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1

Die stationäre Phase

Sortimentsübersicht

Auswahlentscheidung


2

Trennmechanismen

Adsorptions-Chromatographie

Verteilungs-Chromatographie

Ionenaustausch-Chromatographie

Komplex-Chromatographie


3

Adsorption - Verteilung


4

Welche stationäre Phase ?

Aluminiumoxid

Kieselgel

RP-Schichten

Amino-, Cyano und Diolphase

Florisil

Polyamid

Cellulose

Kieselgur

Imprägnierte Schichten

Ionenaustauscher-Schichten


5

Weiteres über stationäre Phasen

Schichtuntergrund

Binder

Phosphoreszenzindikator

Hersteller-/Chargenabhängigkeit

Labordämpfe- Vorwaschen der Schicht

Aktivität der Schicht

DC-HPTLC


6

Abkürzungen

(G Gips als Bindemittel

(H ohne artfremde Bindemittelzusätze

F Fluoreszenzindikator

245 Anregungswellenlänge des F

PSC präperative Schichten Schichtdicke > 0,25 mm

R hochgereinigtes Sorbens

RP 2,8,18 Reversed Phae/Umkehrphase mit

Kettenlänge/C-Atome 2,8,18

W wasserfeste,- benetzbare Schichten

S säurestabiler Indikator

60 mittlerer Porendurchmesser in Angström (=6 nm)


7

Terminologie & Polarität

Normalphasen-Chromatographie

(Straight Phase):

polare SP + unpolare MP

Umkehrphasen-Chromatographie

(Reversed Phase):

unpolare SP + polare MP

Polarität der Schichten

Si > NH 2 > CN/Diol > RP-2 > RP-8 > RP-18


8

Stationäre Phasen auf Kieselgel-Basis

O

chirale Phasen

Cu +

[

CH3 CH

Cu

O OH

[

CH

3

unpolare chemisch

gebundene Phasen

N

[

]

8

]

5

] 8

Si

O

O

Si

[

Si

polare Phase

O

O

Si

O

O

Si

O

Si

O

Si

O O O

Si

O

Si

O Si

CH3 CH

O

CH CH3

]

CH3 CH

3

H

NH2 NH

C N

mittelpolare chemisch

gebundene Phasen

O OH

OH


9

Gebundene Phasen - DIOL

Weniger beeinflusst durch Feuchtigkeit

Einsatz als Normal- oder Umkehrphase

Brauchbarste der gebundenen Phasen

Grosse Ähnlichkeit mit Kieselgel

Geringere Retention

Hormone, Steroide


10

Gebundene Phasen - Aminopropyl

Als Normalphase Trennung nach Art und

Anzahl funktioneller Gruppen

Als NP: H + -Donor oder H + Als NP: H -Akzeptor

+ -Donor oder H + -Akzeptor

Als RP: schwacher Anionenaustauscher

Fluoreszierende Flecken mit Zuckern

Carbonsäuren, Phenole, Nucleotide,

Vitamine, Xanthin-Derivative, Zucker


11

Gebundene Phasen - Cyano

Mittelpolar

Als Normalphase wie desaktiviertes Kieselgel

Hochselektiv für polare Heterocyclen

Als Umkehrphase zur Ionenpaar-Trennung

von Säuren

Pharmazeutische Konservierungstoffe


12

Umkehrphasen (RP 2, RP 8, RP 18)

Unpolare Stoffe (Lipide)

• Fettsäuren, Carotenoide, Steroide

Polare Stoffe

• Basische und saure Wirkstoffe

Stoffe, die auf aktiven Schichten labil sind

• Vitamine, Antibiotika, Cannabinoide

Insektizide, Alkaloide, Barbiturate, Antioxidantien,

Analgetika, Lebensmittelfarben


13

Aktivität der stationären Phase

Hängt ab vom Wassergehalt

der Oberfläche

• Aktivierung: Entfernung von

Wasser bei 120o Hängt ab vom Wassergehalt

der Oberfläche

• Aktivierung: Entfernung von

Wasser bei 120 C

• Konditionierung:

Gleichgewicht mit definierter

Feuchte

Beeinflusst:

• RF Werte: hohe Aktivität -

kleiner RF • Trennung

Muss kontrolliert werden

oC • Konditionierung:

Gleichgewicht mit definierter

Feuchte

Beeinflusst:

• RF Werte: hohe Aktivität -

kleiner RF • Trennung

Muss kontrolliert werden

Relative Feuchte

Trennung von Polyphenylen mit Hexan


14

Einstellen der relativen Feuchte

Masse %

H2SO4 H2SO4

%relative

Feuchte

Gesättigte

Salzlösung

% relative

Feuchte

10 96 Pb(NO3)2 98

20 88 KBr 84

30 75 NaNO2 66

. 40 56 NaHSO4

H2O 52

50 35 KF 31

60 16 HCOOK 21

. 70 3 ZnCl2

1.5 H2O 10


15

DC oder HPTLC ?

