrix abgelöst werden, indem man dem Elutionspuffer einen

Überschuss des ungebundenen Liganden hinzufügt. Dann bindet das Protein bevorzugt

an den in hoher Konzentration gelösten Liganden im Elutionspuffer statt an den

niedriger konzentrierten, matrixgebundenen Liganden. Diese Methode ist am effektivsten,

wenn der Ligand ein kleines Molekül ist. Mit der Affinitätschromatographie

allein kann ein Protein um den Faktor 1000 bis 10.000 aufgereinigt werden.

Analysetechniken 3.7

Die Elektrophorese dient zur Trennung von Proteinen auf der Grundlage ihrer Wanderung

in einem elektrischen Feld. Bei der Polyacrylamidgel-Elektrophorese (PAGE)

werden die Proteinproben auf eine hochvernetzte Gelmatrix aus Polyacrylamid gegeben,

an die anschließend ein elektrisches Feld gelegt wird. Die Matrix wird durch

Pufferung auf einen schwach alkalischen pH-Wert eingestellt, so dass die meisten

Proteine in anionischer Form vorliegen und zur Anode wandern. Typischerweise

werden mehrere Proben parallel zusammen mit einer Referenzprobe analysiert. Die

Gelmatrix bremst die durch das elektrische Feld erzwungene Wanderung der Proteine

in Abhängigkeit von ihrer Größe. Dabei werden im Gegensatz zur Gelfiltration

die größeren Moleküle stärker zurückgehalten. Im Endeffekt werden die Proteine bei

der PAGE also sowohl auf der Basis ihrer Ladung als auch ihrer Größe beziehungsweise

Masse getrennt.

Eine Modifikation der Elektrophoresetechnik verwendet die negativ geladenen

Anionen des Detergens Natriumdodecylsulfat (SDS, engl. sodium dodecyl sulfate,

Abbildung 2.8), um die natürliche Ladung der Proteine zu maskieren, so dass die

Trennung nur noch aufgrund der Masse der Proteine erfolgt. Die SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese

(SDS-PAGE) wird eingesetzt, um die Reinheit eines Proteins

und sein Molekülgewicht abzuschätzen. Bei der SDS-PAGE wird das Detergens

sowohl dem Polyacrylamidgel als auch den Proteinproben hinzugefügt. Zu


(a)

Puffer

SDS-behandelte Proben

in den Taschen des Gels

SDS-Polyacrylamidgel

zwischen Glasplatten

(b)

Puffer

angefärbtes Polyacrylamidgel

Probenspuren

1

2

3

den Proteinproben wird außerdem ein Reduktionsmittel gegeben, um alle Disulfid-

bindungen zu reduzieren. Das Dodecylsulfat-Anion (CH 3(CH 2) 11OSO 3 ; Abbil-

dung 2.8), das einen langen hydrophoben Schwanz aufweist, bindet an die hydrophoben

Seitenketten von Aminosäureresten in der Polypeptidkette. Die Bindung

von SDS an ein typisches Protein erfolgt etwa in einem Verhältnis von einem SDS-

Anion (Dodecylsulfat-Anion) pro zwei Aminosäurereste. Da größere Proteine entsprechend

mehr SDS-Anionen binden als kleinere, ist das Ladungs-Masse-Verhältnis

für alle behandelten Proteine annähernd gleich. Alle SDS-Protein-Komplexe

sind stark negativ geladen und wandern zur Anode, wie in Abbildung 3.12a illustriert.

Dabei ist ihre Wanderungsgeschwindigkeit durch das Gel umgekehrt proportional

zum Logarithmus ihrer Masse, da größere Proteine durch die netzartige

Struktur des Gels einen größeren Widerstand überwinden müssen und deswegen

langsamer wandern als die SDS-Komplexe kleinerer Proteine. Dieser Siebeffekt

unterscheidet sich von der Gelfiltrations-Chromatographie, da bei der Gelfiltration

größere Moleküle vom Zugang zu den zu kleinen Poren ausgeschlossen sind und

somit schneller wandern als kleinere Proteine. Bei der SDS-PAGE müssen alle Proteinmoleküle

die Poren beziehungsweise Siebmaschen des Gels durchdringen, so

dass die größten Proteine am langsamsten wandern. Die Proteinbanden, die durch

diese unterschiedlich schnellen Wanderungen der verschiedenen Proteine entstehen,

können durch Anfärben sichtbar gemacht werden (Abbildung 3.12b und

Abbildung 3.13). Die Molekülmasse eines unbekannten Proteins kann durch den

Vergleich seiner Wanderungsgeschwindigkeit mit derjenigen eines Referenzproteins

auf demselben Gel annäherungsweise bestimmt werden.

Obwohl die SDS-PAGE hauptsächlich als analytisches Werkzeug zum Einsatz

kommt, kann die Technik auch für die Reinigung von Proteinen angepasst werden.

Die denaturierten Proteine können bei der SDS-PAGE durch Ausschneiden der Banden

wiedergewonnen werden. Das jeweilige Protein wird durch Elektroelution,

bei der das Protein infolge eines elektrischen Feldes in eine Pufferlösung hinein-

4

5

Wanderungsrichtung

sinkende Molekülmasse

Energieversorgung

3.7 Analysetechniken

Abbildung 3.12: SDS-PAGE. (a) Eine Elektrophoreseapparatur

umfasst ein SDS-Polyacrylamidgel

zwischen zwei Glasplatten und eine Pufferlösung

in einem oberen und einem unteren

Vorratsbehälter. Die Proteinproben werden in die

Taschen des Gels gefüllt und anschließend wird

eine elektrische Spannung angelegt. Da die mit

SDS komplexierten Proteine negativ geladen sind,

wandern sie zur Anode. (b) Das Bandenmuster

einer Proteinprobe kann nach der Elektrophorese

durch Anfärben sichtbar gemacht werden. Da die

kleinsten Proteine am schnellsten wandern, befinden

sich die Banden der Proteine mit der geringsten

Molekülmasse nach der Elektrophorese am

Fuße des Gels (unten).

Myosin

-Galactosidase

Rinder-Serumalbumin

Ovalbumin

Carboanhydrase

Sojabohnen-Trypsin-

Inhibitor

Lysozym

Aprotinin

Abbildung 3.13: Angefärbte Proteine, die auf

einem SDS-Polyacrylamidgel durch Elektrophorese

getrennt wurden.

99


3

100

Aminosäuren und die Primärstruktur von Proteinen

wandert, aus dem ausgeschnittenen Gel extrahiert. Nach der Konzentrierung und der

Entfernung von Salzen kann ein solches Proteinpräparat für strukturelle Analysen,

für die Herstellung von Antikörpern oder andere Zwecke verwendet werden.

Wie der Name bereits andeutet, handelt es sich bei der Massenspektrometrie um

eine Technik, mit der unter anderem die Massen von Molekülen bestimmt werden

können. Im einfachsten Typ eines Massenspektrometers wird die Zeit gemessen, die

ein geladenes Gasphasen-Molekül benötigt, um eine definierte Wegstrecke bis zu

einem Detektor nach einer definierten Beschleunigung in einem elektrischen Feld

im Vakuum zu durchfliegen (Flugzeitanalysator oder TOF-Analysator; engl. time-offlight

analysator). Die Flugzeit hängt von der Ladung und von der Masse des Moleküls

ab. Deswegen wird als Ergebnis das Masse-Ladungs-Verhältnis (m/z) dokumentiert.

Diese Technik wird in der Chemie bereits seit fast einhundert Jahren eingesetzt,

aber ihre Anwendung auf Proteine war bis vor kurzer Zeit nur sehr eingeschränkt realisierbar,

weil es nicht möglich war, geladene Proteinmoleküle in einen gasförmigen

Partikelstrom im Vakuum zu überführen.

