Aus dem Institut für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie der

Aus dem Institut für
Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie
der Tierärztlichen Hochschule Hannover
und der
Experimentellen Unfallchirurgie
der Unfallchirurgischen Klinik
der Medizinischen Hochschule Hannover
Wirkung eines Pan­Selektinantagonisten auf die inflammatorische
Immunreaktion in einem multi­hit­Traumamodell der Maus mit
nachfolgender Sepsis
Inaugural­Dissertation
Zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Veterinärmedizin
(Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von
Binja Bergmann
aus Osterode
Hannover 2006

Wissenschaftliche Betreuung:
Univ.­Prof. Dr. med. vet. Manfred Kietzmann, Institut für Pharmakologie, Toxikologie und
Pharmazie der Tierärztlichen Hochschule Hannover
und
Prof. Dr. rer. biol. hum. Martijn van Griensven, Experimentelle Unfallchirurgie,
Unfallchirurgische Klinik der Medizinischen Hochschule Hannover, inzwischen Ludwig
Boltzmann Institut für experimentelle und klinische Traumatologie, Wien
1. Gutachter: Univ.­Prof. Dr. med. vet. Manfred Kietzmann
2. Gutachter: Univ.­Prof. Dr. med. vet. Klaus Otto
Tag der mündlichen Prüfung: 22.05.2006

Meiner lieben Mutter
&
Ilke und Uwe
gewidmet

INHALTSVERZEICHNIS
1 Einleitung .....................................................................................................................1
2 Literaturübersicht .......................................................................................................4
2.1 Die Rolle des Immunsystems bei der Pathogenese des SIRS und MODS..............4
2.2 Definitionen .........................................................................................................5
2.2.1 Schock.........................................................................................................5
2.2.2 Systemisches­Entzündungsantwort­Syndrom (SIRS) und Sepsis .................5
2.2.3 Multiorganversagen / Multiorgan­Dysfunktions­Syndrom ...........................9
2.2.3.1 Pathophysiologie.................................................................................9
2.3 Neutrophile Granulozyten ..................................................................................14
2.3.1 Chemotaxis und Extravasation...................................................................15
2.3.2 Die Selektine .............................................................................................18
2.4 T­Lymphozyten..................................................................................................19
2.4.1 Grundlegende Merkmale ...........................................................................19
2.4.2 Funktion der T­Helferzellen ......................................................................22
2.4.2.1 Charakterisierung der TH1­Zellen......................................................23
2.4.2.2 Charakterisierung der TH2­Zellen......................................................24
2.4.3 T­Zell­vermittelte Zytotoxizität .................................................................25
2.4.4 Charakterisierung der natürlichen Killerzellen ...........................................27
2.4.5 T­Lymphozytenfunktion bei Trauma und Sepsis........................................29
2.5 Apoptose............................................................................................................31
2.6 Die Rolle der Zytokine bei der Pathogenese des SIRS und MODS .....................34
2.6.1 Tumor Nekrose Faktor­α (TNF­α) und TNF­Rezeptoren...........................36
2.6.2 Interleukin­6 (IL­6) ...................................................................................40
2.6.3 Interleukin­10 (IL­10)................................................................................41
2.6.4 Interleukin­12 (IL­12)................................................................................43
2.6.5 Interferon­γ (IFN­γ)...................................................................................44
2.6.6 Monozyten­chemotaktisches Protein­1 (Monocyte chemotactic
protein­1, MCP­1) .....................................................................................46
2.7 Überempfindlichkeitsreaktion vom verzögerten Typ ..........................................47

2.8 Sepsisinduktion durch coecale Ligatur und Punktion (CLP) in Verbindung
mit einem „two­hit“­Modell der Maus................................................................48
2.9 Behandlungsstrategien in der Sepsisprävention und –behandlung.......................51
2.10 Immunmodulation mit Bimosiamose (TBC1269) ...............................................54
3 Fragestellung..............................................................................................................58
4 Material und Methoden.............................................................................................59
4.1 Material..............................................................................................................59
4.1.1 Chemikalien und Medikamente .................................................................59
4.1.2 Geräte........................................................................................................60
4.1.3 Verbrauchsmaterialien...............................................................................60
4.2 Methoden...........................................................................................................61
4.2.1 Versuchstiere.............................................................................................61
4.2.1.1 Versuchstiergruppen .........................................................................62
4.2.2 „First­Hit“.................................................................................................63
4.2.2.1 Femurfraktur.....................................................................................64
4.2.2.2 Hämorrhagischer Schock ..................................................................64
4.2.3 Coecale Ligatur und Punktion (CLP, „second­hit“)....................................65
4.2.4 Bimosiamose­Medikation..........................................................................66
4.2.5 Aufrechterhaltung der Analgesie ...............................................................66
4.2.6 Klinische Untersuchungsparameter............................................................67
4.2.7 Messung der T­Zell­vermittelten Typ­IV­Reaktion....................................68
4.2.8 Blut­ und Organentnahme..........................................................................68
4.3 Durchflusszytometrie .........................................................................................70
4.3.1 Durchflusszytometrische Analyse von T­Lymphozyten .............................70
4.3.1.1 Analyse apoptotischer T­Lymphozyten.............................................71
4.3.1.2 Durchführung der durchflusszytometrischen Analyse........................71
4.3.2 Durchflusszytometrische Analyse von Zytokinen ......................................73
4.3.2.1 Durchführung der Messung...............................................................74
4.4 Myeloperoxidase in der bronchoalveolären Lavage ............................................75
4.5 Histologie...........................................................................................................76
4.5.1 Histologische Technik ...............................................................................76
4.5.2 Bewertung der histologischen Präparate ....................................................77

4.6 Statistik..............................................................................................................78
5 Ergebnisse ..................................................................................................................80
5.1 Überlebensraten .................................................................................................80
5.2 Körpergewicht ...................................................................................................80
5.3 Körpertemperatur...............................................................................................86
5.4 Aktivität.............................................................................................................91
5.5 T­Zell­vermittelte Typ IV­Reaktion ...................................................................97
5.6 Durchflusszytometrische Auswertung von T­Lymphozyten..............................101
5.6.1 CD4 + ­Lymphozyten ................................................................................101
5.6.2 CD8 + ­Lymphozyten ................................................................................103
5.6.3 CD4 + CD8 + ­Lymphozyten........................................................................106
5.6.4 NK­Zellen ...............................................................................................108
5.6.5 Apoptose.................................................................................................111
5.6.6 Nekrose und Spätapoptose.......................................................................114
5.7 Durchflusszytometrische Auswertung von Zytokinen.......................................117
5.7.1 TNF­α.....................................................................................................117
5.7.2 IL­6.........................................................................................................119
5.7.3 IL­12p70 .................................................................................................122
5.7.4 MCP­1.....................................................................................................124
5.7.5 Interferon­γ..............................................................................................127
5.7.6 IL­10.......................................................................................................128
5.8 Messung der MPO­Aktivität in der Lunge........................................................131
5.9 Histologische Auswertung................................................................................134
5.9.1 Lunge......................................................................................................134
5.9.2 Leber.......................................................................................................138
5.9.3 Niere .......................................................................................................142
5.9.4 Milz.........................................................................................................146
6 Diskussion ................................................................................................................152
6.1 Klinische Parameter und Mortalität der Versuchstiere ......................................154
6.2 Lymphozytensubpopulationen, NK­Zellen und Apoptoserate...........................156
6.3 Zytokine...........................................................................................................159
6.4 Organpathologie...............................................................................................166

6.5 Abschließende Diskussion................................................................................170
7 Zusammenfassung ...................................................................................................173
8 Summary..................................................................................................................175
9 Literaturverzeichnis ................................................................................................177
10 Danksagung..............................................................................................................219

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
ADCC Antikörperabhängige, zellvermittelte Zytotoxizität
AK Antikörper
APC Aktiviertes Protein C
APZ Antigenpräsentierende Zelle
ARDS Adult Respiratory Distress Syndrome
BAL Bronchoalveoläre Lavage
BALT Bronchienassoziiertes lymphatisches Gewebe
Bcl2 B­cell lymphoma­2­protein
BSA Bovine serum albumin (Rinderserumalbumin)
C Complement
CAD Caspase­activated DNase
CARS Compensatory Antiinflammatory Response Syndrome
CASP Colon ascendens stent peritonitis
CBA Cytometric Bead Array
CD Cluster of Differentiation
CLP Coecale Ligatur und Punktion
CLTR Cecal ligation and Tip resection
CRP C­reaktives Protein
DFF DNA­fragmentierender Faktor
DIC Disseminated Intravasal Coagulation

DNA Desoxyribonukleinsäure
DNFB 2,4­Dinitrofluorbenzen
ELAM Endothelial Leucocyte Adhesion Molecule
ELISA Enzyme linked Immuno Sorbent Assay
Fab­Fragment Fragment antigen binding
FACS Fluorescence­activated cell sorter
Fas CD95
FcR Rezeptor für das Fab­Fragment der Immunglobuline
FITC Fluorescein­Isothiocyanat
FSC Forward Scatter
GALT Gut­associated lymphoid tissue
G­CSF Granulocyte­Colony­Stimulating Factor
GlyCAM­1 Glycosilation­dependent cell adhesion molecule­1
GM­CSF Granulocyte­Monocyte­Colony Stimulating Factor
HE Hämalaun­Eosin
ICAM­1 Intercellular Adhesion Molecule­1
IFN Interferon
Ig Immunglobulin
IL Interleukin
IP Interferon­gamma­inducible­protein
ISS Injury Severity Score
i.v. intravenös

KGW Körpergewicht
KIR Killer all inhibitory receptor
LFA­1 Leucocyte Function Associated Molecule­1
LPS Lipopolysaccharide
LT Leukotrien
MadCAM­1 Mucosal cell­adhesion molecule­1
MALT Mukosaassoziiertes lymphatisches Gewebe
MARS Mixed Antagonist Response Syndrome
MCF Macrophage chemotactic factor
MCP­1 Monocyte chemotactic protein
MHC Major Histocompatibility Complex
MHH Medizinische Hochschule Hannover
MICA MHC class I chain­related Antigen
min Minuten
MODS Muliorgan­Dysfunktions­Syndrom (Multiple Organ Dysfunction
Syndrome)
MOV Multiorganversagen
MPO Myeloperoxidase
mRNA Messanger RiboNuclein Acid
n Anzahl
NaCl Natriumchlorid
NK­Zellen Natürliche Killerzellen
PaCO2
Arterieller Kohlenstoffdioxidpartialdruck

PAF Platelet Activating Factor
PBS Phosphate­buffered­saline
PE Phycoerythrin
PG Prostaglandin
PI Propidiumiodid
PMN Polymorphonukleäre Granulozyten
PS Phosphatidylserin
R Rezeptor
RT Raumtemperatur
s.c. subkutan
Sham Scheinoperation
SIRS Systemisches­Entzündungsantwort­Syndrom (Systemic
Inflammatory Response Syndrome)
sLe x
Sialyl­Lewis x ­Einheit
SSC Side Scatter
TBC1269 Bimosiamose
TBC1269Z Di­Natrium­Salz von Bimosiamose
TCR T­Zell­Rezeptor
TGF­β Transforming Growth Factor β
TH­Zellen T­Helferzellen
TNF Tumornekrosefaktor
TNF­RI Tumornekrosefaktor­Rezeptor 1
TNF­RII Tumornekrosefaktor­Rezeptor 2

VCAM Vascular Cell Adhesion Molecule
VLA Very Late Antigen
Ferner gelten die allgemeinen SI­Einheiten und die chemischen Elementsymbole.

Einleitung 1
1 Einleitung
Bis 1969 war das Krankheitsbild des Multiorganversagens (MOV) bei polytraumatisierten
Patienten unbekannt. Aufgrund langer Rettungszeiten und wenig entwickelter
intensivmedizinischer Behandlungsmaßnahmen verstarben Patienten, die einen
hämorrhagischen Schock erlitten, an dem großen Blutverlust, bevor sich das Krankheitsbild
des MOV entwickeln konnte. Auch in der Tiermedizin stellt das Multiorganversagen nach
Polytrauma aus den genannten Gründen eine zunehmende Komplikation dar. Durch die
Verbesserung der Notfallbehandlung und den Einsatz neuer Diagnosetechniken konnten
manche Todesursachen wie z.B. das Verbluten auch in der Tiermedizin vermindert werden.
In der Humanmedizin blieb das Verbluten bis 1940 der limitierende Faktor für das Überleben
der Patienten. Zur Therapie des akuten traumatischen Volumenmangelschocks wurden Blut­
transfusionen und kristalloide Volumenersatzmittel eingesetzt. Dadurch ergab sich ein neues
Spektrum an Folgeerkrankungen. Im Vordergrund standen zunächst pathophysiologische
Veränderungen der Lunge. Das Krankheitsbild der „Shocklung“ wurde in dieser Zeit
mehrfach beschrieben. Bereits 1932 beschrieb MOON einen ähnlichen Komplex von
Symptomen, zu denen Luftnot, erhöhte Temperatur und zentrale Zyanose gehörten (MOON
1932). JENKINS et al. (1950) sprachen von der kongestiven Atelektase. Letztendlich führten
ASHBAUGH et al. (1967) den noch heute gültigen Begriff „Adult Respiratory Distress
Syndrome“ (Akutes Atemnotsydrom des Erwachsenen, ARDS) ein, als sie erkannt hatten,
dass dieses progressive Lungenversagen nicht nur nach Trauma auftrat, sondern auch nach
großen elektiven operativen Eingriffen wie Bauchhöhlenoperationen (SKILLMAN et al.
1969), Peritonitis (BURKE et al. 1963) oder anderen Infektionen (CLOWES et al. 1968).
Somit wurde klar, dass die pulmonale Beeinträchtigung wahrscheinlich die Folge entfernter
Prozesse im Körper ist. Die ARDS war zu dieser Zeit die häufigste Todesursache bei
schwerverletzten Patienten (ASHBAUGH et al. 1967; BAUE 1975; EISEMANN et al. 1977).
Die Inzidenz des ARDS konnte durch weitere Fortschritte in der intensivmedizinischen
Behandlung verringert werden, so dass neben den zunächst lebenslimitierenden
Lungenveränderungen auch die Schädigungen der weiteren Organsysteme klinisch an

Einleitung 2
Bedeutung gewannen. Eine weitere Komplikation bei Polytraumapatienten stellt dabei die
Entwicklung eines Systemischen­Entzündungsantwort­Syndroms (SIRS, Systemic
Inflammatory Response Syndrome) dar. Die eigentlich erwünschte Immunantwort
überschreitet dabei das sinnvolle Reaktionsniveau, wodurch weitere Organschäden entstehen.
1973 wurde dieses neu entstandene Sydrom von TILNEY et al. als „distal organ failure“
beschrieben. Der Begriff des Multiorganversagens (MOV) wurde 1975 durch Baue geprägt
(BAUE 1975). Auf den Intensivstationen wurde seitdem eine steigende Zahl von Patienten
ermittelt, die trotz maximaler Intensivtherapie nicht mehr stabilisiert werden konnten und ein
mit hoher Letalität einhergehendes progressives MOV entwickelten (MANSHIP et al. 1984;
CARRICO et al. 1986; SCHUSTER 1989). Dieses Syndrom stand in jener Zeit an erster
Stelle der Todesursachen Schwerverletzter (ASHBAUGH et al. 1967; BAUE 1975;
EISEMANN et al. 1977; ALBERTS et al. 1986) und stellt noch heutzutage die
schwerwiegendste Komplikation bei schwerverletzten Patienten dar. Ungefähr 40 % der
schwerkranken Patienten auf den Intensivstationen entwickeln ein MOV, welches eine
Mortalitätsrate von bis zu 70 % aufweist (DEITCH 1992; MARSHALL et al. 1995;
RANGEL­FRAUSTO et al. 1995; SALVO et al. 1995). In späteren Jahren wurde der Begriff
MOV durch das Multiorgan­Dysfunktions­Syndrom (MODS) ersetzt, um das Kontinuum der
Organdysfunktion und nicht nur deren Endpunkt besser beschreiben zu können.
Bisher gibt es keine ausreichend wirksame Therapie des SIRS und MODS. Die Applikation
von monoklonalen Antikörpern (AK) zur Neutralisation der Zytokine, die für die Entwicklung
der genannten Syndrome entscheidend sind, erbrachte keine zufriedenstellenden Ergebnisse
(DINARELLO et al. 1993). Auch die kontinuierliche Hämofiltration bei SIRS­ bzw. MODS­
Patienten, um die Konzentration von Endotoxinen und Zytokinen im Blut zu verringern
(KODAMA et al. 1995; HIRASWA et al. 1996), erbrachte nicht die erwünschten Erfolge. Es
besteht vielmehr die Gefahr einer zusätzlichen Aktivierung von Leukozyten (SCHETZ et al.
1995). Weitere Therapieversuche wie die topische und parenterale Gabe von Antibiotika
(CERRA et al. 1992; GASTINNE et al. 1992), Anti­Endotoxin­Therapien mit Antiseren
(MANTHOUS et al. 1993; ZANETTI et al. 1993) oder die Applikation von Antioxidantien
zur Reduktion freier Radikale (SCHILLER et al. 1993) erbrachten keine deutlichen Erfolge.

Einleitung 3
Ein möglicher Therapieansatz, um in das pathogenetische Geschehen bei der Entwicklung des
SIRS und MODS einzugreifen, ist die selektive Inhibition von Adhäsionsmolekülen. Diese
haben einen entscheidenden Einfluss bei der Neutrophilenmigration und neutrophile
Granulozyten stellen die Schlüsselzellen in der Pathogenese dieser Syndrome dar. Die in
dieser Studie verwendete Testsubstanz Bimosiamose kann die Inhibition einer bestimmten
Klasse von Adhäsionsmolekülen auslösen, die für den ersten Schritt der
Neutrophilenmigration verantwortlich ist. Mittels einer induzierten Sepsis in Mäusen soll die
Wirksamkeit dieser Substanz untersucht und die Beeinflussung immunologischer Reaktionen
ermittelt werden.

Literaturübersicht 4
2 Literaturübersicht
2.1 Die Rolle des Immunsystems bei der Pathogenese des SIRS und
MODS
Das Immunsystem des Körpers hat die Aufgabe, die Invasion von Mikroorganismen wie
Bakterien, Viren, Pilze und Parasiten zu verhindern. Es besteht eine Proportionalität zwischen
der Intensität der Immunabwehr und der Stärke der Infektion. Ziel dieser Immunantwort ist
es, das schädigende Agens zu eliminieren.
Funktionell unterscheidet man zwischen dem angeborenen und dem erworbenen
Immunsystem. Die angeborene Immunität dient der ersten Abwehr von Infektionen während
der ersten vier bis sechs Tage, die bis zum Einsetzen der erworbenen Immunantwort
vergehen, und umfasst physikalische, zelluläre und chemische Mechanismen. Zusätzlich
spielt sie bei der Auslösung und der anschließenden Steuerung der adaptiven
Immunreaktionen eine entscheidende Rolle. Die angeborene Immunität kann jedoch
Krankheitserreger nicht spezifisch erkennen und keinen gezielten Schutz gegen eine erneute
Infektion geben. Das erworbene Immunsystem besteht aus humoralen (Antikörper) und
zellulären Komponenten. Es basiert auf der klonalen Selektion von Lymphozyten, die eine
Vielzahl hochspezifischer Rezeptoren besitzen, die es dem Immunsystem ermöglichen, jedes
beliebige fremde Antigen zu erkennen. Bei der adaptiven Immunantwort vermehren sich die
antigenspezischen Lymphozyten und differenzieren zu Effektorzellen, die die
Krankheitserreger vernichten (JANEWAY u. TRAVERS 1997, S. 11).
Bei einer physiologischen Immunantwort regulieren sich die funktionellen Einheiten des
Immunsystems gegenseitig, so dass es zu einer angemessenen Reaktion kommt, die innerhalb
bestimmter Grenzen bleibt und rechtzeitig beendet wird.
Den Zustand von permanent anwesenden Bakterien einschließlich der dazugehörenden
Immunantwort bezeichnete SCHOTTMÜLLER (1914) als „Sepsis“ (griech. Fäulnis).
SCHUSTER (1989) erweiterte diese Definition um die Aussage, dass ebenfalls Endotoxin
sowie die anwesenden humoralen Mediatoren eine Sepsis auslösen können. Findet ein sich

Literaturübersicht 5
ständig wiederholender Kontakt zwischen dem Immunsystem und den mikrobiellen Agentien
statt, kommt es zu einer gesteigerten Aktivierung des Immunsystems. Diese
hyperinflammatorische Situation birgt die Gefahr der Dysregulation des Immunsystems und
der Schädigung des Organismus. Die Dysregulation kann unter diesen Umständen in einem
septischen Schock enden, der zu einem MOV führen kann (BUDELMANN 1969).
2.2 Definitionen
2.2.1 Schock
Schock wird im Allgemeinen definiert als ein akut bis subakut verlaufendes, fortschreitendes
allgemeines Kreislaufversagen, verursacht durch Abnahme der zirkulierenden Blutmenge
oder der Blutumlaufgeschwindigkeit. Im kardiogenen Schock ist die Ursache das Pumpver­
sagen des Herzens, im hämorrhagischen Schock das verminderte zirkulierende Blutvolumen
und im septischen Schock ein veränderter Gefäßtonus. Ist der Schock von kurzer Dauer oder
wird er adäquat therapiert, kann er ohne Komplikationen ausheilen. In einigen Fällen folgen
trotz angemessener Volumentherapie schwerwiegende Komplikationen (GORIS 1993).
2.2.2 Systemisches­Entzündungsantwort­Syndrom (SIRS) und Sepsis
Die Ursachen für ein SIRS können neben Infektionen mit Bakterien, Viren, Protozoen oder
Pilzen auch multiple Traumata, ein hämorrhagischer Schock, eine Ischämie­Reperfusion oder
eine akute Pankreatitis sein. Dabei liegt ein SIRS vor, wenn zwei oder mehr der folgenden
Parameter in entsprechender Weise pathologisch verändert sind (BONE et al. 1992):
• Rektaltemperatur < 36°C oder > 38°C,
• Atemfrequenz > 20 Atemzüge pro Minute oder
arterieller Kohlenstoffdioxidpartialdruck < 4,3 kPa,
• Herzfrequenz > 90 Schläge pro Minute,

Literaturübersicht 6
• Leukozyten < 4.000 pro mm 3 oder > 12.000 pro mm 3 oder 10 % der Leukozyten bestehen
aus unreifen Formen.
Geht das SIRS mit einer nachgewiesenen Infektion einher, wird von einer Sepsis gesprochen.
Bei einer schweren Sepsis ist zusätzlich die Hämodynamik beeinträchtigt. Dies äußert sich in
Symptomen wie Hypoperfusion mit Laktatazidose, Oligurie, Bewusstseinsstörungen oder
Hypotonie (systolischer Blutdruck < 90 mmHG). Vom septischen Schock spricht man, wenn
die Hypotonie trotz adäquater Volumensubstitution persistiert (BONE et al. 1992).
Das MODS kann als Folge von SIRS oder Sepsis auftreten. Es liegt vor, wenn die
Organfunktion nicht ausreicht, um die Homöostase aufrecht zu erhalten (s. Tab. 2.1) (BONE
et al. 1992).
Tabelle 1: Definitionen des „Systemic inflammatory response syndrome“ (SIRS), der
(schweren) Sepsis und des Multiorgan­Dysfunktions­Syndroms (MODS) nach der
Konsensuskonferenz der „Society of Critical Care Medicine“ und des „American College of
Chest Physicians“ von 1991 (BONE et al. 1992).
SIRS Zwei oder mehr der folgenden Symptome können diagnostiziert werden:
Rektale Temperatur < 36°C oder > 38°C
Atemfrequenz > 20 pro Minute oder paCO2 < 4,3 kPa
Herzfrequenz > 90 pro Minute
Leukozyten < 4.000 pro mm 3 oder > 12.000 pro mm 3 oder 10 % unreif
Sepsis SIRS mit dokumentierter Infektion
Schwere Sepsis SIRS mit dokumentierter Infektion, Beeinträchtigung der Hämodynamik
und septischer Schock
MODS Zustand eines physiologischen Ungleichgewichts, in dem die Organfunktion
nicht im Stande ist, die Homöostase aufrecht zu erhalten

Literaturübersicht 7
Die Entwicklung eines SIRS kann in drei Phasen unterteilt werden (BONE 1996c; DAVIES
u. HAGEN 1997):
• Phase 1 (Initialphase): lokale Immunantwort
• Phase 2: initiale systemische Immunantwort
• Phase 3: massive systemische Inflammation
Die Initialphase besteht aus einer physiologischen lokalen Immunantwort als Reaktion auf ein
lokales Trauma oder Infektionsgeschehen. Dabei werden humorale und zelluläre Mediatoren
lokal aktiviert, um bereits aufgetretene Schäden zu beseitigen und eine Ausbreitung zu
verhindern (REGEL et al. 1989). Sind diese nicht in der Lage, den initiierenden Schaden zu
kontrollieren, werden geringe Mengen von Zytokinen systemisch freigesetzt, um die lokale
Immunantwort zu verstärken (Phase 2). Makrophagen und Thrombozyten werden rekrutiert
und Wachstumsfaktoren produziert. Die Einwanderung peripherer immunkompetenter Zellen,
vorwiegend neutrophiler Granulozyten, erfolgt. Diese Akutphase­Reaktion wird durch eine
verminderte Produktion von proinflammatorischen Zytokinen und durch die Freisetzung von
endogenen Antagonisten bzw. antiinflammatorischen Zytokinen kontrolliert (DINARELLO et
al. 1993; PLATZER et al. 1995). Dieser Prozess der zweiten Phase endet erst mit Abklingen
der Infektion bzw. Wiederherstellung der Homöostase (FUKUSHIMA et al. 1994; BONE
1996a).
Misslingt die Wiederherstellung der Homöostase, wirkt die systemische Immunantwort in
einer dritten Phase destruktiv. Sie besteht aus der massiven systemischen Inflammation, in der
große Mengen von Zytokinen freigesetzt werden, die das Endothel und die Endorgane vor
allem durch die Aktivierung zellulärer Faktoren schädigen (BONE 1996c). Entweder gelingt
es dem Organismus, die Entzündung mittels antiinflammatorischer Mediatoren wirksam zu
bekämpfen, oder die systemische Inflammation führt zum MODS. Durch die progressive
endotheliale Dysfunktion kommt es dabei zu einer Erhöhung der mikrovaskulären
Permeabilität mit konsekutiver Transsudation in das Interstitium und Bildung von
Mikrothromben, so dass eine Gewebsischämie auftreten kann (SEEKAMP u. WARD 1993;
PAPE et al. 1994). Bei der Wiederherstellung der Durchblutung kann es schließlich zu einem

Literaturübersicht 8
Reperfusionsschaden z.B. aufgrund von Sauerstoffradikalen und Hitze­Schock­Proteinen
kommen, die im Ischämiegebiet gebildet werden (RINALDO et al. 1990; CIPOLLE et al.
1993).
Zusätzlich wird bei der systemischen Inflammation die Diapedese der Leukozyten durch die
Endothelzellen gesteigert. Aufgrund der systemischen Vasodilatation und der
Flüssigkeitsverschiebung in den Extravasalraum infolge vermehrter Gefäßpermeabilität
entsteht eine signifikante Hypotension mit peripheren Ödemen, beginnendem anaeroben
Metabolismus und Organdysfunktion.
Die Folgen des SIRS tragen zu tiefgreifenden pathophysiologischen Veränderungen in den
verschiedenen Organen bei und werden heute sogar als Hauptfaktoren bei der Entwicklung
folgender Syndrome und Erkrankungen angesehen (BONE 1996c):
• Septischer Schock
• Disseminierte intravasale Gerinnung (DIC)
• „Adult Respiratory Distress Syndrome” (ARDS)
• Organversagen und Multiorgan­Dysfunktions­Syndrom (MODS).
Kommt es im Rahmen des SIRS zu einer antiinflammatorischen Reaktion, die das
physiologische Maß überschreitet, tritt eine ausgeprägte Immunparalyse ein (RANDOW et al.
1995; KREMER et al. 1996). Dies wird als „Compensatory Antiinflammatory Response
Syndrome“ (CARS) bezeichnet (BONE 1996a; BONE 1996b; BONE 1996d; DAVIES u.
HAGEN 1997). Während dieser Phase besteht eine besonders große Gefahr für eine Infektion
des Organismus mit Mikroorganismen, woraus leicht eine Sepsis und in Folge dessen ein
septischer Schock entstehen können (VOLK et al. 1990; MOORE 1999). Bestehen sowohl
Pro­ als auch Antiinflammation nebeneinander, spricht man von „Mixed Antagonist Response
Syndrome“ (MARS) (BONE 1996a; BONE 1996b; DAVIES u. HAGEN 1997). Auch diese
beiden klinischen Zustände können zum MODS führen. Patienten, bei denen ein SIRS oder
MODS festgestellt wurde, erliegen demnach nicht zwangsläufig einer unkontrollierten

Literaturübersicht 9
Infektion, sondern unter Umständen der dysregulierten Entzündungsantwort (VAN
GRIENSVEN 1999a).
2.2.3 Multiorganversagen / Multiorgan­Dysfunktions­Syndrom
Das MOV kann sowohl nach Trauma als auch nach Sepsis auftreten (LIN et al. 1996). Zudem
können Trauma und Sepsis zusammen auftreten oder ein Trauma kann im Verlauf eine Sepsis
hervorrufen (Abbildung 1). Im folgenden werden die Definitionen der Konsensuskonferenz
der Society of Critical Care Medicine und des American College of Chest Physicians von
1991 vorgestellt (BONE et al. 1992). Der Begriff MOV wurde dabei ersetzt durch die
Bezeichnung Multiorgan­Dysfunktions­Syndrom (MODS), um das Kontinuum der
Organdysfunktion zu beschreiben.
2.2.3.1 Pathophysiologie
Trotz frühzeitigem adäquaten Volumenersatz, umfangreichen operativen Möglichkeiten zur
Gefäßrekonstruktion oder Frakturstabilisierung und aggressiver antibiotischer Therapie
kommt es bei einigen Schwerverletzten und Sepsispatienten zum Multiorgan­Dysfunktions­
Syndrom. Das MODS zeigt keine klinischen, biochemischen oder morphologischen
Unterschiede zwischen Patienten mit vorhergehendem SIRS oder mit Sepsis. Die Überlebens­
raten korrelieren mit der Ausprägung der Organdysfunktion, nicht aber mit dem Vorhanden­
sein eines bakteriellen Focus (GORIS et al. 1985). Die Erklärung hierfür liegt darin, dass
nicht allein Bakterien die Auslöser des Organversagens sind, sondern dass endogene
Faktoren, die aufgrund des mikrobiellen Reizes aktiviert wurden, die Entwicklung eines
MODS verantworten. Eine Rolle spielt die unkontrollierte Aktivierung des Immunsystems,
dessen Entzündungsmediatoren und Zellen zum MODS führen können. Dabei ist der Ablauf
der Immunreaktion auf Trauma und bakterieller Infektion miteinander vergleichbar. Die
Aktivierung des Immunsystems nach einer schweren Verletzung lässt sich in zwei Phasen

Literaturübersicht 10
einteilen. Die Initialphase beginnt unmittelbar nach dem Trauma, die zweite Phase beginnt
drei bis sieben Tage später und beruht teilweise auf septiformen Komplikationen.
Bei der Entzündung in der ersten Phase handelt es sich primär um einen lokalen Prozess.
Durch Weichteiltrauma oder Verbrennungen wird die Komplementkaskade frühzeitig
aktiviert und die Komplementfaktoren C3a und C5a werden freigesetzt. Gewebsständige
Makrophagen phagozytieren die Erreger/Gewebe und sezernieren daraufhin Leukotriene,
Interferon­γ, TNF­α und weitere chemotaktisch wirksame Substanzen. Dadurch werden lokal
Adhäsionsmoleküle des Endothels (ICAM­1, ELAM­1, VCAM­1, E­Selektin) exprimiert, die
zur Adhäsion der aktivierten neutrophilen Granulozyten führen. Diese wandern durch
Diapedese aus dem Gefäßsystem aus und bewegen sich gegen den Konzentrationsgradienten
der chemotaktischen Substanzen zum Ort der Entzündung. Dort bekämpfen sie durch die
Freisetzung von proteolytischen Enzymen (Elastase, Kathepsin G) und reaktiven
Sauerstoffradikalen die Erreger. Zudem werden Monozyten aktiviert und differenzieren zu
Makrophagen. Diese phagozytieren am Ort der Entzündung Erreger oder nekrotisches
Gewebe. Die lokale Freisetzung von Histamin, Bradykinin oder Prostazyklin unter anderem
durch die Anaphylatoxine C3a und C5a bedingt eine lokale Vasodilatation und eine erhöhte
Kapillarpermeabilität. Im Extravasalraum entsteht ein proteinreiches Exsudat (Ödem).
Gelangen die Erreger oder die bakteriellen Endotoxine in den Kreislauf, führen diese zu einer
raschen Freisetzung von TNF­α, Interleukin­1 (IL­1), Interleukin­6 (IL­6), Interleukin­8 (IL­
8), dem Plättchenaktivierenden Faktor (PAF), Interferon­γ und Prostaglandinen aus
Granulozyten, Monozyten und Endothelzellen (LOPPNOW u. LIBBY 1989; NAWROTH et
al. 1989). Die oben genannten Vorgänge laufen jetzt systemisch ab und es kommt zu einer
generalisierten Entzündung. Die pyrogen wirkenden Zytokine, z.B. IL­1, führen zu Fieber und
verringern den peripheren Gefäßwiderstand. Adhäsionsmoleküle werden auf den
Endothelzellen exprimiert. Es folgt eine Granulozytenadhäsion und –diapedese im gesamten
Kreislauf ähnlich der oben beschriebenen lokalen Reaktion. Die Auswanderung der
neutrophilen Granulozyten macht sich im Blut als Leukopenie bemerkbar. Die systemische
Komplementaktivierung bewirkt eine weitere Aktivierung der neutrophilen Granulozyten. Sie
werden zur Degranulation stimuliert, wobei lysosomale Enzyme und Sauerstoffradikale

Literaturübersicht 11
(„respiratory burst“) freigesetzt werden. Mehrere der genannten Faktoren besitzen
schädigende Wirkung auf die Endothelzellen, was zu einer progressiven endothelialen
Dysfunktion führt. Diese resultiert in einer erhöhten Permeabilität mit Transsudation in die
Organe. Histologisch finden sich Einzelorganschädigungen in Lungen, Nieren und Leber in
Form eines interstitiellen Ödems und einer Granulozyteninfiltration (PAPE et al. 1994).
Ein weiteres humorales System, das in der Pathophysiologie der Entzündung eine Rolle spielt,
ist das Kallikrein/Kininsystem, dessen Aktivierung zur Bildung von Bradykinin führt. Das
Bradykinin trägt zur Minderung des Gefäßwiderstands und somit zur Hypotonie bei (BONE
1991).
Zusätzlich wird das Blutgerinnungssystem aktiviert. Die Verbrauchskoagulopathie führt zur
Bildung von Thromben und Fibrin aus Fibrinogen in nahezu allen Gefäßen, wodurch eine
lokale Ischämie auftreten kann. Nach Verbrauch des Fibrinogens kommt es zu einer
insuffizienten Gerinnung mit Blutungsneigung (VAN GRIENSVEN 2001).