TLC HPTLC

Mittlere Korngrösse: 10 - 15 µm 5 - 7 µm

Korngrössenverteilung: weit eng

Schichtdicke: 250 µm 100, 200 µm

Probenzahl: max. 12 36 - 72

Laufstrecke: 100 - 150 mm 30 - 50 mm

Entwicklungsdauer: 30 - 200 min 3 - 20 min

LM-Verbrauch: 50 ml 5 - 10 ml

Detektionsgrenze, Abs.: 100 - 1000 ng 10 - 100 ng

Fluor.: 1 - 100 ng 0,1 - 10 ng


16

HPTLC – DC - Vergleich


17

HPTLC – DC: Partikelgrössen


18

Herstellung von Kieselgel und RP


19

HPTLC-Sorbenzien

Lichrospher - HPTLC klassisch


20

HPTLC - Lichrospher


23

UTLC


24

HPTLC – DC: Optimale Trennstrecke


Fließmittelauswahl

Methodenentwicklung in der DC


Anforderungen an das Fließmittel

Darf nicht mit der Probe reagieren

Ausreichende Selektivität und Stärke

Geringe Toxizität

Viskosität /sollte gering sein

Zusammen mit Oberflächenspannung bestimmt

sie die Geschwindigkeit der Fließmittelfront und

die Trennzeit

Dampfdruck/ nicht hoch nicht niedrig

Hoher Dampfdruck erhöht Risiken die mit

Adsorption und Desorption des FM-Dampfes an

bzw. von der Schicht.

Selektive Verdampfung möglich

Genügende Reinheit und Stabilität


Anforderungen an das Fließmittel

Reinheit

Trennung von 4 Polyhydroxybutyraten mit Chloroform

Stabilisator: Ethanol Amylen


Dateiname:0122.... Bahn:16

Currenta SER-ANT, Chempark Dormagen, Geb. Da 5, 41538 Dormagen

200

AE

180

A300

A280

A260

A240

A220

A200

A190

160

140

120

100

80

60

40

20

0

Analyse w:

160

140

120

100

A300

A280 80

A260 60

A240

40

A220

20

A200

0

3/FEB/2009

0 20 40 60 80 100

mm

Dateiname:0160.... Bahn:6

Currenta SER-ANT, Chempark Dormagen, Geb. Da 5, 41538 Dormagen

200

AE

180

A190

Analyse w:

Anforderungen an das Fließmittel

Reinheit

14/MAR/2009

0 20 40 60 80 100

mm

Eindampfrückstand aus 4 mL t-BME (Fluka 20257 , LOT 1390414)

Im AMD-Gradient, UV-Detektion

Eindampfrückstand aus 4 mL t-BME (SIAL 34875 , LOT 8323A)

Im AMD-Gradient „PF-Absicherung“, UV-Detektion


Anforderungen an das Fließmittel

Stabilität

• Gereinigte Lösemittel gut verschlossen und

gegebenenfalls lichtgeschützt aufbewahren

• Fließmittel immer frisch bereiten

Systeme wie n-Butanol/Eisessig/Wasser neigen zur

Veresterung!

Noch bedenklicher sind Verseifungen- es entstehen freie

Säuren und Alkohol !


Cs

Anforderungen an das Fließmittel

Verteilungsisotherme

cm

Verteilungsisotherme sollte linear sein

Zu trennende Substanzen sollen sich im

System Fließmittel-Schicht gleichmäßig

verteilen, damit der Fleck rund bleibt

Zusatz von Säuren, Basen ,

solvatisierenden Lösemitteln unterdrücken

überlagernde Dissoziations- oder

Assoziationsgleichgewichte- Substanzen

werden in einheitliche Molekülform überführt

H.-P. Frey, K. Zieloff: Qualitative u. quantitative

Dünnschichchromatographie, VCH (1993)


Charakterisierung von Fließmitteln

Lösemittelstärke - ε o

• Dimensionslose Größe zwischen 0 und 1

• Charakterisiert das Vermögen des Lösemittels zum Stofftransport

auf der Schicht

• Adsorptionsenergie des Lösemittels pro Flächeneinheit unabhängig

von Adsorptionsaktivität

• Pentan/Hexan ist als = 0.00 definiert


Eluotrope Reihe auf Kieselgel

Pentane / Hexane 0.00 Ethyl acetate 0.48

Cyclohexane 0.04 Acetone 0.50

CCl 4 0.11 Acetonitrile 0.60

Toluene 0.27 Dioxane 0.60

Isopropyl ether 0.28 Pyridine 0.70

Dichloromethane 0.30 Propanol 0.82

Chloroform 0.36 Methanol 0.95

Diethylether 0.43 Acetic acid >>1

Geiss, Fundamentals of TLC, Huethig 1987


Lösemittelstärke

Zunehmende Fliessmittelstärke: Einfluss auf die Trennung eines Testfarbstoffes.