Dieses Problem wurde in den späten 1980er-Jahren mit der Entwicklung zweier

neuer Typen von Massenspektrometern gelöst. Bei der Elektrospray-Massenspektrometrie

wird die Proteinlösung durch eine feine Kapillare in ein Vakuum gepumpt.

Zwischen der Spitze der Kapillare und einer Gegenelektrode liegt dabei eine hohe

Spannung an. Die winzigen Tröpfchen, die ins Vakuum eingespritzt werden, verdampfen

sofort und setzen gasförmige, durch die Spannung an der Spitze der Kapillare

ionisierte, geladene Proteine in die Gasphase frei. Diese geladenen Proteine

werden in einem elektrischen Feld beschleunigt und ihre Masse wird auf der Grundlage

der Ablenkung ihrer Flugbahn in einem definierten Magnetfeld analysiert. Die

zweite neue Technik ist die so genannte Matrix-Assisted Laser-Desorption Ionization

(MALDI). Bei dieser Technik wird das Protein mit einer chemischen Matrix

gemischt und diese proteinhaltige Matrix wird auf einen Metallträger aufgebracht.

Die Matrix besteht aus kleinen, sauren, organischen Molekülen, die Licht einer bestimmten

Wellenlänge absorbieren, die in der Regel im UV-Bereich liegt. Die Proteine

werden infolge einer Protonierung durch die sauren Matrixmoleküle ionisiert.

Im Vakuum des Massenspektrometers absorbieren nun die Matrixmoleküle das Licht

von Laserpulsen, die die Absorptionswellenlänge der Matrixmoleküle aufweisen,

und werden dadurch explosionsartig ins Vakuum freigesetzt. Dabei reißen sie die geladenen

Proteinmoleküle aus dem Substrat mit ins Vakuum (Desorption). Die geladenen

Proteine in der Gasphase werden durch ein definiertes elektrisches Feld in

Richtung des Detektors beschleunigt (Abbildung 3.14). Wenn die Masse des Proteins

mit einem TOF-Analysator ermittelt wird, nennt man diese Technik MALDI-TOF.

Die Rohdaten aus einem Massenspektrometrie-Experiment können, wie in Abbildung

3.14c gezeigt, relativ einfach sein. Bei einem einzelnen Teilchen, das genau eine

positive Ladung trägt, entspricht der Zahlenwert des gemessenen Masse-Ladungs-

Verhältnisses (m/z) gleichzeitig dem Zahlenwert der Masse des Teilchens. In anderen

Fällen, insbesondere bei der Elektrospray-Massenspektrometrie, kann das Massenspektrum

ein wesentlich komplizierteres Bild bieten. Häufig treten Signale mehrerer

unterschiedlich geladener Spezies im Spektrum auf, so dass die korrekte Masse des

Proteins durch die Analyse einer größeren Zahl von Signalen von Molekülen mit

einer Ladung von +1, +2, +3 etc. bestimmt werden muss. Das Spektrum kann regelrecht

entmutigen, wenn die Proteinprobe nicht gut genug aufgereinigt wurde und deswegen

noch aus einer Mischung verschiedener Proteine besteht. Glücklicherweise

sind heute hochentwickelte Computerprogramme verfügbar, mit denen die Daten ana-


(a)

Metallträger

(Abstoßungselektrode)

(b)

(c)

relative

Intensität

Matrix

Laser

Laser

Beschleunigungselektrode

m/z

Matrixmoleküle

Proteine

TOF-Analysator

Detektor

lysiert und die korrekte Masse berechnet werden kann. Die Massenspektrometrie verdankt

ihre derzeitige Popularität in gleichem Maß der Entwicklung dieser Software

wie auch der neuen Gerätetechnik und den neuen Methoden der Probenpräparation.

Die Massenspektrometrie stellt eine sehr empfindliche und äußerst genaue Analysentechnik

dar. Häufig kann die Masse eines Proteins bereits aus picomolaren Mengen,

die von einem SDS-PAGE-Gel isoliert worden sind, erhalten werden. Die korrekte

Masse kann durch die Massenspektrometrie mit einer Genauigkeit von weniger

als der Masse eines einzelnen Protons bestimmt werden.

3.7 Analysetechniken

Abbildung 3.14: MALDI-TOF-Massenspektrometrie.

(a) Durch die Energie von Laserpulsen

werden geladene Proteinmoleküle aus der Matrix

ins Vakuum freigesetzt. (b) Die geladenen Proteine

werden durch ein elektrisches Feld in Richtung des

Detektors beschleunigt. (c) Die Flugzeit bis zum

Detektor hängt von der Ladung und der Masse des

Proteins ab.

101


3

102

Aminosäuren und die Primärstruktur von Proteinen

Abbildung 3.15: Säurekatalysierte Hydrolyse

eines Peptids. Durch die Behandlung mit 6 M HCl

bei 110°C über 16 bis 72 Stunden werden die

Aminosäuren eines Peptids freigesetzt.

PITC

N C S

H ..

N

COO

C H

Aminosäure

H R

pH = 9,0

S

N C

N

H H

COO

PTC-Aminosäure

Abbildung 3.16: Behandlung einer Aminosäure

mit Phenylisothiocyanat (PITC). Die

α-Aminogruppe einer Aminosäure reagiert mit

Phenylisothiocyanat zur entsprechenden Phenylthiocarbamoyl-Aminosäure

(PTC-Aminosäure).

C

R

H

H 3N

R 1

CH

H 3N

R 1

COOH

O

CH C N CH C

H

2H 2O

R 2

R 2

O

6M HCl

+ H3N CH COOH + H3N CH COOH

Aminosäurenzusammensetzung von Proteinen 3.8

Nachdem ein Protein isoliert wurde, kann seine Aminosäurenzusammensetzung

ermittelt werden. Zu diesem Zweck werden zunächst die Peptidbindungen des Proteins

gespalten. Dies erfolgt durch eine saure Hydrolyse, die typischerweise mit

6 M HCl durchgeführt wird (Abbildung 3.15). Im Anschluss wird das Hydrolysat

(die Lösung mit dem hydrolysierten Protein) chromatographisch getrennt und die einzelnen

Aminosäuren werden quantitativ analysiert. Diese Prozedur nennt man Aminosäurenanalyse.

Bei einer sehr gebräuchlichen Methode zur Aminosäurenanalyse

wird das Proteinhydrolysat bei einem pH-Wert von 9,0 mit Phenylisothiocyanat

(PITC) behandelt, um die Phenylthiocarbamoyl-Aminosäurederivate (PTC-Aminosäuren)

zu erzeugen (Abbildung 3.16). Die Mischung der PTC-Aminosäuren wird

dann mithilfe der HPLC getrennt. Dabei wird eine HPLC-Säule eingesetzt, die mit

einem feinen Kieselgel gefüllt ist, an welches kurze Kohlenwasserstoffketten angeknüpft

sind. Auf einer solchen Säule werden die Aminosäuren aufgrund der unterschiedlichen

hydrophoben Eigenschaften ihrer Seitenketten getrennt. Jedes der PTC-

Aminosäurederivate wird bei der Elution detektiert und seine Konzentration wird

durch Messung der Extinktion des Eluats bei 254 nm (Absorptionsmaximum des

PTC-Restes) bestimmt. Ein Beispiel eines Diagramms der Extinktion des Eluats in

Abhängigkeit von der Zeit finden Sie in Abbildung 3.17. Jedes Signal entspricht

einer bestimmten PTC-Aminosäure und repräsentiert damit auch eine Aminosäure,

die im ursprünglichen Protein enthalten war. Da die verschiedenen PTC-Amino-

Extinktion

H

R 3

N CH

COOH

BZ S G H TA R P Y VM IL F K

0 5 10 15

Zeit (min)

20 25 30 35

Abbildung 3.17: Chromatogramm aus einer HPLC-Trennung von PTC-Aminosäuren. PTC-Aminosäuren

im Eluat der Säule werden durch ihre Extinktion bei 254 nm detektiert. Die Signale sind mit dem

Ein-Buchstaben-Code der zugehörigen Aminosäuren gekennzeichnet. Die Buchstaben B und Z stehen für

alle Aspartat- und Asparaginreste (B) beziehungsweise alle Glutamin- und Glutamatreste (Z) zusammen.