Literaturübersicht 12
Abbildung 1: Schematische Darstellung der verschiedenen humoralen und zellulären
Systeme, die eine Rolle in der Entwicklung des MODS bei einer Sepsis spielen (VAN
GRIENSVEN 2001).

Literaturübersicht 13
Das MODS wird über die kumulative Sequenz von Einzelorgan­Schädigungen definiert, die
in interindividueller Ausprägung und Reihenfolge nach einem Trauma auftreten. Die
klinischen Anzeichen eines MODS können als generalisierte Entzündung zusammengefasst
werden. Zudem finden sich bei Patienten mit MODS Anzeichen eines interstitiellen Ödems
und einer Granulozyteninfiltration in Lungen, Leber und Nieren (PAPE et al. 1994; PAPE et
al. 1998).
Dieser Zustand, bestehend aus Endothelschaden mit Transsudation und Beeinträchtigung der
Blutzufuhr durch Störung der Mikro­ und Makrozirkulation, kann darin resultieren, dass die
Funktionalität eines Organs verloren geht. Die Lunge ist nicht nur das erste Organ, das nach
Polytrauma eine Funktionsstörung aufweist, sondern sie ist auch das Organ, bei dessen
Funktionsstörung unter Polytrauma die höchste Mortalität beschrieben wird (REGEL et al.
1996). Laut FAIST et al. (1983) ist ein MODS nicht ohne respiratorisches Versagen möglich.
Für das Vorherrschen einer Lungendysfunktion bei Polytrauma gibt es folgende
Erklärungsansätze:
• Mitbeteiligung der Lunge durch direktes Trauma mit Folge eines ARDS.
• Theorie des „first filter“: Die Lunge erhält über den Blutkreislauf Zelltrümmer, Toxine,
aktivierte Blutzellen und Zytokine mit nachfolgender Permeabilitätsschädigung der
kapillären Membranen und Entwicklung eines interstitiellen Lungenödems.
• Die Lungenkapillaren stellen das größte „endotheliale“ Organ des Körpers dar, wodurch
die endotheliale Dysfunktion hier am stärksten zum Tragen kommt.
Das kardiovaskuläre System zeigt bei Versagen eine Mortalität von über 60 %, liegt aber in
seiner Häufigkeit (Inzidenz von 21 %) deutlich hnter dem Versagen von Lunge und Leber
(Inzidenz 75 % bzw. 67 %) (REGEL et al. 1991). Das Leberversagen steht mit 54 % an dritter
Stelle der Mortalität, den ersten Rang nimmt das Lungenversagen mit 66 % ein. Nur bei
weniger als 5 % der Patienten wurde eine Beeinträchtigung der Nierenfunktion festgestellt.

Literaturübersicht 14
2.3 Neutrophile Granulozyten
Neutrophile Granulozyten sind Zellen der myeloiden Reihe, die sich im Knochenmark
innerhalb von etwa 14 Tagen über mehrere Differenzierungsstadien aus Myeloblasten zu
reifen PMN (polymorphonukleäre Granulozyten) entwickeln. Diese reifen Zellen verlassen
das Knochenmark und treten vorübergehend in die Blutbahn ein, wo sie eine Halbwertzeit
von ungefähr sechs Stunden aufweisen. Bei Bedarf tritt der reife PMN mittels Diapedese ins
Gewebe ein, wo er ein bis zwei Tage funktionsfähig bleibt (BAINTON et al. 1971).
Neutrophile Granulozyten haben einen Durchmesser von 10 bis 20 µm und sind
charakterisiert durch den lobulierten Nukleus und die zwei Arten von Granula, die eine
wichtige Rolle beim Lysieren von körperfremden Stoffen spielen. Die primären, azurophilen
oder peroxidase­positiven Granula beinhalten Myeloperoxidase, Elastase, Lysozym und β­
Glycerophosphatase. Die sekundären, spezifischen Granula sind peroxidase­negativ und
bestehen aus Laktoferrin, Prokollagenase, alkalischer Phosphatase und Lysozym
(ACKERMANN 1971; BAINTON et al. 1971). Die sekretorische Funktion und die Fähigkeit
zur Phagozytose machen die neutrophilen Granulozyten zu einer der wichtigsten Zellen des
unspezifischen Immunsystems (GRISWOLD u. MAIER 1988). Nach dem Eindringen von
körperfremden Stoffen bilden sie die erste Abwehrfront, die zur Phagozytose fähig ist, und
werden aufgrund ihrer kurzen Überlebenszeit im Gewebe von den Zellen des mononukleären
Phagozytensystems abgelöst. Im Gegensatz zu den neutrophilen Granulozyten sind diese
Zellen neben der Phagozytose auch zur Antigenpräsentation fähig.
Für die Komplikationen, die bei einer Ischämie / Reperfusion entstehen, sind größtenteils
Granulaprodukte und reaktive Sauerstoffradikale der PMN verantwortlich, die zu sekundären,
distalen Organschäden führen (WELBOURN et al. 1991b). Ihr pathologisches Muster ist in
allen Organen einheitlich (BURCHARDI 1987; BERNARD et al. 1994), unabhängig davon,
in welchem Gebiet die Ischämie vorlag. So konnten pulmonale Schäden nach Ischämie /
Reperfusion der Extremitäten (BELKIN et al. 1989; WELBOURN 1991a; SEEKAMP u.
WARD 1993; SEEKAMP et al. 1994), der Leber (DUBAYBO u. CARLSON 1988) und nach
genereller Ischämie (FEHRENBACH et al. 2003) im Zusammenhang mit einem hypovolämi­

Literaturübersicht 15
schen Schock festgestellt werden. Die Organschäden sind unter anderem bedingt durch die
Sauerstoffradikale, die mit der Desoxyribonukleinsäure der Zellen reagieren und irreparable
DNA­Strangbrüche hervorrufen (BIELSKI u. SHIUE 1979; BURGER et al. 1980).
PMN gelten nicht nur als Schlüsselzellen des Ischämie­Reperfusionsschadens, sondern auch
des SIRS und MODS (KORTHUIS et al. 1988; VEDDER et al. 1988; FUJISHIMA u.
AIKAWA 1995). Eine verringerte Apoptoserate der Granulozyten wurde sowohl bei SIRS als
auch nach Polytrauma beobachtet, was darauf hindeutet, dass die PMN länger überleben und
somit verstärkt schädliche Funktionen ausüben können (ERTEL et al. 1997; JIMENEZ et al.
1997).
2.3.1 Chemotaxis und Extravasation
Die Chemotaxis ist ein induktiver chemischer Reiz, der die Wanderungsrichtung der
neutrophilen Granulozyten und anderer phagozytierender Zellen in Abhängigkeit vom
Konzentrationsgradienten der reizauslösenden Substanz, den Chemokinen, bestimmt. Sie
binden an spezifische Rezeptoren auf den PMN, wodurch die Granulozyten zu amöboiden
Bewegungen veranlasst werden. Befinden sich die PMN im Blutstrom, erfolgen eine
mehrphasige Adhäsion sowie eine Migration der Zellen durch das Gefäßendothel und das
Gewebe zum Ort höherer Chemokinkonzentrationen. Dies kann entweder ein Infektionsherd
sein, wo die mikrobiellen Organismen phagozytiert und anschließend lysiert werden, oder es
liegt eine traumainduzierte Sekretion von Chemokinen vor.
Zu den Chemokinen gehören u.a. IL­1, IL­8, TNF­α, die Komplementfaktoren C3a und C5a,
Leukotriene (z.B. LTB4), PAF und das Fragment D der Fibrinolyse (DEMLING 1985;
WEIGELT et al. 1988; WARREN et al. 1989; KINDT et al. 1991). Ein großer Teil dieser
Substanzen wird nach der Ischämie während der Reperfusionsphase direkt im Gewebe von
Endothelzellen und Gewebsmakrophagen gebildet. Der entscheidende Schritt für die
Extravasation, d. h. für die Wanderung der neutrophilen Granulozyten aus den Blutgefäßen in
das umliegende Gewebe zum Ort der Inflammation, ist ihre Adhäsion an den kapillären

Literaturübersicht 16
Endothelzellen (FURIE et al. 1987; HARLAN 1987). Sie wird über Adhäsionsmoleküle
vermittelt, die sowohl von den PMN als auch von den Endothelzellen auf der Zelloberfläche
exprimiert werden (KUROSE et al. 1994). In den unterschiedlichen Phasen der Extravasation
spielen drei Gruppen von Adhäsionsmolekülen eine entscheidende Rolle: die Selektine, die
Integrine und die Immunglobulin­ähnlichen Moleküle. Zwischen dem Endothel und den PMN
kommt es zu einer hochaffinen spezifischen Ligand­Rezeptor­Bindung und es folgt eine
selektive Akkumulation neutrophiler Granulozyten im inflammatorischen bzw.
reperfundierten Gebiet.
Während der Chemotaxis werden die neutrophilen Granulozyten von den oben genannten
Chemokinen sowie von weiteren Substanzen wie Immunkomplexen, Komplement­ sowie
Gerinnungsfaktoren und von Faktoren des Kallikrein­Kininsystems zusätzlich aktiviert
(WEIGELT et al. 1988; WESTABY 1988; CERASOLI et al. 1990; JONAS et al. 1991;
NEUHOF 1991; WARREN 1991). Diese Aktivierung kann über Zellmembran­ oder
intrazelluläre Rezeptoren geschehen. Dadurch kommt es zu einer vermehrten Expression von
Adhäsionsmolekülen und es erfolgt eine gesteigerte Produktion und Freisetzung von
Mediatoren wie lysosomalen Enzymen und Sauerstoffradikalen.
Die Extravasation besteht aus aufeinanderfolgenden Phasen, dem „Rolling“ und
„Attachment“ (Aggregation), der „Firmadhesion“ (Adhäsion) und „Diapedesis“
(Transmigration). Beim „Rolling“ sind die Wechselwirkungen zwischen den Adhäsions­
molekülen nicht stark genug, um den Scherkräften des Blutstroms zu widerstehen, so dass die
Neutrophilen am Endothel entlangrollen, indem sie ständig neue Verbindungen ausbilden und
bestehende wieder lösen. Dieser Schritt wird durch Selektine vermittelt (LEY et al. 1991;
BARGATZE et al. 1994). Die endothelialen P­ und E­Selektine binden an Kohlenhydrat­
seitenketten des L­Selektins auf neutrophilen Granulozyten und vermitteln durch diese
Bindungen die transiente Adhäsion zwischen dem Endothel und den PMN (ANDERSON u.
SPRINGER 1987; SPRINGER 1990; BUTCHER 1991). Das L­Selektin nimmt bei dieser
Reaktion eine wichtige Rolle ein, da es neben der initialen Adhäsionsfunktion auch eine
Signalfunktion in die neutrophilen Granulozyten hinein besitzt (SPERTINI et al. 1991b;
RICHTER u. ZETTERBERG 1994; WADDELL et al. 1994; SIMON et al. 1995).

Literaturübersicht 17
Der nächste Schritt des Migrationsprozesses ist das sogenannte „Attachment“ oder Abstoppen
der neutrophilen Granulozyten auf den Endothelzellen, welches durch die Gruppen der
Integrine und der Immunglobulin­ähnlichen Adhäsionsmoleküle ausgelöst wird. Durch das
Entlangrollen der neutrophilen Granulozyten an der Gefäßwand sezernieren die
Endothelzellen das Lipid PAF, das eine Aktivierung der Neutrophilen bewirkt und die
Expression der Integrine auf ihrer Oberfläche erhöht. Die Immunglobulin­ähnlichen
Adhäsionsmoleküle werden auf den Endothelzellen durch Chemokine wie TNF­α induziert.
Aber auch nicht aktivierte Zellen zeigen eine kontinuierliche Basisexpression, die durch
Aktivierung nach etwa acht Stunden ihr Maximum erreicht (ROTHLEIN et al. 1986;
STAUNTON et al. 1989).
Wird die Bindung zwischen den Integrinen und den Immunglobulin­ähnlichen
Adhäsionsmolekülen in der Weise verstärkt, dass ein stabiler Zell­Zell­Kontakt entsteht, geht
das „Attachment“in die „Firmadhesion“über. Die stabile Bindung zwischen den PMN und
den Endothelzellen beendet somit die Rollbewegung und ermöglicht es den Leukozyten, sich
zwischen den Endothelzellen hindurch zu zwängen.
Im dritten Schritt durchqueren die neutrophilen Granulozyten das Endothel und verlassen die
Blutgefäße. Neben den Integrinen ist dabei auch eine weitere Wechselwirkung entscheidend,
bei der das immunglobulinähnliche Molekül CD31 sowohl auf den PMN als auch an den
Verbindungsstellen zwischen den Epithelzellen exprimiert wird. Die Granulozyten drängen
sich zwischen die Endothelzellen und durchdringen die Basalmembran mit Hilfe
proteolytischer Enzyme, die die Membranproteine zerstören. Die Passage durch die
Gefäßwand wird als „Diapedese“ bezeichnet. Anschließend wandern die PMN an einem
Konzentrationsgradienten von Chemokinen entlang, die von Zellen am Infektionsherd oder
im reperfundierten Gebiet ausgeschüttet werden.

Literaturübersicht 18
2.3.2 Die Selektine
Die Familie der Selektine umfasst das P­Selektin (CD62P), das als Adhäsionsmolekül auf
Endothelzellen und aktivierten Thrombozyten exprimiert wird. Ein weiteres Selektin der
Endothelzellen ist das E­Selektin (CD62E), dessen maximale Expression drei bis sechs
Stunden nach Beginn der Entzündungsreaktion stattfindet. P­ und E­Selektine binden an
Kohlenhydratseitenketten des L­Selektins oder an Glycoproteine auf neutrophilen
Granulozyten, aktivierten T­Zellen sowie Monozyten und leiten dadurch die erste Phase der
Extravasation ein. Das L­Selektin (CD62L) kommt ausschließlich auf hämatopoetischen
Zellen vor (GALLATIN et al. 1983; JUTILA et al. 1990; TEDDER et al. 1990). Sowohl reife
als auch unreife Subpopulationen der Thymozyten exprimieren L­Selektin, ebenso die
meisten B­Zellen. Auch eine Subpopulation der Memory­T­Zellen und die natürlichen
Killerzellen (NK­Zellen) sind L­Selektin­positiv. Zudem wird es von den Zellen der
myeloiden Reihe während des gesamten Differenzierungsprozesses konstitutiv exprimiert.
Bei den neutrophilen Granulozyten ist das L­Selektin auf den Mikrovilli lokalisiert. Dies
könnte sich als vorteilhaft für den frühen Kontakt des L­Selektins mit den endothelialen
Liganden erweisen (TEDDER et al. 1995). Die Selektine sind strukturell eng verwandt und
unterscheiden sich in ihrem extrazellulären Bereich durch die lektinähnliche Kette; zudem
werden sie von evolutionär konservierten Genen kodiert (TEDDER et al. 1989; JOHNSTON
et al. 1990; ORD et al. 1990; WATSON 1990; COLLINS et al. 1991). Als Beispiel wird im
Folgenden die Struktur des L­Selektins näher beschrieben.
Das L­Selektin ist charakterisiert durch eine einzigartige extrazelluläre Region. Diese besteht
aus vier unterschiedlichen Domänen (einer aminoterminalen, kalziumabhängigen
Lektindomäne, einer epidermalen, Wachstumsfaktor­ähnlichen Domäne und zwei short­
consensus­repeat­ Einheiten). Alle vier Domänen sind bei der Zelladhäsion von Bedeutung,
da die Deletion einer einzelnen Domäne die Bindungskapazität von neutrophilen
Granulozyten einschränkt (KANSAS et al. 1994; TEDDER et al 1995). Das L­Selektin der
PMN kann vom P­ und E­Selektin der Endothelzellen gebunden werden. Zudem sind auch
Kohlenhydrate wie das sialysierte Lewis x ­Antigen, CD34 und ein sulfatiertes 50 kD
Glykoprotein Liganden des L­Selektins (HELFET et al. 1990; PHILLIPS et al. 1990;

Literaturübersicht 19
PICKER et al. 1991; LASKY et al. 1992; BAUMHUETER et al. 1993). Da diese
Kohlenhydrate in den verschiedenen Geweben differenziert exprimiert werden, resultieren
daraus je nach Gewebetyp unterschiedliche Affinitäten für die neutrophilen Granulozyten
(BERG et al. 1998).
Nach Aktivierung der neutrophilen Granulozyten tritt ein sogenanntes „Shedding“ des L­
Selektins auf. Dabei erfolgt eine proteolytische Spaltung des extrazellulären Anteils des
Selektins, die durch Metalloproteinasen vermittelt wird (KISHIMOTO et al. 1989; GRIFFIN
et al. 1990; SPERTINI et al. 1991a). Das abgespaltene Fragment ist bei neutrophilen
Granulozyten 80 kD bis 105 kD schwer (JUNG u. DAILEY 1990; SCHLEIFENBAUM et al.
1992) und wird als lösliches L­Selektin bezeichnet.
Das „Shedding“ und somit auch die Konzentration des löslichen L­Selektins im Serum
korrelieren mit dem Aktivitätsniveau der PMN, wobei der maximale Serumspiegel sechs
Stunden nach dem Trauma erreicht wird (MAEKAWA et al. 1998).
Die Inhibition des L­Selektins schützt vor einem Ischämie­Reperfusionsschaden nach
hämorrhagischen Schock (RAMAMOORTHY et al. 1996), was durch eine verminderte
Fähigkeit der PMN zur Migration in das inflammatorische Gebiet erklärt werden kann.
2.4 T­Lymphozyten
2.4.1 Grundlegende Merkmale
Die Population der Lymphozyten gehört zur erworbenen (spezifischen) Immunität, die
gegenüber der angeborenen Immunabwehr abgegrenzt werden kann. Die B­Lymphozyten
sind Zellen der humoralen spezifischen Immunität und für die Antikörperproduktion
zuständig. Vertreter der zellulären Immunität sind die T­Lymphozyten. Sie werden in diesem
Kapitel näher betrachtet.

Literaturübersicht 20
Die Vorläuferzellen der T­Lymphozyten entstehen im Knochenmark und wandern
anschließend in den Thymus ein. In diesem Stadium werden die T­Zellen „doppelt­negative“
Thymozyten genannt, da sie keines der drei Moleküle besitzen, die die reifen T­Zellen
definieren, den CD3:T­Zell­Rezeptor­Komplex und die Corezeptormoleküle CD4 oder CD8.
In der nächsten Entwicklungstufe prägen diese Zellen im Thymus sowohl CD4 als auch CD8
aus und werden nun als „doppelt­positive“ Thymozyten bezeichnet. Eine geringe
Konzentration dieser Zellen ist jedoch auch im Blut feststellbar und wird in der vorliegenden
Arbeit zur Bestimmung der Proliferationsrate der T­Lymphozyten herangezogen (Kapitel
4.3.1.2 Durchführung der durchflusszytometrischen Analyse). Im letzten Schritt der
Entwicklung beenden die „doppelt­positiven“ Thymozyten die Expression eines der beiden
Corezeptormoleküle (CD4 oder CD8) und werden später in den peripheren lymphatischen
Organen durch den Kontakt mit Antigenen aktiviert.
Die T­Lymphozyten werden nach ihrer Funktion in die Klassen der zytotoxischen T­Zellen,
der T­Helferzellen (TH1­ und TH2­Zellen) und der T­Suppressorzellen unterteilt.
Verschiedene T­Zell­Oberflächenproteine (CD­Proteine), die bei den Subpopulationen
unterschiedlich exprimiert werden, dienen als phänotypische Marker. Man kann daher
monoklonale Antikörper gegen diese Oberflächenproteine benutzen, um die T­
Zellsubpopulationen zu identifizieren und zu isolieren (Kapitel 4.3.1 Durchflusszytometrische
Analyse von T­Lymphozyten). Alle drei Klassen der T­Lymphozyten spüren Antigene auf,
die von unterschiedlichen Pathogenen stammen. Peptide von Pathogenen, die sich im
Zytoplasma der Zelle vermehren, werden von MHC­Klasse­I­Molekülen (MHC („major
histocompatibility complex“, Haupthistokompatibilitätskomplex)) an die Zelloberfläche
gebracht und CD8 + ­T­Zellen gezeigt, die zu zytotoxischen T­Zellen ausdifferenzieren und
infizierte Zellen töten. Zytotoxische T­Zellen haben daher den Phänotyp CD3 + CD4 ­ CD8 + .
Antigene von Krankheitserregern, die in intrazellulären Vesikeln wachsen, und solche, die
von aufgenommenen extrazellulären Bakterien und Toxinen abstammen, werden von MHC­
Klasse­II­Molekülen an die Zelloberfläche transportiert und den CD4 + ­T­Zellen präsentiert
(Phänotyp CD3 + CD4 + CD8 ­ ). Diese können zu zwei Arten von Effektorzellen differenzieren.
Pathogene, die sich in großer Zahl in Vesikeln von Makrophagen ansammeln, regen
gewöhnlich die Differenzierung von TH1­Zellen an. Extrazelluläre Antigene stimulieren

Literaturübersicht 21
dagegen die Bildung der TH2­Zellen. TH1­Zellen aktivieren die keimtötenden Eigenschaften
von Makrophagen und regen B­Zellen an, IgG­Antikörper zu synthetisieren. Diese opsonieren
extrazelluläre Pathogene für die Aufnahme durch phagozytierende Zellen. TH2­Zellen lösen
eine humorale Immunantwort aus, indem sie B­Zellen anregen, IgM­Antikörper zu bilden.
Das Verhältnis der CD4 + ­Zellen zu den CD8 + ­Zellen beträgt in der Regel 2:1 (ABBAS et al.
1996d). T­Suppressorzellen sind entweder CD8 + ­T­Zellen oder TH2­Zellen, die zur Sekretion
von IL­10 fähig sind. Sie bewirken eine Herabsetzung der Immunabwehr, die vor allem bei
Tumor­Patienten zu beobachten ist.
Die Aktivierung einer T­Zelle erfolgt durch die Erkennung eines Antigens, das auf einer
antigenpräsentierenden Zelle an ein MHC­I­ oder MHC­II­Molekül gebunden ist. Während
der Antigenerkennung assoziieren sich CD4­ oder CD8­Moleküle auf der T­Zell­Oberfläche
mit Komponenten des TCR. Sowohl der TCR als auch CD4­ bzw. CD8­Moleküle binden an
das MHC­Molekül. Da die Funktionen der CD4­ und CD8­Moleküle eng mit der T­Zell­
Rezeptor­Funktion (TCR­Funktion) verbunden sind, werden sie auch Corezeptoren genannt.
Weiterhin ist ein costimulierendes Signal notwendig, das durch die Bindung entsprechender
Adhäsionsmoleküle der T­Zelle und der antigenpräsentierenden Zelle erzeugt wird (ABBAS
et al. 1996b).
Wie dargestellt, erkennen die zytotoxischen T­Zellen und die T­Helferzellen fremde
Peptidantigene nur in Bindung mit eigenen MHC­Molekülen auf der Oberfläche von Antigen­
präsentierenden Zellen (APZ). Sie reagieren nicht auf lösliche oder zirkulierende Antigene.
Die Klasse­I­MHC­Moleküle kommen auf allen kernhaltigen Zellen vor, die Klasse­II­MHC­
Moleküle dagegen auf Makrophagen, dendritischen Zellen, Endothelzellen und B­
Lymphozyten.
Durch die Aktivierung werden die Effektorfunktionen der T­Zellen ausgelöst. Den Zellen
wird ermöglicht, eine wirksame Immunantwort gegen das fremde Antigen hervorzurufen. Die
wichtigste Effektorfunktion der CD4 + ­T­Helferzellen ist die Sekretion von Zytokinen, die auf
T­ und B­Lymphozyten, Makrophagen, Granulozyten und das vaskuläre Endothel wirken. Die

Literaturübersicht 22
Haupteffektorfunktion der CD8 + ­zytotoxischen T­Zellen besteht darin, die antigentragende
Zielzelle zu lysieren.
2.4.2 Funktion der T­Helferzellen
Die CD4 + ­T­Zellen können aufgrund ihrer verschiedenen Effektorfunktionen in
Subpopulationen, die TH1­ und TH2­Zellen, klassifiziert werden. Da die meisten
Effektorfunktionen der T­Helferzellen durch Zytokine vermittelt werden, haben die Zellen mit
verschiedenen Zytokin­Produktionsmustern auch andere Funktionen (ABBAS et al. 1996e).
Warum sich eine proliferierende CD4 + ­T­Zelle zu einer TH1­ oder einer TH2­Zelle entwickelt,
ist noch unklar. Die Entscheidung über die Art der Differenzierung fällt bereits in den
Anfangsstadien der Immunantwort. Vor allem die Fähigkeit der Pathogene, die
Zytokinproduktion durch Zellen des erworbenen Immunsystems zu stimulieren, ist für die
Form der adaptiven Antwort entscheidend. Die Antigenstimulation führt über eine Population,
die man TH0­Lymphozyten nennt und ein Gemisch unterschiedlicher Zytokine produziert, zu
der Differenzierung der Subpopulationen der T­Helferzellen. Unterstützt wird diese Theorie
dadurch, dass der Grad der TH1­/TH2­Polarisation mit der Chronizität der Immunantwort
zunimmt. Die gemischten Zytokinmuster der TH0­Zellen sind am deutlichsten in der frühen
Phase der Lymphozytenaktivierung detektierbar (KELSO 1995). Zudem ist auch die
Konzentration des Antigens entscheidend für die Ausdifferenzierung der TH0­Zellen. Es gibt
Hinweise darauf, dass eine niedrige Antigenkonzentration eine stärkere TH1­Antwort
induziert, wogegen hohe Antigendosen die TH2­Entwicklung fördern (BRETSCHER et al.
1992; HOSKEN et al. 1995). Die TH2­Entwicklung wird durch die Antigenpräsentation
mittels B­Lymphozyten stimuliert (FITCH et al. 1993). Für die Differenzierung zu TH2­Zellen
ist außerdem das IL­4 als ein autokriner Wachstumsfaktor nötig. Bei TH1­Zellen ist dafür vor
allem IL­2 erforderlich (ABBAS et al. 1996c).
Die Entscheidung, ob TH1­ oder TH2­Zellen gebildet werden, hat für den Verlauf einer
Infektion weitreichende Konsequenzen: Die selektive Bildung von TH1­Zellen führt zu einer

Literaturübersicht 23
zellvermittelten Immunität, während die selektive Produktion von TH2­Zellen eine humorale
Immunantwort zur Folge hat.
2.4.2.1 Charakterisierung der TH1­Zellen
TH1­Zellen unterstützen primär die zytotoxischen T­Zellen bei der zellvermittelten Immunität
gegen intrazelluläre Erreger (Bakterien, Viren, Protozoen) und sind an der Hypersensibilität
vom verzögerten Typ beteiligt.
TH1­Zellen sezernieren folgende Zytokine und exprimieren auf ihrer Zelloberfläche die
nachstehenden Liganden:
• IFN­γ aktiviert die Makrophagen und steigert ihre mikrobizide Aktivität (NATHAN et al.
1983). Zudem stimuliert es die Produktion von IgG­Antikörpern, die dazu geeignet sind,
Antigene zu opsonieren, um deren Phagozytose zu steigern und deren Affinität zu
Komplementproteinen zu erhöhen, welche die Antigene opsonieren und lysieren können.
• IL­2 induziert die T­Zell­Proliferation und erhöht so die Zahl der Effektorzellen.
• IL­3 und GM­CSF (granulocyte macrophage colony stimulating factor) stimulieren
die Produktion neuer Makrophagen durch ihre Wirkung auf die hämatopoetischen
Stammzellen im Knochenmark.
• TNF­α und TNF­β: Vor allem TNF­α aktiviert das Endothel, das daraufhin
Makrophagen induziert, zu binden und an der Infektionsstelle aus dem Blutgefäß
auszutreten (Chemokine). Die Funktion von TNF­β ist der von TNF­α untergeordnet.
• MCF (macrophage chemotactic factor) ist ein Chemokin mit makrophagenanlockender
Aktivität.
• Der CD40­Ligand gehört zur TNF­Familie und kann den B­Zellen sowie den
Makrophagen über den Rezeptor CD40 aktivierende Signale vermitteln.
• Der Fas­Ligand tötet chronisch infizierte Zellen, die den Rezeptor Fas besitzen, und setzt
auf diese Weise Bakterien frei, die von den Makrophagen zerstört werden.

Literaturübersicht 24
Immunantworten, bei denen TH1­Zellen dominieren, sind oft mit Gewebsverletzungen
verknüpft, die durch die Rekrutierung und Aktivierung der Granulozyten bedingt sind. Die
mikrobizide TH1­Antwort kann auch pathologisch in Gewebsverletzungen ausufern (SCOTT
et al. 1994; VON HERRATH et al. 1995), etwa durch toxische Nebeneffekte der freigesetzten
Zytokine oder anderen inflammatorischen Mediatoren der Phagozyten.
2.4.2.2 Charakterisierung der TH2­Zellen
Bei der humoralen Immunantwort werden von den TH2­Zellen die Zytokine IL­4, IL­5, IL­6,
Il­10 und IL­13 produziert. IL­4 stimuliert die IgE­Antikörperproduktion der B­Lymphozyten
und ist daher ein wichtiger Initiator der IgE­abhängigen, Mastzell­vermittelten allergischen
Immunreaktion (GALLI 1993; ABBAS et al. 1996c). IL­5 ist ein die eosinophilen
Granulozyten aktivierendes Zytokin (WARDLAW et al. 1995). Die Produktion dieser beiden
Zytokine von einer T­Zell­Subpopulation erklärt die häufige Präsenz von IgE und aktivierten
Eosinophilen bei Immunreaktionen wie Allergien und Helminthiasis (KOPF et al. 1996;
YOSHIDA et al. 1996). Zudem exprimieren TH2­Zellen den CD40­Liganden und sezernieren
GM­CSF. TH2­Zellen rufen also eine Phagozyten­unabhängige Immunabwehr hervor. Sie
stimulieren zudem die B­Lymphozyten zur Produktion von IgM­Antikörpern gegen
extrazelluläre Antigene.
Einige der synthetisierten Zytokine haben antiinflammatorische Eigenschaften: IL­4, IL­10
und IL­13 antagonisieren die durch IFN­γ hervorgerufene Makrophagenaktivierung. Diese
Zytokine kontrollieren so die Inflammation und die Gewebsverletzung, die durch die TH1­
Zellen vermittelt wurden, und können dadurch vor autodestruktiver, überschießender
Gewebsverletzung schützen. Bei einer Unterdrückung der TH2­Antwort ergibt sich dagegen
ein Defekt in der zellulären Immunität gegen intrazelluläre Mikroorganismen.
Durch die Zytokine regulieren sich die TH1­ und die TH2­Zellen gegenseitig in ihrer
Entwicklung und Aktivität. So verstärkt das von den TH1­Zellen produzierte IFN­γ die
Entwicklung dieser Zellpopulation und inhibiert die Proliferation der TH2­Zellen (FITCH et

Literaturübersicht 25
al. 1993). Wird IL­10 von den TH2­Zellen ausgeschüttet, blockiert es die Aktivierung der
TH1­Zellen (FIORENTINO et al. 1989). Beginnt die Immunantwort sich in Richtung der TH1­
oder der TH2­Zellen zu entwickeln, tendiert sie dazu, auch in diese Richtung ausgebildet zu
werden (ABBAS et al. 1996e). Diese Festlegung ist das Resultat der Vernetzung von Zytokin­
vermittelter Selbstverstärkung und gegenseitiger Regulierung.
2.4.3 T­Zell­vermittelte Zytotoxizität
Naive CD8 + ­T­Zellen, die im Thymus gebildet werden, sind schon dafür vorbestimmt,
zytotoxische T­Zellen zu werden, obwohl sie noch keine der differenzierten zytolytischen
Funktionen besitzen. Die Antigenerkennung erfolgt über Klasse­I­MHC­Moleküle, die von
jeder Zelle, die einen Zellkern besitzt, exprimiert werden.
Die Aufgabe zytotoxischer T­Zellen besteht darin, nach ihrer Aktivierung infizierte Zellen,
die fremde Antigene (sogenannte endogene Antigene) produzieren und diese auf dem Klasse­
I­MHC präsentieren, zu lysieren. Sie sind in folgenden Situationen wichtig (KLEIN 1991b):
• bei intrazellulären Infektionen oder solchen, die durch Phagozytose nur ungenügend lokal
gehalten werden können (u.a. virale Infekte, Infekte mit obligat intrazellulären Bakterien),
• bei der Eliminierung neoplastischer Zellen und
• bei der akuten Transplantatabstoßung.
Die Aktivierung der naiven CD8 + ­T­Zellen erfolgt durch die Erkennung eines Antigens und
durch das von den TH1­Zellen gebildete IL­2. Die meisten zytotoxischen T­Zellen
produzieren zu wenig IL­2, so dass sie im Sinne einer parakrinen Aktivierung vollständig auf
das von den Helferzellen gebildete IL­2 angewiesen sind (ABBAS et al. 2001).
Um die Zielzellen zu eliminieren, ohne das gesunde Gewebe zu zerstören, müssen die
zytotoxischen T­Zellen sowohl effektiv als auch selektiv töten. Sie werden bei der Induktion
der Apoptose (programmierter Zelltod, Kapitel 2.5 Apoptose) selbst nicht geschädigt und

Literaturübersicht 26
können dadurch mehrere Zielzellen abtöten. Durch die gezielte Freisetzung der
Effektormoleküle wird der programmierte Zelltod ausschließlich in den infizierten Zellen
ausgelöst, ohne ausgedehnte Gewebeschäden hervorzurufen. Ein weiterer Vorteil besteht in
der Möglichkeit zur schnellen Eliminierung der Zielzellen. Zytotoxische T­Zellen können
Zytotoxine in inaktiver Form speichern. Der Vorrat an lytischen Granula wird bei jeder
Reaktion des T­Zell­Rezeptors wieder aufgefüllt, so dass nacheinander viele Zielzellen
vernichtet werden können.
Zytotoxische T­Zellen können bei Zielzellen auf zwei Arten den programmierten Zelltod
induzieren. Beim Erkennen fremder Antigene auf der Zielzelle üben sie ihre Wirkung vor
allem durch die Freisetzung von speziellen lytischen Granula aus. Diese Granula sind
modifizierte Lysosomen und enthalten verschiedene Zytotoxine. Eine Klasse von ihnen, das
Perforin, kann polymerisieren und Poren in der Membran der Zielzellen bilden. Die andere
Klasse der Zytotoxine sind die Granzyme. Dies sind Proteasen, die durch die Poren in die
Zielzelle eindringen und eine Enzymkaskade aktivieren, was schließlich zur Fragmentierung
der DNA der Zielzelle führt.
Ein zweiter Zytotoxizitätsmechanismus ist von Membranproteinen auf der zytotoxischen T­
Zelle abhängig. In der Zellmembran von aktivierten CD8 + ­T­Lymphozyten wird der Fas­
Ligand exprimiert. Befindet sich in der Zielzellmembran der Rezeptor Fas und wird dieser
von den Fas­Liganden der T­Zelle aktiviert, erfolgt in der Zielzelle die Auslösung der
Apoptose.
Die Wirkung der zytotoxischen T­Zellen beruht außerdem auf der Sekretion der Zytokine
IFN­γ, TNF­α und TNF­β. IFN­γ inhibiert die virale Replikation und induziert eine
gesteigerte Expression von Klasse­I­MHC­ und Peptidtransportmolekülen in infizierten
Zellen. Es aktiviert zudem Makrophagen und wirkt chemotaktisch auf diese Phagozyten.
TNF­α und TNF­β können bei der Aktivierung der Makrophagen sowie beim
zytokinvermittelten Töten einiger Zielzellen mit IFN­γ zusammenwirken (JANEWAY u.
TRAVERS 1997, S. 276).