MP: Hexan mit 0, 5, 10, 15, 20, 30, 40, und 90% Ethylacetat (von links nach recht)

CAMAG Applikationslabor


Lösemittelstärke binärer Mischungen

Die Lösemittelstärke einer

Mischung ist nicht additiv

Bei Zugabe eines “starken”

Lösemittels zu einem schwachen,

ändert sich die Lösemittelstärke erst

drastisch, dann immer weniger

F. Geiß, Die Parameter der Dünnschichtchromatographie,

Fr.Vieweg+Sohn, Braunschweig 1972


Lösemittelstärke und Selektivität

Vergleichende Entwicklung mit

Lösemittel εo A,B = 0.18 auf

Aluminiumoxid bei 58% r.F.

a) 7.1% Ethylacetat in Hexan

b) 9.53% Aceton in Hexan

c) 29.9% Toluen in Hexan

H.-P. Frey, K. Zieloff: Qualitative u. quantitative

Dünnschichchromatographie, VCH (1993)


Polaritätsindex (P`) nach Snyder

• Maß für die Fähigkeit eines Fließmittels mit verschiedenen

Lösungsmitteln (z.B. Ethanol, Dioxan, Nitromethan) in

Wechselwirkung zu treten

• Zur Berücksichtigung der Protonenakzeptor-

Protonendonator- und Dipoleigenschaften wurden die

Verteilungskoeffizienten der Fließmittel gelöst in den oben

genannten Lösemitteln hinzugezogen

• Aus diesen Daten berechnete Snyder log (K“)-Werte, die

sich additiv zum P`-Wert zusammenstzen

P`= log (K“) Ethanol + log (K“) Dioxan + log (K“) Niromethan


Polaritätsindex (P`) nach Snyder

P`= log (K“) Ethanol + log (K“) Dioxan + log (K“) Niromethan

Es lassen sich daraus die Wechselwirkungsanteile der Fließmittel mit den

Lösemitteln Etahanol, Dioxan, Nitromethan berechnen.

Zum Beispiel:

χ e = log (K“) Ethanol /P´

P´= χ eP´ + χ dP´ + + χ nP´

(χ e + χ d + + χ n) = 1 P` Polaritätsindex

Χ e

Χ d

Χ n

Anteil Fließmittelwechselwirkung mit

Ethanol (Protonenakzeptoreigensch.)

Anteil Fließmittelwechselwirkung mit

Dioxan (Protonendonatoreigensch.)

Anteil Fließmittelwechselwirkung mit

Nitromethan (Dipoleigensch.)


Einteilung der Lösemittel nach

Selektivität (Snyder)

I Aliphatische Ether, Trialkylamine, Trialkylphosphate

II Aliphatische Alkohole

III Pyridin, THF, DMSO, DMF, Diethylenglycol

IV Benzylalkohol, Ethylenglycol, Essigsäure, Formamid

V Dichlormethan, 1,2-Dichlorethan

VI Ketone , Ester, Dioxan, Nitrile

VII Aromatische (halogenierte) Kohlenwasserstoffe,

Nitroverbindungen

VIII Chloroform, Wasser, Fluoroalkohole, m- Kresol


Polaritätsindex, Selektivitätsparameter, Selektivitätsgruppe

X e - gemessene

Protonenakzeptorstärke

X d - gemessene Protonendonatorstärke

X n - gemessene Dipolwirkung

Eike Reich, Anne Schibli „High-Performance Thin-Layer Chromatography for the

Analysis of Medical Plants“, Thieme Verlag


Lösemittelstärke und Selektivität

A: Hexan /15% Ethylacetat

B: Hexan /20% Aceton

C: Hexan /10% Isopropanol

D: Chloroform

Aceton und Ethylacetat- gleiche Selektivitätsgruppe IV

Isopropanol II, Chloroform VIII

Eike Reich, Anne Schibli „High-Performance Thin-Layer Chromatography for the

Analysis of Medical Plants“, Thieme Verlag


Zusammenfassung

• Selektivität- entscheidender Faktor zur

Trennung von Substanzen gleicher Polarität

• Fließmittelstärke Faktor zur Trennung von

Substanzen unterschiedlicher Polarität

• Isoelutrope Fließmittel- gleiche Stärke

unterschiedliche Selektivität-unterschiedliche

Trennungen


Vorbetrachtungen zur Methodenentwicklung

Definition der analytischen Zielstellung

• Soll die Methode zur Routine oder für eine Entwicklung erarbeitet

werden?