(Aus: Hunkapiller, M.W., Strickler, J.E., Wilson, K.J. 1984. Contemporary methodology for protein structure

determination. Science 226: 304 – 311.)

R 3


säurederivate mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten eluiert werden, kann man

mithilfe des Elutionszeitpunktes durch den Vergleich mit bekannten Standards die

jeweilige Aminosäure identifizieren. Die Gesamtmenge jeder Aminosäure ist proportional

zur Fläche unter ihrem Signal. Mit dieser Methode der Aminosäurenanalyse

können noch Proben untersucht werden, die nur etwa ein Picomol (10 −12 mol) eines

Proteins mit etwa 200 Aminosäureresten enthalten.

Trotz ihrer Nützlichkeit kann die saure Hydrolyse keine vollständige Aminosäurenanalyse

liefern. Die Amidbindungen in den Seitenketten von Asparagin und

Glutamin werden nämlich durch die Säure ebenfalls gespalten, so dass Asparaginsäure

und Glutaminsäure entstehen. Eine Unterscheidung zwischen Asparagin und

Asparaginsäure sowie zwischen Glutamin und Glutaminsäure ist auf diese Weise

also nicht möglich. Deswegen werden bei der Anwendung der sauren Hydrolyse die

gefundenen Glutamat- und Glutaminreste gemeinsam mit Glx beziehungsweise Z

sowie die Asparagin- und Aspartatreste gemeinsam mit Asx beziehungsweise B

gekennzeichnet. Diese Benennung wurde auch im Diagramm der Abbildung 3.17 verwendet.

Weitere Einschränkungen der Anwendbarkeit der sauren Hydrolyse ergeben

sich aus den kleinen Verlusten von Serin, Threonin und Tyrosin. Außerdem wird

die Seitenkette von Tryptophan fast vollständig zerstört.

Durch die Anwendung der verschiedenen Analysetechniken ist die vollständige

Aminosäurenzusammensetzung von vielen Proteinen bestimmt worden. Dabei wurden

teilweise dramatische Unterschiede in der Zusammensetzung der Proteine gefunden,

die das enorme Potenzial widerspiegeln, das sich aus der großen Zahl möglicher Kombinationen

der 20 verschiedenen Aminosäuren ergibt. Die Aminosäurenzusammensetzung

wie auch die Sequenz eines Proteins kann prinzipiell auch aus der Sequenz

des zugehörigen Gens ermittelt werden. Heutzutage ist es tatsächlich häufig einfacher,

DNA zu klonen und ihre Sequenz zu ermitteln, als ein Protein zu reinigen

und zu sequenzieren. Tabelle 3.3 zeigt die durchschnittliche Häufigkeit von Aminosäuren

in mehr als 1000 untersuchten Proteinen, deren Sequenzen in Proteindatenbanken

gespeichert sind. Danach kommen die Aminosäuren Leucin, Alanin und

Glycin am häufigsten vor, gefolgt von Serin, Valin und Glutamat. Tryptophan, Cystein

und Histidin sind dagegen die seltensten Aminosäuren in typischen Proteinen.

Bestimmung der Aminosäuresequenz 3.9

Die Aminosäurenanalyse liefert Informationen über die Zusammensetzung eines

Proteins, aber nicht zu seiner Primärstruktur (Sequenz oder Reihenfolge der Aminosäurereste

in der Peptidkette). Im Jahr 1950 entwickelte Pehr Edman eine Technik,

die die Abspaltung und Identifikation jeweils nur eines Aminosäurerestes

vom N-Terminus eines Proteins pro Arbeitsgang ermöglicht. Bei diesem so genannten

Edman-Abbau wird das Protein bei einem pH-Wert von 9,0 mit PITC (Phenylisothiocyanat)

behandelt, das auch als Edman-Reagens bekannt ist. Erinnern Sie

sich, dass PITC bei der Aminosäurenanalyse zur Behandlung freier Aminosäuren

eingesetzt wird (Abbildung 3.16). Beim Edman-Abbau wird das Protein aber vorher

nicht hydrolysiert. Stattdessen reagiert PITC nur mit dem freien N-Terminus

der Polypeptidkette zu deren Phenylthiocarbamoyl-Derivat oder PTC-Peptid

(Abbildung 3.18). Durch die Behandlung des PTC-Peptids mit einer wasserfreien

Säure, wie zum Beispiel Trifluoressigsäure, wird selektiv die Peptidbindung

zum endständigen PTC-Aminosäurerest gespalten. Dabei wird das Anilinthiazoli-

3.9 Bestimmung der Aminosäuresequenz

Aminosäure

Stark hydrophob

Häufigkeit in

Proteinen (%)

Ile (I) 5,2

Leu (L) 9,0

Phe (F) 3,9

Met (M)

Weniger hydrophob

2,4

Ala (A) 8,3

Gly (G) 7,2

Cys (C) 1,7

Trp (W) 1,3

Tyr (Y) 3,2

Pro (P) 5,1

Thr (T) 5,8

Ser (S)

Stark hydrophil

6,9

Asn (N) 4,4

Gln (Q)

Sauer

4,0

Asp (D) 5,3

Glu (E)

Basisch

6,2

His (H) 2,2

Lys (K) 5,7

Arg (R) 5,7

Tabelle 3.3: Aminosäurenzusammensetzung

von Proteinen.

Pehr Edman (1916–1977). Edman entwickelte

eine Technik zur Sequenzierung von Polypeptiden.

103


3

104

Aminosäuren und die Primärstruktur von Proteinen

Abbildung 3.18: Edman-Abbau. Der N-terminale

Rest einer Polypeptidkette reagiert mit

Phenylisothiocyanat zum entsprechenden Phenylthiocarbamoyl-Peptid.

Durch die Behandlung dieses

Derivats mit wasserfreier Trifluoressigsäure

(F 3CCOOH) wird das Anilinthiazolinon-Derivat

des N-terminalen Aminosäurerestes gebildet. Das

Anilinthiazolinon-Derivat wird extrahiert und

anschließend mit wässriger Säure behandelt, wodurch

eine Umlagerung zum stabilen Phenylthiohydantoin-Derivat

(PTH-Derivat) eingeleitet wird.

Das PTH-Derivat kann dann chromatographisch

identifiziert werden. Die zurückbleibende Polypeptidkette,

deren neuer N-Terminus sich zuvor in

Position 2 befand, wird nun dem nächsten Zyklus

des Edman-Abbaus unterworfen.

wässrige Säure

N C S + H2N C C N CH

Phenylisothiocyanat

(PITC, Edman-Reagens)

N

N

Die Aminosäure wird

chromatographisch identifiziert.

S

C

H S C

O

Anilinthiazolinon-Derivat

O

N

C

C

N

F 3 CCOOH

+

..