Literaturübersicht 27
2.4.4 Charakterisierung der natürlichen Killerzellen
Natürliche Killerzellen (NK­Zellen) sind große granuläre Lymphozyten, die aus dem
Knochenmark stammen und direkt in die peripheren Gewebe einwandern. Ihre Reifung und
Differenzierung erfolgt außerhalb des Thymus (ABBAS et al. 1996a). Der Anteil der NK­
Zellen beträgt im Blut rund 12–15 % der Lymphozyten (ABBAS et al. 1996a). Sie sind
hauptsächlich in den sekundären lymphatischen Organen (Milz, Lymphknoten,
darmassoziiertes lymphatisches Gewebe (GALT = gut­associated lymphoid tissue), BALT
(bronchienassoziiertes lymphatisches Gewebe), MALT (mucosaassoziiertes lymphatisches
Gewebe)) und in geringer Zahl auch im Knochenmark zu finden und besitzen die Fähigkeit,
neoplastische, virusinfizierte und unter besonderen Umständen auch gesunde Zellen
abzutöten. Durch ihre Funktionsweise sind sie ein wichtiger Bestandteil der angeborenen
Immunität, da sie keine antigenspezifischen Rezeptoren tragen. Bei der Immunabwehr
erfüllen sie deshalb ihre Funktion in der frühen Phase der Infektion und können unmittelbar
beim Zusammentreffen mit anderen Zellen diese innerhalb von etwa vier Stunden abtöten
(JANEWAY u. TRAVERS 1997, S. 363­365).
NK­Zellen besitzen im Gegensatz zu den T­Helferzellen und den zytotoxischen T­Zellen
keine CD3­ und CD4­Moleküle. Nur bei einigen Subpopulationen ist der Rezeptor CD8
vorhanden. Beim Menschen exprimieren NK­Zellen das charakteristische Oberflächenantigen
CD56, das zur Identifizierung und zur Isolierung von dieser Zellpopulation verwendet werden
kann (Kapitel 4.3.1 Durchflusszytometrische Analyse von T­Lymphozyten). Zudem besitzen
die natürlichen Killerzellen auf ihrer Oberfläche die Rezeptoren CD2, CD16 (FcγRIII, ein
Rezeptor für Immunglobuline mit einer niedrigen Affinität) und den Fas­Liganden (CD95L)
(TIZARD 2000, S. 297).
Natürliche Killerzellen können ihre Zielzellen mittels mehrerer Mechanismen töten. Bei der
antikörperabhängigen zellvermittelten Zytotoxizität (ADCC) werden antikörperbehaftete
Zielzellen von NK­Zellen zerstört. Virusinfizierte Zellen exprimieren auf ihrer Oberfläche
unter Umständen virale Proteine. Opsonieren Antikörper der Subklassen IgG1 und IgG3 diese
Zellen, kann der Fc­Rezeptor FcγRIII, der von den NK­Zellen exprimiert wird, an diese

Literaturübersicht 28
Antikörper binden. Dadurch wird ein zytotoxischer Angriff der NK­Zellen ausgelöst. Die
Mechanismen entsprechen denen der zytotoxischen T­Zellen. Perforin und Granzyme werden
freigesetzt und der programmierte Zelltod wird induziert. Die Produktion der Zytotoxine kann
durch IL­2 und IL­12 gesteigert werden.
Die zytotoxische Aktivität der NK­Zellen wird ebenfalls ausgelöst, wenn sie auf der
Zielzelloberfläche keine MHC­Klasse­I­Moleküle vorfinden. Die Bindung der inhibierenden
Rezeptoren (Ly49 bei Mäusen, KIR (killer cell inhibitory receptor) beim Menschen) an die
MHC­Klasse­I­Moleküle hemmt normalerweise die NK­Aktivitäten, so dass gesunde Zellen
nicht von einem zytotoxischen Angriff betroffen sind. Tumormetastasen und virusinfizierte
Zellen exprimieren oft keine MHC­Klasse­I­Moleküle. Einerseits unterbinden einige Viren
die gesamte Proteinsynthese ihrer Wirtszelle, wodurch keine MHC­Moleküle produziert
werden können. Andererseits verhindern manche Viren selektiv die Exprimierung dieser
Rezeptoren an der Zelloberfläche, um der Erkennung durch CD8­T­Zellen zu entgehen
(JANEWAY u. TRAVERS 1997, S. 363­365).
Ein weiteres Molekül, das die zytotoxische Aktivität der NK­Zellen aktiviert, ist das zu den
MHC­Klasse­I­Molekülen gehörende Protein MICA. Es bindet keine Antigene, ist aber bei
der Kommunikation mit T­Zellen relevant. MICA wird von Krebszellen und virusinfizierten
Zellen exprimiert; auf gesunden Zellen wird dieser Rezeptor nicht gefunden. Da NK­Zellen
einen Rezeptor für MICA besitzen, reagieren sie auf Ziele, die dieses Protein ausbilden mit
der Aktivierung ihrer Zytotoxizität. Dabei ist das Signal stärker als die Inhibition durch MHC­
Klasse­I­Moleküle (TIZARD 2000, S. 298). NK­Zellen können weiterhin mit Hilfe des
erwähnten Fas­Liganden die Apoptose auslösen.
Die Aktivität der NK­Zellen wird reguliert durch die Zytokine IL­2, IL­3, IL­4, IL­12 und
IFN­γ. IL­2 stimuliert ihre Proliferation, während IL­4 die Zytotoxizität verstärkt. Die
Aktivität der Zellen erhöht sich um das 20­ bis 100fache bei Kontakt mit IFN­α und IFN­β
oder mit dem Aktivierungsfaktor für natürliche Killerzellen, dem IL­12, einem der Zytokine,
das in den frühen Phasen vieler Infektionen gebildet wird. IL­12 kann zusammen mit TNF­α
auch die Synthese großer Mengen von IFN­γ durch NK­Zellen auslösen. Nach ihrer

Literaturübersicht 29
Aktivierung sezernieren die NK­Zellen die proinflammatorischen Zytokine TNF­α und IFN­γ
(TIZARD 2000, S. 299).
2.4.5 T­Lymphozytenfunktion bei Trauma und Sepsis
Experimentelle und klinische Untersuchungen haben gezeigt, dass sich die Funktion des
Immunsystems bei polytraumatischen oder operativen Verletzungen dramatisch verändert
(ANTONACCI et al. 1984). Als Konsequenz auf das traumatische Ereignis entwickelt sich
eine schwere Dysfunktion des Immunsystems. Die Verletzungen aktivieren unzählige
inflammatorische Reaktionen, die erheblich zum Status der Immunsuppression beitragen
(MUNSTER et al. 1980; FAIST et al. 1986; POLK et al. 1988; XU et al. 1998; PAPE et al.
1999a), einem Phänomen, dem die gesteigerte Empfänglichkeit für posttraumatische und
postoperative Sepsis sowie für das Multi­Organ­Versagen zugemessen wird. Die
Immunsuppression, die in milden Formen dem Patienten bei der Heilung dienlich ist, birgt in
der ausgeprägten Form die Gefahr schwerer Infektionen, die wiederum in einem MODS
enden können (MOORE 1999). Die Folge von Sepsis oder Trauma kann eine systemische
Inflammation sein. Diese führt entweder zu einem frühen MODS oder, falls der Patient
überlebt, zu einer Immunsuppression. Es werden vermehrt antiinflammatorische Substanzen
sezerniert, und die Makrophagen zeigen eine erhöhte Apoptoserate sowie nach der initialen
massiven Sekretion von proinflammatorischen Substanzen eine ausgeprägte Areaktivität
(AYALA et al. 1996b).
Das breite Spektrum der veränderten immunologischen Mechanismen betrifft sowohl das
zelluläre als auch das humorale Immunsystem. In zahlreichen Studien wurde eine generelle
Abnahme der T­Lymphozytenproliferation nach traumatischen Verletzungen (WOOD et al.
1984; O`GORMAN et al. 1986; FAIST et al 1987), nach Verbrennungen (MUNSTER et al.
1980) und nach Hämorrhagie (ABRAHAM u. CHANG 1985) festgestellt. Dabei haben
Patienten mit den ausgeprägtesten Defiziten in der T­Zell­Proliferation ein erhöhtes
Infektions­ und Mortalitätsrisiko (KEANE et al. 1983; LEVY et al. 1984; O`MAHONY et al.
1984).

Literaturübersicht 30
Die verminderte T­Zell­Funktion hat mehrere Ursachen. Einerseits wird die T­Zell­
Proliferation durch den Trauma­induzierten Anstieg von T­Suppressor­Zellen herabgesetzt
(MUNSTER 1976; WINCHURCH u. MUNSTER 1980). In verschiedenen Studien wurde die
Präsenz von funktionell aktiven CD8 + ­T­Suppressor­Zellen nach Verbrennung und
Hämorrhagie gezeigt (MILLER u. BAKER 1979; KUPPER u. GREEN 1984; ABRAHAM u.
CHANG 1988). Die Aktivität der Suppressorzellen korreliert mit der Präsenz einer
prolongiert verlaufenden Sepsis, da sie die Proliferation von T­Helferzellen in Zellkulturen
inhibieren können, was eine Reduktion der CD4 + ­T­Helferzellen zur Folge hat. Zudem
zeigten KUPPER et al. (1985), dass der Transfer von CD8 + ­T­Zellen die Letalität von
Mäusen bei einer bakteriellen Sepsis erhöht. Die Verschiebung des Verhältnisses von
Suppressor­ zu TH1­Zellen wurde von ANTONACCI et al. (1984) bei Brandopfern bestätigt.
Er begründete das T­Zell­Defizit jedoch nicht mit einer Zunahme der T­Suppressorzellen,
sondern mit einer Abnahme der TH1­Zellen.
Zusätzlich wird nach einem Trauma ebenfalls die Aktivierung der T­Lymphozyten
supprimiert. Funktionsdefizite der Makrophagen nehmen dabei eine Schlüsselstellung ein, da
diese Phagozyten durch die Antigenpräsentation und die Zytokinfreisetzung eine wichtige
Rolle bei der T­Lymphozytenaktivierung übernehmen. STEPHAN et al. (1989) zeigten, dass
Antigenprozessing und ­präsentation gegenüber den T­Helferzellen nach Trauma und Schock
vermindert sind. Dies ist zurückzuführen auf eine Verschiebung der Subpopulationen in
Richtung einer Makrophagenpopulation (Suppressor­Makrophagen), die hohe
Konzentrationen von Prostaglandin E2 (PGE2) produziert (HOFFMANN 1980; MILLER­
GRAZIANO et al. 1988; SZABO et al. 1990). PGE2 inhibiert die Synthese von IL­1 sowie IL­
2 und vermindert dadurch die Aktivierung der TH1­Zellen. Weiterhin ist es an der
Herunterregulation von IL­2­Rezeptoren auf der Zellmembran von T­Lymphozyten beteiligt
(CHOUAIB et al. 1985), und die Produktion der Zytokine IFN­γ, IL­2 und IL­3 ist reduziert.
Die Expression von IL­2­Rezeptoren ist nach schweren traumatischen Verletzungen bis zu 14
Tage post Trauma reduziert, wodurch die Aktivierung und die klonale Expansion der T­
Lymphozyten supprimiert ist (HOYT et al. 1990).

Literaturübersicht 31
Eine weitere Ursache für eine verminderte Aktivierung der T­Lymphozyten ist die
Abspaltung („Shedding“) der IL­2­Rezeptoren von der Lymphozytenoberfläche
(THEODORCZYK­INJEYAN 1989). Die abgespaltenen Rezeptoren bewahren die Funktion
der IL­2­Bindung und führen zur Inaktivierung des gebundenen IL­2, da ihre Fähigkeit zur
Signaltransduktion nicht mehr vorhanden ist.
Bei Trauma und Hämorrhagie ist außer der T­Zellfunktion auch die Zytotoxizität von NK­
Zellen eingeschränkt. STEPHAN et al. (1987) berichteten von einer prolongierten
Verschlechterung der NK­Zellaktivität in einem murinen Modell der Hämorrhagie und
Reperfusion.
2.5 Apoptose
Der programmierte Zelltod (Apoptose) ist eine physiologische, energieabhängige, zelluläre
Reaktion, die eine wichtige Rolle bei der Gewebeumformung während der Entwicklung und
der Metamorphose aller vielzelligen Lebewesen spielt. Dabei ist die Apoptose abhängig von
der Synthese spezifischer Genprodukte, die das Selbstmordprogramm der Zelle aktivieren.
Die Dauer eines apoptotischen Vorgangs beträgt etwa 12 bis 24 Stunden.
Der programmierte Zelltod ist durch typische, histomorphologische Merkmale charakterisiert.
Die ersten Veränderungen bestehen aus der Fragmentierung der DNA, der Auflösung des
Zellkerns und Veränderungen der Zellmorphologie. Dabei werden im Zellkern DNasen
aktiviert, welche die genomische DNA zwischen Nucleosomen zerschneiden. Dadurch
entstehen Kern­DNA­Fragmente von 180 bis 200 Basenpaaren oder eines Vielfachen davon
(JANEWAY u. TRAVERS 1997, S. 271; TIZARD 2000, S. 161­165). An der
Zytoplasmamembran ist die Bildung von Ausstülpungen und Bläschen zu beobachten. Die
Zelle zerstört sich von innen heraus selbst, indem sie durch das Abstoßen
membrangebundener Vesikel schrumpft. Die Vesikel („apoptotic bodies“) werden
anschließend durch phagozytierende Zellen eliminiert (JANEWAY u. TRAVERS 1997, S.
271). Der Vorgang findet ohne inflammatorische Prozesse statt.

Literaturübersicht 32
Biochemisch kommt es bereits zu Beginn der Apoptose zu charakteristischen Veränderungen.
In der Zellmembran wird das Protein Phosphatidylserin (PS), das normalerweise auf der
zytoplasmatischen Membranseite lokalisiert ist, auf die extrazelluläre Seite verlagert (PS­Flip,
Kapitel 4.3.1.1 Analyse apoptotischer T­Lymphozyten). Annexin V ist ein
calciumabhängiges, 35­36 kD Protein, das an Phospholipide bindet und eine hohe Affinität zu
Phosphatidylserin hat. Es bindet an das PS, das von den Zellen exprimiert wird (WUCHER et
al. 1997), und führt dazu, dass apoptotische von nicht­apoptotischen Zellen unterschieden
werden können. Da diese Bindung auch nach dem Zelltod bestehen bleibt, sind spät­
apoptotische und nekrotische Zellen ebenfalls positiv für Annexin V. Sie müssen durch eine
weitere Färbung diskriminiert werden. Zu diesem Zweck kann der Farbstoff Propidiumiodid
(PI) verwendet werden, der ein standardisiertes Mittel bei der durchflusszytometrischen
Untersuchung darstellt, um vitale und nicht vitalen Zellen voneinander zu unterscheiden.
Lebende Zellen oder Zellen im frühen Apoptosestadium mit einer intakten Plasmamembran
sind für PI nicht passierbar. Im Gegensatz dazu weisen tote Zellen oder Zellen im späten
Apoptosestadium eine zerstörte Integrität der Plasmamembran auf und sind permeabel für PI.
PI bindet an die DNA, und der Komplex fluoresziert nach Anregen mit dem Laser bei einer
Wellenlänge von λ= 488 nm.
Die Induktion der Apoptose wird u.a. über das Membranprotein CD95 (Fas) oder über den
TNF­Rezeptor ausgelöst, die sich auf der Oberfläche der meisten Körperzellen befinden
(NAGATA u. GOLSTEIN 1995; AYALA et al. 1999). Der natürliche Ligand von CD95 ist
CD95L (Fas Ligand), der von zytotoxischen T­Zellen und einigen TH1­Zellen exprimiert
wird. Die Bindung von CD95L an CD95 liefert das entscheidende Signal, um den
Apoptosevorgang intrazellulär zu aktivieren (DHEIN et al. 1992; OSHIMI et al. 1996).
Das CD95­System hat eine große Bedeutung für die Apoptose von T­Lymphozyten im
peripheren Blut. Ruhende T­Lymphozyten exprimieren nur geringe Mengen von CD95L.
Nach ihrer Aktivierung durch antigene Stimuli erhöhen die T­Lymphozyten die Synthese und
Expression von CD95 und CD95L (ALDERSON et al. 1993; DHEIN et al. 1995). Nach dem
Anheften des CD95­Liganden an den CD95­Rezeptor derselben Zelle besitzt diese durch
Induktion der Apoptose die Fähigkeit zum autokrinen Suizid. Darüber hinaus können die

Literaturübersicht 33
Zellen durch Zell­Zell­Kontakt oder durch Sezernierung von löslichem CD95L andere
aktivierte T­Lymphozyten töten (parakriner Tod).
Durch das Anheften des Liganden an den CD95­Rezeptor wird eine Kaskade zytosolischer
Enzyme aktiviert. Die Kaskade besteht aus mehreren Proteasen, den Caspasen (STENNICKE
1995; PATEL et al. 1996). Die Caspasen werden nach einem präapoptotischen Signal
aktiviert und sind Teil einer zur Apoptose führenden Signalkaskade, die wichtige Proteine des
Zytoskeletts und der DNA zerstört.
Eine Hemmung der Apoptose erfolgt durch mehrere Zytokine, wie z.B. IL­1, IL­6 und G­
CSF. Auch bestimmte Proteine, wie z.B. das B­Zell Lymphoma­2­Protein (Bcl2), können den
programmierten Zelltod inhibieren ( RIEDEMANN et al. 2003).
Die meisten antigenspezifischen T­Lymphozyten werden nach Ablauf einer Immunreaktion
durch Apoptose eliminiert; nur ein kleiner Teil wird zu Gedächtniszellen umgewandelt. Die
Immunantwort wird damit beendet und eine chronische Entzündung verhindert. Eine
Unterdrückung der Apoptose (z.B. durch einen genetischen Defekt) führt zu einer
Ansammlung fehlerhafter Lymphozyten mit Splenomegalie und Bildung von Autoantikörpern
(RIEUX­LAUCAT et al. 1995).
Bei einer polymikrobiellen Sepsis wird vor allem in den lymphatischen Organen eine erhöhte
Apoptoserate festgestellt. Dies könnte eine mögliche Erklärung für die spätere
Immunparalyse sein. So findet man erhöhte Apoptoseraten der unreifen Zellen im
Knochenmark, in der Milz und im Thymus. Allerdings können erst 24 Stunden nach der
coecalen Ligatur und Punktion (CLP) verringerte Zellzahlen in diesen Geweben festgestellt
werden (AYALA et al. 1996a). Die Behandlung von septischen Mäusen mit Caspase­
Inhibitoren verringerte die Apoptoserate der Lymphozyten und verbesserte die Überlebensrate
gegenüber der Kontrollgruppe (HOTCHKISS 1999b). Des Weiteren sind nicht nur die
lymphatischen, sondern auch die parenchymatösen Organe wie Niere, Kolon, Ileum und
Leber von vermehrter Apoptose betroffen (BERNARD 1990; HOTCHKISS et al. 1997;
AYALA et al. 1998).

Literaturübersicht 34
Auch Makrophagen zeigen in späteren Sepsis­Phasen vermehrt Apoptose, was neben ihrer
Areaktivität zur Immunparalyse beiträgt (AYALA et al. 1996b). Die genannten Ergebnisse
der Tiermodelle wurden bei Patienten mit septischem Schock und MODS bestätigt. In fast
allen Organen wurde immunhistochemisch eine erhöhte Caspaseaktivität festgestellt
(RINALDO 1990; HOTCHKISS et al. 1999a; PAPATHANASSOGLOU et al. 2000).
2.6 Die Rolle der Zytokine bei der Pathogenese des SIRS und MODS
Nach bisherigen Untersuchungen steht die Expression der Adhäsionsmoleküle und die
Aktivität der neutrophilen Granulozyten in einem engen Zusammenhang mit der Freisetzung
von Zytokinen (GAMBLE et al. 1985; POHLMAN et al. 1986; NATHAN et al. 1989;
KUIJPERS et al. 1992).
Zytokine haben sowohl ein proinflammatorisches als auch ein antiinflammatorisches
Wirkungsprofil. Nach einem infektiösen oder traumatischen Ereignis erfolgt im Körper im
Rahmen einer physiologischen Reaktion zunächst die Ausschüttung der proinflammatorischen
Zytokine TNF­α, IL­1, IL­6 und IL­12. Im weiteren Verlauf der Abwehrreaktion kommt es
aufgrund negativer Rückkopplungsmechanismen zu einer vermehrten Freisetzung der
antiinflammatorischen Zytokine IL­10, IL­4 und IL­13 (DINARELLO 1996).
Durch das beschriebene Zusammenspiel der Zytokine ist es dem Organismus möglich, eine
zeitlich und qualitativ begrenzte Entzündungsreaktion hervorzurufen, um regenerative
Prozesse zu ermöglichen. So ist bei einer limitierenden Immunreaktion nach wenigen Tagen
am Plasmazytokinspiegel der Übergang von der inflammatorischen Primärphase zur
kompensatorischen hypoinflammatorischen Sekundärphase zu erkennen.

Literaturübersicht 35
Abbildung 2: Konzeptionelles Schema des Ablaufs der Immunreaktion auf Trauma oder
Sepsis, die zum MODS führen (VAN GRIENSVEN 1999a).
Gerät dieser Regelmechanismus aus dem Gleichgewicht, kann es zur Manifestation
folgenschwerer Syndrome kommen. Bei einer überschießenden, systemischen, pro­
inflammatorischen Immunreaktion (SIRS) wird das physiologisch sinnvolle Reaktionsniveau
überschritten, was schließlich in einem MODS enden kann (SEEKAMP et al. 1998).
Überwiegen hingegen die kompensatorischen Rückkopplungsmechanismen mit Freisetzung
antiinflammatorischer Zytokine, wird eine Sekundärphase eingeleitet, die durch eine
ausgeprägte Hyporeaktivität des Immunsystems gekennzeichnet ist. Diese Immunparalyse
wird als CARS („Compensatory Anti­inflammatory Response Syndrom“) bezeichnet. Liegt
hingegen eine persistierende proinflammatorische Aktivität trotz aktiver
antiinflammatorischer Immunantwort vor, sind die Voraussetzungen für ein MARS („Mixed
Antagonist Response Syndrom“) erfüllt (BONE 1996a, 1996b, 1996c; DAVIES u. HAGEN
1997).

Literaturübersicht 36
2.6.1 Tumor Nekrose Faktor­α (TNF­α) und TNF­Rezeptoren
Zur TNF­Familie gehören unter anderem die Zytokine TNF­α und TNF­β. Obwohl beide
Tumor Nekrose Faktoren nahezu die gleichen biologischen Wirkungen besitzen, ist
hauptsächlich TNF­α an inflammatorischen Reaktionen beteiligt (TRACEY u. CERAMI
1993). TNF­α wird von Monozyten, Makrophagen, T­Lymphozyten sowie von NK­Zellen
und aktivierten neutrophilen Granulozyten sezerniert (Abbildung 3), TNF­β hingegen nur
von Lymphozyten (CERASOLI et al. 1990; BELLOMO 1992; MULLIGAN et al. 1993).
TNF­α besteht zunächst aus einem 26 kD membrangebundenen Molekül und spielt in dieser
Form eine Rolle bei interzellulären Prozessen (KRIEGLER et al. 1988). Im weiteren Verlauf
wird das Molekül proteolytisch gespalten und es entsteht ein 17 kD Protein. Die bioaktive
freie Form des TNF­α besteht aus einem Trimer, das aus jeweils drei dieser Proteine gebildet
wird.
Die Schlüsselrolle von TNF­α in der Pathogenese des septischen Schocks konnten von
BEUTLER et al. (1985a, 1985b) nachgewiesen werden. In humanen Seren wurden in diesen
Fällen erhöhte Konzentrationen dieses Zytokins gemessen. Mit Hilfe dieser Werte kann eine
prognostische Aussage über die Überlebenswahrscheinlichkeit der Patienten getroffen werden
(DAMAS et al. 1989; DEBETS et al. 1989; CALANDRA et al. 1991), wobei hohe TNF­α­
Konzentrationen mit einer schlechten Prognose korrelieren (CASEY et al. 1993). Weiterhin
wurde die Beeinflussung der Syndrome SIRS und MODS durch TNF­α untersucht
(BROUCKAERT u. FIERS 1996). In weiteren Studien bestand für Patienten, die nach
Trauma ständig erhöhte TNF­α­Plasmaspiegel aufwiesen, eine schlechte Prognose (CASEY
et al. 1993; THIJS u. HACK 1995). Bei an ARDS („Adult Respiratory Distress Syndrome“)
verstorbenen Patienten konnten sowohl in der bronchoalveolären Lavage als auch im Plasma
stark erhöhte TNF­α­Konzentrationen festgestellt werden (MEDURI et al. 1995a, 1995b).
Eine verlässliche Prognose über den Verlauf der Erkrankung konnte in diesem Falle jedoch
nicht erstellt werden (MEDURI et al. 1995a). Erwähnenswert ist zudem, dass Monozyten von
septischen Patienten mit erhöhten TNF­Spiegeln nach Stimulation mit Endotoxin weniger

Literaturübersicht 37
TNF­α als gesunde Kontrollgruppen sezernieren (RIGATO u. SALOMOA 2003). Durch die
Areaktivität der Monozyten besteht die Gefahr der Entwicklung eines CARS.
Die TNF­α­Bildung kann durch exogene und endogene Faktoren induziert werden. Sowohl
Endotoxine, Lipopolysaccharide (LPS) als auch Enterotoxin, Zellwandbestandteile von
Mykobakterien und Faktoren des Komplementsystems sind für die Sekretion dieses Zytokins
verantwortlich (OKUSAWA et al. 1988). Geringe Mengen von TNF­α sind für eine adäquate
Immunantwort sogar von Nutzen. Die Gabe von Anti­TNF­Antikörpern vor Induktion einer
experimentellen Peritonitis verschlechtert die Überlebensraten von Mäusen
(ECHTENACHER et al. 1990), wohingegen eine vorangehende Injektion geringer TNF­α­
oder Endotoxindosen wahrscheinlich durch Toleranzinduktion die Überlebensraten verbessert
(ECHTENACHER et al. 1995). TNF­α ist weiterhin in einigen seiner Wirkungen mit denen
des Endotoxins vergleichbar. Versuchstiere, die mit geringen Dosen von humanem
rekombinanten TNF­α behandelt werden, zeigen Symptome wie Hypotension, Fieber,
Lymphopenie, Neutrophilie, metabolische Azidose, pulmonale Hypertonie und
Endothelaktivierung. Die Verabreichung hoher Dosen geht bei den Tieren mit Durchfällen,
Dünndarmnekrosen und Endothelschäden einher. Die Schäden am Endothel bedingen eine
Extravasation von Erythrozyten und Granulozyten ins Interstitium, was zu einer Hypovolämie
und schließlich zum Schock führen kann (TRACEY et al. 1986; REMICK et al. 1987).
TNF­α beeinflusst Endothelzellen aufgrund mehrerer Wirkungsmechanismen. Es induziert im
Zusammenspiel mit weiteren Zytokinen die Freisetzung von IL­1, IL­6 und IL­8 aus den
Endothelzellen (LOPPNOW u. LIBBY 1989). Zudem erhöht TNF­α die prokoagulierende
Aktivität des Endothels (NAWROTH u. STERN 1986) und steigert zusammen mit IL­1
dessen Permeabilität (BRETT et al. 1989; VAN GRIENSVEN et al. 1999b), indem es die
Expression von Adhäsionsmolekülen wie E­Selektin und ICAM­1 auf Endothelzellen erhöht
(REDL et al. 1993). Dies bedingt eine vermehrte Aktivierung und Adhäsion von neutrophilen
Granulozyten, die hauptsächlich an den Gewebeschäden in den betroffenen Organen beteiligt
sind.

Literaturübersicht 38
Abbildung 3: Biologische Wirkung des TNF­α (VAN GRIENSVEN et al. 2003).
TNF­α bindet an zwei verschiedene membrangebundene Rezeptoren. Sie werden als TNF­RI
(55 kD) und TNF­RII (75 kD) bezeichnet und befinden sich mit Ausnahme der Erythrozyten
auf allen Zelltypen. Beide Rezeptoren sind in löslicher Form (sTNFR) im Plasma
nachweisbar, wo sie bioaktives TNF­α binden und auf diese Weise antagonistisch wirken
können (MOLDAWER 1994; PESCHON et al. 1998). Drei Stunden nach einem Trauma
können erhöhte Konzentrationen von sTNF­RI und sTNF­RII im Plasma gemessen werden,
die sich nach weiteren neun Stunden wieder normalisiert haben (HENSLER et al. 2002).
Die Rezeptoren vermitteln verschiedene biologische Funktionen. Der TNF­RI steuert die
Entwicklung von Lymphfollikeln in den peripheren Lymphknoten (MATSUMOTO et al.
1996) und vermittelt die Apoptose von peripheren zytotoxischen T­Lymphozyten (SPEISER
et al. 1996). Die Apoptose anderer Zellen wird durch die Induktion beider Rezeptortypen

Literaturübersicht 39
veranlasst (VANDENABEELE et al. 1995). Zudem werden eine Vielzahl der Effekte, die von
TNF­α induziert werden, über den TNF­RI vermittelt. Dieser Rezeptor wird bei SIRS­
Patienten auf neutrophilen Granulozyten und Monozyten verstärkt exprimiert (HUBL et al.
1999) und ist für das Überleben einer Sepsis von entscheidender Bedeutung (VAN
GRIENSVEN et al. 2001). Die TNF­α induzierte T­Lymphozytenproliferation wird hingegen
über den TNF­RII vermittelt (TARTAGLIA et al. 1993; GRELL et al. 1998).
Abbildung 4: Darstellung der biologischen Wirkung von TNF­α auf die verschiedenen
Rezeptoren (WITTWER 2001).

Literaturübersicht 40
2.6.2 Interleukin­6 (IL­6)
Das Zytokin IL­6 nimmt sowohl bei der Immunabwehr als auch bei der Hämatopoese eine
entscheidende Rolle ein (VAN SNICK 1990; KISHIMOTO et al. 1992; AKIRA et al. 1993;
HIRANO 1994) und stellt bei Trauma­Patienten das wichtigste sekundäre Zytokin dar
(MARTIN et al. 1997).
Nach Abspaltung einer hydrophoben Signalsequenz entsteht aus dem 212 Aminosäuren
kodierenden Polypeptid das bioaktive Protein, das eine Länge von 184 Aminosäuren aufweist.
Aufgrund unterschiedlicher Glykosylierungen und Phosphorylierungen kann das
Molekulargewicht von IL­6 zwischen 21,5 und 28 kD liegen.
Die Hauptproduzenten von IL­6 sind aktivierte Makrophagen/Monozyten, T­ und B­
Lymphozyten sowie Endothelzellen. Dabei produzieren Monozyten IL­6 entweder spontan
oder nach Stimulation mit Endotoxin oder IL­1 (AARDEN et al. 1985; BAUER et al. 1988;
NAVARRO et al. 1989; WAAGE et al. 1990). Bei Endothelzellen wird die IL­6­Produktion
durch Endotoxin, TNF­α oder IL­1 induziert (SHALABY et al. 1989a, 1989b). In Studien an
Volontären oder Versuchstieren wird IL­6 nach Endotoxin­Gabe später als TNF oder IL­1
sezerniert. Während in Mäusen die TNF­Konzentration im Plasma bereits eine Stunde nach
Endotoxinapplikation ihr Maximum erreichte, war die Höchstkonzentration von IL­6 erst
nach zwei Stunden messbar. Nach TNF­Injektion konnte das Maximum des IL­6­
Plasmaspiegels bereits nach einer Stunde nachgewiesen werden (SHALABY et al. 1989b).
Dadurch ist bewiesen, dass TNF­α und IL­1 eine IL­6­Produktion induzieren. Eine Inhibition
der IL­6­Produktion wird hingegen durch die Zytokine IL­4, IL­10 und IL­13 hervorgerufen.
Durch IL­6 wird die B­Lymphozytenproliferation induziert, was zu einer vermehrten Bildung
von Immunglobulinen führt. IL­6 fördert weiterhin die vermehrte Differenzierung von
zytotoxischen T­Zellen und steigert die Proliferation der T­Lymphozyten. Die Aktivität der
NK­Zellen wird erhöht. Eine entscheidende Rolle spielt IL­6 bei der Induktion der Akut­
Phase­Reaktion, indem es die Hepatozyten zur Erhöhung der Synthese von Akut­Phase­

Literaturübersicht 41
Proteinen wie C­reaktives Protein (CRP), Fibrinogen oder Komplementfaktoren stimuliert
(KELLER et al. 1996).
Das IL­6 ist derzeit eines der besten prognostischen Marker bezüglich des Outcomes bei
Patienten mit septischem Schock, SIRS oder MODS (REMICK et al. 2002) und wird in vielen
intensivmedizinischen Kliniken routinemäßig bestimmt (HACK et al. 1989; HELFGOTT et
al. 1989; WAAGE et al. 1989; ZABEL et al. 1989; CALANDRA et al. 1991). Hohe IL­6­
Plasmaspiegel korrelieren dabei mit einem schlechten Outcome (CASEY et al. 1993). Die IL­
6­Serumkonzentration, die beispielsweise unmittelbar nach einem traumatischen Ereignis
gemessen wird, kann mit dem „Injury Severity Score“ (ISS) verglichen werden und Hinweise
auf die Schwere des Traumas und Komplikationen geben. Mit Hilfe dieses Scores findet eine
Einteilung der Patienten in Risikogruppen statt, um eine optimale intensivmedizinische
Versorgung gewährleisten zu können (Pape et al. 1999b; GEBHARD et al. 2000). Patienten,
die ein SIRS überlebt haben, wiesen im Vergleich zu Patienten mit einem schlechten
Outcome niedrigere IL­6­Spiegel im Serum auf (TERREGINO et al. 1997). Ähnliche
Beobachtungen bezüglich der Korrelation zwischen IL­6­Serum­ bzw. BAL­Konzentration
und Überlebenswahrscheinlichkeit wurde bei ARDS­Patienten gemacht (MEDURI et al.
1995a, 1995b).
Anhand der IL­6­Plasmakonzentration kann weiterhin zwischen einer schweren Sepsis und
einem nicht­infektionsbedingten SIRS unterschieden werden, da Sepsispatienten höhere IL­6­
Level als die SIRS­Patienten aufweisen (DU et al. 2002).
2.6.3 Interleukin­10 (IL­10)
Interleukin­10 ist ein antiinflammatorisch oder immunsuppressiv wirkendes Zytokin, das vor
allem bei der Regulation inflammatorischer Prozesse eine entscheidende Rolle spielt. Das 18
kD Protein wird hauptsächlich von TH2­Zellen synthetisiert. Weitere Produzenten dieses
Zytokins sind B­Lymphozyten, Monozyten/Makrophagen und neutrophile Granulozyten,
wobei TNF­α die Sekretion von IL­10 zumindest teilweise induzieren kann.

