Funktionelle Analyse des Hypusin enthaltenden Proteins in ...

4.4.1 Isolierung von Hefe-Zellkernen für die RNA-Extraktion . . . . . . . . 58
4.4.2 Isolierung von Mitochondrien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58
4.5 Überprüfung der Existenz eines mitochondrialen Membranpotentials . . . . . . 58
4.6 Zell-Proliferationsassay . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59
4.7 Zelluläre Fluoreszenzfärbungen, Mikroskopie . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59
4.7.1 Anfärbung der Zellkerne in Hefezellen durch DAPI-Färbung . . . . . . 59
4.7.2 End-Labeling von DNA-3’-Termini entstanden durch DNA-Strangbrüche:
TUNEL . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60
4.7.3 Mikroskopische Untersuchungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60
4.7.4 Elektronenmikroskopie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60
5 Ergebnisse 61
5.1 Funktionsstudie am Hypusin enthaltenden Protein
durch Punktmutanten-Charakterisierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61
5.1.1 Genetische Überprüfung der Doppeldisruption beider HYP-Gene . . . . 61
5.1.2 Überprüfung von Art und Eigenschaften der Plasmidausstattung . . . . 64
5.1.3 Eine Punktmutagenese-Studie führt zur temperatursensitiven Mutante
G81V . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67
5.1.3.1 Regenerierung der Punktmutante G81V durch FOA-Screening 69
5.1.4 Wachstumsverhalten des Hefestammes WDHG81Gal im Vergleich zum
Wildtyp . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73
5.1.5 Genetische Stabilität des Mutantenstammes WDHG81Gal . . . . . . . 75
5.1.6 Proteinchemische phänotypische Charakterisierung durch 2D-Gel-Analyse 75
5.1.6.1 Analyse von Gesamtextrakten . . . . . . . . . . . . . . . . . 75
5.1.7 Proteomanalytischer Vergleich mitochondrialer Proteine . . . . . . . . 91
5.1.7.1 Mitochondrien-Analysen durch 2D-Gel-Elektrophorese
aus Kulturen bei permissiver Temperatur . . . . . . . . . . . 92
5.1.7.2 2D-Gel-Analyse von isolierten Mitochondrien nach Inkubation
bei 37°C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100
5.1.8 Überprüfung der mitochondrialen Aktivität und Funktionalität
des mitochondrialen Genoms . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 105
5.1.8.1 Messung des Atmungsketten-Membranpotentials an isolierten
Mitochondrien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 105
5.1.8.2 Wachstumsverhalten auf nicht vergärbaren Kohlenstoffquellen 107
5.1.9 Differentielle Gen-Transkriptionsprofil-Analyse der
HYP(hum)- Punktmutante G81V . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 110
5.1.9.1 Experimenteller Ansatz und Probenvorbereitung . . . . . . . 111
5.1.9.2 Allgemeine Eigenschaften der Auswertungsergebnisse . . . . 112
5.1.9.3 Ist Hypp ein RNA-Kernexportfaktor in Hefe? . . . . . . . . 118
5.1.9.4 Beteiligung Hypps an einem speziellen mRNA-Abbauweg . 125
5.1.9.5 Anreicherung von Pseudogenen – ein direkter Hinweis auf
NMD-Defizienz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 128
5.1.9.6 Beeinträchtigung des telomeren Positions-Effektes in G81 . . 128
5.1.9.7 Anreicherung retrotransposabler Elemente, ihrer LTR-Sequenzen
und ihnen benachbarter ORFs . . . . . . . . . . . . . . . . . 132
iv