R 1

H

Rückkehr zu alkalischen

Bedingungen für eine erneute Reaktion

mit Phenylisothiocyanat im

nächsten Zyklus des Edman-Abbaus

non-Derivat des N-terminalen Aminosäurerestes freigesetzt. Dieses Derivat kann

mit einem organischen Lösungsmittel, wie zum Beispiel Chlorbutan, extrahiert

werden, wobei das restliche Peptid in der wässrigen Lösung verbleibt. Das instabile

Anilinthiazolinon-Derivat wird anschließend durch wässrige Säure in das stabile

Phenylthiohydantoin-Derivat (PTH-Aminosäure) der ursprünglichen N-terminalen

Aminosäure umgewandelt. Die in der wässrigen Phase zurückgebliebene Polypeptidkette

ist also um die N-terminale Aminosäure verkürzt worden, so dass jetzt der

Aminosäurerest 2 des ursprünglichen Proteins den N-Terminus darstellt. Diese Polypeptidkette

kann erneut bei einem pH-Wert von 9,0 mit PITC behandelt werden.

Dieser Edman-Zyklus kann mit einer Sequencer genannten Apparatur automatisch

O

N-terminale Aminosäure

eines Polypeptids

R 1

C

O

C

N CH

H

O

C

R 2

H H H H R2 H

Phenylthiocarbamoyl-Peptid (PTC-Peptid)

N

C

H

R 1

Phenylthiohydantoin-Derivat

(PTH-Derivat) der abgespaltenen

N-terminalen Aminosäure

S

C

C

pH = 9,0

N

R 1

H

H

H 3N

CH

R 2

O

C

N

O

C

N

H

Polypeptidkette mit

n−1 Aminosäureresten

N

H


(a)

(b)

H O

N

N

H

H

N

Iodacetat

H 2C

H 2C

H 2C

CH C

CH

..

S

S

CH C

Cystin

I

CH 2

SH

COO

O

O

C

2 HSCH 2CH 2OH

H O

H O

CH C

S-Carboxymethylcystein

+ H + I

vielfach wiederholt werden. Dabei liefert jeder Zyklus eine PTH-Aminosäure, die

chromatographisch, in der Regel durch HPLC, identifiziert werden kann. Auf diese

Weise erhält man schließlich die gesamte oder zumindest einen großen Teil der

Sequenz (Primärstruktur) des Proteins.

Wenn ein Protein einen oder mehrere Cystinreste enthält, müssen die Disulfidbindungen

zunächst gespalten werden, damit die zugehörigen Cysteinreste während

der entsprechenden Zyklen des Edman-Abbaus als PTH-Aminosäuren (beziehungsweise

PTC-Aminosäuren) abgespalten werden können und die Aminosäure nicht

über die Disulfidbindung an die Polypeptidkette gebunden bleibt. Zur Spaltung der

Disulfidbindungen werden häufig Thiole eingesetzt, wie zum Beispiel 2-Mercaptoethanol.

Thiole reduzieren Cystinreste zu Paaren von Cysteinresten (Abbildung

3.19a). Die reaktiven Sulfhydrylgruppen der Cysteinreste werden vor Beginn des

Edman-Abbaus noch mithilfe eines Alkylierungsmittels, beispielsweise mit Iodacetat,

behandelt. Auf diese Weise werden die oxidierbaren Cysteinreste in stabile

S-Carboxymethylcysteinreste überführt und somit vor der erneuten Umwandlung zu

Cystinresten mit Disulfidbindungen in der Anwesenheit von Sauerstoff geschützt

(Abbildung 3.19b).

Die Ausbeute des Edman-Abbaus liegt unter sorgfältig kontrollierten Bedingungen

bei annähernd 100 Prozent und wenige Picomol eines Proteins genügen, um die

Sequenz von 30 Resten oder mehr zu bestimmen, bevor weitere Messungen durch die

steigenden Konzentrationen der Produkte, die in den vorhergehenden Zyklen nicht

zurückgewonnen werden konnten, zu stark beeinträchtigt werden. Wenn ein Zyklus

des Edman-Abbaus zum Beispiel mit einer Ausbeute von 98 Prozent durchgeführt

werden kann, würde die Gesamtausbeute nach dem dreißigsten Zyklus (0,98) 30 =

0,55 = 55 Prozent betragen. Mit anderen Worten: Nur etwa die Hälfte der PTH-Aminosäuren,

die im dreißigsten Zyklus produziert werden, würde tatsächlich von dem

ursprünglich vom N-Terminus dreißig Reste entfernten Aminosäurerest stammen.

N

N

H

N

H 2C

H 2C

H 2C

CH

S

CH 2

SH

SH

COO

C

CH C

O

zwei Cysteinreste

+

S

S

CH OH

2 CH 2

CH OH

2 CH 2

3.9 Bestimmung der Aminosäuresequenz

Abbildung 3.19: Spaltung und Blockierung

von Disulfidbindungen. (a) Wenn ein Protein

mit einem Überschuss von 2-Mercaptoethanol

(HSCH 2CH 2OH) umgesetzt wird, findet ein Disulfid-Austausch

statt, bei dem jeder Cystinrest zu

zwei Cysteinresten reduziert und 2-Mercaptoethanol

zu einem Disulfid oxidiert wird.(b) Die Behandlung

des reduzierten Proteins mit dem Alkylierungsmittel

Iodacetat führt zur Umwandlung aller

Cysteinreste in oxidationsstabile S-Carboxymethylcysteinreste

und somit zum Schutz vor einer

erneuten Bildung von Disulfidbindungen in der

Anwesenheit von Sauerstoff.

105


3

106

Aminosäuren und die Primärstruktur von Proteinen

H 3N

+ + H3CSCN + H + Br

H2C C O

H

N C H

H3N Gly Arg Phe Ala Lys

H3N Trp Val COO

Peptidylhomoserinlacton

Gly

Arg

H 2C

Phe Ala Lys Met Trp Val

O

BrCN (+ H 2 O)

COO

Abbildung 3.20: Spaltung eines Proteins mit Bromcyan. Bromcyan spaltet Polypeptidketten am

C-terminalen Ende von Methioninresten. Bei der Reaktion entstehen ein Peptidylhomoserinlacton und

ein neuer N-Terminus.

Strategien zur Proteinsequenzierung 3.10

Die meisten Proteine enthalten zu viele Aminosäurereste, um mit Erfolg vollständig

durch einen nur vom N-Terminus ausgehenden Edman-Abbau sequenziert werden

zu können. Deswegen werden zunächst Proteasen, das sind Enzyme, die die Hydrolyse

von Peptidbindungen in Proteinen katalysieren, oder bestimmte chemische Reagenzien

zur selektiven Spaltung einiger Peptidbindungen des Proteins eingesetzt.

Die dabei gebildeten kleineren Polypeptide werden anschließend isoliert und mithilfe

des Edman-Abbaus vollständig sequenziert.

Das chemische Reagens Bromcyan (BrCN) spaltet Polypeptide spezifisch am C-terminalen

Ende von Methioninresten. Das Ergebnis der Behandlung eines methioninhaltigen

Polypeptids mit Bromcyan sind kleinere Polypeptide mit C-terminalen

Homoserinlacton-Resten und neuen N-terminalen Aminosäureresten ( Abbildung

3.20). Da die meisten Proteine nur relativ wenige Methioninreste besitzen, führt

die Behandlung mit Bromcyan in der Regel nur zu ein paar unterschiedlichen Polypeptidfragmenten.

Bei der Umsetzung eines Polypeptids, das drei innere, nicht endständige

Methioninreste enthält, mit Bromcyan sollten zum Beispiel vier unterschiedliche

Peptidfragmente erzeugt werden. Jedes der Fragmente kann dann,

ausgehend von seinem N-Terminus, sequenziert werden.