Literaturübersicht 42
Das immunsuppressive Zytokin reguliert vor allem die T­Zell­ und Makrophagenfunktion und
wirkt zusätzlich auf NK­Zellen, Mastzellen und Thymozyten ein. IL­10 unterdrückt die
Sekretion der Mediatoren IL­1β, IL­6, TNF­α und reaktiver Sauerstoffradikale von
aktivierten Makrophagen (MACKAY et al. 1994; RONGIONE et al. 1997). Zudem
exprimieren die mononukleären Zellen durch die Einwirkung von IL­10 weniger MHC­
Klasse­II­Moleküle, wodurch die antigenpräsentierende Funktion der Makrophagen und die
darauffolgende T­Zellproliferation vermindert wird (MOORE et al. 1993). IL­10 senkt
zusätzlich die Zytokinproduktion von TH1­Zellen, die IL­2, IL­3, IFN­γ und TNF­β
produzieren. Weiterhin wird die Funktion der NK­Zellen inhibiert.
Durch IL­10 wird besonders das IFN­γ stark gehemmt, wobei die Inhibition nicht durch die
Senkung der Zytokinsekretion der TH1­Zellen begründet ist, sondern indirekt durch eine
Beeinträchtigung der Antigenpräsentation und Sekretion proinflammatorischer Zytokine
durch Makrophagen vermittelt wird (FIORENTINO et al. 1991; ENK et al. 1993). Weiterhin
wirkt IL­10 auf T­ und B­Lymphozyten ein, indem es ihre Proliferation und Differenzierung
induziert (FIORENTINO et al. 1991; MOORE et al. 1993; MOSMANN 1994).
Erhöhte IL­10­Plasmaspiegel können vor allem bei Patienten mit Sepsis bzw. septischem
Schock und bei Traumapatienten gefunden werden. In der frühen posttraumatischen Phase ist
die Synthese von IL­10 auf neutrophile Granulozyten, später auf TH­Zellen, zurückzuführen
(WOLK et al. 1999). Die Schwere der Verletzung und die Wahrscheinlichkeit für das
Auftreten von Komplikationen wie Sepsis, ARDS und MODS korrelieren mit der IL­10­
Konzentration im Plasma (MARCHANT et al. 1994; NEIDHARDT et al. 1997). Diese
Tatsache ist vor allem auf die immunsuppressiven Eigenschaften von IL­10 zurückzuführen.
Im Falle einer Überproduktion von IL­10 kann es zur Entwicklung eines CARS kommen
(BONE 1996b).
Wird Mäusen, an denen eine CLP durchgeführt worden ist, in der inflammatorischen
Primärphase der Sepsis exogenes IL­10 verabreicht, so kann die Zeitspanne bis zum Eintritt
des septischen Schocks, verlängert werden. Zusätzlich ist eine höhere Überlebensrate im
Vergleich zur Kontrollgruppe festzustellen (RONGIONE et al. 2000; LATIFI et al. 2002). In

Literaturübersicht 43
der hypoinflammatorischen Sekundärphase bewirkt IL­10 hingegen eine verringerte T­Zell­
Funktion sowie eine höhere Apoptoserate der TH1­Zellen und steigert die Empfänglichkeit für
Sekundärinfektionen (AYALA et al. 2001; OBERHOLZER et al. 2002).
Die Neutralisation von IL­10 durch Anti­IL­10­Antikörper vermindert bei Traumapatienten in
dieser Phase die Empfänglichkeit gegenüber Sekundärinfektionen (STEINHAUSER et al.
1999). Werden septischen Mäusen diese Antikörper zwölf Stunden nach der CLP verabreicht,
kann ihre Überlebensrate gesteigert werden (SONG et al. 1999; KALECHMANN et al.
2002). Eine zu frühe Inhibition von IL­10 führt jedoch zu einem Anstieg der TNF­α­
Konzentrationen und folglich zu einer erhöhten Mortalität (VAN DER POLL et al. 1995;
SONG et al. 1999).
2.6.4 Interleukin­12 (IL­12)
Interleukin­12 ist ein wichtiges proinflammatorisches Zytokin, das sowohl auf das
angeborene als auch auf das erworbende Immunsystem einwirkt (ROMANI et al. 1997). Das
biologisch aktive IL­12 ist ein Heterodimer, das als IL­12p70 bezeichnet wird und aus den
Untereinheiten p35 und p40 besteht (BRUNDA 1994).
IL­12 wird von antigenpräsentierenden Zellen wie Monozyten, Makrophagen, B­Zellen,
dendritischen Zellen und Keratinozyten synthetisiert. Es induziert zusammen mit IFN­γ die
Differenzierung der CD4 + ­T­Zellen zu TH1­Zellen und ist aus diesem Grund für die TH1­
vermittelte Immunität gegen Mikroorganismen von Bedeutung (ROMANI et al. 1997).
Zudem verstärkt es die Proliferation und Zytotoxizität der T­ und NK­Zellen und vermindert
die Produktion von IgE, indem es die Synthese von IL­4 inhibiert.
Eine verminderte IL­12­Synthese führt bei Trauma­Patienten zu einer Verlagerung der
Immunantwort. Durch die stärkere Differenzierung der TH2­Zellen durch IL­4 wird die
humorale Immunantwort verstärkt ausgebildet, was zu einem schlechteren Outcome der
Patienten führt (O’SULLIVAN et al. 1995; SPOLARICS et al. 2003). In einer weiteren Studie

Literaturübersicht 44
von WICK et al. (2000), die an polytraumatisierten Patienten durchgeführt wurde, korrelierte
die Mortalität mit der IL­12­Serumkonzentration. Das Outcome von Patienten mit einem
hohen IL­12­Spiegel konnte als prognostisch günstiger eingestuft werden als von Patienten
mit niedrigen Serumkonzentrationen, da weniger Komplikationen durch Infektionen auftraten.
Der verminderte IL­12­Level kann möglicherweise durch die Anwesenheit von PGE2 erklärt
werden, das infolge der Verletzungen freigesetzt wurde (SCHWACHA et al. 2002). Die Gabe
von IL­12 an polytraumatisierte Patienten bewirkte wiederum eine erhöhte Resistenz gegen
Infektionen (O’SUILLEABHAIN et al. 1996; GOEBEL et al. 2000).
ECHTENACHER et al. (2001) beschrieben, dass IL­12 und IFN­γ zwar für die
Immunantwort gegen Lipopolysaccharide und für die Resistenz gegen Infektionen notwendig
sind, eine Verminderung oder ein Fehlen dieser Zytokine jedoch keinen Einfluss auf die
Mortalität nach einer CLP bei Mäusen hat. Die präoperative Applikation von IL­12 oder die
Behandlung mit IFN­γ während der CLP erhöhte jedoch die Mortalität erheblich.
2.6.5 Interferon­γ (IFN­γ)
Interferon­γ ist ein 20 bis 25 kD Protein und wird hauptsächlich von T­Zellen (TH1­ und
CD8 + ­T­Zellen), von Makrophagen und NK­Zellen synthetisiert (LIN et al. 1999). Die
Zielzellen dieses Interferons umfassen B­Zellen, T­Zellen, Makrophagen, neutrophile
Granulozyten sowie NK­Zellen.
Der entscheidende Effekt von IFN­γ ist die Aktivierung von Makrophagen und neutrophilen
Granulozyten, wodurch sowohl die Antikörper­vermittelte Phagozytose als auch die
Antikörper­abhängige zellvermittelte Zytotoxizität (ADCC) stimuliert werden. Dadurch wird
die Immunabwehr gegen bakterielle Infektionen gesteigert. Weiterhin verstärkt IFN­γ die
Bildung bestimmter Immunglobulinisotypen, bedingt die Lymphozytenproliferation und
fördert sowohl die Synthese von TNF­α und IL­1β (LIN et al. 1999) als auch von IL­6, IL­8
und IP­10 („IFN­gamma­inducible protein“). Die Synthese weiterer Zytokine wie IL­4, IL­10

Literaturübersicht 45
und IL­12 wird laut einer Studie von DE METZ et al. (2001) nicht erhöht. Durch IFN­γ
exprimieren Endothelzellen, Keratinozyten, Fibroblasten und Makrophagen vermehrt MHC­
Klasse­II­Moleküle. Bei virusinfizierten Zellen wird sowohl die MHC­Klasse­I­ als auch die
MHC­Klasse­II­Expression erhöht, wodurch die infizierte Zelle leichter erkannt und abgetötet
werden kann. IFN­γ stimuliert zudem die Aktivität der TH1­Zellen, die vermehrt IL­2 und IL­
2R synthetisieren, inhibiert jedoch die Produktion von IL­4 der TH2­Zellen. NK­Zellen
werden durch das Interferon aktiviert und zur eigenen IFN­γ­Synthese angeregt, wodurch
weitere NK­Zellen stimuliert werden.
Die Behandlung von Polytraumapatienten mit IFN­γ wurde in mehreren Studien untersucht.
POLK et al. (1992) erhielten keine signifikanten Ergebnisse in Bezug auf Infektionsrate oder
Mortalität, da keine Unterschiede zwischen behandelten und unbehandelten Patienten
festgestellt wurden. In einer weiteren Studie wurde eine verringerte Mortalität der
behandelten Patienten beobachtet (RODEBERG et al. 1997). SCHINKEL et al. (2001)
benannten die Applikation von IFN­γ als eine effektive prä­ und postoperative
Therapiemaßnahme. Auch in experimentellen Studien konnte bei Interferonapplikation ein
günstigeres Outcome bezüglich Mortalität infolge einer Infektion ermittelt werden
(COCKFIELD et al. 1993).
IFN­γ ist bei der Pathogenese der Sepsis von entscheidender Bedeutung. Seine Synthese wird
durch die synergistischen Effekte von IL­18, IL­12 und IL­15 stimuliert. Durch Anti­IL­Anti­
körper kann die Synthese von IFN­γ verhindert werden, wobei Anti­IL­12­AK die stärkste
inhibitorische Wirkung aufweisen, gefolgt von Anti­IL­18­ und Anti­IL­15­AK (LAUW et al.
1999). QIU et al. (2001) riefen bei Ratten eine intra­abdominale Sepsis mittels CLP hervor
und konnten durch die Gabe von Anti­IFN­γ­AK die Bakterienmigration aus dem Coecum
heraus sowie durch das Peritoneum hindurch vermindern. Bei einer ähnlichen Studie konnte
nach einer Sepsis die Entzündungsreaktion in der Lunge durch Anti­IFN­γ­AK verringert
werden, was anhand einer geringeren MPO­Aktivität und Superoxid­Konzentration im
Vergleich zu Kontrollgruppen nachgewiesen werden konnte (YIN et al. 1999).

Literaturübersicht 46
2.6.6 Monozyten­chemotaktisches Protein­1 (Monocyte chemotactic
protein­1, MCP­1)
MCP­1 gehört zur Familie der Chemokine, die anhand der Anordnung ihrer Cysteinreste in
drei große Gruppen eingeteilt werden können. Bei den α­ oder CXC­Chemokinen sind die
Cysteinreste durch jeweils unterschiedliche Aminosäuren voneinander getrennt. Im
Allgemeinen fördern sie die Wanderung der neutrophilen Granulozyten. Ein wichtiger
Vertreter dieser Chemokine ist IL­8. MCP­1 gehört zu den β­ oder CC­Chemokinen. Die
ersten beiden Cysteinreste liegen unmittelbar benachbart an den Positionen 11 und 12, zwei
weitere folgen an den Positionen 36 und 52. In der elektrophoretischen Auftrennung stellt sich
MCP­1 als ein 15 kD und 13 kD Protein dar, wodurch es in die beiden Chemokine MCP­1α
und ­ß unterteilt wird. Da beide Untergruppen eine identische Aminosäuresequenz aufweisen,
ist das unterschiedliche Gewicht wahrscheinlich auf eine nicht identifizierte posttranslationale
Modifikation zurückzuführen (YOSHIMURA u. LEONARD 1992). Die Hauptaufgabe der
CC­Chemokine besteht darin, die Wanderung der Monozyten zu unterstützen. Die dritte
Gruppe stellen die C­Chemokine dar, die nur einen Cysteinrest an derselben Stelle wie die
anderen Chemokine haben. C­Chemokine wie Lymphotactin oder Eotaxin erfüllen meist
Spezialaufgaben.
Die Synthese von MCP­1 durch verschiedene Zelltypen erfolgt nach einer Stimulation mit
Lipopolysacchariden, IL­1, IFN­γ und TNF­α. Vor allem Lymphozyten, Makrophagen,
Monozyten, Fibroblasten und Endothelzellen synthetisieren MCP­1 (YOSHIMURA u.
LEONARD 1992). Das freigesetze MCP­1 bindet an den Chemokin­Rezeptor CCR2B, der
sich auf Monozyten, B­ und T­Zellen, Mastzellen, Basophilen und NK­Zellen befindet. Es hat
keine direkte Wirkung auf neutrophile und eosinophile Granulozyten. Die Auswirkungen auf
die PMN ergeben sich aus dem Zusammenspiel der MCP­1­ und der Leukotrien­B4­
Konzentration, wobei LTB4 chemotaktisch auf neutrophile Granulozyten wirkt. MCP­1
erhöht die Chemotaxis der Zielzellen und steigert bei Monozyten die Freisetzung der
Superoxidanionen und der Arachidonsäure. Zusätzlich steigt der intrazelluläre
Calciumspiegel. Bei Mastzellen und basophilen Granulozyten wird die Histaminfreisetzung
stimuliert. Basophile zeigen weiterhin erhöhte Leukotrienfreisetzung und erhöhte Adhäsion.

Literaturübersicht 47
MCP­1 steigert die Proliferationsrate der B­Zellen und stimuliert deren IgE­ und IgG4­
Synthese. NK­Zellen können vermehrt Tumorzellen abtöten und zeigen erhöhte Adhäsion an
extrazelluläre Matrixproteine.
Bei einer CLP­induzierten Sepsis erhöht sich die Konzentration von MCP­1 in Geweben wie
Leber, Lunge, Niere und Bauchfell. Durch die Applikation von Anti­MCP­1­Antikörpern
verringern sich die Konzentrationen von IL­12 und IL­13, während jene von IL­10 und TNF­
α ansteigen. MCP­1 übt folglich eine schützende Funktion auf Gewebe und Organe aus,
indem es die Synthese antiinflammatorischer und immunstimulierender Zytokine steigert
(MATSUKAWA et al. 2000). Eine Hemmung von MCP­1 führt zu einer verringerten
Überlebensrate nach CLP, was auf die verringerte Chemotaxis und Aktivierung von
Makrophagen und neutrophilen Granulozyten zurückzuführen ist. Die Applikation von Anti­
MCP­1­Antikörpern führt zu einem Absinken der LTB4­Level in der Bauchhöhlenflüssigkeit,
während die Gabe von MCP­1 in einer dosisabhängigen Konzentrationserhöhung von LTB4
in Makrophagen resultiert (MATSUKAWA et al. 1999). BONE­LARSON et al. (2000)
bestätigten die Beobachtung, dass erhöhte MCP­1­Konzentrationen mit einer geringeren
Mortalität nach Sepsisinduktion durch CLP verbunden sind.
2.7 Überempfindlichkeitsreaktion vom verzögerten Typ
Aus den Ausführungen über die angeborene und erworbene Immunität geht hervor, dass das
Immunsystem unterschiedliche Stadien der Aktivierung im posttraumatischen Verlauf
aufweist. Ein Maß für die Aktivierung des Immunsystems besteht aus der Stärke einer
induzierten Überempfindlichkeitsreaktion vom verzögerten Typ (Typ IV) (Kapitel 4.2.7
Messung der T­Zell­vermittelten Typ­IV­Reaktion).
Der Überempfindlichkeit vom verzögerten Typ liegt eine Aktivierung spezifischer T­Zellen
zugrunde. Nach dem zweiten Antigenkontakt entwickelt sich eine T­Zell­abhängige, lokale
Entzündungsreaktion, die durch inflammatorische CD4 + ­T­Zellen des TH1­Klons vermittelt
wird. Diese T­Zellen erkennen die entsprechenden Peptid­Hapten­MHC­Klasse­II­Komplexe

Literaturübersicht 48
auf antigenpräsentierenden Zellen und sezernieren die inflammatorischen Zytokine IFN­γ und
IL­2. Die Endothelzellen exprimieren dadurch verstärkt Adhäsionsmoleküle und MHC­
Klasse­II­Moleküle. Die Durchlässigkeit der Blutgefäße wird zudem von den vasoaktiven
Substanzen Serotonin, IL­8 und Lymphotactin, die zusätzlich von den T­Zellen sezerniert
werden, erhöht. Es kommt zu einer verstärkten Zufuhr von Flüssigkeit, Proteinen und
akzessorischen Zellen.
Da die T­Zellen, die durch einen vorangegangenen Antigenkontakt sensibilisiert wurden, sehr
selten sind, kann es mehrere Stunden dauern, bis sie an die Stelle des zweiten Antigen­
kontakts gelangen und Zytokine freisetzen. Jede einzelne der folgenden Phasen nimmt Zeit in
Anspruch, so dass die voll ausgeprägte Reaktion erst nach 24 bis 48 Stunden einsetzt.
An der Hypersensibilitätsreaktion vom Typ IV können auch CD8 + ­Zellen beteiligt sein, die
das Gewebe hauptsächlich durch zellvermittelte Zytotoxizität schädigen. Ist das Antigen
lipidlöslich, kann es die Zellmembran durchqueren und Proteine im Zellinneren verändern.
Aus den modifizierten Proteinen entstehen im Zytosol modifizierte Peptide, die in das
endoplasmatische Reticulum und von dort aus von MHC­Klasse­I­Molekülen an die
Zelloberfläche transportiert werden. Dort werden sie von CD8 + ­T­Zellen erkannt, welche die
betroffenen Zellen töten.
2.8 Sepsisinduktion durch coecale Ligatur und Punktion (CLP) in
Verbindung mit einem „two­hit“­Modell der Maus
Bei dem Zusammenwirken von Trauma und Sepsis handelt es sich um einen äußerst
komplexen Vorgang. Schon die Interaktionen der verschiedenen Mediatoren sind in vitro nur
ansatzweise zu erforschen, so dass zur Beurteilung neuer Behandlungsstrategien relevante
Tiermodelle notwendig sind. Die Anforderungen an ein solches Modell bestehen darin, dass
es reproduzierbar, möglichst wenig aufwändig und somit kostengünstig ist. Die pathologi­
schen Veränderungen sollten denen des Sepsis­Patienten gleichen. Neue Möglichkeiten be­
stehen durch die Züchtung von gentechnisch veränderten Tieren mit spezifischen Mutationen.

Literaturübersicht 49
Studien in den 1950er Jahren ergaben, dass eine gramnegative Sepsis durch Endotoxin
verursacht wird. Die damaligen Forschungsschwerpunkte lagen in den physiologischen,
immunologischen und biochemischen Veränderungen nach Verabreichung von Endotoxin vor
allem an Mäuse und Ratten. Die Ergebnisse neuerer Studien zeigen zwar eine ähnlich hohe
Mortalität zwischen Tiergruppen, denen Lipopolysaccharide (LPS) injiziert worden sind, und
CLP­Modellen, allerdings gibt es signifikante Unterschiede hinsichtlich des
Synthesezeitpunkts und der Konzentration der Zytokine. Die Applikation von LPS erzeugt
nicht die Zytokin­Profile einer Sepsis (REMICK et al. 2000). Weiterhin gibt es Unterschiede
zwischen dem klinischen Bild einer Sepsis und dem Endotoxin­Schock. Bei einer Sepsis sind
Symptome wie erhöhtes Herzzeitvolumen, verminderter peripherer Widerstand, Hypotension
und Oligurie vorherrschend. Die Verabreichung von Endotoxin erzeugt ebenfalls eine
Hypotension, jedoch in Verbindung mit erhöhtem peripheren Widerstand und verringertem
Herzzeitvolumen.
Eine experimentelle Sepsis kann weiterhin durch die intravenöse oder intraperitoneale
Injektion von lebenden Bakterien ausgelöst werden. Diese Form der Sepsisinduktion birgt die
Gefahr, dass der Wirt von der Bolusgabe der Bakterien oder des Endotoxins überwältigt wird
und sein Immunsystem nicht mehr in der Lage ist, sämtliche Abwehrmechansimen
einzusetzen.
Beim CLP­Modell nach BAKER (1984) wird das Coecum von Ratten oder Mäusen ligiert
und anschließend mit einer Kanüle punktiert. Dadurch entsteht ein septischer Herd, von dem
zeitweise Bakterien an den Kreislauf abgegeben werden. Diese intermittierende Bakterien­
freisetzung entspricht den pathologischen Veränderungen der meisten Sepsis­Patienten. Im
Modell kann die Zytokinsynthese und die Mortalität durch die Größe der Punktionskanüle
und durch die Anzahl der Punktionen beeinflusst werden (OTERO­ANTON et al. 2001). Die
Länge des Coecumabschnitts, der ligiert wird, wirkt sich ebenfalls auf die Mortalität aus.
SINGLETON und WISCHMEYER (2003) konnten feststellen, dass die Mortalität zwischen
90 % und 100 % liegt, wenn der ligierte Abschnitt mehr als 30 % der Coecumlänge beträgt.
Liegt dieser Abschnitt jedoch unter 5 %, ist keine Mortalität zu verzeichnen.

Literaturübersicht 50
Die Ligatur und Punktion dieses Darmabschnitts erzeugt eine sofortige und konstante
bakterielle Invasion in die Peritonealhöhle. Es kommt zu einer polymikrobiellen Peritonitis in
Anwesenheit von devitalisiertem Gewebe, vergleichbar einer rupturierten Appendizitis oder
Divertikulitis. Mittels Blutkulturen sind bereits eine Stunde nach CLP sowohl gramnegative
als auch grampositive Bakterien nachweisbar.
Weitere Modelle, die zur Sepsisinduktion geeignet sind, sind die „Cecal ligation and Tip
resection“(CLTR), bei dem das Coecum ligiert und seine Spitze anschließend reseziert wird.
Die Mortalität ist bei diesem Modell direkt proportional zu der Länge des eröffneten Darms
(TSUNODA er al. 2002). Ein weiteres Modell ist die „Colon ascendens stent peritonitis“
(CASP), bei dem das Colon ascendens in einer definierten Länge bzw. mit einem definierten
Durchmesser eröffnet wird. MAIER et al. (2004) beschreiben, dass 24 Stunden nach dem
jeweiligen Eingriff das ligierte Coecum bei der CLP mit Dünndarmschlingen verklebt war.
Bei den CASP­Mäusen trat hingegen noch immer Darminhalt aus der Läsion aus. Bei der
CLP entsteht ein intraabdominaler Abszess, bei dem geringere Anzeichen einer systemischen
Entzündung auftreten.
Das „two­hit“­Modell beruht auf der Beobachtung, dass Polytraumapatienten, die eine
Organdysfunktion entwickeln, häufig mehreren, aufeinander folgenden körperlichen Schäden
(„Hits“) ausgesetzt waren. Jeder vorangegangene Eingriff, wie zum Beispiel eine
Hämorrhagie, beeinflusst die Antwort auf einen weiteren Insult. Das Modell wird bei Mäusen
und Ratten angewandt und besteht aus einer Femurfraktur, die mit einem hämorrhagischen
Schock verbunden wird. 48 Stunden später erfolgt der „second­hit“ in Form einer CLP,
wodurch eine Sepsis verursacht wird. Bei VAN GRIENSVEN et al. (2002) lag die Mortalität
innerhalb der ersten 96 Stunden nach Sepsisinduktion bei 85 %. Bei den Tieren wurden
pathologische Veränderungen der Lungen und Lebern festgestellt, u.a. war die TNF­α
Konzentration im Plasma erhöht. Bei dem Modell steht die Entwicklung eines SIRS im
Vordergrund. Die posttraumatischen, pathologischen Veränderungen sind eher auf die stark
erhöhten Zytokinkonzentrationen als auf ein chronisches MODS zurückzuführen.

Literaturübersicht 51
2.9 Behandlungsstrategien in der Sepsisprävention und –behandlung
Bisher gibt es nur wenige Therapieerfolge in der Behandlung von Sepsis oder SIRS. Zur
Verringerung der Mortalität und zur Verbesserung der Prognose dieser Patienten existieren
jedoch zahlreiche Präventions­ und Therapieansätze.
Bei der Sepsis oder dem SIRS kann die Entzündungsantwort vom Immunsystem nicht mehr
reguliert werden. Dies ist anfangs durch eine gesteigerte Immunantwort gekennzeichnet. Die
Synthese und Sekretion proinflammatorischer Zytokine wie TNF­α, IL­1, IL­6 und IL­8
sowie von Akut­Phase­Proteinen, wie z.B. dem C­reaktiven Protein, wird erhöht. Durch die
Aktivierung des Komplementsystems werden wirksame Chemokine wie das Spaltprodukt
C5a freigesetzt, die anschließend Immunzellen zum Ort der Entzündung locken und ihre
Zytokinproduktion weiter steigern. Zusätzlich wird bei einer Sepsis das Gerinnungssystem
aktiviert; eine disseminierte intravasale Gerinnung kann die Folge sein. Die Aufgabe der
proinflammatorischen Zytokine besteht unter anderem darin, neutrophile Granulozyten und
Makrophagen zu aktivieren und die Freisetzung von Sauerstoffradikalen aus deren Granula zu
stimulieren. Sauerstoffradikale wirken bakterizid, können jedoch auch auf körpereigenes
Gewebe einwirken und zu einer erhöhten vaskulären Permeabilität und zu vermehrten
Organschäden beitragen
Im weiteren Verlauf von Sepsis oder SIRS folgt auf die inflammatorische Primärphase eine
hypoinflammatorische Sekundärphase, die durch negative Rückkopplungsmechanismen
bedingt ist. Antiinflammatorische Zytokine wie IL­10, IL­13 und TGF­ß werden freigesetzt,
zahlreiche Immunmechanismen, u.a. die Funktion der neutrophilen Granulozyten, werden
unterdrückt. Eine Immunparalyse ist die Folge.
Das Hauptziel aktueller Behandlungsstrategien ist eine Unterdrückung und Blockierung
einzelner proinflammatorischer Mediatoren. Frühere Behandlungsstrategien, wie z.B. die
Therapie mit unterschiedlichen Antioxidantien wie Eisenchelatbildner, Katalase oder N­
Acetylcystein zur Reduktion freier Radikale, brachten keine deutlichen Erfolge (SCHILLER
et al. 1993). Weiterhin wurde eine kontinuierliche Hämofiltration bei SIRS­ bzw. MODS­

Literaturübersicht 52
Patienten erwogen, um die Konzentration von Endotoxinen und inflammatorischen
Immunmediatoren im Plasma zu verringern und den Sauerstoffpartialdruck zu verbessern
(KODAMA et al. 1995; HIRASAWA et al. 1996). In anderen Studien erbrachte die
Hämofiltration keine Erfolge bei der Reduktion der Immunmediatoren, sondern vielmehr die
Gefahr einer zusätzlichen Aktivierung von Leukozyten (SCHETZ et al. 1995).
Die Behandlung septischer Patienten mit hohen Corticosteroid­Dosen führte in den sechziger
Jahren des 20. Jahrhunderts zu keiner signifikanten Verbesserung der Prognose (BENNETT
1963). Neuere Studien von ANNANE et al. (2002) belegen, dass die Mortalität dieser
Patienten durch die Therapie mit geringeren Corticosteroid­Dosen gesenkt werden kann. Eine
längerfristige Behandlung von ARDS­Patienten mit Methylprednisolon bewirkt eine
Verbesserung der Lungenfunktion und eine Verringerung des MODS sowie der Mortalität
(MEDURI et al. 1998). Durch die Therapie mit Methylprednisolon können geringere IL­6­
und TNF­α­Konzentrationen im Serum verzeichnet werden.
Eine weitere Behandlungsstrategie ist die Neutralisation der Endotoxine von gramnegativen
Bakterien. Dabei zeigen die Anti­Endotoxin­Therapie mittels Antiseren oder die Behandlung
mit monoklonalen IgM­Antikörpern gegen den Kern des LPS oder gegen die Lipid­A­Region
des Endotoxinmoleküls in klinischen Studien jedoch keine nennenswerten Erfolge (ZIEGLER
et al. 1991; BONE et al. 1995; COHEN 1999).
Spezifische immunsupprimierende Therapien gegen IL­1, TNF­α sowie gegen den
Thrombozyten­aggregierenden­Faktor und Bradykinin mittels monoklonaler Antikörper
erbrachten zwar in Studien an Tiermodellen positive Ergebnisse (BEUTLER et al. 1985b;
TRACEY et al. 1987; OHLSSON et al. 1990; FEIN et al. 1997), eine Verbesserung des
Krankheitsbildes bei Sepsis­ und SIRS­Patienten konnte jedoch nicht festgestellt werden
(FISHER et al. 1994; OPAL et al. 1997; REINHART u. KARZAI 2001). Um in der
hypoinflammatorischen Sekundärphase der Sepsis das Immunsystem zu aktivieren, wurden
immunstimulierende Mediatoren wie IFN­γ und G­CSF (Granulozyten­Kolonie­
stimulierender Faktor) appliziert, was mit einer geringfügig verbesserten Überlebensrate
verbunden war (VINCENT et al. 2002).