• Soll die Methode zur Untersuchung von Rohmaterial, Extrakten,

Endprodukten oder Mischproben dienen?

• Möchten Sie die Identität einer Komponente oder der Komponente

in einer Mischung analysieren?

• Möchten Sie quantifizieren?

• Welche Matrices erwarten Sie, welche NWG?

• Können Sie bereits auf eine bestehende Methode zurückgreifen?

Eike Reich, Anne Schibli „High-Performance Thin-Layer Chromatography for the

Analysis of Medical Plants“, Thieme Verlag


Vorbetrachtungen zur Methodenentwicklung

Aspekte

• Eine qualitative Methode dient als Fingerprint und sollte so viel

wie möglich Komponenten auftrennen

• Steht Ihnen exklusives Referenzmaterial aus kontrolliertem Anbau

zur Verfügung ist eine Identitätsprüfung weniger schwierig

• Ist Ihre Leitdroge Bestandteil einer Mischung kann ein komplexer

Fingerprint der Mischung entwickelt werden. Die spezifischen

Banden der Leitdroge müssen herausgearbeitet werden, die

übrigen werden als Matrix angesehen.

• Quantitative Methode setzt Basislinientrennung voraus. Das

Chromatogramm kann so einfach wie möglich gestaltet werden.

Extensive Probenvorbereitung kann erforderlich sein.

Eike Reich, Anne Schibli „High-Performance Thin-Layer Chromatography for the

Analysis of Medical Plants“, Thieme Verlag


Vorbetrachtungen zur Methodenentwicklung

Ausgangspunkt

• Auftragen der Proben (Lösemittel, Probevolumen,

Auftragegeschwindigkeit, Größe und Schärfe der Auftragezone)

• Modifikation der stationären Phase (Aktivität, Imprägnierung)

• Chromatographiekammer (Typ, Sättigungsgrad)

• Entwicklungsmodus (Einfach, Mehrfach, Gradient)

• Detektion und Derivatisierung (UV-Absorption, Fluoreszenz,

Reagentien, Konditionierrung)

Eike Reich, Anne Schibli „High-Performance Thin-Layer Chromatography for the

Analysis of Medical Plants“, Thieme Verlag


Was ist bekannt ?

• Anzahl der Komponenten

• Chemische Struktur

• Molekulargewicht

• Löslichkeit

• Matrix

• Konzentrationsbereich

• pKa ; UV Spektrum, etc.

• Nichts


Schema zur Methodenentwicklung

Probe

Analyten

detektierbar?

Probenvorbereitung

nein

ja

Postchrom.

Derivatisierung

Analyten

angetrennt 1 ?

Orientierung über das

chromatogr. System

(z. B. Dreieck-Schema

nach Stahl)

Probenvorbereitung optimieren,

evtl. prächrom. derivatisieren

nein

ja

Optimierung Gasphase,

Konditionierung,

Zweifachentwicklung

Wahl der stationären

Phase (mit Kieselgel

starten)

e/o e/o

AMD

nein

Analyten

getrennt?

Optimierung der

mobilen Phase

Weitere chrom. Verfahren

Analyten

getrennt?

ja

nein

ja

Ende

1 Bei Beurteilung einer Trennung selektive Detektion berücksichtigen

berücksichtigen

CAMAG Applikationslabor


Auswahl des Fließmittels

Praktische Lösung

• Standardsysteme

• Fleckentest

• Prisma-Modell

• CAMAG - Optimierungsschema


Auswahl des Fließmittels

Standardsysteme

Lösemittelgemische:

1.Toluen/Ethylacetat 95+5 für unpolare Komponenten

2. Chloroform/Methanol/Wasser

70+30+4 für Saponine und Lignane

3. Ethylacetat/Essigsre/Ameisensre/Wasser

100+11+11+27 für Flavonoide

4. Acetonitril/Wasser/Ameisensäure

30+8+2 für Aminosäuren

5. Butanol/Essigsäure/Wasser

7+1+2 für polare Komponenten

Eike Reich, Anne Schibli „High-Performance Thin-Layer Chromatography for the

Analysis of Medical Plants“, Thieme Verlag


1.Toluen/Ethylacetat 95+5

für unpolare Komponenten

2. Chloroform/Methanol/Wasser 70+30+4

für Saponine und Lignane

3.Ethylacetat/Essigsre/Ameisensre/

Wasser 100+11+11+27 für

Flavonoide

4. Acetonitril/Wasser/Ameisensäure

30+8+2 für Aminosäuren

5. Butanol/Essigsäure/Wasser

7+1+2 für polare Komponenten

Eike Reich, Anne Schibli „High-Performance Thin-Layer Chromatography for the

Analysis of Medical Plants“, Thieme Verlag


Fleckentest

Versuch und Irrtum

• Lösen der Probe in unpolarem Lösemittel

• Applikation auf die DC-Platte

• Applikation ~ 20 µL unterschiedlicher Lösemittel

auf die Probenflecken

• Es erfolgt eine Zirkularentwicklung

• Trocknen der Lösemittel


Fleckentest

Goldenseal CAMAG Applikationslabor


Fleckentest

CAMAG Applikationslabor


Lavender

Fleckentest

CAMAG Applikationslabor


Vor- und Nachteile Fleckentest

• Schnell und automatisiert

• Lösmittelanzahl und Typ sind flexibel

• Information über Lösemittelstärke und

Selektivität

• Ungesättigtes offenes System

• Unsystematisch


Vororientierung

Dreieck-Schema nach Stahl


Auswahl stationäre Phase

• Beginnen mit Kieselgel

• Für spezielle Trennprobleme spezielle Schichten:

Bsp.:Eugenol, Methyleugenol, Isoeugenol

Kieselgel Amino- Cyano

MP: Toluen, D: Schwefelsäurereagenz,

1 Eugenol,

2 Methyleugenol,

3 Isoeugenol

1

OH

OH

OMe

OMe

OMe

OMe

Eike Reich, Anne Schibli „High-Performance Thin-Layer Chromatography for the

Analysis of Medical Plants“, Thieme Verlag

3

2


Reine

Fliessmittel

Herabsetzen /

Erhöhen der

Fliessmittelstärke

m. Wasser oder stärkeren

LSM gleiche

Selektivitätsgruppe

Mischungen,

Modifier-Zugabe

(Säuren, Basen)

Umgebung der

besten

Mischung


Auswahl mobile Phase Stufe 1

Beispiel Curcuma

A: TBME

B: Methanol

C: THF

D: Ethylacetat

E: DCM

F: Toluen

G: Chloroform

Gruppe A: die gewünschten Komponenten sind

getrennt, die Rf-Werte sind im passenden

Bereich, das Trennproblem ist gelöst

Gruppe B: Sie erhalten Rf-Werte über 0,8

Gruppe C: Sie erhalten Rf-Werte kleiner 0,2

Eike Reich, Anne Schibli „High-Performance Thin-Layer Chromatography for the

Analysis of Medical Plants“, Thieme Verlag


Auswahl mobile Phase Stufe 2

Beispiel Curcuma

TBME Methanol THF Ethylacetat TBME Ethylacetat

Lösemittel der Gruppe B werden mit n-Hexan „verdünnt“. Je höher die

Lösemittelstärke, desto höher muss der Anteil an n-Hexan ausfallen. Sollte die

Probe komplett in die Front laufen, sollte ein Verhältnis von mindestens 1:4

eingesetzt werden.

A-D 1:4 E und F 1:1

Eike Reich, Anne Schibli „High-Performance Thin-Layer Chromatography for the

Analysis of Medical Plants“, Thieme Verlag


Auswahl mobile Phase Stufe 2

Beispiel Curcuma

DCM/Essigsre Toluol/Essigsre Chloroform/Essigsre

9+1 8+2 9+1

Lösemitteln der Gruppe C wird ein polarer Modifier zugesetzt (z.B. Essigsäure, Ameisensäure

oder Basen wie z.B. Diethylamin, Ammoniak). Ein erster guter Versuch sind ca. 10%. Auch der

Zusatz von Wasser ist möglich, wenn die Mischbarkeit gegeben ist.

Eike Reich, Anne Schibli „High-Performance Thin-Layer Chromatography for the

Analysis of Medical Plants“, Thieme Verlag


Auswahl mobile Phase Stufe 3

Beispiel Curcuma

Kombination von 2 Lösemitteln aus den Gruppen B und C zunächst als Mischung 1:1,

dann im Umkreis durch „pobieren“ beste Mischung finden

Einstellung der Lösemittelstärke mit Modifiern um scharfe Trennzonen zu bekommen.

Bei Fleckentailing ist z.B. eine Wasserzugabe von 0,5-1% nützlich.

Modifizierung der Trennbedingungen (Kammersättigung, Feuchte)

A: Isopropanol/Hexan/Wasser 1:6:0,2

B:TBME/Hexan/Ameisensre 5:5:0,1

C:Toluol/Methanol 4,5:0,5

D: Chloroform/Methanol/Ameisensäure 10:0,1:0,1

Eike Reich, Anne Schibli „High-Performance Thin-Layer Chromatography for the

Analysis of Medical Plants“, Thieme Verlag


Feinabstimmung der Methode

Es wurde ein Fließmittel gefunden.