Viele verschiedene Proteasen stehen für die Erzeugung von Fragmenten zur Proteinsequenzierung

zur Verfügung. Trypsin katalysiert zum Beispiel die spezifische

Spaltung am Carbonylende von Lysin- und Argininresten, die beide positiv geladene

Seitenketten aufweisen (Abbildung 3.21a). Die Staphylococcus aureus-V8-Protease

katalysiert dagegen die Spaltung von Peptidbindungen am Carbonylende von negativ

geladenen Aminosäureresten (Glutamat und Aspartat). Unter geeigneten Bedingungen

(50mM Ammoniumhydrogencarbonat) spaltet sie nur Glutamyl-Peptidbindungen.

Chymotrypsin ist eine weniger selektive Protease, die bevorzugt die Hydrolyse

von Peptidbindungen am Carbonylende von ungeladenen Resten mit aromatischen

oder voluminösen, hydrophoben Seitenketten, wie zum Beispiel Phenylalanin, Tyrosin

und Tryptophan, katalysiert (Abbildung 3.21b).

Durch eine wohlüberlegte Anwendung von Bromcyan, Trypsin, Staphylococcus

aureus-V8-Protease und Chymotrypsin auf einzelne Proben eines großen Proteins

kann man viele Peptidfragmente unterschiedlicher Größe erzeugen. Diese Fragmente

werden dann getrennt und mithilfe des Edman-Abbaus sequenziert. Im abschließen-


(a)

(b)

(c)

H3N Gly Arg Ala Ser Phe Gly Asn Lys Trp Glu Val COO

Trypsin

H3N Gly Arg Ala Ser Phe Gly Asn Lys Trp Glu Val COO

Chymotrypsin

Gly Arg Ala Ser Phe Gly Asn Lys Trp Glu Val

Gly Arg Ala Ser Phe Gly Asn Lys Trp Glu Val

den Schritt der Sequenzbestimmung wird die Aminosäuresequenz einer großen

Polypeptidkette durch die Aneinanderreihung von übereinstimmenden Sequenzen

überlappender Fragmente aus den Peptidspaltungen mit den unterschiedlichen

Reagenzien ermittelt. Dieser letzte Schritt wird in Abbildung 3.21c nochmals an

einem Beispiel verdeutlicht. In der Schriftsprache ist es üblich, einen Aminosäurerest

an einer bestimmten Position mit dem Drei-Buchstaben-Code der zugehörigen

Aminosäure zu benennen, gefolgt von einem Leerzeichen und der Sequenznummer

dieses speziellen Restes. Der dritte Rest des in Abbildung 3.21a gezeigten Startpeptids

wird gemäß dieser Nomenklatur zum Beispiel als „Ala 3“ bezeichnet.

Der Prozess der Erzeugung und Sequenzierung von Peptidfragmenten ist von

besonderer Bedeutung, wenn der N-Terminus des Proteins blockiert ist. Die N-terminale

α-Aminogruppe vieler bakterieller Proteine liegt zum Beispiel formyliert

vor, reagiert deshalb nicht mit dem Edman-Reagens und ist somit einem Edman-

Abbau nicht zugänglich. Durch die gezielte Spaltung eines solchen Proteins mit

den oben beschriebenen Reagenzien in mehrere Peptidfragmente mit unblockierten

N-Termini und deren anschließende Trennung kann zumindest ein Teil der inneren

Sequenzabschnitte des Proteins ermittelt werden.

Die kovalente Struktur von Proteinen mit Disulfidbindungen ist erst aufgeklärt,

wenn auch die Positionen dieser Disulfidbindungen bekannt sind. Diese können

bestimmt werden, indem man das intakte Protein fragmentiert, die Peptidfragmente

isoliert und feststellt, welche Fragmente Cystinreste enthalten. Allerdings kann sich

diese Aufgabe als ziemlich kompliziert herausstellen, wenn das Protein mehrere

Disulfidbindungen aufweist.

Mithilfe der Ableitung der Aminosäuresequenz eines bestimmten Proteins aus

der Sequenz seines Gens (Abbildung 3.22) werden technische Einschränkungen

3.10 Strategien zur Proteinsequenzierung

H3N Gly Arg COO + H3N Ala Ser Phe Gly Asn Lys COO + H3N Trp Glu Val COO

H3N Gly Arg Ala Ser Phe COO + H3N Gly Asn Lys Trp COO + H3N Glu Val COO

Abbildung 3.21: Spaltung und Sequenzierung eines Oligopeptids. (a) Trypsin katalysiert die Spaltung

von Peptiden am Carbonylende der basischen Reste Arginin und Lysin. (b) Chymotrypsin katalysiert

dagegen die Spaltung von Peptiden am Carbonylende von ungeladenen Resten mit aromatischen oder

voluminösen, hydrophoben Seitenketten, wie zum Beispiel Phenylalanin,Tyrosin und Tryptophan. (c) Durch

die Sequenzierung jedes Fragments (hervorgehoben durch die Kästen) mithilfe des Edman-Abbaus und

die Aneinanderreihung von übereinstimmenden Sequenzen überlappender Fragmente kann man deren

Reihenfolge und damit die Sequenz des gesamten Oligopeptids ableiten.

107


3

108

Aminosäuren und die Primärstruktur von Proteinen

Frederick Sanger (*1918). Sanger bekam für

seine Arbeiten zur Sequenzierung von Proteinen

1956 den Nobelpreis für Chemie verliehen. Im

Jahr 1980 wurde er für die Entwicklung von Methoden

zur Sequenzierung von DNA zum zweiten

Mal mit dem Nobelpreis für Chemie geehrt.

DNA A A G A G T G A A C C TGT

C

Protein

Lys Ser Glu Pro Val

Abbildung 3.22: DNA-Sequenzabschnitt und zugehörige Proteinsequenz. Die Aminosäuresequenz

eines Proteins kann prinzipiell aus der Sequenz der Nucleotide im zugehörigen Gen abgeleitet werden.

Dabei wird jede Aminosäure durch eine spezifische Sequenz von drei Nucleotiden festgelegt. Die Buchstaben

A, C, G und T repräsentieren die Nucleotidreste der DNA.

der direkten Analysemethoden überwunden. So kann zum Beispiel auf diesem Weg

nicht nur die Menge des Tryptophans bestimmt werden, sondern es ist auch möglich,

zwischen Aspartat und Asparagin zu unterscheiden, weil diese Aminosäurereste

durch verschiedene Codons codiert werden. Trotzdem ist die direkte Sequenzierung

von Proteinen immer noch von Bedeutung, da diese Methode die einzige Möglichkeit

darstellt, festzustellen, ob Aminosäuren des Proteins nach vollendeter Proteinbiosynthese

modifiziert oder ganz entfernt wurden.

Im Jahr 1953 war Frederick Sanger der erste Wissenschaftler, der die vollständige

Sequenz eines Proteins (Insulin) aufklären konnte. Für diese Arbeiten wurde er

1956 mit dem Nobelpreis für Chemie geehrt und 24 Jahre später erhielt Sanger den

zweiten Nobelpreis für seine Pionierarbeiten auf dem Gebiet der Sequenzierung von

Nucleinsäuren. Heute kennen wir die Aminosäuresequenzen zehntausender verschiedener

Proteine. Diese Sequenzen enthüllen nicht nur Details der Struktur

einzelner Proteine, sondern sie geben den Wissenschaftlern auch die Möglichkeit,

Familien verwandter Proteine zu identifizieren sowie die dreidimensionale Struktur

und manchmal auch die Funktion neu entdeckter Proteine zumindest näherungsweise

vorherzusagen.