Literaturübersicht 53
Ein erfolgversprechender Therapieansatz ist die Gabe von aktiviertem Protein C. Protein C ist
ein von der Leber gebildetes Glycoprotein, das im Blutplasma nachgewiesen werden kann
und durch die Reaktion mit Thrombin aktiviert wird. Als Serin­Protease baut es die aktiven
Formen der Gerinnungsfaktoren V und VIII ab. Seine antiinflammatorische Wirkung macht
es als Therapeutikum in der Sepsisbehandlung interessant. Aktiviertes Protein C (APC)
hemmt die Synthese von TNF­α, IL­1 und IL­6 in Monozyten und reduziert die Adhäsion der
neutrophilen Granulozyten an den Endothelzellen (HEALY 2002). Im Verlauf einer Sepsis
werden einerseits große Mengen an Protein C verbraucht, andererseits wird seine Synthese
eingeschränkt. Geringe APC­Konzentrationen korrelieren mit einem schlechten Outcome,
wohingegen APC­behandelte Gruppen in Tiermodellen eine verbesserte Überlebensrate auf­
wiesen (HEALY 2002), was in klinischen Studien bestätigt wurde (BERNARD et al. 2001).
Neben den Zytokinen, die von den Zellen des Immunsystems synthetisiert werden, besitzen
auch Spaltprodukte des Komplementsystems wie C5a eine proinflammatorische Wirkung.
C5a ist ein stark wirksames Chemokin, das neutrophile Granulozyten und Makrophagen
aktiviert. Zusätzlich erhöht es die endotheliale Permeabilität und bewirkt eine Vasodilatation.
Da das Komplementsystem schon in einer frühen Phase der Sepsis aktiviert wird, können sich
große Mengen dieser Spaltprodukte bilden, woraus eine nicht regulierbare Hyperaktivität des
Immunsystems folgt (HUBER­LANG et al. 2001). C5a bindet an den Rezeptor C5aR, der
sich auf verschiedenen Zelltypen befindet und während der Sepsis vor allem in Lunge, Leber,
Niere und Herz induziert wird. Antiseren gegen C5a oder gegen seinen Rezeptor stellen in
Tiermodellen eine wirksame Behandlungsstrategie dar, die das Outcome verbessern konnte
(RIEDEMANN et al. 2002). So wurden Antiseren gegen C5a erfolgreich bei einer klinischen
Ischämie­Reperfusions­Studie eingesetzt (FITCH et al. 1999).
Eine weitere Therapiemöglichkeit betrifft die Regulation der Apoptose durch Apoptose­
Inhibitoren bei Sepsis­ und SIRS­Patienten. Während einer Sepsis durchlaufen eine große
Zahl von Lymphozyten und Zellen des lymphatischen Gewebes den programmierten Zelltod,
während neutrophile Granulozyten eine verzögerte Apoptose zeigen. Die erhöhte
Konzentration an neutrophilen Granulozyten führt zu vermehrten Gewebeschäden, während
die gesteigerte Depletion der immunkompetenten Lymphozyten ein Grund für die

Literaturübersicht 54
Immunsuppression in der zweiten Phase der Sepsis darstellt (OBERHOLZER et al. 2001). In
Tiermodellen konnte nachgewiesen werden, dass sich die Prognose bei einer Sepsis
verbesserte, wenn entweder eine vermehrte Expression von Apoptose­verhindernden
Proteinen wie zum Beispiel Bcl­2 vorhanden war oder Caspasen gehemmt wurden. Durch
beide Mechanismen nahm die Apoptose der Lymphozyten ab und die Überlebensrate der
Tiere stieg an (HOTCHKISS et al. 1999b).
Darüber hinaus kann die selektive Inhibition von Adhäsionsmolekülen, die für die
Neutrophilenmigration von Bedeutung sind, einen neuen Therapieansatz darstellen. Erste
Therapieansätze waren monoklonale Antikörper gegen Integrin­Adhäsionsmoleküle
neutrophiler Granulozyten (Anti­CD18, Anti­CD11b) (WINN et al. 1993; TALBOTT et al.
1994) und die Inhibition von L­Selektin, das für das „Rolling“der neutrophilen Granulozyten
an den Endothelzellen verantwortlich ist. Mit monoklonalen Antikörpern gegen L­Selektin
EL­246 (VAN GRIENSVEN 1999a), DREG­200 (MA et al. 1993) und CY­1747 (RUBIO­
AVILLA et al. 1997) konnten gute Erfolge erzielt werden, wobei allerdings bei mehrfacher
Applikation eines monoklonalen Antikörpers eine Anti­Antikörper­Reaktion auftreten kann.
Eine längerfristige Behandlung eines Patienten mit einem monoklonalen Antikörper über
mehrere Tage oder eine wiederholte Applikation bei Auftreten von Organdysfunktionen wäre
wahrscheinlich nicht mehr effektiv, sondern würde den Patienten eventuell zusätzlich
belasten. Zudem besteht die Gefahr einer allergischen Reaktion auf das Fremdeiweiß.
Die genannten Einschränkungen gelten nicht für neu entwickelte Selektinantagonisten wie
Bimosiamose, die den Sialyl­Lewis x ­Einheiten in ihrem Aufbau gleichen und als
niedermolekulare Substanzen zu keiner Anti­Antikörper­Reaktion führen können.
2.10 Immunmodulation mit Bimosiamose (TBC1269)
Wie bereits erwähnt, ist ein Therapieansatz bei der Behandlung von SIRS und MODS die
Hemmung der endothelialen Adhäsion und Extravasation von neutrophilen Granulozyten, die
einen wesentlichen Beitrag zur Pathogenese dieser Syndrome leisten (Kapitel 2.3 Neutrophile

Literaturübersicht 55
Granulozyten). Bimosiamose ist ein Selektinantagonist, der die Bindung der Sialyl­Lewis x ­
Einheiten an Selektine verhindert. Wie in den Kapiteln 2.3.1 und 2.3.2 beschrieben, werden
drei verschiedene Selektine unterschieden, die für die erste Phase der Extravasation, dem
„Rolling“, verantwortlich sind. E­ und P­Selektine werden von aktivierten Endothelzellen
exprimiert, wobei sich P­Selektine auch auf aktivierten Thrombozyten befinden. L­Selektine
sind auf neutrophilen Granulozyten, Monozyten und auf großen Teilen von B­ und T­
Lymphozyten und NK­Zellen nachweisbar. Die Selektine binden an Sialyl­Lewis x –Einheiten
(sLe x ) und an andere Oligosaccharide, die sich auf der Oberfläche von neutrophilen
Granulozyten, Monozyten, einigen T­Lymphozyten, eosinophilen und basophilen Granulo­
zyten sowie auf Endothelzellen befinden (PHILLIPS et al. 1990; FOXALL et al. 1992).
In der Vergangenheit konnten die Strukturelemente der sLe x , die für die Bindung an Selektine
verantwortlich sind, identifiziert werden (DEFREES et al. 1993; RAMPHAL et al. 1994;
STAHL et al. 1994). Schon vor der Entwicklung von Bimosiamose gab es
Selektinantagonisten, die überwiegend aus Oligosacchariden (HIRUMI et al. 1996; DEKANY
et al. 1997; YOSHINO et al. 1997) oder glycosylierten Peptiden (CAPPI et al. 1996; WU et
al. 1996) bestanden. Die Anwendbarkeit dieser Selektinantagonisten war durch mehrere
Nachteile, u.a. durch eine geringe Stabilität und eine kurze pharmakokinetische Halbwertzeit,
jedoch sehr beschränkt.
Die Struktur von Bimosiamose besteht hingegen aus zwei Mannoseresten und zwei
Carboxylgruppen, die als Molekül der Struktur der dimeren sLe x gleichen (ONAI et al. 2003).
Bimosiamose ist ein relativ kleines Molekül mit einem Molekulargewicht von 862,93 g/mol.
Im Vergleich zu anderen Selektinantagonisten besitzt es eine höhere chemische und
thermische Stabilität. Ferner ist die synthetische Herstellung einfacher und mit geringeren
Kosten verbunden (DUPRE et al. 1996).

Literaturübersicht 56
Abbildung 5: Struktur von Bimosiamose (TBC1269) (1,6­Bis [3­(3­carboxymethylphenyl)­4­
(2­α­D­mannopyranosyloxy)­phenyl] hexan).
Das Di­Natrium­Salz der freien Säure TBC1269 ist TBC1269Z; beide Verbindungen werden
als Bimosiamose bezeichnet. Als Lösungsmittel für Bimosiamose, das in Form von
kristallinem, weißem Pulver vorliegt, wird ein Citratpuffer verwendet. Die in dieser Arbeit
gewonnenen Daten wurden mit der Salzform des TBC1269 erhoben.
Bimosiamose bewirkt eine kompetitive Hemmung der Bindung von sLe x an E­, P­ und L­
Selektine (KOGAN et al. 1998; DAVENPECK et al. 2000; ONAI et al. 2003), wobei die
Bindung an P­Selektin am stärksten gehemmt wird (DAVENPECK et al. 2000). Die
Bindungsstärke von Bimosiamose an die Selektine ist dabei höher als von ihren natürlichen
Liganden, den Sialyl­Lewis x ­Einheiten (KOGAN et al. 1998). Im Vergleich der
verschiedenen Leukozytensubpopulationen wird die Adhäsion von neutrophilen Granulozyten
an P­Selektin stärker gehemmt als von eosinophilen Granulozyten, was auf eine
unterschiedliche Bindungsfähigkeit und ­stärke der Leukozytenklassen an P­Selektin
zurückzuführen ist (DAVENPECK et al. 2000).
Neben der Sepsis können weitere Erkrankungen, die im Zusammenhang mit
Gewebsentzündungen durch aktivierte neutrophile Granulozyten entstehen, mit
Selektinantagonisten wie Bimosiamose behandelt werden. Bei Erkrankungen wie Psoriasis,
atopischer Dermatitis, Asthma, rheumatoider Arthritis und beim Ischämie­
Reperfusionsschaden nach Organtransplantationen oder Cardio­Pulmonaren­Bypass­

Literaturübersicht 57
Operationen soll die Substanz Bimosiamose eine positive Wirkung zeigen (TODDERUD et
al. 1997; RAMOS­KELLY et al. 1999 u. 2000) . In mehreren Tiermodellen konnte eine
Verminderung des Ischämie­Reperfusionsschadens nachgewiesen werden (PALMA­
VARGAS et al. 1997; ONAI et al. 2003). Eine Behandlungsstrategie des allergischen
Asthmas wurde von ABRAHAM et al. (1999) in einem Schafmodell dargestellt.
Das Ziel der vorliegenden Arbeit ist die Beschreibung des Einflusses von Bimosiamose auf
die Neutrophilenmigration sowie auf die Entwicklung eines MODS im „two­hit“­Modell der
Maus. Verschiedene Plasma­ und Gewebeparameter dienen dabei zur Darstellung der
Neutrophilenaktivität, der Aktivierung des Immunsystems und der Quantifizierung des
Endothelschadens. Zur Dokumentation der entstandenen Organschäden erfolgt außerdem eine
histologische Untersuchung von Leber, Lunge, Niere und Milz.

Fragestellung 58
3 Fragestellung
Aus der auf Literaturstudien basierenden Einleitung geht hervor, dass die Mechanismen, die
bei Polytrauma­ und Sepsispatienten zum MODS führen, sehr komplex und von vielen
Faktoren abhängig sind. Das in dieser Studie verwendete „two­hit“­Modell ist ein
reproduzierbares Kleintiermodell des traumainduzierten prolongierten Organversagens, das
die klinische Situation polytraumatisierter Patienten realitätsnah simuliert. An der induzierten
systemischen Immunantwort sind vor allem neutrophile Granulozyten, Endothelzellen und
Zytokine beteiligt. Neutrophile Granulozyten sind die Schlüsselzellen des SIRS und MODS,
ihre Interaktion mit den Endothelzellen wird über L­Selektin vermittelt. Mit Hilfe der
Zytokine werden die weiteren Schritte der B­ und T­Zell­Antwort induziert, als Chemokine
locken sie zusätzlich phagozytierende Zellen zum Ort der Entzündung.
Im Rahmen dieser Arbeit werden die Auswirkungen des Selektinantagonisten Bimosiamose
auf den Verlauf der Sepsis / MODS beobachtet und folgende Fragestellungen bearbeitet.
1. Besitzt Bimosiamose einen positiven Einfluss auf die Überlebensrate in einem Trauma­
Modell?
2. Werden die klinischen Untersuchungsparameter in diesem Modell durch Bimosiamose
positiv beeinflusst?
3. Besitzt Bimosiamose in dem vorgestellten Versuchsmodell einen positiven Einfluss auf
das supprimierte Immunsystem?
4. Beeinflusst Bimosiamose die Zusammensetzung der immunkompetenten Zellen im Blut
nach dem „second­hit“ bzw. einer Scheinoperation?
5. Wie beeinflusst Bimosiamose das Zytokinfreisetzungsmuster im Blut nach dem „second­
hit“ bzw. einer Scheinoperation?
6. Übt Bimosiamose einen Einfluss auf die Apoptoserate der T­Lymphozyten nach dem
„second­hit“ bzw. einer Scheinoperation aus?
7. Kann Bimosiamose der Organpathologie vorbeugen?

Material und Methoden 59
4 Material und Methoden
4.1 Material
4.1.1 Chemikalien und Medikamente
• Aceton (Sigma Aldrich Chemie GmbH, Steinheim)
• Annexin V (Bender MedSystems GmbH, Wien, Österreich)
• Antikörper, monoklonal gegen CD4, CD8 und Ly 49 (Bender MedSystems GmbH, Wien,
Österreich)
• Bimosiamose (TBC1269) (Revotar Biopharmaceuticals AG, Henningsdorf)
• Desinfektionsmittel Softasept® (B. Braun Melsungen AG, Melsungen)
• FACS­Bindungspuffer (Bender MedSystems GmbH, Wien, Österreich)
• Formalin (Merck AG, Darmstadt)
• Heparinlösung (Liquemin® N 25000) (Hoffmann­La Roche AG, Grenzach­Wyhlen)
• Ketamin­Lösung (Ketanest®) (Parke­Davis GmbH, Karlsruhe)
• Metamizol (Novalgin®, Aventis Pharma Deutschland GmbH, Bad Soden a. Ts.)
• Natriumchloridlösung 0,9 % (B. Braun Melsungen AG, Melsungen)
• Olivenöl, natives (EuAB, Zentralapotheke MHH, Hannover)
• Ringer­Lactat­Lösung (B. Braun Melsungen AG, Melsungen)
• Stickstoff (Linde AG, Geschäftsbereich Linde Gas, Hannover)
• Waschlotion Bactolin® basic (Bode Chemie, Hamburg)
• Xylazin­Lösung (Rompun® 2 %) (Bayer AG, Leverkusen)
Allgemeine Laborchemikalien (u.a. verschiedene Salze für Pufferlösungen) wurden in
handelsüblicher p.A.­Qualität (Sigma­Aldrich Chemie GmbH, Steinheim) bezogen.

Material und Methoden 60
4.1.2 Geräte
• Digitalthermometer (Greisinger electronic GmbH, Bonn)
• Durchflusszytometer FACScalibur (Becton Dickinson Biosciences GmbH, Heidelberg)
• Einbettungsautomat mit Einkammersystem (Shandon, Frankfurt)
• Feinwaage A 120 S (Sartorius AG, Göttingen)
• Kühlzentrifuge (Heraeus GmbH, Hanau)
• Mikroskop (Carl Zeiss AG, Jena)
• Photometer Biophotometer (Eppendorf AG, Hamburg)
• Photometer Ultrospec 2000 (Pharmacia Biotech, Cambridge, England)
• Präzisionsmikrometer (Oditest Kroeplin, Berlin)
• Rotationsmikrotom (Cambridge Instruments, Nussloch)
• Rüttler Typ VF 2 (Janke & Kunkel, IKA Labortechnik, Staufen i. Br.)
• Schermaschine (Aesculap Typ H 585)
• Tischzentifuge (Heraeus GmbH, Hanau)
• Ultraschallhomogenisator Sonoplus GM 2070 (Bandelin­Electronic, Berlin)
• Waage (Mettler­Waagen GmbH, Gießen)
• Zentrifuge 3200 (Eppendorf AG, Hamburg)
4.1.3 Verbrauchsmaterialien
• Cytometric Bead Array (Zytokin­CBA) (Becton Dickinson Biosciences GmbH,
Heidelberg)
• Einmalhandschuhe, unsteril (Kimberly Clark, Roswell, USA)
• FACS­Röhrchen, 5 ml (Sarstedt AG & Co., Nürnbrecht)
• Faden Prolene®, 1,5 metric (Ethicon GmbH, Norderstedt)
• Faden Mersilene®, Polyester, geflochten, steril, 4 metric (B. Braun Melsungen AG,
Melsungen)
• Hämatokrit­Glaskapillare (Sarstedt AG & Co., Nürnbrecht)

Material und Methoden 61
• Kanülen (26G, 24G und 21G) (B. Braun Melsungen AG, Melsungen)
• Kompressen, 10 x 20 cm (Lohmann & Rauscher International GmbH & Co.KG,
Neuwied)
• Kryoröhrchen mit Schraubdeckel (Nunc GmbH & Co.KG, Wiesbaden)
• Pipettenspitzen (Sarstedt AG & Co., Nürnbrecht)
• Reaktionsgefäße, 1,5 ml (Sarstedt AG & Co., Nürnbrecht)
• Skalpellklingen No. 11 (Feather Industries Limited, Tokyo, Japan)
• Spritzen (1 ml und 2 ml) (B. Braun Melsungen AG, Melsungen)
• Zentrifugenröhrchen, 15 ml (Greiner GmbH, Nürtingen)
4.2 Methoden
4.2.1 Versuchstiere
Die Studie wurde an männlichen Wildtypmäusen (C57Bl/6­Mäuse) durchgeführt. Das
mittlere Körpergewicht betrug 19 ± 1,6 g.
Die Tiere wurden im Zentralen Tierlabor der Medizinischen Hochschule Hannover gezüchtet
und untergebracht, wo sie Zugang zu pelletierter Standardnahrung (Altromin 1324, Lage,
Deutschland) und Wasser ad libitum hatten. Zwei Tage vor Versuchsbeginn wurden sie zur
Gewöhnung im Labor bei einem normalen circadianen Rhythmus mit Tageslicht in Typ­III­
Käfigen (810 cm 2 Grundfläche) bei einer Gruppengröße von maximal sechs Tieren bei 20 ± 2
°C gehalten.
Die durchgeführten Versuche wurden von der Bezirksregierung Hannover unter dem
Aktenzeichen 05/1034 genehmigt.

Material und Methoden 62
4.2.1.1 Versuchstiergruppen
Die Mäuse wurden in zwei Versuchsreihen (Überlebenszeit 48 bzw. 96 Stunden), die jeweils
aus sechs Tiergruppen bestanden, randomisiert eingeteilt (Tabelle 2). Die Gruppen eins und
zwei beider Versuchsreihen dienten als Kontrollgruppen. An ihnen wurde nur eine
Laparotomie ohne weitere Manipulation (Sham, Scheinoperation) durchgeführt. Bei den
Gruppen drei und vier wurde ausschließlich eine Sepsisinduktion mittels coecaler Ligatur und
Punktion (CLP, „second­hit“) vorgenommen. An den Tieren der Gruppen fünf und sechs
wurde der „first­hit“ durch einen traumatisch­hämorrhagischen Schock induziert. Zwei Tage
später erfolgte bei diesen Tieren der „second­hit“. In der Reihe 1 wurde die Tötung der Mäuse
48 Stunden nach der CLP bzw. Scheinoperation durchgeführt. Die Tiere der Reihe 2 wurden
96 Stunden nach den genannten Eingriffen getötet.
Die Gruppen eins, drei und fünf beider Versuchsreihen erhielten als Intervention eine Stunde
nach der CLP bzw. Scheinoperation das Medikament Bimosiamose in einer Dosierung von 5
mg/kg Körpergewicht intravenös in die ventrale Schwanzvene injiziert, während bei den
Gruppen zwei, vier und sechs beider Versuchsreihen das Vehikel dieses Medikaments in einer
äquivalenten Menge intravenös verabreicht wurde.

Material und Methoden 63
Tabelle 2: Gruppeneinteilung der Versuchstiere
Reihe Gruppe n FemurHämor­ CLP Sham TBC Vehikel Tötung Gruppenname
frakturrhagie 1269 nach Std.
I 1 9 × × 48 Sham­TBC­48
2 6 × × 48 Sham­s­48
3 6 × × 48 CLP­TBC­48
4 11 × × 48 CLP­s­48
5 11 × × × × 48 2hit­TBC­48
6 7 × × × × 48 2hit­s­48
II 1 9 × × 96 Sham­TBC­96
2 9 × × 96 Sham­s­96
3 11 × × 96 CLP­TBC­96
4 12 × × 96 CLP­s­96
5 7 × × × × 96 2hit­TBC­96
6 11 × × × × 96 2hit­s­96
mit n = Anzahl der Tiere einer Gruppe
CLP = coecale Ligatur und Punktion
Sham = Scheinoperation
TBC1269 = Bimosiamose
× = durchgeführte Eingriffe und Substanzapplikationen der jeweiligen
Versuchsgruppe.
4.2.2 „First­Hit“
Der „first­hit“, der bei den Gruppen fünf und sechs beider Versuchsreihen durchgeführt
wurde, bestand aus einer geschlossenen Fraktur des linken Femurs und einer einstündigen
Hypovolämiephase, die sich an die Frakturversorgung anschloss. Hierbei wurden 60 % des
Blutvolumens aus dem retrobulbären Venenplexus entnommen. Anschließend erfolgte die
Reperfusion. Die Mäuse blieben während des gesamten Eingriffs anästhesiert und wurden
durch eine Wärmelampe vor Auskühlung geschützt.

Material und Methoden 64
4.2.2.1 Femurfraktur
Die Mäuse wurden bei erhaltener Spontanatmung mit 100 mg/kg Körpergewicht (KGW)
Ketaminhydrochlorid und 5 mg/kg KGW Xylazin narkotisiert. Die Verabreichung der
Medikamente erfolgte mittels einer Mischspritze durch subkutane Injektion in die
Nackenfalte. Nach Eintritt der Anästhesie wurde mit einer nach Hiltunen modifizierten
Femurfrakturmaschine mit einem standardisierten Gewicht von 400 g der linke Femurschaft
des Tieres frakturiert (HILTUNEN et al. 1993). Die Fraktur wurde anschließend geschlossen
reponiert und mit einer Schiene versorgt.
4.2.2.2 Hämorrhagischer Schock
Unmittelbar nach der Frakturversorgung erfolgte die Blutentnahme durch Punktion des
retrobulbären Venenplexus. Das Blut wurde über einer Waage aufgefangen, so dass das
abzunehmende Blutvolumen direkt ermittelt werden konnte. Die Menge des abzunehmenden
Blutvolumens war vom Körpergewicht abhängig und wurde anhand der folgenden Formel
bestimmt:
⎛ Körpergewicht
in g
⎞
60 % des Blutvolumens
in mg = ⎜
⋅ 600 − 20 μl ⋅1,1mg/
μl
33,3 g/mg
⎟
⎝
⎠
Formel 1: Formel zur Berechnung des abzunehmenden Blutvolumens
mit 33,3 = Hämatokrit
600 = 1000 : 60, wobei 1000 = Umrechnung der ml in µl und 60 =
60 % des Blutvolumens
20 µl = Volumen der Hämatokrit­Glaskapillare (steht dem
Wiegevorgang nicht zur Verfügung)
1,1 mg/µl = Dichtefaktor des Blutes.
Durch intravenöse Volumensubstitution mit einer kristalloiden Lösung (Natriumchloridlösung
0,9 %) in vierfacher Menge des entnommenen Blutvolumens wurde der hypovolämische
Zustand nach einer Zeitdauer von 60 Minuten beendet. Für die Volumensubstitution über die

Material und Methoden 65
Schwanzvene wurde eine Feindosierungsspritze mit einer 26G­Kanüle verwendet. Nach dem
Experiment wurden die Mäuse bis zum Erwachen aus der Narkose unter einer Wärmelampe
gehalten und bei Eintritt einer eingeschränkt vorhandenen körperlichen Aktivität in ihre
Käfige umgesetzt. Die Tiere reagierten zu diesem Zeitpunkt auf Zuwendung und zeigten
häufige Aktivitätspausen.
4.2.3 Coecale Ligatur und Punktion (CLP, „second­hit“)
Die Induktion einer polymikrobiellen Sepsis wurde bei den Tiergruppen drei bis sechs beider
Versuchsreihen durchgeführt. Bei den Gruppen fünf und sechs erfolgte die CLP 48 Stunden
nach Auslösung des traumatisch­hämorrhagischen Schocks, während bei den Gruppen drei
und vier auf den vorangehenden „first­hit“ verzichtet wurde.
Die Mäuse wurden nach der unter 4.2.2.1 genannten Methode narkotisiert und in Rückenlage
fixiert. Nach Rasur, Reinigung (Bactolin® basic Waschlotion) und Desinfektion (Softasept®)
der Abdominalregion wurde unter sterilen Bedingungen die Haut und die Bauchmuskulatur in
der Medianen mit einem Skalpell in kraniokaudaler Richtung 1­1,5 cm durchtrennt. Mit Hilfe
einer anatomischen Pinzette wurde das Coecum aufgesucht, mobilisiert und die Regio
ileocoecalis dargestellt. Distal der Valva ileocoecalis wurde das Coecum mit einem
Polyesterfaden ligiert, ohne die Darmkontinuität zu unterbrechen. Im weiteren Verlauf wurde
der ligierte Coecumanteil an der mesenteriumfernen Seite einmal mit einer 21G­Nadel
punktiert und vorsichtig coecaler Inhalt in diese Wunde vorgeschoben, um ein Offenhalten
der Punktionsstelle zu erreichen. Nach Rückverlagerung des Coecums und intraperitonealer
Applikation von 1 ml NaCl­Lösung (0,9 %) wurde das Abdomen zweischichtig verschlossen.
Die Betreuung der Mäuse post operationem wurde nach dem unter 4.2.2.2 beschriebenen
Verfahren durchgeführt.
An den Tiergruppen eins und zwei beider Versuchsreihen wurde ausschließlich eine
Scheinoperation durchgeführt. Dabei wurden Anteile des Dünn­ und Dickdarms mit einer
anatomischen Pinzette mobilisiert und aus der Operationswunde auf eine mit

Material und Methoden 66
Natriumchloridlösung befeuchtete Kompresse vorgelagert. Nach Zurückverlagerung der
Organe in die Bauchhöhle wurde wie bei der CLP eine intraperitoneale Applikation von 1 ml
NaCl­Lösung (0,9 %) vorgenommen. Der Wundverschluss und die postoperative Betreuung
erfolgte wie bei den CLP­Tieren.
4.2.4 Bimosiamose­Medikation
Bei den Gruppen eins, drei und fünf beider Versuchsreihen erfolgte 60 min nach der CLP
bzw. Scheinoperation die intravenöse Applikation von Bimosiamose (TBC 1269Z) in einer
Dosierung von 5 mg/kg Körpergewicht in die Schwanzvene. Da die Stammlösung eine
Konzentration von 100 mg/ml besaß, wurde diese im Verhältnis von 1 zu 100 mit isotoner
Natriumchloridlösung verdünnt. In Abhängigkeit des Körpergewichts der Maus wurde dem
Tier die entsprechende Menge der Substanzverdünnung zusammen mit Natriumchloridlösung
(0,9 %) intravenös verabreicht. Die injizierte Flüssigkeitsmenge betrug zusammen 1 ml. Die
Applikation erfolgte noch unter Narkose.
Den Tieren der Gruppen zwei, vier und sechs wurde zur Simulation der Bimosiamose­Gabe
äquivalent das Vehikel und isotone Natriumchloridlösung injiziert.
Die Substanz Bimosiamose (TBC 1269) sowie ihr Vehikel wurden von der Firma Revotar
Biopharmaceuticals AG, Hennigsdorf, hergestellt.
4.2.5 Aufrechterhaltung der Analgesie
Die analgetische Behandlung der Mäuse erfolgte bei den Gruppen eins bis vier beider
Versuchsreihen ab dem Tag der coecalen Ligatur und Punktion bzw. der Scheinoperation. Die
Analgesie der Gruppen fünf und sechs wurde ab dem Tag der Fraktur/Hämorrhagie („first­
hit“) vorgenommen. Die Tiere erhielten bis zum Ende der Versuchsreihe täglich Metamizol,
das dem Trinkwasser in analgetischer Dosis (30 mg/kg Körpergewicht) zugesetzt wurde. Bei

Material und Methoden 67
einem mittleren Metamizolbedarf von 0,6 mg pro Maus, einem durchschnittlichen
Trinkverhalten von 2 ml/d sowie einem Trinkflaschenvolumen von 500 ml ergeben sich 150
mg Metamizol pro Trinkflasche.
4.2.6 Klinische Untersuchungsparameter
Die Erhebung der klinischen Basiswerte von Mortalität, Körpergewicht, Körperinnentempera­
tur und Aktivität der Tiere begann morgens einen Tag vor dem eigentlichen Versuchsbeginn
und wurde im Abstand von 24 Stunden bis zum Abschluss der Versuche wiederholt.
Komplikationen bei der Wundheilung und weitere Besonderheiten wurden dokumentiert. Die
rektale Körpertemperatur (°C) wurde mit einem digitalen Thermometer über eine bimetallene
Nickel/Chromnickel­Temperatursonde gemessen (Messgenauigkeit: 0,1 °C). Das
Körpergewicht der Mäuse wurde mit einer Waage überprüft. Ausgewertet wurde die
Differenz des aktuellen Körpergewichts im Vergleich zum Gewicht bei Versuchsbeginn.
Die Beurteilung der Aktivität fand täglich morgens zu einem Zeitpunkt statt, bevor weitere
Stressoren auf die Tiere eingewirkt hatten. Der individuelle Aktivitätslevel der Mäuse wurde
anhand definierter Verhaltensmerkmale erhoben (Tabelle 3).
Tabelle 3: Aktivitätseinteilung der Mäuse.
Level Qualität Verhaltensmerkmale
6 sehr aktiv Kräftig, neugierig, schnelle Bewegungen
5 aktiv Neugierig, schnell, vereinzelte Aktivitätspausen
4 eingeschränkt aktiv Häufige Aktivitätspausen, reagiert auf Zuwendung
3 ruhig Desinteressiert an Umwelt, selten aktiv, schläfrig
2 lethargisch Keine Aktivität, Verharren in einer Position, keine
Nahrungsaufnahme
1 moribund Keine Aktivität, Vitalfunktionen (z.B. Atmung) deutlich
reduziert, Tod zu erwarten

Material und Methoden 68
4.2.7 Messung der T­Zell­vermittelten Typ­IV­Reaktion
Zur Untersuchung von immunmodulatorischen Einflüssen von Bimosiamose auf das zelluläre
Immunsystem wurde bei den Mäusen eine T­Zell­vermittelte Typ­IV­Reaktion durch eine
epikutane Kontaktsensibilisierung provoziert. Alle Tiere wurden dazu 24 Stunden vor
Versuchsbeginn mittels Applikation von 50 µl 2,4­Dinitrofluorbenzen (DNFB) 1 % epikutan
am rasierten Rücken sensibilisiert und die Basiswerte der Ohrdicke mit einem
Präzisionsmikrometer erhoben.
Der zweite Antigenkontakt erfolgte 24 bzw. 72 Stunden nach CLP bzw. Scheinoperation mit
50 µl DNFB 0,5 % epikutan an der Rückseite des rechten Ohrs. Nach weiteren 24 Stunden
wurde die Ohrdicke erneut bestimmt. Die Zunahme der Immunantwort von den
Bimosiamose­ und den Vehikel­behandelten Tieren wurde anschließend bestimmt und
miteinander verglichen.
Die Zunahme der Ohrdicke ist bedingt durch eine inflammatorische Ödemreaktion. DNFB
kann aufgrund seines niedrigen Molekulargewichts durch die Haut diffundieren, bewirkt aber
allein keine Sensibilisierung von T­Lymphozyten. Erst durch die Fähigkeit zur Bildung von
Proteinkonjugaten kann dieses Hapten Lymphozyten stimulieren (KLEIN 1991a).
Die Basis der verwandten Lösung bestand aus Aceton und nativem Ölivenöl im Verhältnis
von 4 ml zu 1 ml. Für eine 1%ige DNFB­Lösung wurden 50 µl DNFB und für eine 0,5%ige
Lösung 25 µl DNFB mit der Lösungsbasis verdünnt.
4.2.8 Blut­ und Organentnahme
Die Tötung der Tiere erfolgte 48 bzw. 96 Stunden nach CLP/Scheinoperation. Nach
Einleitung der Ketamin/Xylazin­Narkose wurden die Mäuse in Rückenlage fixiert. Nachdem
eine mediane Relaparotomie durchgeführt worden war, konnte der Brustkorb eröffnet werden.
Dazu wurde das Zwerchfell vom Abdomen aus von Brustbein und Rippen abgetrennt, die

Material und Methoden 69
Rippen in caudocranialer Richtung im Schaftbereich durchtrennt und das Brustbein mit den
costalen Anteilen nach cranial verlagert. Die Blutentnahme erfolgte durch kardiale Punktion
(Tötung der Tiere durch Exsanguation), wobei ca. 0,8 ml Blutvolumen pro Tier gewonnen
werden konnte. Die vorzeitige Gerinnung des Bluts konnte mit Hilfe eines mit Heparin
gefüllten Spritzenkonus verhindert werden. Die Zentrifugation des Vollbluts erfolgte über 2,5
min bei Raumtemperatur bei 13.000x g. Das Plasma wurde zur späteren Zytokin­ und
Proteinbestimmung bei –80 °C eingefroren. Die festen Bestandteile des Bluts wurden mit 1
ml isotoner Natriumchloridlösung resuspendiert, auf Eis gelagert und zur Phänotypisierung
von CD4 + , CD8 + sowie NK­Zellen und zur Quantifizierung der Apoptoserate verwendet.
Ein Leberlappen, die Milz und beide Nieren wurden entfernt und bis zur histologischen
Aufarbeitung in 5%iger phosphatgepufferter Formalinlösung aufbewahrt. Die Trachea wurde
bis zum Kehlkopf dargestellt und das Herz­Lungen­Paket entnommen. Zur Durchführung der
bronchoalveolären Lavage wurde eine stumpfe 23G­Kanüle in die Trachea bis zur Bifurcatio
tracheae vorgeschoben und ligiert. Anschließend wurde 1 ml sterile Kochsalzlösung (NaCl
0,9 %) in die Lunge infundiert. Beim Absaugen der Lavageflüssigkeit konnte durchschnittlich
70 % dieser Flüssigkeit zurückgewonnen werden. Die Lavageflüssigkeit wurde in
Flüssigstickstoff schockgefroren und bis zur weiteren Bearbeitung bei –80 °C aufbewahrt. Sie
diente zur Messung der Akkumulation neutrophiler Granulozyten in der Lunge (Kapitel 4.4
Myeloperoxidase in der bronchoalveolären Lavage). Im Anschluss fand eine intra­alveoläre
Fixierung und Aufbewahrung des Organs bis zur histologischen Aufarbeitung in 5%iger
phosphatgepufferter Formalinlösung statt.

Material und Methoden 70
4.3 Durchflusszytometrie
4.3.1 Durchflusszytometrische Analyse von T­Lymphozyten
Der Nachweis und die Differenzierung bestimmter Subpopulationen sowie die Analyse
apoptotischer/nekrotischer T­Lymphozyten erfolgten mittels Durchflusszytometrie im
FACScalibur (FACS = Fluorescent­activated cell sorter).
Zu Beginn der Probenaufarbeitung wurde die Suspension aus Blutkörperchen und isotoner
Natriumchloridlösung in ein FACS­Röhrchen überführt und mit 14 ml Schwinzer­Lösung
(Zusammensetzung: 8,3 g Ammoniumchlorid, 1,0 g Kaliumkarbonat, 0,1 g EDTA ad 1 Liter
Aqua dest.) versetzt. Durch dieses hypotone Reagenz wurde eine Hämolyse der in der
FACScan­Analyse störenden Erythrozyten erreicht. Die Suspension wurde hierfür 15 min im
Kühlschrank bei 4 °C aufbewahrt. Nach Ablauf der Inkubationszeit erfolgte eine
Zentrifugation für 10 min bei 1.500 U/min und 4 °C. Der Überstand wurde anschließend
verworfen. Die Probe wurde in 1 ml PBS (Phosphate­buffered­saline) resuspendiert,
gewaschen und für 5 min bei 1.500 U/min zentrifugiert. Der Überstand wurde wiederum
dekantiert und die Probe mit 60 µl FACS­Bindungspuffer versetzt und gemischt. Von jeder
Probe wurden jeweils 15 µl in vier FACS­Röhrchen überführt.
In jedes Röhrchen wurden je 5 µl eines monoklonalen Antikörpers, der an einen bestimmten
Fluoreszenzfarbstoff konjugiert war, hinzugegeben. Mit Hilfe dieser Antikörper (Anti­CD­
AK) konnten spezifische Zelloberflächenantigene der T­Lymphozyten detektiert werden: das
CD4­Antigen der T­Helferzellen, das CD8­Antigen der zytotoxischen T­Zellen und das
CD56­Antigen der natürlichen Killerzellen.
• Röhrchen­Nr. 1 diente als Leerwert, es wurden keine Antikörper zugegeben.
• Röhrchen­Nr. 2 diente zur Bestimmung der Anzahl der CD4 + ­ und CD8 + ­Lymphozyten
sowie dem Anteil der Lymphozyten, der beide Oberflächenantigene exprimiert hatte. Es
enthielt Anti­Maus­CD4­Antikörper gekoppelt an Fluorescein Isothiocyanat (FITC) und
Anti­Maus­CD8­Antikörper + Phycoerythrin (PE).