Variation des Auftragevolumens (qualitativ Maximum an

Zonen, quantitativ linearer Arbeitsbereich)

Derivatisierung/Visualisierung ( spezifische und

unspezifische Reagenzien, Optimierung der Derivatisierung für gute

Reproduzierbarkeit)

Robustheit der Methode

Parameter der densitometrischen Messung

(Wellenlänge, Spaltdimension, Geschwindigkeit)


Nun kann die Methode

validiert werden


Detektion/Derivatisierung in der DC


Detektion/Derivatisierung

Lokalisierung und Identifizierung

Lokalisierung (Ermittlung der Lage im Chromatogramm)

Physikalische Verfahren

Chemische Reaktionen

Biologische Reaktionen

Identifizierung (Verwendung von gruppenspezifischen Reagenzien)

Chemisches Verhalten

Physikalische, chemische, biologische

Eigenschaften


Physikalische Detektion


visuelle und

photom.

Auswertung

Chemische Reaktionen

Derivatisierung

bei der Probenvorbereitung

prächromatographisch

postchromatographisch

Chromatogramm

am Start

chromatogr.

Entwicklung


Prächromatographische in-situ-Derivatisierung

Chemische Reaktionen

Für Substanzen mit ähnlichen chromatographischen,

aber unterschiedlichen chemischen Eigenschaften

Zur Erhöhung der Stabilität

Umsetzung flüchtiger Substanzen in Derivate

Erhöhung der Nachweisempfindlichkeit durch z.B.

Erzeugung einer Fluoreszenz

Nachteil:

Analyt wird mit Derivatisierungsreagenz verunreinigt

und muss zusätzlich abgetrennt werden

Molekül wird größer und durch das Reagenz in der

Struktur ähnlicher- dadurch schlechtere Trennung

Beispiel: Dansylierungen

Dansylhydrazin für Carbonylgruppen

Dansylchlorid für NH und OH-Gruppen

Dansylsemipiperazid für Fettsäuren

Dansylazirin selektiv für SH-Gruppen

Reagenzapplikation punkt- oder

strichförmig

Applikation Untersuchungslösung

(in feuchte Reagenzzone)

eventuelle Wärmebehandlung

(Startzone abdecken)

Chromatographische Entwicklung


Prächromatographische in-situ-Derivatisierung

Chemische Reaktionen

Beispiel: Dansylierungen

Dansylhydrazin für Carbonylgruppen

Dansylchlorid für NH und OH-Gruppen

Dansylsemipiperazid für Fettsäuren

Dansylazirin selektiv für SH-Gruppen

Gerad- und ungeradzahlige Fettsäuren nach in-situ-Derivatisierung mit Dansylsemicadaverid

1: C-24 bis C-16 2: C-24 bis C-6 3: C-20 bis C-12 4: C-20 bis C-11

5: C-19 bis C-11 6: C24 bis C-16


Erwärmen

Chemische Reaktionen

Postchromatographische Derivatisierung

Entwicklung des Chromatogramms

Trocknen

Derivatisierungstechniken

Bedampfen

Tauchen

Sprühen


Trocknen der Platte

• Vertikale Lage der Platte, um Fließen des Restlösemittels

und damit Fleckendiffusion zu verhindern (so lange wie

Feuchte offensichtlich).


Kritische Trocknung

im Luftstrom

Anethol in Anis- und Fenchelöl

MP: Toluen/Ethylacetat 95+5

D: UV 254

Die etherischen Öle werden im Luftstrom von ihren Plätzen gerissen!

E.Reich,A. Schibli „HPTLC for the Analysis of Medicinal Plants“, Thieme 2006


Derivatisierungstechniken

Thermochemische Reaktionen (Erwärmen)

Aminophase für die

Trennung von Zuckern

Erhitzen der Platte

3-5 min auf 150°C


Bedampfen

• Doppeltrogkammer oder

Konditionierkammer

• Nutzung von Joddämpfen , Ammoniak,

Brom, Chlor,


Chemische Reaktionen

Postchromatographische Derivatisierung

• Erzeugung einer Absorption im sichtbaren-oder

UV-Bereich oder einer Fluoreszenz

• Verwendung von gruppenspezifischen

Reagenzien zum stoffspezifischen Nachweis

• Steigerung der Selektivität

• Steigerung der Nachweisempfindlichkeit


Spraydosen

Laborsprüher

Derivatisierungstechniken

Sprühen

Sprühautomat (DESAGA)