Bestimmung von evolutionären

Beziehungen durch den Vergleich

der Sequenz von Proteinen 3.11

In vielen Fällen ist das gleiche Protein aus einer Anzahl verschiedener Spezies

sequenziert worden. Die Ergebnisse zeigen, dass sich die Sequenzen von Proteinen

aus eng verwandten Spezies stark ähneln, während sich die Sequenzen von Proteinen

aus nur entfernt verwandten Spezies schon etwas deutlicher unterscheiden

können. Diese Unterschiede spiegeln die evolutionären Veränderungen gegenüber

der Proteinsequenz eines gemeinsamen Vorfahren wider.

Das Protein Cytochrom c, das aus einer einzelnen Polypeptidkette von etwa 104

Aminosäuren besteht, ist ein ausgezeichnetes Beispiel für die Evolution auf molekularer

Ebene. Cytochrom c kommt in allen aeroben Organismen vor und seine

Proteinsequenzen in nur sehr entfernt verwandten Spezies, wie zum Beispiel Säugetieren

und Bakterien, sind ähnlich genug, um mit großer Sicherheit darauf schließen

zu können, dass die Proteine homolog sind. Verschiedene Proteine oder Gene werden

als homolog definiert, wenn sie von einem gemeinsamen Vorläuferprotein beziehungsweise

Vorläufergen abstammen. Der anerkannte Nachweis einer Homologie

erfolgt auf der Grundlage von Sequenzähnlichkeiten.

Der erste Schritt zur Enthüllung evolutionärer Beziehungen besteht in der direkten,

parallelen Gegenüberstellung der Sequenzen des untersuchten Proteins aus

verschiedenen Spezies. In Abbildung 3.23 finden Sie für Cytochrom c ein Beispiel


10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

Mensch

Schimpanse

Klammeraffe

Makak

Kuh

Hund

Grauwal

Pferd

Zebra

3.11 Bestimmung von evolutionären Beziehungen durch den Vergleich der Sequenz von Proteinen

Schnappschildkröte

Königspinguin

Taube

Huhn

Truthahn

Ente

Känguru

Kaninchen

Ochsenfrosch

Alligator

Thunfisch

Hundshai

Seidenspinner

Fruchtfliege

Seestern

Ackerschmalwand

Tomate

Kürbis

Mungobohne

Sonnenblume

Weizen

Debaryomyces

Hefe

Aspergillus

Candida

Rhodomicrobium

Nitrobacter

Agrobacterium

Rhodopila

Abbildung 3.23: Cytochrom-c-Sequenzen. Hier sind die Sequenzen von Cytochrom-c-Proteinen aus verschiedenen Spezies parallel gegenübergestellt, um ihre Ähnlichkeiten zu demonstrieren. In einigen Fällen

sind Lücken (durch Bindestriche illustriert) eingefügt worden, um die Passgenauigkeit zu erhöhen. Die Lücken repräsentieren Streichungen und Einfügungen in die Gene, die diese Proteine codieren. Bei einigen Spezies

sind zusätzliche Reste am Ende der Sequenz weggelassen worden. Hydrophobe Reste sind blau und polare Reste orangefarben dargestellt.

109


3

110

Aminosäuren und die Primärstruktur von Proteinen

Neurospora

crassa

Bäckerhefe

Candida

krusei

Abbildung 3.24: Phylogenetischer Baum für

Cytochrom c. Die Länge der Zweige ist proportional

zur Anzahl der Unterschiede zwischen den

Sequenzen von vielen Cytochrom-c-Proteinen.

(Aus: Schwartz, R.M., Dayhoff, M.O. 1978. Origins

of prokaryotes, eukaryotes, mitochondria, and

chloroplasts. Science 199: 395 – 403.)

eines solchen Vergleichs. Diese Nebeneinanderstellung ergibt eine bemerkenswerte

Konservierung von Resten an bestimmten Positionen. Alle Sequenzen enthalten zum

Beispiel einen Prolinrest in Position 30 und einen Methioninrest in Position 80. Im

Allgemeinen tragen konservierte Reste zur strukturellen Stabilität oder zur Funktion

des Proteins bei.

Es findet offensichtlich eine negative Auslese der Aminosäuresubstitutionen in

diesen unveränderten Positionen statt. An anderen Stellen wird eine begrenzte Anzahl

von Substitutionen beobachtet. In den meisten Fällen erlaubter Substitutionen

werden Aminosäuren gegen Reste mit ähnlichen Eigenschaften ausgetauscht. Position

98 wird zum Beispiel von Leucin, Isoleucin oder Valin eingenommen, die sämtlich

hydrophobe Seitenketten aufweisen. Analog können viele andere Stellen durch

eine Anzahl verschiedener, polarer Reste besetzt werden. Manche Positionen sind

äußerst variabel. Die Reste in diesen Positionen tragen nur sehr wenig zur strukturellen

Stabilität und zur Funktion des Proteins bei und die Substitutionen in solchen

Positionen entstehen während der Evolution durch zufällige genetische Mutationen.

Die Cytochrom-c-Sequenzen von Menschen und Schimpansen sind identisch.

Darin spiegelt sich ihre enge evolutionäre Verwandtschaft wider. Die Sequenzen

des Klammeraffen und des Makakken sind, wie erwartet, denen des Menschen und

des Schimpansen sehr ähnlich, da alle vier Spezies zu den Primaten gehören. Die

Mensch,

Zebra, Schimpanse

Debaryomyces

kloeckeri

Pferd Makak Affe

Kanin-

Pinguin

Schwein, Kuh, Schaf Graues Huhn, Truthahn

Hund

chenRiesen- Ente

kän Taube

Grauwal

guru

Schnappschildkröte

Hundshai Ochsen-

Alligator Thunfisch

frosch

Karpfen

Bonito

Nachtschwärmer

Seidenspinner

Fruchtfliege

Schraubenwurmfliege

Pazifisches

Neunauge

Weizen

Mungobohne

Kürbis

Tomate

Bacteria

Sonnenblume


Sequenzen der Cytochrom-c-Moleküle aus Pflanzen ähneln sich untereinander

viel mehr als sie mit den Sequenzen anderer Spezies übereinstimmen.

Abbildung 3.24 illustriert die Ähnlichkeiten zwischen den Cytochrom-c-

Sequenzen verschiedener Spezies, indem sie sie in einem Baum anordnet, dessen

Zweiglängen proportional zur Anzahl der Unterschiede in der Aminosäuresequenz

des Proteins sind. Eng verwandte Spezies sind auf denselben Zweigen des Baumes

zusammengelagert, weil ihre Proteine sich sehr ähnlich sind. Bei großen evolutionären

Abständen kann die Anzahl der Unterschiede sehr groß sein. Die bakteriellen

Sequenzen unterscheiden sich zum Beispiel beträchtlich von den eukaryontischen

Sequenzen. Dies ist ein Zeichen für eine frühe evolutionäre Divergenz,

ausgehend von einem gemeinsamen Vorfahren, der vor mehreren Milliarden Jahren

gelebt hat. Der Baum zeigt deutlich die drei verschiedenen eukaryontischen

Reiche: Pilze, Tiere und Pflanzen. Die Sequenzen von Protisten sind in diesem

Baum nicht berücksichtigt worden, um die Komplexität des Baumes zu verringern.

Die aus Sequenzdaten abgeleiteten phylogenetischen Bäume stimmen im Allgemeinen

mit jenen Bäumen weitgehend überein, die von Evolutionsbiologen auf der

Grundlage morphologischer Daten und der Auswertung von Fossilienfunden erstellt

wurden. Die aus Sequenzvergleichen ermittelten Daten zur molekularen Evolution

liefern unabhängige Belege für gemeinsame Abstammungslinien.