Material und Methoden 71
• Röhrchen­Nr. 3 diente zur quantitativen Analyse der natürlichen Killerzellen und enthielt
Anti­Ly­49­Antikörper + FITC (das Anti­Ly­49 der Maus entspricht dem Anti­CD56­
Antikörper des Menschen).
• Röhrchen­Nr. 4 diente zur Analyse apoptotischer Zellen. Es enthielt 5 µl Annexin V
konjugiert an FITC und 5 µl Propidiumiodid (PI) (Kapitel 4.3.1.1 Analyse apoptotischer
T­Lymphozyten).
Die Röhrchen wurden für 30 min bei 4 °C inkubiert. Anschließend wurden die Zellen mit
PBS gewaschen und 5 min bei 1.500 U/min zentrifugiert. Nach Verwerfen des Überstandes
und Zugabe von 100 µl PBS als Messvolumen wurden die Zellsuspensionen bis zur
FACScan­Analyse im Dunkeln bei Kühlschranktemperatur aufbewahrt.
4.3.1.1 Analyse apoptotischer T­Lymphozyten
Die Analyse apoptotischer Zellen mittels Durchflusszytometrie erfolgte unter Verwendung
von Annexin V, das an das Fluorochrom FITC konjugiert war, und Propidiumiodid (Kapitel
2.5 Apoptose). Die Verwendung eines Annexin V­FITC­Assays gilt als zuverlässige und
reproduzierbare Methode zur Detektion apoptotischer Zellen (ANDREE et al. 1990) und
ermöglicht eine frühe Identifizierung apoptotischer Prozesse.
4.3.1.2 Durchführung der durchflusszytometrischen Analyse
Zur durchflusszytometrischen Untersuchung der Lymphozyten wurde ein FACScalibur
verwendet. Dies ist ein Meßsystem, das optische Signale, Streulicht und Fluoreszenz
einzelner, in einem Flüssigkeitsstrom fokussierter Partikel, analysiert. Die Zellsuspension
wird über ein Ansaugsystem zu einem Analysepunkt geleitet, den die Zellen als Einzelzellen
hintereinander passieren. Jede Zelle wird von einem fokussierten Lichtstrahl eines
Argonionlasers mit einer Wellenlänge von 488 nm beleuchtet und angeregt. Das optische
Detektionssystem quantifiziert die Fluoreszenz­ und Streulichtemissionen jeder einzelnen

Material und Methoden 72
Zelle. Der Farbstoff FITC ist im grünen, die Farbstoffe PE und PI im roten
Fluoreszenzspektrum detektierbar. Alle Farbstoffe lassen sich bei einer Wellenlänge von 488
nm zur Emission anregen.
Durch zwei Parameter der Lichtstreuung lassen sich die wichtigsten Leukozytengruppen
unterscheiden. Das Vorwärtsstreulicht (Forward Scatter = FSC) liefert Informationen über die
Zellgröße, das Seitwärtsstreulicht (Side Scatter = SSC) über die Granularität der Zellen.
Aufgrund des unterschiedlichen Zellaufbaus weist jede Subpopulation ein individuelles
charakteristisches Muster auf. Die Darstellung erfolgt im Punktehistogramm („dot plot“),
wobei jeweils der relative Anteil der Zellen angegeben wird. Für die Datenauswertung bei
dieser Studie war wichtig, dass die zu analysierende Zellpopulation ­ in diesem Fall waren es
die Lymphozyten – von anderen Zellen abgegrenzt wurde. Das Definieren dieses
Auswertungsfensters („gating“) bewirkte, dass bei der weiteren Analyse nur solche
Ergebnisse berücksichtigt wurden, die innerhalb des vorab definierten Bereichs lagen. Je
Probe wurden 5.000 Lymphozyten ausgezählt. Die Datenauswertung erfolgte mit dem
Programm WinMDI, Version 2.8.
Die Charakterisierung der CD4 + ­ und CD8 + ­T­Lymphozyten erfolgte anhand ihrer
Fluoreszenzintensitätsverteilung in der Zweifarbenimmunfluoreszenz (FL1­Kanal: Detektor
für FITC­markierte Proben, FL2­Kanal: Detektor für PE­markierte Proben). Bei der
Darstellung im „dot plot“ mit Anti­CD4­AK/FITC auf der Abszisse und Anti­CD8­AK/PE
auf der Ordinate lagen im rechten unteren Quadranten die CD4 + ­Zellen. Der linke obere
Quadrant enthielt die CD8 + ­Zellen.
Die CD56 + ­Zellen wurden im „dot plot“ auf der Ordinate gegen den Forward Scatter auf der
Abszisse aufgetragen. Von den eingegrenzten T­Lymphozyten stellten sich die CD56 + ­Zellen
in der oberen Hälfte des Histogramms dar.
Die Darstellung apoptotischer Zellen mit Annexin V­FITC/PI erfolgte ebenfalls im „dot plot“.
Mit Annexin V­FITC auf der Abszisse und dem Farbstoff Propidiumiodid auf der Ordinate
stellten sich die apoptotischen Zellen im rechten unteren Quadranten und die spät­

Material und Methoden 73
apoptotischen und nekrotischen Zellen im rechten oberen Quadranten dar. Der linke untere
Quadrant enthielt die lebenden Zellen.
4.3.2 Durchflusszytometrische Analyse von Zytokinen
In der vorliegenden Arbeit wurde eine Auswahl von Zytokinen (TNF­α, IL­6, IL­12p70,
MCP­1, IFN­γ und IL­10) im Plasma der Versuchstiere gemessen. Bis zur Analyse erfolgte
die Aufbewahrung des Plasmas bei –80 °C.
Im Gegensatz zur Analyse der Lymphozyten wurden keine Zellen, sondern „Beads“ (engl.:
Perle, Tropfen) gemessen. Die FACS­Analyse hat gegenüber einem herkömmlichen ELISA
(Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) mehrere Vorteile: Es wird nur ein Sechstel des
ursprünglichen Probenvolumens für die gleiche Anzahl an Ergebnissen benötigt, welche
außerdem in nur einem Durchlauf gemessen werden können. Zusätzlich ist die Genauigkeit
der Ergebnisse durch die Einzelbeadmessung größer als bei einem ELISA. Das Prinzip des
Cytometric Bead Arrays (CBA) besteht darin, dass die verschiedenen im Plasma enthaltenen
Zytokine mit Hilfe von spezifischen Antikörpern, denen am Fc­Teil ein „Bead“ angehängt ist,
für den Laserstrahl sichtbar gemacht werden. Je nach Zytokinzugehörigkeit besitzen diese
„Beads“ verschiedene Fluoreszenzintensitäten, um eine Unterscheidung zu ermöglichen. Ein
weiterer gegen das Zytokin gerichteter Detektionsantikörper ist an seinem Fc­Teil mit einem
PE­Farbstoff gekoppelt. Die Menge dieses Farbstoffes wird vom FACS­Gerät ermittelt, sie
verhält sich proportional zur vorhandenen Menge des Zytokins.
Die Darstellung der Messwerte erfolgte über einen angeschlossenen Computer mit dem
Programm Cell Quest Pro (BD Biosciences). Die mit Hilfe von rekombinanten Zytokinen
erstellten Standardkurven wurden als Regressionskurven mit dazugehörigen beschreibenden
Funktionen dargestellt. Mit Hilfe dieser Funktionen wurde die Serumkonzentration der
Zytokine in den Proben berechnet und anhand eines Punktediagramms („dot plot“) sowie in
tabellarischer Form dargestellt.

Material und Methoden 74
4.3.2.1 Durchführung der Messung
Der „Cytometric Bead Array“ besteht aus folgenden Reagenzien:
Mouse Inflammation Capture Beads: Jedes Gefäß enthält Antikörper, die gegen ein
bestimmtes Zytokin gerichtet sind. Um eine Unterscheidung zu ermöglichen, sind die
enthaltenen Antikörper an einen „Bead“ gekoppelt, welcher mit einer für das Zytokin
spezifischen Intensität fluoresziert. Die Zytokine sind in abnehmender Fluoreszenzstärke
geordnet (IL­6 > IL­10 > MCP­1 > IFN­γ > TNF­α > IL­12p70).
Mouse Inflammation Standards: Murine Zytokine enthaltende Flüssigkeit zur Erstellung einer
Standardreihe. Mit Hilfe dieser Standardreihe können Fluoreszenzintensitäten bei bestimmten
Zytokinkonzentrationen am Zytometer gemessen werden.
Cytometer Setup Beads: „Beads“ enthaltende Flüssigkeit zur Kalibrierung des Zytometers.
Mouse Inflammation PE Detection Reagent: Mit PE­Farbstoff konjugierte Antikörper, die
gegen die verschiedenen Zytokine gerichtet sind.
PE Positive Control Detector: Mit PE­Farbstoff konjugierte Antikörper zur anfänglichen
Einstellung des Zytometers.
FITC Positive Control Detector: Mit FITC­Farbstoff konjugierte Antikörper zur anfänglichen
Einstellung des Zytometers.
Verdünnungsflüssigkeit: Gepufferte Proteinlösung.
Waschpuffer: PBS­Lösung.

Material und Methoden 75
Durchführung:
Erstellung der Standardreihe: Der Mouse Inflammation Standard wurde mit 0,2 ml
Verdünnungsflüssigkeit versetzt. Die Inkubationszeit betrug 15 Minuten. Aus dieser Lösung
erfolgte die Erstellung einer Standardreihe mit den Verdünnungsstufen: Standard mit höchster
Konzentration, 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64, 1:128 und 1:256. Die Konzentrationen der
Standardreihe reichten von 5.000 pg/ml (Standard mit höchster Konzentration) bis zu 20
pg/ml (1:256). Als Negativkontrolle diente die Assay­Flüssigkeit.
Erstellung der „Mixed Capture Beads“: Da die verschiedenen Antikörper in unterschiedlichen
Gefäßen aufbewahrt wurden, mussten sie vor der Messung gemischt werden. Es wurde aus
allen Behältnissen jeweils die gleiche Menge Antikörperflüssigkeit entnommen (10 µl pro
Plasmaprobe, Standardlösung und Negativkontrolle) und in ein Röhrchen gegeben.
Plasmaproben: 50 µl der „Mixed Capture Beads“ und 50 µl Plasma wurden in die
verschiedenen Probenröhrchen gegeben. Danach erfolgte die Zugabe von 50 µl Mouse
Inflammation PE Detection Reagent, worauf sich eine Inkubation über zwei Stunden bei
Raumtemperatur im Dunkeln anschloß. Nach diesem Inkubationsschritt wurde jeweils 1 ml
Waschpuffer in die Röhrchen gegeben und diese wurden anschließend bei 200x g für 5 min
zentrifugiert. Der Überstand wurde vorsichtig abgesaugt und verworfen. Das „Bead“­Pellet
wurde in 300 µl Waschpuffer resuspendiert. Die Auswertung der Proben erfolgte mittels
Durchflusszytometrie. Die jeweilige Zytokinkonzentration im Serum wurde in pg/ml
berechnet.
4.4 Myeloperoxidase in der bronchoalveolären Lavage
Die Myeloperoxidase (MPO) befindet sich in den Lysosomen der neutrophilen Granulozyten
und ist ein wichtiger Bestandteil des „Respiratory Burst“ (Zerstörung der aufgenommenen
Bakterien durch Radikale). Die Akkumulation der neutrophilen Granulozyten im
Lungengewebe wurde anhand der MPO­Aktivität in der BAL gemessen, da der direkte

Material und Methoden 76
Zusammenhang zwischen der Anzahl der neutrophilen Granulozyten und der MPO­Aktivität
bewiesen ist (ALLAN et al. 1985).
100 µl der Lavageflüssigkeit wurden in ein Eppendorfröhrchen überführt und eine
Ultraschall­Homogenisation über 10 sec durchgeführt. Anschließend wurde die Probe 120
min bei 60 °C inkubiert. Die Myeloperoxidase ist hitzeresistent und wird im Gegensatz zur
„normalen“ Peroxidase, die bei diesem Verfahren zerstört wurde, nicht beeinträchtigt. Nach
dem Abkühlen auf Raumtemperatur wurde die Probenflüssigkeit in einer Photoküvette mit
100 µl Wasserstoffperoxid 3 %, 100 µl 0,1 M Kaliumphosphatpufferlösung und 100 µl o­
dianisidine­Hydrochlorid 1 % (Enzymsubstrat) versetzt. Die Myeloperoxidase reagierte mit
dem o­Dianisidin, so dass ein Farbumschlag entstand, der proportional zur MPO­Aktivität
war. Er konnte als Änderung der optischen Dichte bei 436 nm über drei Minuten gemessen
werden. Die Myeloperoxidase­Konzentration pro ml Lavageflüssigkeit konnte mit der
folgenden Formel errechnet werden.
Gemessene Extinktionsänderung
⋅100
= mU MPO/ml BAL/min
Anzahl der gemessenen Minuten
Formel 2: Formel zur Berechnung der MPO­Konzentration in der Lavageflüssigkeit
mit BAL = Bronchoalveoläre Lavage
MPO = Myeloperoxydase
mU = milliUnits.
4.5 Histologie
4.5.1 Histologische Technik
Die entnommenen Gewebeproben wurden für mindestens sieben Tage in phosphatgepufferter
5%iger Formalinlösung fixiert, zu Beginn der Aufbereitung in Einlegekassetten umgelagert
und für 24 Stunden in 5%iger Formalinlösung aufbewahrt. Anschließend wurden sie zur Ent­
fernung des Fixierers zwölf Stunden in fließendem Leitungswasser gewässert. Es folgten eine

Material und Methoden 77
Dehydrierung in einer aufsteigenden Ethyl­Alkoholreihe (70 %, 80 %, 90 %, 100 %) und die
Paraffineinbettung der Proben mit Hilfe eines Einbettungsautomaten mit Einkammersystem.
Von den Paraffinblöcken wurden mit einem Rotationsmikrotom 3 µm breite Schnitte
angefertigt. Zum Strecken wurden die Mikrotomschnitte in 37 °C warmes Wasser überführt
und anschließend auf Objektträger aufgezogen, welche zum Trocknen auf eine 37 °C
vorgewärmte Streckbank gelegt wurden.
Bevor die histologischen Schnitte gefärbt werden konnten, mussten sie entparaffiniert werden.
Die Präparate wurden 10 min in Xylol und anschließend in einer absteigenden Alkoholreihe
(100 %, 90 %, 70 %) jeweils für drei Minuten ausgewaschen und in destilliertes Wasser
überführt. Der Zellkernfärbung mit dem basischen Farbstoff Hämalaun folgte nach kurzem
Eintauchen in lauwarmes Leitungswasser die Differenzierung in einer Salzsäure/Alkohol­
Lösung (0,3 % HCl in 70 % Alkohol). Das Bläuen, die eigentliche Färbereaktion, wurde durch
fließendes, lauwarmes Leitungswasser (10 min) ausgelöst. Nach jeweils 15sekündigem
Eintauchen in 80%­ und 90%igem Ethanol erfolgte die Färbung in der sauren Eosin­Lösung
(20 sec). Die Entwässerung wurde über eine aufsteigende Alkoholreihe (80 %, 96 %, 100 %,
jeweils 2 min) durchgeführt.
4.5.2 Bewertung der histologischen Präparate
Die mikroskopische Beurteilung der Präparate wurde mit 50­, 100­ und 400­facher
Vergrößerung durchgeführt.
Lunge
Die histologischen Präparate der Lunge wurden lichtmikroskopisch bezüglich der
Granulozyteninfiltration und des Auftretens eines interstitiellen Ödems untersucht. Die
Befunde wurden semiquantitativ durch Einteilung in drei verschiedene Kategorien bestimmt
(Granulozyteninfiltration bzw. interstitielles Ödem „nicht vorhanden“, „gering vorhanden“,

Material und Methoden 78
„ausgeprägt vorhanden“). Den verschiedenen Kategorien wurde jeweils ein Punktewert
(Score) zugeteilt, der zur statistischen Auswertung herangezogen wurde.
Leber
Die histologischen Präparate der Leber wurden in Bezug auf die Granulozyteninfiltration, die
hydropische Leberzelldegeneration und das Auftreten eines interstitiellen Ödems untersucht.
Die Bewertung wurde analog zur Lunge durch Klassifizierung und Zuteilung einer Punktzahl
durchgeführt.
Milz
Die Milzpräparate der Versuchstiere wurden auf nekrotische Veränderungen, auf die
Abgrenzbarkeit der weißen zur roten Milzpulpa und auf die Lymphozytendichte in der weißen
Milzpulpa untersucht. Die Bewertung erfolgte nach einer Punkteskala, bei der die Milz in
Bezug auf die Nekrose in „ohne besonderen Befund“ (0), „geringgradig“ (1) oder „mittel­ bis
hochgradig“ nekrotisch (2) eingeteilt wurde. Die Abgrenzbarkeit der weißen zur roten
Milzpulpa konnte entweder als „vorhanden“ (1) oder „fehlend“ (2) bewertet werden. Die
Fülle der weißen Pulpa wurde als in „geringgradig“ (1) oder „physiologisch“ (2) bezeichnet.
Niere
Die Präparate der Niere wurden ebenfalls auf Infiltrationen von neutrophilen Granulozyten
nach dem oben beschriebenen Prinzip untersucht. Außerdem erfolgte die Beurteilung der
Dichte der Mesangiumzellen in den Glomeruli (Glomerulumfülle).
4.6 Statistik
Die statistische Auswertung wurde mit Hilfe der Software SigmaStat 2.03 (SPSS Inc., San
Rafael, USA) durchgeführt. Innerhalb der Gruppen wurden für die Untersuchungsparameter
der Mittelwert gebildet und als Streuungsmaß der Standardfehler des Mittelwerts (SEM)
berechnet.

Material und Methoden 79
Der Vergleich untereinander bezog sich auf die Gruppen Sham­TBC­48 gegen CLP­TBC­48,
Sham­TBC­96 gegen CLP­TBC­96, Sham­s­48 gegen CLP­s­48 und Sham­s­96 gegen CLP­
s­96. Auf gleiche Weise wurde der Vergleich zwischen den Sham­ und den entsprechenden
2hit­Gruppen vorgenommen. Weiterhin wurden die Reihen Sham­TBC­48 mit Sham­s­48,
Sham­TBC­96 mit Sham­s­96, CLP­TBC­48 mit CLP­s­48, CLP­TBC­96 mit CLP­s­96,
2hit­TBC­48 mit 2hit­s­48 sowie 2hit­TBC­96 mit 2hit­s­96 verglichen. Dargestellt wurden
die Mittelwerte ± SEM.
Signifikante Unterschiede zwischen den Gruppenmittelwerten wurden mit dem ungepaarten
Student`s t­test ermittelt. Bei ungleicher Varianz oder nicht normal verteilter Population
wurde ein Mann­Whitney Rank Sum Test durchgeführt. Die Überlebenskurven wurden mit
dem z­Test geprüft (p < 0,05 = signifikanter Unterschied).

Ergebnisse 80
5 Ergebnisse
5.1 Überlebensraten
Alle Sham­operierten Tiere der Bimosiamose­Gruppen überlebten den Versuch bis zur Blut­
und Organentnahme 48 bzw. 96 Stunden nach der Laparotomie. In den entsprechenden
Vehikelgruppen verstarb ein Tier in der Sham­s­96­Gruppe nach einer Beobachtungszeit von
72 Stunden, die Überlebensrate lag in dieser Gruppe bei 87,5 %.
Durch die Applikation von Bimosiamose konnte in den CLP­Gruppen die Mortalität im
Vergleich zu den entsprechenden Vehikelgruppen größtenteils nur tendenziell verringert
werden. Bei den CLP­TBC­48­Tieren betrug die Überlebensrate 100 %. Sie verringerte sich
in der CLP­s­48­Gruppe signifikant auf 54,5 %. In der CLP­TBC­96­Gruppe verstarb eine
von zehn Mäusen nach 72 Stunden, wodurch sich eine Überlebensrate von 90 % ergab. Bei
den CLP­s­96­Tieren verstarben zwei von zwölf operierten Mäusen, die Überlebensrate lag
bei 83,3 %.
In den 2hit­48­Gruppen verstarb jeweils eine von sieben bzw. acht operierten Mäusen nach
der CLP. Dadurch ergab sich in der 2hit­TBC­48­Gruppe eine Überlebensrate von 85,7 % und
bei den 2hit­s­48­Mäusen von 87,5 %. In den entsprechenden 96h­Gruppen war die Mortalität
etwas stärker ausgeprägt. Von den zehn 2hit­TBC­96­Tieren verstarben drei Mäuse
(Überlebensrate: 70 %) und in der 2hit­s­96­Gruppe überlebten zehn von dreizehn Tieren die
Sepsis bis zur Blut­ und Organentnahme (Überlebensrate 76,9 %).
5.2 Körpergewicht
Die Tiere besaßen vor Versuchsbeginn ein Körpergewicht von durchschnittlich 18,5 ± 1,4 g.
Alle Tiere der Sham­ und CLP­Reihen erlitten einen Gewichtsverlust in den ersten 24
postoperativen Stunden (Abbildung 6 u. 7), der im Vergleich zwischen den Sham­ und den
entsprechenden CLP­Gruppen signifikant war. Die Sham­Gruppen nahmen in diesem
Zeitraum durchschnittlich 0,8 ± 0,1 g ab. Die CLP­Tiere zeigten eine höhere

Ergebnisse 81
Gewichtsabnahme von durchschnittlich 2,0 ± 0,2 g. Sham­operierte Tiere beider Zeitgruppen
nahmen anschließend wieder an Gewicht zu, so dass sie am Versuchsende ihr ursprüngliches
Gewicht fast erreicht bzw. überschritten hatten.
Die CLP­Tiere erlitten einen deutlichen Gewichtsverlust, der bis zum Versuchsende nach 48
bzw. 96 Stunden anhielt. Die Bimosiamose­behandelten Tiere der 48h­ und der 96h­CLP­
Gruppen verloren gegenüber den Vehikel­behandelten Gruppen geringfügig mehr Gewicht,
was statistisch jedoch nicht signifikant war.
Gewichtsveränderung (g)
1
0,5
0
­0,5
­1
­1,5
­2
­2,5
­3
*
0 24 48
Beobachtungszeitraum (Std.)
*
Sham­TBC­48
Sham­s­48
CLP­TBC­48
CLP­s­48
Abbildung 6: Gewichtsveränderung gegen Tag 0 der experimentellen Sham­ und CLP­48­
Gruppen. Abgebildet sind Mittelwerte ± SEM.
mit Sham­TBC­48 = 48h­Gruppe mit einer Scheinoperation und einer Bimosiamose­
Applikation
Sham­s­48 = 48h­Gruppe mit einer Scheinoperation und einer Vehikel­
Applikation
CLP­TBC­48 = 48h­Gruppe mit einer CLP und einer Bimosiamose­Applikation
CLP­s­48 = 48h­Gruppe mit einer CLP und einer Vehikel­Applikation
0 Std. = Zeitpunkt der CLP bzw. Scheinoperation
* = p < 0,05 für Sham­TBC­48 vs. CLP­TBC­48 und Sham­s­48 vs.
CLP­s­48

Ergebnisse 82
Gewichtsveränderung (g)
2,0
1,0
0,0
­1,0
­2,0
­3,0
­4,0
*
*
*
*
0 24 48 72 96
Beobachtungszeitraum (Std.)
* *
Sham­TBC­96
Sham­s­96
CLP­TBC­96
CLP­s­96
Abbildung 7: Gewichtsveränderung gegen Tag 0 der experimentellen Sham­ und CLP­96­
Gruppen. Abgebildet sind Mittelwerte ± SEM.
mit Sham­TBC­96 = 96h­Gruppe mit einer Scheinoperation und einer Bimosiamose­
Applikation
Sham­s­96 = 96h­Gruppe mit einer Scheinoperation und einer Vehikel­
Applikation
CLP­TBC­96 = 96h­Gruppe mit einer CLP und einer Bimosiamose­Applikation
CLP­s­96 = 96h­Gruppe mit einer CLP und einer Vehikel­Applikation
0 Std. = Zeitpunkt der CLP bzw. Scheinoperation
* = p < 0,05 für Sham­TBC­96 vs. CLP­TBC­96 und Sham­s­96 vs.
CLP­s­96
Wie besprochen wurde bei den Sham­Gruppen die Differenz des aktuellen Gewichts zum
Gewicht unmittelbar vor Versuchsbeginn ausgewertet. Um diese Ergebnisse mit dem
Gewichtsverlust der 2hit­Tiere vergleichen zu können, wurde bei diesen Gruppen das
Körpergewicht am Tag der CLP (Tag 0) als Ausgangswert genommen (Abbildung 8 u. 9).
Wie die Tiere der Sham­Gruppen erlitten auch die Mäuse der 2hit­Gruppen einen
Gewichtsverlust in den ersten 24 Stunden nach der CLP. Die 2hit­Tiere wiesen eine durch­
schnittliche Gewichtsabnahme von 2,4 ± 0,3 g auf. Sie war in allen Gruppen signifikant höher
als in den entsprechenden Sham­Gruppen. Bei den 2hit­Tieren stagnierte der Gewichtsverlust
im weiteren Beobachtungszeitraum, teilweise war eine geringe Gewichtszunahme vorhanden.
Statistisch signifikante Ergebnisse innerhalb der 2hit­Gruppen lagen nicht vor.

Ergebnisse 83
Gewichtsveränderung (g)
0,5
0,0
­0,5
­1,0
­1,5
­2,0
­2,5
­3,0
* *
0 24 48
Beobachtungszeitraum (Std.)
Sham­TBC­48
Sham­s­48
2hit­TBC­48
2hit­s­48
Abbildung 8: Gewichtsveränderung gegen Tag 0 der experimentellen Sham­ und 2hit­48­
Gruppen. Abgebildet sind Mittelwerte ± SEM.
mit Sham­TBC­48 = 48h­Gruppe mit einer Scheinoperation und einer Bimosiamose­
Applikation
Sham­s­48 = 48h­Gruppe mit einer Scheinoperation und einer Vehikel­
Applikation
2hit­TBC­48 = 48h­Gruppe mit einem 2hit und einer Bimosiamose­Applikation
2hit­s­48 = 48h­Gruppe mit einem 2hit und einer Vehikel­Applikation
0 Std. = Zeitpunkt der CLP bzw. Scheinoperation
* = p < 0,05 für Sham­TBC­48 vs. 2hit­TBC­48 und Sham­s­48 vs.
2hit­s­48

Ergebnisse 84
Gewichtsveränderung (g)
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
­0,5
­1,0
­1,5
­2,0
­2,5
­3,0
­3,5
* * * *
0 24 48 72 96
Beobachtungszeitraum (Std.)
Sham­TBC­96
Sham­s­96
2hit­TBC­96
2hit­s­96
Abbildung 9: Gewichtsveränderung gegen Tag 0 der experimentellen Sham­ und 2hit­96­
Gruppen. Abgebildet sind Mittelwerte ± SEM.
mit Sham­TBC­96 = 96h­Gruppe mit einer Scheinoperation und einer Bimosiamose­
Applikation
Sham­s­96 = 96h­Gruppe mit einer Scheinoperation und einer Vehikel­
Applikation
2hit­TBC­96 = 96h­Gruppe mit einem 2hit und einer Bimosiamose­Applikation
2hit­s­96 = 96h­Gruppe mit einem 2hit und einer Vehikel­Applikation
0 Std. = Zeitpunkt der CLP bzw. Scheinoperation
* = p < 0,05 für Sham­TBC­96 vs. 2hit­TBC­96 und Sham­s­96 vs.
2hit­s­96
In den Abbildungen 10 und 11 wird die Gewichtsveränderung der 2hit­Gruppen ab dem
Zeitpunkt der Fraktur/Hämorrhagie (F/H) beschrieben. Dieser Eingriff wurde 48 Stunden vor
der CLP durchgeführt. Als Ausgangsgewicht diente hier das Körpergewicht vom Tag der
Fraktur/Hämorrhagie. Bei allen Tieren kam es 24 Stunden nach dem Eingriff zu einem
Gewichtsverlust von durchschnittlich 0,8 ± 0,3 g. Bis zum Zeitpunkt null (Tag der CLP)
nahmen die Gruppen wieder an Gewicht zu, erreichten den Ausgangswert jedoch nicht. Aus
diesem Grund wurde, wie in diesem Kapitel beschrieben, zur Bewertung des
Gewichtsverlusts durch die CLP bei den 2hit­Gruppen die Gewichtsdifferenz aus dem
Gewicht am Tag der CLP und dem folgenden Beobachtungszeitraum gebildet.

Ergebnisse 85
Gewichtsveränderung (g)
1,0
0,5
0,0
­0,5
­1,0
­1,5
­2,0
­2,5
­3,0
­3,5
F/H
CLP
­48 ­24 0 24 48
Beobachtungszeitraum (Std.)
Sham­TBC­48
Sham­s­48
2hit­TBC­48
2hit­s­48
Abbildung 10: Gewichtsveränderung gegen Tag ­2 der experimentellen Sham­ und 2hit­48­
Gruppen. Abgebildet sind Mittelwerte ± SEM.
mit Sham­TBC­48 = 48h­Gruppe mit einer Scheinoperation und einer Bimosiamose­
Applikation
Sham­s­48 = 48h­Gruppe mit einer Scheinoperation und einer Vehikel­
Applikation
2hit­TBC­48 = 48h­Gruppe mit einem 2hit und einer Bimosiamose­Applikation
2hit­s­48 = 48h­Gruppe mit einem 2hit und einer Vehikel­Applikation
­48 Std. = Zeitpunkt der Fraktur/Hämorrhagie
0 Std. = Zeitpunkt der CLP bzw. Scheinoperation

Ergebnisse 86
Gewichtsveränderung (g)
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
­0,5
­1,0
­1,5
­2,0
­2,5
­3,0
­3,5
F/H CLP
­48 ­24 0 24 48 72 96
Beobachtungszeitraum (Std.)
Sham­TBC­96
Sham­s­96
2hit­TBC­96
2hit­s­96
Abbildung 11: Gewichtsveränderung gegen Tag ­2 der experimentellen Sham­ und 2hit­96­
Gruppen. Abgebildet sind Mittelwerte ± SEM.
mit Sham­TBC­96 = 96h­Gruppe mit einer Scheinoperation und einer Bimosiamose­
Applikation
Sham­s­96 = 96h­Gruppe mit einer Scheinoperation und einer Vehikel­
Applikation
2hit­TBC­96 = 96h­Gruppe mit einem 2hit und einer Bimosiamose­Applikation
2hit­s­96 = 96h­Gruppe mit einem 2hit und einer Vehikel­Applikation
­48 Std. = Zeitpunkt der Fraktur/Hämorrhagie
0 Std. = Zeitpunkt der CLP bzw. Scheinoperation
5.3 Körpertemperatur
Vor Versuchsbeginn betrug die durchschnittliche rektale Temperatur aller Mäuse 35,8 ± 0,5
°C. Bei den Sham­operierten Tieren befand sich die Körpertemperatur während des gesamten
Versuchs, ausgenommen der Narkose­bedingten Hypothermie, im Normalbereich (Abbildung
12 u. 13).
Die Körpertemperatur der CLP­Tiere wies 24 Stunden post operationem zwar meist
physiologische Werte auf, die sich jedoch unterhalb der entsprechenden Körpertemperatur der
Sham­operierten Tiere befand (Abbildung 12 u. 13). Dieser Unterschied war bei allen CLP­

Ergebnisse 87
Gruppen im Vergleich zu den entsprechenden Sham­Gruppen statistisch signifikant (p <
0,05). Weiterhin konnte zu diesem Zeitpunkt ein statistisch signifikanter
Temperaturunterschied zwischen der CLP­TBC­48­ und der CLP­s­48­Gruppe festgestellt
werden (p < 0,05). 48 Stunden nach der CLP besaß die CLP­TBC­48­Gruppe eine
durchschnittliche Körpertemperatur von 34,9 ± 1,7 °C, die CLP­s­48­Gruppe 33,0 ± 0,7 °C.
Dieser Unterschied war jedoch nicht signifikant.
Temperatur (°C)
37
36
35
34
33
32
*
0 24 48
Beobachtungszeitraum (Std.)
Sham­TBC­48
Sham­s­48
CLP­TBC­48
CLP­s­48
Abbildung 12: Körpertemperatur der Sham­ und CLP­48­Gruppen. Abgebildet sind
Mittelwerte ± SEM.
mit Sham­TBC­48 = 48h­Gruppe mit einer Scheinoperation und einer Bimosiamose­
Applikation
Sham­s­48 = 48h­Gruppe mit einer Scheinoperation und einer Vehikel­
Applikation
CLP­TBC­48 = 48h­Gruppe mit einer CLP und einer Bimosiamose­Applikation
CLP­s­48 = 48h­Gruppe mit einer CLP und einer Vehikel­Applikation
0 Std. = Zeitpunkt der CLP bzw. Scheinoperation
* = p < 0,05 für Sham­TBC­48 vs. CLP­TBC­48; Sham­s­48 vs.
CLP­s­48 und CLP­TBC­48 vs. CLP­s­48

Ergebnisse 88
Bei den 96h­Gruppen konnte zu allen Beobachtungszeitpunkten eine signifikante Temperatur­
differenz zwischen den Sham­ und den entsprechenden CLP­Gruppen festgestellt werden (p <
0,05) (Abbildung 13). Zusätzlich konnten 48 Stunden nach der CLP bzw. Scheinoperation
signifikante Ergebnisse im Vergleich der Gruppen Sham­TBC­96 und Sham­s­96 sowie 72
Stunden nach dem Eingriff zwischen den Gruppen CLP­TBC­96 und CLP­s­96 ermittelt
werden.
Temperatur (°C)
38
37
36
35
34
33
32
31
* **
***
0 24 48 72 96
Beobachtungszeitraum (Std.)
*
Sham­TBC­96
Sham­s­96
CLP­TBC­96
CLP­s­96
Abbildung 13: Körpertemperatur der Sham­ und CLP­96­Gruppen. Abgebildet sind
Mittelwerte ± SEM.
mit Sham­TBC­96 = 96h­Gruppe mit einer Scheinoperation und einer Bimosiamose­
Applikation
Sham­s­96 = 96h­Gruppe mit einer Scheinoperation und einer Vehikel­
Applikation
CLP­TBC­96 = 96h­Gruppe mit einer CLP und einer Bimosiamose­Applikation
CLP­s­96 = 96h­Gruppe mit einer CLP und einer Vehikel­Applikation
0 Std. = Zeitpunkt der CLP bzw. Scheinoperation
* = p < 0,05 für Sham­TBC­96 vs. CLP­TBC­96 und Sham­s­96 vs.
CLP­s­96
** = p < 0,05 für Sham­TBC­96 vs. CLP­TBC­96; Sham­s­96 vs.
CLP­s­96 und Sham­TBC­96 vs. Sham­s­96
*** = p < 0,05 für Sham­TBC­96 vs. CLP­TBC­96; Sham­s­96 vs.
CLP­s­96 und CLP­TBC­96 vs. CLP­s­96

Ergebnisse 89
Die Körpertemperatur der Mäuse des 2hit­Modells lag zum Zeitpunkt der
Fraktur/Hämorrhagie (Beobachtungszeitpunkt –48 Stunden) und während der folgenden 48
Stunden bis zum Zeitpunkt der CLP (Beobachtungszeitpunkt 0 Stunden) im physiologischen
Bereich (Abbildung 14 u. 15). 24 Stunden nach Sepsisinduktion war die Temperatur der Tiere
deutlich geringer als vor Versuchsbeginn bzw. vor der CLP und auch signifikant geringer als
die der Sham­operierten Mäuse zum gleichen Zeitpunkt (p < 0,05).
Im weiteren Verlauf sank die Körpertemperatur dieser Tiere ab, so dass 48 Stunden nach der
CLP die durchschnittliche Temperatur in der 2hit­TBC­48­Gruppe bei 34,0 ± 0,2 °C lag. Die
entsprechende Vehikel­behandelte Kontrollgruppe (2hit­s­48­Gruppe) besaß eine tendenziell
geringere Temperatur von 33,6 ± 0,3 °C. Signifikante Temperaturunterschiede konnten zu
diesem Zeitpunkt zwischen den Gruppen Sham­TBC­48 vs. 2hit­TBC­48, Sham­TBC­96 vs.
2hit­TBC­96 sowie Sham­TBC­96 vs. Sham­s­96 ermittelt werden. 72 und 96 Sunden nach
der CLP bzw. Scheinoperation ergaben sich signifikante Temperaturunterschiede zwischen
den Reihen Sham­TBC­96 vs. 2hit­TBC­96 sowie am Versuchsende zusätzlich zwischen den
Gruppen Sham­s­96 vs. 2hit­s­96 (p < 0,05). In der 2hit­96­Reihe wies die Vehikel­Gruppe
am Versuchsende ebenfalls eine geringere Körpertemperatur als die Bimosiamose­
behandelten Tiere auf (2hit­TBC­96­Gruppe: 34,2 ± 0,8 °C; 2hit­s­96­Gruppe: 32,5 ± 0,7 °C).
Diese Differenz war jedoch nicht signifikant.