Derivatisierungstechniken

Sprühen

Vorteile

Einfach und schnell

Keine besondere Ausrüstung

Kleine Volumina

Nachteile

Erzeugung von Sprühnebeln

Schwierige Gewährleistung der Homogenität

Undefiniertes Volumen

Routine zum exakten Sprühen muss erst erworben

werden

Es könne partielle Feuchteinseln entstehen


Derivatisierungstechniken

Tauchen

• Gleichmäßige Belegung

mit Reagenz

• Reproduzierbare

Ergebnisse durch

standardisierte

Bedingungen

• Keine Sprühnebel

• Reinigen der Rückseite

• Vertikale Lagerung um

Bandenverbreiterung

auszuschließen


Vergleich Tauchen-Sprühen

Tauchen Sprühen

CAMAG Applikationslabor


Vergleich Tauchen-Sprühen

Diplomarbeit Katherine Gessler, Uni Basel


Vergleich Sprühen-Tauchen

Derivatisierung von Capsaicin

mit Gibbs-Reagenz

(Dichlorchinon chlorimid

gefolgt von Base)

Sprühreagenz: 1%-ige Lsg.

Gibbs-Reagen; 2%-ige

Natriumcarbonat- Lösungen

haben hohe Viskosität und

lassen sich somit schlecht

dosieren

Tauchreagenz: 0,025% Gibbs

Reagenz und basische

Bedampfung mit z.B.

Ammoniak


Reagenzien

Universalreagenzien

Ansprühen mit Wasser macht lipophile

Substanzen kurzzeitig als helle Flecken auf

grauem Grund


Anisaldehyd-

Schwefelsäure-Reagenz

3%

Phosphormolybdänsäure

in Propan-2-ol

Schwefelsäure-Reagenz

Vanillin-Phosphorsäure

Reagenzien

Universalreagenzien

Untersch. gef.

Zonen, häufig bei

365nm Fluoreszenz

Blaue Flecken auf

gelbem Grund

Fluoreszierende

Zonen bei

366nm,oder

verkohlte Zone

Versch. Gefärbte

Zonen auf hellem

Grund

90-125°C 1-5 min

10 min 150-180°C

1-20 min 95-140°C

5-10 min 120-160°C


Anisaldehyd

1ml

0,5ml

0,5ml

1ml

Anisaldehyd-Schwefelsäure

Welche Rezeptur soll ich nehmen?

Schwefelsäure

2ml

5ml

5ml

2ml

Essigsäure

97 ml

10ml

10ml

100ml

Methanol

85ml

85ml

Bedingungen

1-15 min, 90-

125°C

100°C, bis zur

Farbentw.

100°C, 2-5 min

100-105°C

Literatur

Jork,Funk,Fisc

her

Wimmer

Kraus,Koch,

Hoffstetter,

Kuhn

Reich,Schibli

Stahl


Anisaldehyd-Schwefelsäure-Reagenz

10 ml Schwefelsäure werden vorsichtig in eine Mischung aus

170 ml eisgekühltem Methanol und 20 ml Eisessig eingerührt. Zu

dieser Mischung wird 1 ml Anisaldehyd zugefügt.

Das Reagenz ist farblos und sollte im Kühlschrank aufbewahrt

werden. Sollte sich die Farbe ändern, muss es verworfen werden!

Die Platte wird in das Reagenz mit einer Verweilzeit von 1 s getaucht.

Danach wird 2-5 min auf 100°C erhitzt.

Auswertung im Weißlicht und bei UV 366 nm


Ergebnis in Abhängigkeit vom

zugeführten Reagenz

Diplomarbeit Katherine Gessler, Uni Basel


Stoffspezifische Reagenzien

Zucker und Glycoside

Schicht: HPTLC Kieselgel 60 (rel. Feuchte über 62% Schwefelsäure

Fließmittel: Chloroform: Essigsäure: Wasser 30+35+5

Derivatisierung: Diphenylamin, Anilin und Orthophosphorsäure gelöst in Aceton


Beeinflussung der Nachweisempfindlichkeit

zugeführtes Reagenz

Funk, Fischer, Wimmer ,Dünnschichtchromatographie Bd.1


Nachbehandlung

Trocknen

Abzug

vertikale Lagerung

ev. Ventilator oder Fön

Substanzeigenschaften (Flüchtigkeit, Oxidationsempfindlichkeit

beachten)


Trockenschrank

Nicht auf das

Gitternetz legen

Metallblock verwenden

oder frei schwebend

Einwirkung von Wärme

Heizplatte

Visuelle Verfolgung

homogene Umsetzung


Hinweise zur Benutzung von

Wärmeplatten

• Legen Sie die Platte auf die noch kalte Heizplatte

und heizen Sie Platte und Gerät gleichzeitig auf.

• Wollen Sie mehrere Platten derivatisieren kühlen

Sie auf etwa 60°C ab.