Zusammenfassung

Z U S A M M E N F A S S U N G

1. Proteine sind fast ausschließlich aus einem Satz von 20 Aminosäuren

aufgebaut, von denen jede eine Aminogruppe, eine

Carboxylgruppe und eine Seitenkette besitzt, die zur Vereinfachung

häufig durch den Buchstaben R symbolisiert wird. Bis auf

Glycin, das kein asymmetrisch substituiertes Kohlenstoffatom

besitzt, weisen alle Aminosäuren in Proteinen L-Konfiguration

auf.

2. Die Seitenketten von Aminosäuren werden bezüglich ihrer

chemischen Strukturen und Eigenschaften in verschiedene Gruppen

eingeteilt: aliphatische, aromatische, schwefelhaltige, alkoholische,

basische, saure und amidhaltige Seitenketten. Es sind

aber auch weitere Klassifizierungen vorgenommen worden, wie

zum Beispiel nach stark hydrophoben oder hydrophilen Seitenketten.

Die Eigenschaften der Seitenketten der Aminosäuren sind

die entscheidenden Faktoren für die Struktur und die Funktion

eines Proteins.

3. Zellen enthalten weitere Aminosäuren, die nicht zur Proteinbiosynthese

verwendet werden. Einige chemisch modifizierte

Aminosäuren treten zum Beispiel als Hormone oder Neurotransmitter

in Erscheinung. Manche Aminosäuren werden auch

erst nach ihrem Einbau in ein Polypeptid modifiziert.

4. Bei einem pH-Wert von 7 liegt die α-Carboxylgruppe von

Aminosäuren deprotoniert und damit negativ geladen vor

(¬COO ), während die α-Aminogruppe protoniert und somit


positiv geladen ist (¬NH3 ). Die Ladung von ionisierbaren Sei-

tenketten hängt sowohl vom pH-Wert als auch von deren pK S-

Wert ab.

5. Aminosäurereste in Proteinen sind über Peptidbindungen

miteinander verbunden. Die Sequenz (Reihenfolge) der Reste nennt

man die Primärstruktur des Proteins.

6. Die Techniken zur Reinigung von Proteinen beruhen auf den

unterschiedlichen Löslichkeiten, Nettoladungen, Größen und

Bindungseigenschaften der einzelnen Proteine.

7. Analysetechniken wie die SDS-PAGE und die Massenspektrometrie

ermöglichen die Bestimmung von Eigenschaften von

Proteinen, wie zum Beispiel deren Molekülmasse.

8. Die Aminosäurenzusammensetzung eines Proteins kann

durch die Hydrolyse der Peptidbindungen und die anschließende

chromatographische Analyse des Hydrolysats, in der Regel nach

dessen chemischer Modifizierung mit PITC, bestimmt werden.

9. Die Sequenz einer Polypeptidkette kann durch den so genannten

Edman-Abbau ermittelt werden, bei dem die N-terminalen

Aminosäurereste sukzessive abgespalten und identifiziert

werden.

10. Die Sequenzen von großen Polypeptiden können durch die

selektive Spaltung von einigen Peptidbindungen mithilfe von

Proteasen oder chemischen Reagenzien und den anschließenden

Edman-Abbau der resultierenden Fragmente bestimmt werden.

11. Der Vergleich von Sequenzen aus verschiedenen Spezies offenbart

evolutionäre Beziehungen.

Z U S A M M E N F A S S U N G

111


3

112

Aminosäuren und die Primärstruktur von Proteinen

Übungsaufgaben

1

2

3

4

5

6

7

Zeichnen und beschriften Sie die stereochemische

Struktur von L-Phenylalanin. Geben Sie an, ob in diesem

Fall eine R- oder S-Konfiguration vorliegt. Lesen

Sie gegebenenfalls noch einmal den Exkurs Eine alternative

Nomenklatur zur Benennung der Konfiguration

auf Seite 81 in Abschnitt 3.2.

Zeigen Sie, dass die Fischer-Projektion der üblichen

Form von Threonin (Abschnitt 3.2.4) (2S,3R)-Threonin

entspricht.

Patienten mit einem Melanom (Hautkrebs) wird neben

einem Antikrebsmedikament zusätzlich Histamindihydrochlorid

verabreicht, weil die Krebszellen das Medikament

dann besser aufnehmen. Zeichnen Sie die chemische

Strukturformel von Histamindihydrochlorid.

In getrocknetem Fisch, der mit Nitraten und anderen

Salzen behandelt wurde, ist das Mutagen 2-Chloro-4-

(methylthio)-butansäure (CMBA, engl. 2-chloro-4-(methylthio)-butanoic

acid) gefunden worden. Von welcher

Aminosäure stammt diese Verbindung ab?

H 3C

S

Ermitteln Sie für jede der folgenden Seitenketten von

Aminosäuren, von welcher Aminosäure sie abstammt

und welche Art von chemischer Modifizierung stattgefunden

hat.

(a) ¬CH 2OPO 3 2-

CH 2

C

CH2 CH OH

(b) ¬CH 2CH(COO ) 2

Cl

(c) ¬(CH 2) 4¬NH¬C(O)CH 3

Das Tripeptid Glutathion (γ-Glu-Cys-Gly) übernimmt in

Tieren eine Schutzfunktion, indem es toxische Peroxide

abbaut, die während des oxidativen Stoffwechsels

erzeugt werden. Zeichnen Sie die chemische Strukturformel

von Glutathion. Beachten Sie dabei: Das Symbol

γ weist darauf hin, dass die Peptidbindung zwischen

Glu und Cys zwischen der γ-Carboxylgruppe von Glu

und der Aminogruppe von Cys besteht.

Melittin ist ein aus 26 Resten bestehendes Polypeptid

aus dem Gift der Biene. Es wird angenommen, dass

Melittin in seiner monomeren Form in lipidreiche

Membranstrukturen eingebaut wird. Auf welche Weise

O

8

9

1

Cys

10

trägt die Aminosäuresequenz von Melittin zu dieser

Eigenschaft bei?

1

H 3N-Gly-Ile-Gly-Ala-Val-Leu-Lys-Val-Leu-Thr-Gly-Leu

Pro-Ala-Leu-Ile-Ser-Trp-Ile-Lys-Arg-Lys-Arg-Gln-Gln-NH 2

26

Berechnen Sie die isoelektrischen Punkte von (a) Arginin

und (b) Glutamat.

Oxytocin ist ein Nonapeptid-Hormon (ein Peptidhormon

mit neun Resten), das bei Säugetieren vor allem zu

einer Kontraktion der glatten Muskulatur in der Milchdrüse

während des Stillens führt. Unten sehen Sie die

Sequenz einer synthetischen Version von Oxytocin. Wie

groß ist die Nettoladung dieses Peptids bei einem pH-

Wert von (a) 2,0, (b) 8,5 und (c) 10,7? Verwenden Sie für

die ionisierbaren Gruppen die in Tabelle 3.2 angegebenen

pKS-Werte. Die Disulfidbindung ist bei den gegebenen

pH-Werten stabil. Beachten Sie, dass der C-Terminus

amidiert vorliegt.

Im Anschluss finden Sie die Titrationskurve für Histidin.

Die pKS-Werte betragen 1,8 (¬COOH), 6,0 (Seiten-

kette) und 9,3 (¬NH 3 ).

pH

Phe

12

10

8

6

4

2

0

Ile

S

Glu

S

2

3

Asn

Cys

4

1

0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0

Äquivalente OH

(a) Zeichnen Sie die Strukturformeln aller Protolysestufen

(Ionisierungsstufen) von Histidin.