Ergebnisse 90
Temperatur (°C)
37,0
36,5
36,0
35,5
35,0
34,5
34,0
33,5
33,0
32,5
F/H
CLP
­48 ­24 0 24 48
Beobachtungszeitraum (Std.)
*
**
Sham­TBC­48
Sham­s­48
2hit­TBC­48
2hit­s­48
Abbildung 14: Körpertemperatur der Sham­ und 2hit­48­Gruppen. Abgebildet sind
Mittelwerte ± SEM.
Mit Sham­TBC­48 = 48h­Gruppe mit einer Scheinoperation und einer Bimosiamose­
Applikation
Sham­s­48 = 48h­Gruppe mit einer Scheinoperation und einer Vehikel­
Applikation
2hit­TBC­48 = 48h­Gruppe mit einem 2hit und einer Bimosiamose­Applikation
2hit­s­48 = 48h­Gruppe mit einem 2hit und einer Vehikel­Applikation
­48 Std. = Zeitpunkt der Fraktur/Hämorrhagie
0 Std. = Zeitpunkt der CLP bzw. Scheinoperation
* = p < 0,05 für Sham­TBC­48 vs. 2hit­TBC­48 und Sham­s­48 vs.
2hit­s­48
** = p < 0,05 für Sham­TBC­48 vs. 2hit­TBC­48

Ergebnisse 91
Temperatur (°C)
38
37
36
35
34
33
32
31
F/H
CLP
*
** ***
­48 ­24 0 24 48 72 96
Beobachtungszeitraum (Std.)
*
Sham­TBC­96
Sham­s­96
2hit­TBC­96
2hit­s­96
Abbildung 15: Körpertemperatur der Sham­ und 2hit­96­Gruppen. Abgebildet sind
Mittelwerte ± SEM.
mit Sham­TBC­96 = 96h­Gruppe mit einer Scheinoperation und einer Bimosiamose­
Applikation
Sham­s­96 = 96h­Gruppe mit einer Scheinoperation und einer Vehikel­
Applikation
2hit­TBC­96 = 96h­Gruppe mit einem 2hit und einer Bimosiamose­Applikation
2hit­s­96 = 96h­Gruppe mit einem 2hit und einer Vehikel­Applikation
­48 Std. = Zeitpunkt der Fraktur/Hämorrhagie
0 Std. = Zeitpunkt der CLP bzw. Scheinoperation
* = p < 0,05 für Sham­TBC­96 vs. 2hit­TBC­96 und Sham­s­96 vs.
2hit­s­96
** = p < 0,05 für Sham­TBC­96 vs. 2hit­TBC­96 und Sham­TBC­96
vs. Sham­s­96
*** = p < 0,05 für Sham­TBC­96 vs. 2hit­TBC­96
5.4 Aktivität
Das individuelle Aktivitätsniveau der Tiere wurde bei der täglichen klinischen Untersuchung
anhand definierter Verhaltensmerkmale beurteilt (Kapitel 4.2.6 Klinische Untersuchungs­
parameter).

Ergebnisse 92
Alle Sham­operierten Mäuse waren 24 Stunden nach der Laparotomie aktiv. Ihr
durchschnittlicher Aktivitätslevel lag bei 4,9 ± 0,1. Im folgenden Beobachtungszeitraum, der
noch 24 bzw. 72 Stunden umfasste, erholten sich die Tiere von dem Eingriff, so dass ihr
Aktivitätslevel 48 Stunden post operationem durchschnittlich auf 5,0 ± 0,1 anstieg. Auch in
den beiden 96h­Guppen konnte am Versuchsende ein Aktivitätsniveau von 5 festgestellt
werden (Abbildung 16 u. 17).
Der Aktivitätslevel beider CLP­Gruppen, die mit Bimosiamose behandelt worden waren, lag
während des gesamten Beobachtungszeitraums über dem der entsprechenden CLP­s­Gruppe
(Abbildung 16 u. 17). In der CLP­TBC­48­Gruppe befand sich das Aktivitätsniveau 24
Stunden nach der CLP bei 3,8 ± 0,2 und nach weiteren 24 Stunden bei 3,5 ± 0,3. Die
Messergebnisse der CLP­s­48­Gruppe lagen 24 Stunden post operationem bei 3,3 ± 0,3 und
48 Stunden nach der CLP bei 3,2 ± 0,3.
In der CLP­TBC­96­Gruppe stieg der Aktivitätslevel von 3,9 ± 0,1 (Beurteilung 24 Stunden
post operationem) auf 4 ± 0 nach weiteren 24 Stunden an. Am Versuchsende konnte eine
leichte Aktivitätsverringerung festgestellt werden. Im Verlauf des Beobachtungszeitraums der
CLP­s­96­Gruppe fiel die Aktivität der Tiere kontinuierlich ab. 24 Stunden nach der CLP lag
der Wert bei 3,8 ± 0,1, nach 48 Stunden bei 3,6 ± 0,2 und weitere 24 Stunden später bei 3,2 ±
0,3. Am Ende des Beobachtungszeitraums befand sich die durchschnittliche Aktivität dieser
Gruppe bei 2,6 ± 0,3.
Die Messergebnisse aller Sham­Gruppen waren 24 und 48 Stunden post operationem im
Vergleich zu den entsprechenden CLP­Gruppen statistisch signifikant höher (p < 0,05). Dies
war auch in den 96h­Gruppen zum Zeitpunkt 72 und 96 Stunden der Fall. Zu diesen beiden
Zeitpunkten besteht auch eine statistische Signifikanz zwischen den Ergebnissen der Gruppen
CLP­TBC­96 und CLP­s­96 (p < 0,05).

Ergebnisse 93
Aktivität
6
5
4
3
2
1
0
*
0 24 48
Beobachtungszeitraum (Std.)
*
Sham­TBC­48
Sham­s­48
CLP­TBC­48
CLP­s­48
Abbildung 16: Aktivität der Sham­ und CLP­48­Gruppen. Abgebildet sind Mittelwerte ±
SEM.
mit Sham­TBC­48 = 48h­Gruppe mit einer Scheinoperation und einer Bimosiamose­
Applikation
Sham­s­48 = 48h­Gruppe mit einer Scheinoperation und einer Vehikel­
Applikation
CLP­TBC­48 = 48h­Gruppe mit einer CLP und einer Bimosiamose­Applikation
CLP­s­48 = 48h­Gruppe mit einer CLP und einer Vehikel­Applikation
Aktivität 1 = moribund, 2 = lethargisch, 3 = ruhig, 4 = eingeschränkt aktiv,
5 = aktiv, 6 = sehr aktiv
0 Std. = Zeitpunkt der CLP bzw. Scheinoperation
* = p < 0,05 für Sham­TBC­48 vs. CLP­TBC­48 und Sham­s­48 vs.
CLP­s­48

Ergebnisse 94
Aktivität
6
5
4
3
2
1
0
* * **
0 24 48 72 96
Beobachtungszeitraum (Std.)
**
Sham­TBC­96
Sham­s­96
CLP­TBC­96
CLP­s­96
Abbildung 17: Aktivität der Sham­ und CLP­96­Gruppen. Abgebildet sind Mittelwerte ±
SEM.
mit Sham­TBC­96 = 96h­Gruppe mit einer Scheinoperation und einer Bimosiamose­
Applikation
Sham­s­96 = 96h­Gruppe mit einer Scheinoperation und einer Vehikel­
Applikation
CLP­TBC­96 = 96h­Gruppe mit einer CLP und einer Bimosiamose­Applikation
CLP­s­96 = 96h­Gruppe mit einer CLP und einer Vehikel­Applikation
Aktivität 1 = moribund, 2 = lethargisch, 3 = ruhig, 4 = eingeschränkt aktiv,
5 = aktiv, 6 = sehr aktiv
0 Std. = Zeitpunkt der CLP bzw. Scheinoperation
* = p < 0,05 für Sham­TBC­96 vs. CLP­TBC­96 und Sham­s­96 vs.
CLP­s­96
** = p < 0,05 für Sham­TBC­96 vs. CLP­TBC­96; Sham­s­96 vs.
CLP­s­96 und CLP­TBC­96 vs. CLP­s­96
Die 2hit­Gruppen erreichten am Tag nach der Fraktur/Hämorrhagie (Beobachtungszeitpunkt
−24 Stunden) eine durchschnittliche Aktivität von 4,4 ± 0,2. Der Ausgangswert am Tag der
CLP (Beobachtungszeitpunkt 0 Stunden) betrug 4,7 ± 0,3 (Abbildung 18 u. 19).
Der Aktivitätslevel beider 2hit­Gruppen, die mit Bimosiamose nach der CLP behandelt
worden waren, lag während des gesamten weiteren Beobachtungszeitraums größtenteils über
dem der entsprechenden 2hit­s­Gruppe. Diese Ergebnisse waren nicht signifikant. In der 2hit­

Ergebnisse 95
TBC­48­Gruppe befand sich das Aktivitätsniveau 24 Stunden nach der CLP bei 3,2 ± 0,4 und
nach weiteren 24 Stunden bei 3 ± 0,5. Die Messerergebnisse der 2hit­s­48­Gruppe lagen 24
Stunden post operationem bei 3,1 ± 0,3 und 48 Stunden nach der CLP bei 2,7 ± 0,3.
In der 2hit­TBC­96­Gruppe fiel die Aktivität 24 Stunden nach der CLP bis auf 3,3 ± 0,2 ab.
Im weiteren Verlauf erhöhte sich der Aktivitätslevel der Tiere geringgradig, um bis zum Ende
des Beobachtungszeitraums wieder auf 3,1 ± 0,3 abzusinken. Ein ähnliches Bild ergab sich in
der 2hit­s­96­Gruppe. Am Ende des Beobachtungszeitraums sank die Aktivität in dieser
Gruppe jedoch bis auf 2,5 ± 0,2 ab. Die Ergebnisse waren nicht signifikant.
Die Messergebnisse aller Sham­Gruppen waren 24 und 48 Stunden nach dem operativen
Eingriff im Vergleich zu den entsprechenden 2hit­Gruppen statistisch signifikant (p < 0,05).
Dies war auch in den 96h­Gruppen zum Zeitpunkt 72 und 96 Stunden der Fall.

Ergebnisse 96
Aktivität
6
5
4
3
2
1
0
F/H CLP
­48 ­24 0 24 48
Beobachtungszeitraum (Std.)
* *
Sham­TBC­48
Sham­s­48
2hit­TBC­48
2hit­s­48
Abbildung 18: Aktivität der Sham­ und 2hit­48­Gruppen. Abgebildet sind Mittelwerte ±
SEM.
mit Sham­TBC­48 = 48h­Gruppe mit einer Scheinoperation und einer Bimosiamose­
Applikation
Sham­s­48 = 48h­Gruppe mit einer Scheinoperation und einer Vehikel­
Applikation
2hit­TBC­48 = 48h­Gruppe mit einem 2hit und einer Bimosiamose­Applikation
2hit­s­48 = 48h­Gruppe mit einem 2hit und einer Vehikel­Applikation
­48 Std. = Zeitpunkt der Fraktur/ Hämorrhagie
Aktivität 1 = moribund, 2 = lethargisch, 3 = ruhig, 4 = eingeschränkt aktiv,
5 = aktiv, 6 = sehr aktiv
0 Std. = Zeitpunkt der CLP bzw. Scheinoperation
* = p < 0,05 für Sham­TBC­48 vs. 2hit­TBC­48 und Sham­s­48 vs.
2hit­s­48

Ergebnisse 97
Aktivität
6
5
4
3
2
1
0
F/H CLP
*
­48 ­24 0 24 48 72 96
Beobachtungszeitraum (Std.)
*
*
*
Sham­TBC­96
Sham­s­96
2hit­TBC­96
2hit­s­96
Abbildung 19: Aktivität der Sham­ und 2hit­96­Gruppen. Abgebildet sind Mittelwerte ±
SEM.
mit Sham­TBC­96 = 96h­Gruppe mit einer Scheinoperation und einer Bimosiamose­
Applikation
Sham­s­96 = 96h­Gruppe mit einer Scheinoperation und einer Vehikel­
Applikation
2hit­TBC­96 = 96h­Gruppe mit einem 2hit und einer Bimosiamose­Applikation
2hit­s­96 = 96h­Gruppe mit einem 2hit und einer Vehikel­Applikation
­48 Std. = Zeitpunkt der Fraktur/Hämorrhagie
0 Std. = Zeitpunkt der CLP bzw. Scheinoperation
Aktivität 1 = moribund, 2 = lethargisch, 3 = ruhig, 4 = eingeschränkt aktiv,
5 = aktiv, 6 = sehr aktiv
* = p < 0,05 für Sham­TBC­96 vs. 2hit­TBC­96 und Sham­s­96 vs.
2hit­s­96
5.5 T­Zell­vermittelte Typ IV­Reaktion
Die Ohrdicke der Mäuse wurde bei der täglichen klinischen Untersuchung am rechten Ohr
gemessen. Für die Auswertung wurden die Ergebnisse vom Tag der Sensibilisierung, die
jeweils am ersten Tag der Versuchsreihe stattfand und die Messergebnisse 24 Stunden nach
dem Zweitantigenkontakt miteinander verglichen. Die durchschnittliche Ohrdicke der Sham­
Tiere vor Versuchsbeginn am Tag der Sensibilisierung betrug 0,21 ± 0,01 mm, 24 Stunden

Ergebnisse 98
nach dem Zweitantigenkontakt war eine Erhöhung der durchschnittlichen Ohrdicke auf 0,39
± 0,01 mm zu beobachten. Die Applikation von Bimosiamose bewirkte eine tendenziell
stärker ausgeprägte Ödemreaktion gegenüber der Vehikel­behandelten Kontrollgruppe
(Abbildung 20). So lag die durchschnittliche Ohrdicke der Sham­TBC­48­Gruppe bei 0,43 ±
0,02 mm und der Sham­s­48­Gruppe bei 0,39 ± 0,01 mm. Die Ohrdicke der Sham­TBC­96­
Gruppe betrug 0,38 ± 0,01 mm und der Sham­s­96­Gruppe 0,37 ± 0,01 mm.
Die durchschnittliche Ohrdicke der CLP­Gruppen lag vor Versuchsbeginn bei 0,2 ± 0,04 mm,
24 Stunden nach dem Zweitantigenkontakt betrug sie 0,33 ± 0,02 mm (Abbildung 20). Beide
TBC­Gruppen zeigten eine geringgradig stärker ausgeprägte Ödemreaktion als die Vehikel­
Tiere, die jedoch nicht signifikant war. Die durchschnittliche Ohrdicke der CLP­TBC­48­
Gruppe lag bei 0,36 ± 0,01 mm, die der CLP­s­48­Gruppe bei 0,32 ± 0,01 mm (p = 0,032).
Das Ausmaß der Ödemreaktion bei der CLP­TBC­96­Gruppe betrug 0,34 ± 0,01 mm, die
CLP­s­96­Tiere zeigten eine Reaktion von 0,31 ± 0,01 mm.
Im Vergleich der Sham­ und CLP­Gruppen miteinander wurde bei den Sham­Gruppen
gegenüber der jeweiligen CLP­Gruppe eine ausgeprägtere Reaktion festgestellt. Die
Unterschiede zwischen den entsprechenden Gruppen waren statistisch signifikant (p < 0,05).
Zudem wies die CLP­TBC­48­Gruppe eine signifikant stärkere Ohrdicke als die CLP­s­48­
Reihe auf (p < 0,05).

Ergebnisse 99
Ohrdicke (mm)
0,50
0,45
0,40
0,35
0,30
0,25
0,20
0,15
0,10
0,05
0,00
Sham­
TBC­48
Sham­s­
48
Sham­
TBC­96
* *
Sham­s­
96
CLP­
TBC­48
*
CLP­s­
48
*
CLP­
TBC­96
*
CLP­s­
96
Abbildung 20: Ohrdicke nach Zweitantigenkontakt mit DNFB der Sham­ und CLP­Gruppen.
Abgebildet sind Mittelwerte ± SEM.
mit Sham­TBC­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einer Scheinoperation und einer
Bimosiamose­Applikation
Sham­s­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einer Scheinoperation und einer
Vehikel­Applikation
CLP­TBC­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einer CLP und einer
Bimosiamose­Applikation
CLP­s­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einer CLP und einer
Vehikel­Applikation
* = p < 0,05
Die Ohrdicke der 2hit­Tiere war nach dem Zweitantigenkontakt bei allen Gruppen signifikant
geringer ausgeprägt als bei den entsprechenden Sham­Gruppen (p < 0,001) (Abbildung 21).
So lag das Ausmaß der Ödemreaktion bei der 2hit­TBC­48­Gruppe bei 0,34 ± 0,01 mm und
bei der vergleichbaren Vehikel­behandelten Kontrollgruppe bei 0,33 ± 0,01 mm. Die
Ohrdicke der 2hit­TBC­96­Gruppe betrug 0,34 ± 0,01 mm und die 2hit­s­96­Tiere zeigten
Reaktionen von 0,3 ± 0,01 mm. Im Vergleich der entsprechenden 2hit­Gruppen untereinander
konnten keine signifikanten Ergebnisse festgestellt werden.

Ergebnisse 100
Ohrdicke (mm)
0,50
0,45
0,40
0,35
0,30
0,25
0,20
0,15
0,10
0,05
0,00
Sham­
TBC­48
Sham­s­
48
*
Sham­
TBC­96
Sham­s­
96
2hit­
TBC­48
* *
2hit­s­
48
2hit­
TBC­96
*
2hit­s­
96
Abbildung 21: Ohrdicke nach Zweitantigenkontakt mit DNFB der Sham­ und 2hit­Gruppen.
Abgebildet sind Mittelwerte ± SEM.
mit Sham­TBC­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einer Scheinoperation und einer
Bimosiamose­Applikation
Sham­s­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einer Scheinoperation und einer
Vehikel­Applikation
2hit­TBC­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einem 2hit und einer
Bimosiamose­Applikation
2hit­s­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einem 2hit und einer Vehikel­
Applikation
* = p < 0,05

Ergebnisse 101
5.6 Durchflusszytometrische Auswertung von T­Lymphozyten
5.6.1 CD4 + ­Lymphozyten
Die Applikation von Bimosiamose führte in den Sham­Gruppen im Vergleich zu den ent­
sprechenden Vehikel­Gruppen zu einer Verringerung der Rate an CD4 + ­Lymphozyten (Abbil­
dung 22). Dabei war der Einfluss von Bimosiamose statistisch signifikant (p < 0,05). Beide
48h­Gruppen wiesen geringere CD4 + ­Lymphozyten­Anteile als die entsprechenden 96h­
Gruppen auf. In der Sham­TBC­48­Gruppe lag der Prozentsatz bei 9,1 ± 2,3 % und bei den
Sham­TBC­96­Mäusen erhöhte er sich auf 14,8 ± 1,3 %. Im Vergleich dazu lag der Anteil der
Sham­s­48­Tiere bei 22,1 ± 3,3 % und der Wert in der Gruppe Sham­s­96 bei 23,6 ± 2,9 %.
In den CLP­Gruppen konnte durch die Gabe von Bimosiamose keine deutliche Differenz der
relativen Menge an CD4 + ­Zellen im Vergleich zu den entsprechenden Vehikel­behandelten
Tieren festgestellt werden. So wies die CLP­TBC­48­Gruppe einen Prozentsatz von 18,5 ±
3,2 % und die CLP­s­48­Gruppe einen Wert von 18,4 ± 2,6 % auf. Bei den entsprechenden
96h­Gruppen verringerte sich dieser Wert jeweils um etwa die Hälfte. Die CLP­TBC­96­
Mäuse erreichten einen CD4 + ­Prozentsatz von 9,5 ± 1,4 % und die CLP­s­96­Tiere von 8,9 ±
0,9 %.
Der CD4 + ­Lymphozyten­Anteil der Sham­operierten 96h­Gruppen war im Vergleich zu den
entsprechenden CLP­Mäusen statistisch signifikant (p < 0,05).

Ergebnisse 102
CD4+­Zellen (%)
30
25
20
15
10
5
0
Sham­
TBC­48
*
Sham­s­
48
* *
*
Sham­
TBC­96
Sham­s­
96
CLP­
TBC­48
*
CLP­s­
48
CLP­
TBC­96
*
*
CLP­s­
96
Abbildung 22: Prozentuale Anteile der CD4 + ­Lymphozyten im Blut der Sham­ und CLP­
Gruppen. Abgebildet sind Mittelwerte ± SEM.
mit Sham­TBC­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einer Scheinoperation und einer
Bimosiamose­Applikation
Sham­s­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einer Scheinoperation und einer
Vehikel­Applikation
CLP­TBC­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einer CLP und einer
Bimosiamose­Applikation
CLP­s­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einer CLP und einer
Vehikel­Applikation
* = p < 0,05
Die Anteile der CD4 + ­Lymphozyten der beiden Bimosiamose­behandelten 2hit­Gruppen
lagen höher als bei den entsprechenden Sham­Gruppen (Abbildung 23). Im Gegensatz dazu
konnten innerhalb der Vehikel­Gruppen höhere Werte bei den entsprechenden Sham­Gruppen
ermittelt werden. Der Prozentsatz der CD4 + ­Lymphozyten in der 2hit­TBC­48­Gruppe betrug
20,2 ± 3,6 % und bei den 2hit­s­48­Mäusen 17,2 ± 2,9 %. In beiden 96h­Gruppen verringerte
sich der Anteil, so dass die Tiere der 2hit­TBC­96­Gruppe durchschnittlich 17,4 ± 0,7 % und
die Mäuse der 2hit­s­96­Gruppe 16,5 ± 1,3 % CD4 + ­Lymphozyten besaßen.
Eine signifikante Erhöhung bzw. Verringerung der Werte bestand zwischen den Gruppen
Sham­TBC­48 und 2hit­TBC­48 bzw. Sham­s­96 und 2hit­s­96 (p < 0,05).

Ergebnisse 103
CD4+­Zellen (%)
30
25
20
15
10
5
0
Sham­
TBC­48
*
* *
Sham­s­
48
Sham­
TBC­96
Sham­s­
96
2hit­
TBC­48
*
2hit­s­48 2hit­
TBC­96
2hit­s­96
Abbildung 23: Prozentuale Anteile der CD4 + ­Lymphozyten im Blut der Sham­ und 2hit­
Gruppen. Abgebildet sind Mittelwerte ± SEM.
mit Sham­TBC­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einer Scheinoperation und einer
Bimosiamose­Applikation
Sham­s­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einer Scheinoperation und einer
Vehikel­Applikation
2hit­TBC­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einem 2hit und einer
Bimosiamose­Applikation
2hit­s­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einem 2hit und einer Vehikel­
Applikation
* = p < 0,05
5.6.2 CD8 + ­Lymphozyten
Die Applikation von Bimosiamose bewirkte in der Sham­operierten 48h­Gruppe eine
signifikante Verminderung der CD8 + ­Zellen (p = 0,046) (Abbbildung 24). Ihr Anteil betrug
in der Sham­TBC­48­Gruppe 7,8 ± 3,3 % und in der Sham­s­48­Gruppe 15,7 ± 1,1 %.
Weiterhin war die Zeitdauer in der Bimosiamose­behandelten Sham­Gruppe statistisch
signifikant (Sham­TBC­48 vs. Sham­TBC­96: p = 0,007).

Ergebnisse 104
Die CLP bewirkte meist Verringerung der CD8 + ­Lymphozyten. Zwischen den beiden 48h­
Gruppen konnte nur eine geringe Differenz festgestellt werden (CLP­TBC­48: 13,0 ± 1,7 %;
CLP­s­48: 11,2 ± 2,1 %). In der entsprechenden 96h­CLP­Gruppe verringerte sich im
Vergleich zur 48h­Gruppe der Anteil der CD8 + ­Lymphozyten. In der CLP­TBC­96­Reihe lag
der Prozentsatz bei 10,4 ± 1,2 %, der sich in der CLP­s­96­Gruppe tendenziell auf 7,1 ± 0,1 %
verminderte.
CD8+­Zellen (%)
25
20
15
10
5
0
Sham­
TBC­48
*
*
Sham­s­
48
Sham­
TBC­96
Sham­s­
96
CLP­
TBC­48
*
*
CLP­s­
48
CLP­
TBC­96
CLP­s­
96
Abbildung 24: Prozentuale Anteile der CD8 + ­Lymphozyten im Blut der Sham­ und CLP­
Gruppen. Abgebildet sind Mittelwerte ± SEM.
mit Sham­TBC­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einer Scheinoperation und einer
Bimosiamose­Applikation
Sham­s­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einer Scheinoperation und einer
Vehikel­Applikation
CLP­TBC­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einer CLP und einer
Bimosiamose­Applikation
CLP­s­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einer CLP und einer
Vehikel­Applikation
* = p < 0,05
Im 2hit­Modell besaßen die Vehikel­behandelten Mäuse in der 2hit­s­48­Gruppe einen
tendenziell höheren CD8 + ­Lymphozyten­Anteil als die entsprechende TBC­Gruppe (2hit­s­
48­Gruppe: 14,7 ± 2,7 %, 2hit­TBC­48­Gruppe: 9,6 ± 2,2 %). In den 96h­Reihen glichen sich

Ergebnisse 105
die Werte (2hit­s­96­Gruppe: 16,4 ± 1,7 %, 2hit­TBC­96­Gruppe: 16,4 ± 1,6 %) (Abbildung
25). In den entsprechenden Gruppen des 2hit­Modells konnte im Vergleich zu den Sham­
Gruppen in drei Fällen eine nicht signifikante Verringerung der CD8 + ­Lymphozyten ermittelt
werden; nur die 2hit­TBC­48­Gruppe lag höher als die vergleichbare Sham­TBC­48­Gruppe.
Weiterhin war wie in den Laparotomie­Gruppen die Zeitdauer in den Bimosiamose­
behandelten 2hit­Gruppen statistisch signifikant (2hit­TBC­48 vs. 2hit­TBC­96: p = 0,032).
CD8+­Zellen (%)
25
20
15
10
5
0
Sham­
TBC­48
*
Sham­s­
48
* *
Sham­
TBC­96
Sham­s­
96
2hit­
TBC­48
2hit­s­48 2hit­
TBC­96
2hit­s­96
Abbildung 25: Prozentuale Anteile der CD8 + ­Lymphozyten im Blut der Sham­ und 2hit­
Gruppen. Abgebildet sind Mittelwerte ± SEM.
mit Sham­TBC­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einer Scheinoperation und einer
Bimosiamose­Applikation
Sham­s­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einer Scheinoperation und einer
Vehikel­Applikation
2hit­TBC­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einem 2hit und einer
Bimosiamose­Applikation
2hit­s­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einem 2hit und einer Vehikel­
Applikation
* = p < 0,05

Ergebnisse 106
5.6.3 CD4 + CD8 + ­Lymphozyten
Der Prozentsatz der CD4 + CD8 + ­Lymphozyten lag in beiden 48h­Gruppen der Sham­
operierten Tiere höher als in den entsprechenden 96h­Gruppen (Abbildung 26). Die
Bimosiamose­Behandlung der Sham­TBC­48­Gruppe bewirkte eine tendenzielle
Verringerung dieses Lymphoytenanteils gegenüber den Sham­s­48­Mäusen (Sham­TBC­48:
1,7 ± 0,5 %; Sham­s­48: 4,0 ± 1,9 %). Die Bimosiamose­ bzw. Vehikel­Applikation hatte in
den Sham­operierten 96h­Gruppen keinen Einfluss auf den Anteil der CD4 + CD8 + ­
Lymphozyten, so dass der Wert der Sham­TBC­96­Gruppe bei 1,2 ± 0,3 % und der der Sham­
s­96­Gruppe bei 1,2 ± 0,2 % lag.
Die Induktion einer Sepsis mittels CLP führte in beiden 48h­Gruppen zu einem Anstieg der
CD4 + CD8 + ­Lymphozyten, der in der CLP­s­48­Gruppe etwas stärker (6,0 ± 1,5 %) als bei den
CLP­TBC­48­Tieren (5,2 ± 1,0 %) ausgeprägt war (Abbildung 26). Bei den 96h­Gruppen
verringerte sich der Prozentsatz wieder. Dies trat in der CLP­s­96­Gruppe stärker in
Erscheinung (1,6 ± 0,2 %), als bei den Bimosiamose­behandelten CLP­TBC­96­Mäusen (3,4
± 1,0 %), und war dadurch in den Vehikelgruppen signifikant (p < 0,05). Signifikant höhere
Konzentrationen ergaben sich zudem im Vergleich der Bimosiamose­behandelten CLP­ und
der Sham­Gruppen beider Zeitreihen. Auch der Vergleich der Gruppen Sham­s­48 vs. Sham­
s­96 und CLP­TBC­96 vs. CLP­s­96 ergab signifikante Konzentrationsunterschiede.

Ergebnisse 107
CD4+CD8+­Zellen (%)
8
7
6
5
4
3
2
1
0
Sham­
TBC­48
Sham­s­
48
*
*
Sham­
TBC­96
Sham­s­
96
*
CLP­
TBC­48
CLP­s­
48
*
CLP­
TBC­96
*
CLP­s­
96
Abbildung 26: Prozentuale Anteile der CD4 + CD8 + ­Lymphozyten im Blut der Sham­ und
CLP­Gruppen. Abgebildet sind Mittelwerte ± SEM.
mit Sham­TBC­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einer Scheinoperation und einer
Bimosiamose­Applikation
Sham­s­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einer Scheinoperation und einer
Vehikel­Applikation
CLP­TBC­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einer CLP und einer
Bimosiamose­Applikation
CLP­s­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einer CLP und einer
Vehikel­Applikation
* = p < 0,05
In allen Gruppen des 2hit­Modells lag der Anteil der CD4 + CD8 + ­Lymphozyten höher als in
den entsprechenden Sham­Reihen. Teilweise waren die Unterschiede signifikant (Sham­TBC­
48 vs. 2hit­TBC­48, Sham­TBC­96 vs. 2hit­TBC­96, Sham­s­96 vs. 2hit­s­96) (p < 0,05)
(Abbildung 27). Die Applikation von Bimosiamose bewirkte in beiden 2hit­Zeitgruppen eine
tendenzielle Verringerung des Lymphozytenanteils im Vergleich zu den Vehikel­Gruppen
(2hit­TBC­48­Gruppe: 5,0 ± 1,3 %; 2hit­s­48­Gruppe: 5,9 ± 1,1 %). Weiterhin konnte in
beiden 2hit­96­Gruppen im Vergleich zu den entsprechenden 2hit­48­Reihen ein
Konzentrationsrückgang festgestellt werden, der in der Bimosiamose­behandelten Gruppe
stärker ausgeprägt war (2hit­TBC­96­Gruppe: 3,4 ± 0,6 %; 2hit­s­96­Gruppe: 5,6 ± 0,9 %).

Ergebnisse 108
CD4+CD8+­Zellen (%)
8
7
6
5
4
3
2
1
0
Sham­
TBC­48
*
Sham­s­
48
*
Sham­
TBC­96
Sham­s­
96
*
2hit­
TBC­48
*
2hit­s­48 2hit­
TBC­96
2hit­s­96
Abbildung 27: Prozentuale Anteile an CD4 + CD8 + ­Lymphozyten im Blut der Sham­ und 2hit­
Gruppen. Abgebildet sind Mittelwerte ± SEM.
mit Sham­TBC­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einer Scheinoperation und einer
Bimosiamose­Applikation
Sham­s­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einer Scheinoperation und einer
Vehikel­Applikation
2hit­TBC­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einem 2hit und einer
Bimosiamose­Applikation
2hit­s­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einem 2hit und einer Vehikel­
Applikation
* = p < 0,05
5.6.4 NK­Zellen
Die Gabe von Bimosiamose verringerte in den Sham­operierten Mäusen beider Zeitgruppen
im Vergleich zu den Vehikel­behandelten Tieren den Anteil der NK­Zellen an den Lympho­
zyten (Abbildung 28). Dieser lag in der Sham­TBC­48­Gruppe bei 20,7 ± 2,7 % und in den
Sham­s­48­Mäusen bei 25,0 ± 2,7 %. Bei den entsprechenden 96h­Gruppen erhöhten sich die
Werte signifikant auf 41,3 ± 2,5 % bei der Sham­TBC­96­Gruppe und auf 48,6 ± 2,2 % bei
der Sham­s­96­Gruppe (p < 0,05). Dieses Ergebnis der beiden Sham­operierten 96h­Gruppen
war statistisch signifikant (p = 0,049).