• Haben Sie hohen Plattendurchsatz, dann legen

Sie die Platten auf ca. 1mm dicke seitlich

angebrachte Abstandhalter (das Luftpolster

verhindert das Aufwölben der Platte. Wählen Sie

eine 10°C höhere Temperatur um Wärmeverlust

auszugleichen.


• Temperatur

• Konzentration und Zusammensetzung

der Lösung

• Stabilität der Lösung


Derivatisierung

Temperatur

1 2

3

366 nm, NP, NP/PEG

366 nm, NP, NP/PEG nach 30 min

366 nm, NP, NP/PEG

Flavonoids of

St. John‘s Wort

1: 3 min Kaltluftstrom

2: 5 min 105°C

3: 30 min 105°C

CAMAG Applikationslabor


Derivatisierung

Temperatur

Diplomarbeit Katherine Gessler, Uni Basel


Konzentration und Zusammensetzung der

Lösung

Diplomarbeit Katherine Gessler, Uni Basel


Derivatisierung

Alter des Reagenz

Diplomarbeit Katherine Gessler, Uni Basel


Lagerung der derivatisierten Platte

Diplomarbeit Katherine Gessler, Uni Basel


Einfluss des Plattenuntergrundes auf

Derivatisierung


Reagenz im Sorbens

Reagenz wird in die Sorbensschicht eingearbeitet

Reagenz

Coffein

Ammoniumsulfat

Silbernitrat

Molybdatophosphorsäure

Nachgewiesene Substanzen

PAH

Lipide

Dihydroxybenzole

Etherische Öle


Reagenz im Fließmittel

Voraussetzung: -gleichmäßige Verteilung auf

der Schicht-Reagenz muss mit der

Fließmittelfront laufen

Beispiele: Ninhydrin bei Aminosäuren

Fluorescamin bei biogenen Aminen

Identifizierung und Quantifizierung von Aminosäuren

und Peptiden (CBS 101,Hamon,Diancourt,Roy,Sbaffo-Poasevara)

Ninhydrin in der mobilen

Phase vermindert das

Rauschen um den Faktor 2.

Die selektive Derivatisierung

ist bestens geeignet, da die

nicht derivatisierte Matrix die

Detektion nicht beeinflusst


Problem

Probleme beim Derivatisieren

Hohe Untergrundfärbung

Benetzungsprobleme

Fleckenelution bzw. Vergrößerung

Schlechte Reproduzierbarkeit

Reaktion

Verdünnen Reagenz, Temperatur

herabsetzen, Platte vorwaschen

Polarität Lösemittel ändern ( KG-

Polarität erhöhen, RP-Polarität

senken)

Polarität Lösemittel ändern ( KG-

Polarität senken, RP-Polarität

erhöhen)

Standardisierte Bedingungen

einhalten


Wirkungsbezogene Detektion

direktes Biomonitoring

Direkte Messung der physiologischen Wirkung – Referenzsubstanzen

müssen nicht vorhanden sein

-Enzymatische Reaktionen

Acetylcholinesterase- Hemmung durch Phosphorsäureester und

Carbamate

Bestimmung von Schwermetallen mit Urease

-Antibiotische Wirkung

mit Bacillus subtilis

-Toxische Wirkung

mit Vibrio fisheri

Marines Bakterium

Kontinuierlilches Biolumineszenzsignal

Nicht pathogen

Seit 1979 für ökotoxische Tests im Einsatz

(DIN 38412-431)


Züchtung der Bakterien

Wie funktioniert das ?

Tauchen der DC-Platte in die Bakteriensuspension

Beseitigung des Überschusses


200 ng

150 ng

np

100 ng

100 μg

Ergebnis

75 μg

50 μg

25 μg

10 μg

A B C D E

A-E: Probenverdünnungen

np: Nitrophenol (toxische Referenz)

Biolumineszenzlöschung

Biolumineszenzstimulation


Beispiele

Patulin in Apfelsaft


Das CAMAG TLC-MS Interface

Laser on/off

Stempel rauf/runter

Schalter Reinigung

Sicherheitschutzschild

on/off Schaltventil zu MS


Stempel


HPLC Pump fördert

Lösungsmittel (MeOH)

Flow rate: 100µl/min

Prinzip TLC-MS Kopplung

CAMAG TLC-MS Interface

MS-ESI

(Electrospray Ionization

Interface)


Funktionsprinzip TLC-MS Interface

Positionierung Platte mit

Laserkreuz auf

gewünschten Spot/Zone

Stempel senkt sich mit 4 bar ab

und Extraktion beginnt


Funktion Stempel und Extraktion

HPLC Pumpe fördert

Lösungsmittel

Stempel senkt sich mit

kontrolliertem Druck

Massenspektometer

analysiert Probe

DC/HPTLC Platte mit Spots/Zonen

MS2

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