(b) Identifizieren Sie die Punkte in der Titrationskurve,

die den vier ionischen Spezies entsprechen.

(c) Identifizieren Sie die Punkte, an denen die durchschnittliche

Nettoladung jeweils +2, +0,5, 0 und –1

beträgt.

(d) An welchem Punkt gleicht der pH-Wert dem pKS- Wert der Seitenkette?

(e) Finden Sie den Punkt, an dem die Seitenkette gerade

vollständig titriert wurde.

5

Pro

His

6

Gly

7

NH 2


11

12

13

14

(f) In welchen pH-Bereichen wäre Histidin ein guter

Puffer?

Zeichnen Sie die Strukturformeln der folgenden Verbindungen,

die während des Edman-Abbaus auftreten:

(a) PTC-Leu-Ala, (b) PTH-Serin und (c) PTH-Prolin.

Sagen Sie die Fragmente voraus, die bei der Behandlung

des folgenden Peptids mit (a) Trypsin, (b) Chymotrypsin

und (c) S.aureus-V8-Protease gebildet werden.

Gly-Ala-Trp-Arg-Asp-Ala-Lys-Glu-Phe-Gly-Gln

Sie haben ein Decapeptid (ein Peptid mit zehn Resten)

mit dem Namen FP isoliert, das eine antikanzerogene

Wirkung aufweist. Bestimmen Sie die Sequenz des Peptids

aus den folgenden Informationen. Beachten Sie, dass

die Aminosäuren durch Kommata getrennt werden,

wenn ihre Sequenz nicht bekannt ist.

(a) Ein Zyklus des Edman-Abbaus des intakten FP ergibt

zwei Mol PTH-Aspartat pro Mol FP.

(b) Die Behandlung einer Lösung von FP mit 2-Mercaptoethanol

und die anschließende Zugabe von Trypsin

führt zu drei Peptiden mit der Zusammensetzung

(Ala, Cys, Phe), (Arg, Asp) und (Asp, Cys,

Gly, Met, Phe). Das intakte (Ala, Cys, Phe)-Peptid

ergibt im ersten Zyklus des Edman-Abbaus PTH-

Cystein.

(c) Die Behandlung eines Mols von FP mit Carboxypeptidase,

die den C-terminalen Rest von Peptiden abspaltet,

liefert zwei Mole Phenylalanin.

(d) Die Umsetzung des intakten Pentapeptids (Asp, Cys,

Gly, Met, Phe) mit Bromcyan (BrCN) ergibt zwei

Peptide mit den Zusammensetzungen (Homoserinlacton,

Asp) und (Cys, Gly, Phe). Das (Cys, Gly, Phe)-

Peptid liefert im ersten Zyklus des Edman-Abbaus

PTH-Glycin.

Die entsprechenden Abschnitte der Aminosäuresequenz

von Cytochrom c aus einem Alligator und einem Ochsenfrosch

lauten folgendermaßen (aus Abbildung 3.23):

Aminosäuren 31-50

ALLIGATOR: NLHGLIGRKT GQAPGFSYTE

OCHSENFROSCH: NLYGLIGRKT GQAAGFSYTD

(a) Suchen Sie ein Beispiel für eine Substitution, an der

ähnliche Aminosäuren beteiligt sind.

(b) Geben Sie ein Beispiel für eine Substitution gegen

eine Aminosäure mit stärker unterschiedlichen

Eigenschaften.

15

16

17

Übungsaufgaben

Mehrere häufig vorkommende Aminosäuren werden

modifiziert, um biologisch wichtige Amine zu produzieren.

Serotonin ist ein biologisch bedeutender Neurotransmitter,

der zum Beispiel im Gehirn synthetisiert

wird. Niedrige Serotoninspiegel im Gehirn sind mit Zuständen

wie Depression, Aggression und Hyperaktivität

in Zusammenhang gebracht worden. Von welcher

Aminosäure stammt Serotonin ab? Identifizieren Sie

die Unterschiede zwischen den Strukturen dieser Aminosäure

und Serotonin.

HO

Unten finden Sie die Struktur des Thyrotropin-Releasing-Hormons

(TRH). TRH ist ein Peptidhormon, das

ursprünglich aus Extrakten des Hypothalamus isoliert

wurde.

(a) Wie viele Peptidbindungen weist TRH auf?

(b) Von welchem Tripeptid stammt TRH ab?

(c) Welche Auswirkungen haben die Veränderungen

gegenüber dem in (b) gesuchten Tripeptid auf die

Ladungen der terminalen Amino- und Carboxylgruppe?

O

H 3N

C

N

H

H

C

Serotonin

CH 2

CH2 CH2 HC

N

H

H

O

C

NH

H 2C

HC

NH

Die Chiralität spielt bei der Entwicklung neuer Medikamente

eine große Rolle. Menschen, die an der Parkinson-Krankheit

leiden, weisen zu geringe Dopamin-

Spiegel im Gehirn auf. Um ihn anzuheben, wird den

Patienten der Wirkstoff L-Dopa verabreicht, der im Gehirn

zu Dopamin umgewandelt wird.

(a) Bestimmen Sie die absolute Konfiguration von L-Dopa

gemäß der R,S-Nomenklatur.

(b) Von welcher Aminosäure stammen sowohl L-Dopa

als auch Dopamin ab?

CH

N

C

O H2C C

CH

N

CH2 CH2 HC

C

O

NH 2

113


3

114

HO

HO

Aminosäuren und die Primärstruktur von Proteinen

H

L-Dopa

O

NH 3

Allgemein

Creighton, T.E. 1993. Proteins: Structures and

Molecular Principles. 2.Auflage, S.1– 48.

New York: W. H. Freeman. Dieser Abschnitt

aus Creightons Monographie ist eine ausgezeichnete

Beschreibung der Chemie von

Polypeptiden.

Greenstein, J.P. und Winitz, M. 1961. Chemistry

of the Amino Acids. New York: John

Wiley & Sons.

Kreil, G. 1997. d-Amino Acids in Animal Peptides.

Annu. Rev. Biochem. 66: 337–345.

Meister, A. 1965. Biochemistry of the Amino

Acids. 2.Auflage. New York: Academic

Press. Band I dieses zweibändigen Werkes

ist die Standardreferenz zu den Eigenschaften

von Aminosäuren.

Reinigung und Analyse von Proteinen

Hearn, M.T.W. 1987. General strategies in the

separation of proteins by high-performance

liquid chromatographic methods.

J. Chromatogr. 418: 3–26. Diskutiert so-

O

HO

HO

Dopamin

NH 3

Lösungen zu den Übungsaufgaben, Onlinetests und weitere Materialien und Informationen zu diesem Buchkapitel

finden Sie auf der Companion-Website unter http://www.pearson-studium.de

AUSGEWÄHLTE LITERATUR

CO 2

wohl die allgemeinen Parameter der Proteinreinigung

als auch die Verwendung

der HPLC.

Mann, M., Hendrickson, R.C. und Pandry, A.

2001. Analysis of Proteins and Proteomes

by Mass Spectrometry. Annu. Rev. Biochem.

70: 437– 473. Dieser Übersichtsartikel

behandelt die modernen Techniken

und die Anwendung der Massenspektrometrie

bei der Identifizierung spezifischer

Proteine mithilfe von Informationen aus

Proteindatenbanken.

Sherman, L.S. und Goodrich, J.A. 1985. The

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Aminosäurenanalyse

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Die Geschichte der Sequenzierung von

Proteinen, RNA und DNA.

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