Ergebnisse 109
In den CLP­Gruppen besaßen die Vehikel­behandelten Tiere höhere bzw. mit den TBC­
Mäusen vergleichbare NK­Zell­Werte. Der Anteil der NK­Zellen betrug in der CLP­TBC­48­
Gruppe 23,8 ± 4,8 % und in der CLP­s­48­Gruppe 36,0 ± 2,1 % (p < 0,05). Die Werte der
96h­Gruppen waren miteinander vergleichbar und lagen unter denen der 48h­Gruppen (CLP­
s­48 vs CLP­s­96: p < 0,05). Die CLP­TBC­96­Gruppe lag mit einem Anteil von 20,6 ± 1,9 %
nicht signifikant höher als die Vehikel­behandelte Gruppe CLP­s­96 (18,0 ± 1,7 %). Es
bestanden signifikante Konzentrationsunterschiede zwischen den meisten Sham­ und den
entsprechenden CLP­Gruppen (Sham­s­48 vs. CLP­s­48, Sham­TBC­96 vs. CLP­TBC­96,
Sham­s­96 vs. CLP­TBC­96).
NK­Zellen (%)
60
50
40
30
20
10
0
Sham­
TBC­48
*
Sham­s­
48
*
Sham­
TBC­96
*
Sham­s­
96
*
CLP­
TBC­48
*
*
CLP­s­
48
*
*
CLP­
TBC­96
CLP­s­
96
Abbildung 28: Prozentuale Anteile der NK­Zellen im Blut der Sham­ und CLP­Gruppen.
Abgebildet sind Mittelwerte ± SEM.
mit Sham­TBC­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einer Scheinoperation und einer
Bimosiamose­Applikation
Sham­s­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einer Scheinoperation und einer
Vehikel­Applikation
CLP­TBC­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einer CLP und einer
Bimosiamose­Applikation
CLP­s­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einer CLP und einer
Vehikel­Applikation
* = p < 0,05

Ergebnisse 110
In den 48h­Gruppen des 2hit­Modells konnte durch die Applikation von Bimosiamose keine
signifikante Differenz der relativen Menge an NK­Zellen im Vergleich zu den entsprechenden
Vehikel­behandelten Tieren festgestellt werden (Abbildung 29). So lag der Anteil der NK­
Zellen in der 2hit­TBC­48­Gruppe bei 29,3 ± 1,5 % und in der 2hit­s­48­Gruppe bei 29,2 ±
3,3 %. Im Vergleich zur letztgenannten Gruppe konnte bei den 2hit­s­96­Mäusen im Durch­
schnitt ein leichter Anstieg der NK­Zellen festgestellt werden, der jedoch nicht signifikant
war (2hit­s­96­Gruppe: 31,9 ± 2,4 %). In der entsprechenden Bimosiamose­behandelten
Gruppe (2hit­TBC­96) verringerte sich hingegen der Anteil der NK­Zellen auf 22,4 ± 1,3 %.
Es bestand eine statistische Signifikanz zwischen drei Sham­ und den entsprechenden 2hit­
Gruppen (Sham­TBC­48 vs. 2hit­TBC­48, Sham­TBC­96 vs. 2hit­TBC­96, Sham­s­96 vs.
2hit­s­96), sowie zwischen den 2hit­TBC­48­ und den 2hit­TBC­96­Tieren (p = 0,005).
Zudem war die Applikation von Bimosiamose in den 2hit­96­Gruppen signifikant (2hit­TBC­
96­Gruppe vs. 2hit­s­96­Gruppe: p = 0,007).

Ergebnisse 111
NK­Zellen (%)
60
50
40
30
20
10
0
Sham­
TBC­48
*
Sham­s­
48
Sham­
TBC­96
*
*
Sham­s­
96
2hit­
TBC­48
*
*
*
2hit­s­48 2hit­
TBC­96
*
2hit­s­96
Abbildung 29: Prozentualen Anteile der NK­Zellen im Blut der Sham­ und 2hit­Gruppe.
Abgebildet sind Mittelwerte ± SEM.
mit Sham­TBC­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einer Scheinoperation und einer
Bimosiamose­Applikation
Sham­s­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einer Scheinoperation und einer
Vehikel­Applikation
2hit­TBC­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einem 2hit und einer
Bimosiamose­Applikation
2hit­s­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einem 2hit und einer Vehikel­
Applikation
* = p < 0,05
5.6.5 Apoptose
Die Apoptoserate der Lymphozyten konnte in allen Gruppen durch die Applikation von
Bimosiamose verringert werden (Abbildungen 30 u. 31). In der Sham­TBC­48­Gruppe lag die
Apoptoserate bei 4,2 ± 1,8 % (Abbildung 30). Bei den Sham­s­48­Mäusen erhöhte sich dieser
Anteil auf 14,1 ± 1,3 %, dieses Ergebnis war statistisch signifikant (p = 0,001). In der Sham­
TBC­96­Gruppe erhöhte sich die Apoptoserate im Vergleich zu der entsprechenden 48h­

Ergebnisse 112
Gruppe auf 7,0 ± 0,6 %. Die Vehikel­behandelte Sham­96­Gruppe besaß ein Anteil an
apoptotischen Zellen von 8,8 ± 1,1 % (Sham­s­48 vs. Sham­s­96: p = 0,01).
Bei der CLP­TBC­48­Gruppe betrug die Apoptoserate der Lymphozyten 8,9 ± 1,4 %; sie war
geringer ausgeprägt als der apoptotische Lymphozyten­Anteil der Vehikel­behandelten­CLP­
48­Gruppe (10,7 ± 1,2 %). In den 96h­Gruppen erhöhte sich die Rate auf 10,3 ± 1,2 % in der
CLP­TBC­96­Gruppe und auf 11,2 ± 1,3 % bei den CLP­s­96­Mäusen. Signifikante
Konzentrationsunterschiede im Vergleich der Sham­ mit den CLP­Gruppen und innerhalb der
CLP­Gruppen konnten nicht festgestellt werden.
Apoptotische Zellen (%)
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
Sham­
TBC­48
*
Sham­s­
48
*
Sham­
TBC­96
Sham­s­
96
CLP­
TBC­48
CLP­s­
48
CLP­
TBC­96
CLP­s­
96
Abbildung 30: Prozentuale Anteile der apoptotischen Lymphozyten im Blut der Sham­ und
CLP­Gruppe. Abgebildet sind Mittelwerte ± SEM.
mit Sham­TBC­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einer Scheinoperation und einer
Bimosiamose­Applikation
Sham­s­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einer Scheinoperation und einer
Vehikel­Applikation
CLP­TBC­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einer CLP und einer
Bimosiamose­Applikation
CLP­s­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einer CLP und einer
Vehikel­Applikation
* = p < 0,05

Ergebnisse 113
Auch in beiden Zeitgruppen des 2hit­Modells konnte durch die Applikation von Bimosiamose
eine signifikante Verringerung der relativen Menge apoptotischer Zellen erreicht werden
(Abbildung 31). Für die 2hit­TBC­48­Gruppe wurde ein Wert von 8,1 ± 1,2 % ermittelt, der
signifikant niedriger lag (p = 0,024) als das Ergebnis der 2hit­s­48­Mäuse (12,5 ± 1,1 %). Ein
ähnliches Bild ergab sich im Vergleich der 96h­Gruppen (2hit­TBC­96­Gruppe: 9,3 ± 1,1 %;
2hit­s­96­Gruppe: 11,9 ± 0,6 %; p = 0,49).
Apoptotische Zellen (%)
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
Sham­
TBC­48
* * *
*
Sham­s­
48
Sham­
TBC­96
Sham­s­
96
2hit­
TBC­48
2hit­s­48 2hit­
TBC­96
*
2hit­s­96
Abbildung 31: Prozentuale Anteile der apoptotischen Zellen im Blut der Sham­ und 2hit­
Gruppen. Abgebildet sind Mittelwerte ± SEM.
mit Sham­TBC­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einer Scheinoperation und einer
Bimosiamose­Applikation
Sham­s­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einer Scheinoperation und einer
Vehikel­Applikation
2hit­TBC­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einem 2hit und einer
Bimosiamose­Applikation
2hit­s­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einem 2hit und einer Vehikel­
Applikation
* = p < 0,05

Ergebnisse 114
5.6.6 Nekrose und Spätapoptose
In der 48h­Gruppe der Sham­operierten Tiere konnte im Vergleich der Behandlungsgruppen
ein statistisch signifikanter Unterschied zwischen der Sham­TBC­48­Gruppe (1,5 ± 0,6 %)
und den Sham­s­48­Mäusen (4,9 ± 1,1 %) festgestellt werden (p = 0,022) (Abbildung 32). In
der Sham­TBC­96­Gruppe erhöhte sich die Nekrose­ und Spätapoptoserate, während sie sich
in der Sham­s­96­Gruppe stark verringerte. Es bestand ein statistisch signifikanter
Unterschied zwischen den Ergebnissen der Gruppe Sham­s­48­ und Sham­s­96 (p = 0,001).
Zwischen den Nekrose­ und Spätapoptoseraten der Sham­ und entsprechenden CLP­Reihen
gab es zwar deutliche aber keine statistisch signifikanten Differenzen (Abbildung 32). In
beiden CLP­48­Gruppen lag die Rate höher als in den entsprechenden 96h­Reihen. Die
Behandlungsgruppen zeigten im Vergleich untereinander kaum Unterschiede in der Nekrose­
und Spätapoptoserate. Durch die Applikation von Bimosiamose konnte in der CLP­TBC­48­
Gruppe ein Wert von 2,3 ± 0,4 % und bei den CLP­TBC­96­Mäusen ein Anteil von 1,2 ±
0,2 % ermittelt werden (p = 0,004). In der CLP­s­48­Gruppe lag der Satz bei 2,3 ± 0,6 %, der
sich in der entsprechenden 96h­Reihe auf 1,2 ± 0,2 % verringerte.

Ergebnisse 115
Nekrotische/spätapoptotische Zellen (%)
7
6
5
4
3
2
1
0
Sham­
TBC­48
* *
Sham­s­
48
Sham­
TBC­96
Sham­s­
96
CLP­
TBC­48
*
CLP­s­
48
CLP­
TBC­96
CLP­s­
96
Abbildung 32: Prozentuale Anteile der nekrotischen und spätapoptotischen Zellen im Blut
der Sham­ und CLP­Gruppen. Abgebildet sind Mittelwerte ± SEM.
mit Sham­TBC­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einer Scheinoperation und einer
Bimosiamose­Applikation
Sham­s­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einer Scheinoperation und einer
Vehikel­Applikation
CLP­TBC­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einer CLP und einer
Bimosiamose­Applikation
CLP­s­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einer CLP und einer
Vehikel­Applikation
* = p < 0,05
Im Vergleich der 48h­Gruppen des 2hit­Modells konnte durch die Applikation von
Bimosiamose kein deutlicher Unterschied in der relativen Menge der nekrotischen und
spätapoptotischen Zellen festgestellt werden (Abbildung 33). In der 2hit­TBC­48­Gruppe lag
das Ergebnis bei 4,4 ± 0,9 % und bei den 2hit­s­48­Tieren konnte eine Rate von 4,6 ± 0,7 %
ermittelt werden. In beiden 96h­Gruppen verringerte sich der Anteil dieser Zellen, wobei in
der Bimosiamose­behandelten Gruppe ein stärkerer Abfall beobachtet wurde (2hit­TBC­96­
Gruppe: 2,3 ± 0,4 %; 2hit­s­96­Gruppe: 4,4 ± 0,4 %) (2hit­TBC­48 vs. 2hit­TBC­96 und 2hit­
TBC­96 vs. 2hit­s­96: p < 0,05).

Ergebnisse 116
Signifikant höhere Konzentrationen konnten im Vergleich zweier Sham­ mit den
entsprechenden 2hit­Gruppen ermittelt werden (Sham­TBC­48 vs. 2hit­TBC­48 und
Sham­s­96 vs. 2hit­s­96: p < 0,05).
Nekrotische/spätapoptotische Zellen (%)
7
6
5
4
3
2
1
0
Sham­
TBC­48
*
Sham­s­
48
*
Sham­
TBC­96
Sham­s­
96
*
2hit­
TBC­48
*
*
2hit­s­48 2hit­
TBC­96
*
2hit­s­96
Abbildung 33: Prozentuale Anteile der nekrotischen und spätapoptotischen Zellen im Blut
der Sham­ und 2hit­Gruppen. Abgebildet sind Mittelwerte ± SEM.
mit Sham­TBC­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einer Scheinoperation und einer
Bimosiamose­Applikation
Sham­s­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einer Scheinoperation und einer
Vehikel­Applikation
2hit­TBC­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einem 2hit und einer
Bimosiamose­Applikation
2hit­s­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einem 2hit und einer Vehikel­
Applikation
* = p < 0,05

Ergebnisse 117
5.7 Durchflusszytometrische Auswertung von Zytokinen
5.7.1 TNF­α
Die durchschnittliche Plasmakonzentration von TNF­α war in den Bimosiamose­behandelten
Sham­Mäusen geringfügig niedriger als in den entsprechenden Vehikel­Gruppen (Abbildung
34), die Ergebnisse waren nicht signifikant. Die TNF­α­Konzentration der Sham­TBC­48­
Gruppe betrug 103,8 ± 7,5 pg/ml und in der Sham­s­48­Gruppe lag der Wert bei 123,5 ± 17,9
pg/ml. Bei den Sham­TBC­96­Mäusen konnte eine Konzentration von 113,5 ± 22,1 pg/ml
gemessen werden, bei den Sham­s­96­Tieren ein Wert von 129,6 ± 12,7 pg/ml.
In den CLP­Gruppen wurde im Vergleich zu den entsprechenden Sham­Gruppen meist ein
geringer Anstieg der TNF­α­Konzentration im Plasma verzeichnet, der durch die Applikation
von Bimosiamose wieder verringert wurde (Abbildung 34). Die CLP­TBC­48­Gruppe lag mit
einer Konzentration von 144,8 ± 15,9 pg/ml unter dem Wert der CLP­s­48­Tiere von 158,6 ±
15,9 pg/ml. Die Plasmakonzentration der CLP­TBC­96­Mäuse betrug 150,9 ± 21,0 pg/ml und
die der CLP­s­96­Gruppe 149,0 ± 11,7 pg/ml. Ein signifikanter Konzentrationsanstieg lag
zwischen der Sham­TBC­48­ und der CLP­TBC­48­Gruppe vor (p < 0,05).

Ergebnisse 118
TNF­alpha (pg/ml)
200
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
Sham­
TBC­48
Sham­s­
48
*
Sham­
TBC­96
Sham­s­
96
CLP­
TBC­48
CLP­s­
48
CLP­
TBC­96
CLP­s­
96
Abbildung 34: Plasmakonzentration von TNF­α der Sham­ und CLP­Gruppen. Abgebildet
sind Mittelwerte ± SEM.
mit Sham­TBC­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einer Scheinoperation und einer
Bimosiamose­Applikation
Sham­s­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einer Scheinoperation und einer
Vehikel­Applikation
CLP­TBC­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einer CLP und einer
Bimosiamose­Applikation
CLP­s­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einer CLP und einer
Vehikel­Applikation
* = p < 0,05
Die durchschnittliche Plasmakonzentration der einzelnen 2hit­Gruppen lag höher als die der
entsprechenden Sham­Gruppen, wobei die Unterschiede teilweise signifikant waren (Sham­
TBC­48 vs. 2hit­TBC­48 und Sham­s­48 vs. 2hit­s­48: p < 0,05) (Abbildung 35). Beide
Bimosiamose­behandelte Gruppen wiesen niedrigere Werte als die entsprechenden Vehikel­
Gruppen auf (2hit­TBC­48­Gruppe: 199,0 ± 43,1 pg/ml, 2hit­s­TBC­48­Gruppe: 460,6 ±
137,9 pg/ml; 2hit­TBC­96­Gruppe: 176,3 ± 23,5 pg/ml, 2hit­s­96­Gruppe: 250,1 ± 108,8
pg/ml). Zusätzlich wurden in beiden 48h­Gruppen niedrigere Konzentrationen als in den
entsprechenden 96h­Gruppen festgestellt, wobei das Ergebnis der beiden Vehikel­Gruppen
signifikant war (2hit­s­48 vs. 2hit­s­96: p = 0,04).

Ergebnisse 119
TNF­alpha (pg/ml)
700
600
500
400
300
200
100
0
Sham­
TBC­48
Sham­s­
48
*
Sham­
TBC­96
*
Sham­s­
96
2hit­
TBC­48
*
2hit­s­48 2hit­
TBC­96
2hit­s­96
Abbildung 35: Plasmakonzentration von TNF­α der Sham­ und 2hit­Gruppen. Abgebildet
sind Mittelwerte ± SEM.
mit Sham­TBC­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einer Scheinoperation und einer
Bimosiamose­Applikation
Sham­s­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einer Scheinoperation und einer
Vehikel­Applikation
2hit­TBC­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einem 2hit und einer
Bimosiamose­Applikation
2hit­s­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einem 2hit und einer Vehikel­
Applikation
* = p < 0,05
5.7.2 IL­6
Die durchschnittliche Plasmakonzentration von IL­6 wies in den vier Sham­Gruppen nur
geringe Unterschiede auf. In der Sham­TBC­48­ bzw. ­96­Gruppe wurden dabei im Vergleich
tendenziell niedrigere Konzentrationen als in den entsprechenden Vehikel­Gruppen
beobachtet (Sham­TBC­48­Gruppe: 237,5 ± 53,1 pg/ml, Sham­s­48­Gruppe: 392,5 ± 134,3
pg/ml, Sham­TBC­96­Gruppe: 269,7 ± 44,6 pg/ml, Sham­s­96­Gruppe: 318,6 ± 72,6 pg/ml;
Abbildung 36). Die CLP verursachte einen deutlichen Anstieg der IL­6­Konzentration, so

Ergebnisse 120
dass die Ergebnisse der Sham­Gruppen im Vergleich mit den entsprechenden CLP­Gruppen
statistisch signifikant waren (p < 0,05) (Abbildung 36). Die durchschnittliche
Plasmakonzentration der CLP­s­48­Gruppe lag mit 2694,8 ± 1529,5 pg/ml höher als die der
CLP­s­96­Gruppe (769,1 ± 85,4 pg/ml). Die Applikation von Bimosiamose verringerte die
Plasmakonzentration tendenziell. Bei den CLP­TBC­48­Mäusen wurde eine Konzentration
von 1132,2 ± 143,6 pg/ml festgestellt. In der CLP­TBC­96­Reihe lag dieser Anteil bei 589,6
± 23,3 pg/ml.
IL­6 (pg/ml)
7.000
6.000
5.000
4.000
3.000
2.000
1.000
0
Sham­
TBC­48
*
Sham­s­
48
*
Sham­
TBC­96
*
Sham­s­
96
CLP­
TBC­48
*
CLP­s­
48
CLP­
TBC­96
CLP­s­
96
Abbildung 36: Plasmakonzentration von IL­6 der Sham­ und CLP­Gruppen. Abgebildet sind
Mittelwerte ± SEM.
mit Sham­TBC­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einer Scheinoperation und einer
Bimosiamose­Applikation
Sham­s­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einer Scheinoperation und einer
Vehikel­Applikation
CLP­TBC­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einer CLP und einer
Bimosiamose­Applikation
CLP­s­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einer CLP und einer
Vehikel­Applikation
* = p < 0,05

Ergebnisse 121
Durch die Fraktur/Hämorrhagie mit folgender Sepsisinduktion wurden im Plasma der 2hit­
Tiere höhere Konzentrationen als in den entsprechenden Sham­Gruppen ermittelt, die
statistisch signifikant waren (p < 0,05) (Abbildung 37). Im Vergleich der 2hit­Gruppen
untereinander wiesen die 48h­Gruppen höhere Plasmakonzentrationen als die entsprechenden
96h­Gruppen auf. So lag die IL­6­Konzentration der 2hit­TBC­48­Gruppe bei 3023,6 ±
1133,5 pg/ml und die der 2hit­TBC­96­Gruppe bei 1794,2 ± 263,7 pg/ml. Die Vehikel­
behandelte 2hit­s­48­Gruppe besaß eine Plasmakonzentration von 2227,9 ± 533,9 pg/ml, die
sich in der 2hit­s­96­Guppe auf 1912,0 ± 812,4 pg/ml verringerte.
IL­6 (pg/ml)
4.500
4.000
3.500
3.000
2.500
2.000
1.500
1.000
500
0
Sham­
TBC­48
* *
*
*
Sham­s­
48
Sham­
TBC­96
Sham­s­
96
2hit­
TBC­48
2hit­s­48 2hit­
TBC­96
2hit­s­96
Abbildung 37: Plasmakonzentration von IL­6 der Sham­ und 2hit­Gruppen. Abgebildet sind
Mittelwerte ± SEM.
mit Sham­TBC­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einer Scheinoperation und einer
Bimosiamose­Applikation
Sham­s­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einer Scheinoperation und einer
Vehikel­Applikation
2hit­TBC­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einem 2hit und einer
Bimosiamose­Applikation
2hit­s­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einem 2hit und einer Vehikel­
Applikation
* = p < 0,05

Ergebnisse 122
5.7.3 IL­12p70
Die durchschnittliche Plasmakonzentration von IL­12p70 lag im Gegensatz zu der IL­6­ oder
TNF­α­Konzentration in den Sham­Gruppen höher als in den CLP­Gruppen (Abbildung 38).
Dabei zeigten die Bimosiamose­behandelten Sham­Mäuse beider Zeitgruppen niedrigere
Werte als die entsprechenden Vehikel­Gruppen. Die Konzentration in der Sham­TBC­48­
Gruppe betrug 397,8 ± 82,3 pg/ml, in der Sham­s­48­Gruppe dagegen 407,2 ± 89,0 pg/ml.
Diese beiden 48h­Gruppen besaßen niedrigere Plasmakonzentrationen als die 96h­Tiere
beider Gruppen. Der Wert der Sham­TBC­96­Mäuse lag bei 502,7 ± 130,6 pg/ml und der der
Sham­s­96­Gruppe bei 543,0 ± 128,2 pg/ml.
Die Plasmakonzentration von IL­12p70 war in den CLP­Gruppen zwar deutlich, aber nur im
Vergleich der Sham­TBC­96­ zu der CLP­TBC­96­Gruppe auch statistisch signifikant
verringert (p = 0,014) (Abbildung 38). Die beiden 48h­CLP­Gruppen zeigten fast identische
Konzentrationen (CLP­TBC­48­Reihe: 163,5 ± 90,8 pg/ml, CLP­s­48­Reihe: 157,7 ± 38,1
pg/ml). Die durchschnittliche Plasmakonzentration der CLP­TBC­96­Mäuse lag bei 161,0 ±
34,5 pg/ml und der Wert der CLP­s­96­Gruppe betrug 267,0 ± 63,5 pg/ml. Die Applikation
von Bimosiamose bei der CLP erbrachte in beiden Zeitgruppen keine statistisch signifikanten
Konzentrationsunterschiede dieses Zytokins.

Ergebnisse 123
IL­12p70 (pg/ml)
800
700
600
500
400
300
200
100
0
Sham­
TBC­48
Sham­s­
48
Sham­
TBC­96
Sham­s­
96
*
CLP­
TBC­48
CLP­s­
48
CLP­
TBC­96
CLP­s­
96
Abbildung 38: Plasmakonzentration von IL­12p70 der Sham­ und CLP­Gruppen. Abgebildet
sind Mittelwerte ± SEM.
mit Sham­TBC­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einer Scheinoperation und einer
Bimosiamose­Applikation
Sham­s­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einer Scheinoperation und einer
Vehikel­Applikation
CLP­TBC­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einer CLP und einer
Bimosiamose­Applikation
CLP­s­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einer CLP und einer
Vehikel­Applikation
* = p < 0,05
Die Plasmakonzentration von IL­12p70 lag in den Bimosiamose­behandelten 2hit­Gruppen
höher als in den entsprechenden Vehikel­Gruppen, wobei beide 96h­Zeitgruppen höhere
Werte als die vergleichbaren 48h­Tiere aufwiesen (Abbildung 39). Die Unterschiede waren
jedoch nicht signifikant. Mit Ausnahme der Sham­TBC­96­Gruppe wiesen die Sham­Gruppen
tendenziell höhere Werte als die entsprechenden 2hit­Gruppen auf. Die Konzentration in der
2hit­TBC­48­Gruppe betrug 376,4 ± 85,9 pg/ml und der Wert der 2hit­TBC­96­Gruppe lag
bei 547,7 ± 70,8 pg/ml. Im Plasma der 2hit­s­48­Mäuse konnte ein Niveau von 227,9 ± 58,4
pg/ml ermittelt werden, das in der 2hit­s­96­Gruppe auf 448,8 ± 107,4 pg/ml anstieg.

Ergebnisse 124
IL­12p70 (pg/ml)
800
700
600
500
400
300
200
100
0
Sham­
TBC­48
Sham­s­
48
Sham­
TBC­96
Sham­s­
96
2hit­
TBC­48
2hit­s­48 2hit­
TBC­96
2hit­s­96
Abbildung 39: Plasmakonzentration von IL­12p70 der Sham­ und 2hit­Gruppen. Abgebildet
sind Mittelwerte ± SEM.
mit Sham­TBC­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einer Scheinoperation und einer
Bimosiamose­Applikation
Sham­s­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einer Scheinoperation und einer
Vehikel­Applikation
2hit­TBC­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einem 2hit und einer
Bimosiamose­Applikation
2hit­s­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einem 2hit und einer Vehikel­
Applikation
* = p < 0,05
5.7.4 MCP­1
Die durchschnittliche Plasmakonzentration des Zytokins MCP­1 aller Sham­operierten Tiere
lag bei 671,4 ± 59,3 pg/ml (Abbildung 40). Im einzelnen ergaben sich folgende Werte:
Sham­TBC­48: 799,2 ± 75,0 pg/ml, Sham­s­48: 572,0 ± 90,0 pg/ml, Sham­TBC­96: 568,9 ±
91,2 pg/ml und Sham­s­96: 745,3 ± 126,6 pg/ml.

Ergebnisse 125
Die Konzentration der CLP­96­Reihen lag im Wertebereich der Sham­operierten Mäuse
(Abbildung 40). In der 48h­Reihe wurden in beiden CLP­Gruppen signifikant höhere MCP­1­
Konzentrationen als in den entsprechenden 96h­Gruppen festgestellt (p < 0,05). Der Wert der
Bimosiamose­behandelten CLP­Mäuse dieser Zeitgruppe lag bei 1651,7 ± 333,5 pg/ml. Die
Plasmakonzentration der CLP­s­48­Gruppe betrug 8037,3 ± 2333,3 pg/ml. Eine signifikante
Konzentrationserhöhung dieses Zytokins ergab sich zusätzlich in den Gruppen Sham­TBC­48
vs. CLP­TBC­48 und Sham­s­48 vs. CLP­s­48 (p < 0,05).
MCP­1 (pg/ml)
12.000
10.000
8.000
6.000
4.000
2.000
0
Sham­
TBC­48
Sham­s­
48
*
Sham­
TBC­96
*
Sham­s­
96
CLP­
TBC­48
*
CLP­s­
48
*
CLP­
TBC­96
CLP­s­
96
Abbildung 40: Plasmakonzentration von MCP­1 der Sham­ und CLP­Gruppen. Abgebildet
sind Mittelwerte ± SEM.
mit Sham­TBC­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einer Scheinoperation und einer
Bimosiamose­Applikation
Sham­s­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einer Scheinoperation und einer
Vehikel­Applikation
CLP­TBC­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einer CLP und einer
Bimosiamose­Applikation
CLP­s­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einer CLP und einer
Vehikel­Applikation
* = p < 0,05

Ergebnisse 126
Die durchschnittliche Konzentration von MCP­1 der 2hit­96­Reihen lag im Wertebereich der
Sham­operierten Mäuse (Abbildung 41). Bei der 2hit­TBC­96­Gruppe wurde eine
durchschnittliche Plasmakonzentration von 827,8 ± 137,3 pg/ml ermittelt, die 2hit­s­96­
Mäuse besaßen eine Konzentration von 803,3 ± 224,5 pg/ml. In der 48h­Reihe wurden in
beiden 2hit­Gruppen eine signifikant höhere MCP­1­Konzentration festgestellt (p < 0,05). Der
Wert der Bimosiamose­behandelten 2hit­Mäuse dieser Zeitgruppe lag bei 2148,8 ± 545,9
pg/ml. Die Plasmakonzentration der 2hit­s­48­Gruppe betrug 2235,7 ± 216,9 pg/ml.
Weiterhin konnte eine signifikant erhöhte Konzentration im Vergleich der Gruppen Sham­
TBC­48 vs. 2hit­TBC­48 und Sham­s­48 vs. 2hit­TBC­48 (p < 0,05) ermittelt werden.
MCP­1 (pg/ml)
3.000
2.500
2.000
1.500
1.000
500
0
Sham­
TBC­48
*
Sham­s­
48
Sham­
TBC­96
Sham­s­
96
2hit­
TBC­48
*
*
2hit­s­48 2hit­
TBC­96
*
2hit­s­96
Abbildung 41: Plasmakonzentration von MCP­1 der Sham­ und 2hit­Gruppen. Abgebildet
sind Mittelwerte ± SEM.
mit Sham­TBC­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einer Scheinoperation und einer
Bimosiamose­Applikation
Sham­s­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einer Scheinoperation und einer
Vehikel­Applikation
2hit­TBC­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einem 2hit und einer
Bimosiamose­Applikation
2hit­s­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einem 2hit und einer Vehikel­
Applikation
* = p < 0,05

Ergebnisse 127
5.7.5 Interferon­γ
Bei beiden Sham­48­Reihen befand sich bei jeweils drei von sechs Tieren die Konzentration
von IFN­γ im Plasma unter der Nachweisgrenze von 20 pg/ml. In der Sham­TBC­48­Gruppe
lag dadurch die durchschnittliche Konzentration bei 12,5 ± 5,8 pg/ml, die mit dem Wert der
Sham­s­48­Gruppe von 13,3 ± 6,0 pg/ml vergleichbar war. Im Plasma der Sham­TBC­96­
Tiere lag nur in einer von sechs Mäusen IFN­γ oberhalb der Nachweisgrenze in einer
Konzentration von 31 pg/ml vor, woraus sich eine durchschnittliche Plasmakonzentration von
5,2 ± 5,2 pg/ml für die Gesamtgruppe ergab. In der Sham­s­96­Gruppe konnte in vier von
sieben Tieren dieses Zytokin nachgewiesen werden. Der durchschnittliche Wert lag bei 23,4 ±
9,0 pg/ml.
Bei den CLP­TBC­48­Tieren konnte in einer von sechs Mäusen IFN­γ in einer Konzentration
von 39,0 pg/ml detektiert werden. Die durchschnittliche Plasmakonzentration lag in dieser
Gruppe bei 6,5 ± 6,5 pg/ml. Bei zwei von sechs Mäusen konnte in der CLP­s­48­Gruppe IFN­
γ nachgewiesen werden, woraus sich ein durchschnittlicher Wert von 13,5 ± 8,6 pg/ml ergab.
In der 96h­Reihe war weder in der Bimosiamose­ noch in der Vehikel­behandelten Gruppe
IFN­γ oberhalb der Nachweisgrenze im Plasma dektierbar. Die Konzentrationsunterschiede in
manchen Gruppen waren zwar deutlich, aber aufgrund der hohen Anzahl an Tieren, bei denen
IFN­γ unter der Nachweisgrenze lag, in keiner Gruppe statistisch signifikant.
Die Bimosiamose­behandelten 2hit­Gruppen besaßen tendenziell niedrigere Plasma­
konzentrationen als die entsprechenden Vehikelgruppen. In der 2hit­TBC­48­Gruppe wurde
nur in einer von fünf Mäusen IFN­γ in einer Konzentration von 82 pg/ml nachgewiesen,
woraus sich ein durchschnittlicher Wert von 16,4 ± 16,4 pg/ml ergab. In der entsprechenden
96h­Gruppe war in einer von sechs Plasmaproben IFN­γ in einer Konzentration von 33 pg/ml
enthalten. Der durchschnittliche Wert lag bei 5,5 ± 5,5 pg/ml. In der 2hit­s­48­Gruppe wurde
in fünf von sieben Proben dieses Interferon ermittelt (Durchschnittswert: 31,6 ± 9,4 pg/ml).
Bei den 2hit­s­96­Tieren konnte bei zwei von acht Mäusen dieses Zytokin im Plasma

Ergebnisse 128
oberhalb der Nachweisgrenze gemessen werden, woraus sich eine durchschnittliche
Konzentration von 16,8 ± 12,7 pg/ml ergab.
Die Ergebnisse der entsprechenden Gruppen zeigten im Vergleich keine signifikanten
Konzentrationsunterschiede.
5.7.6 IL­10
Von 78 überlebenden Mäusen, die in den dargestellten zwölf Gruppen aufgeteilt waren,
konnte nur in 23 Tieren IL­10 oberhalb der Nachweisgrenze von 20 pg/ml ermittelt werden.
In den Sham­operierten TBC­Gruppen konnte jeweils im Plasma eines Tieres das Zytokin
nachgewiesen werden. In der Sham­TBC­48­Gruppe war in einer Plasmaprobe eine IL­10­
Konzentration von 940 pg/ml enthalten, woraus sich eine durchschnittliche Konzentration von
156,7 ± 156,7 pg/ml ergab (Abbildung 42). In der Sham­TBC­96­Gruppe lag der Einzelwert
bei 674 pg/ml, die Durchschnittskonzentration für die gesamte Gruppe betrug 112,3 ± 112,3
pg/ml.
In den Vehikel­behandelten Sham­Gruppen konnte in jeweils drei von sechs bzw. sieben
Tieren IL­10 nachgewiesen werden. Die durchschnittliche Konzentration der Sham­s­48­
Gruppe lag bei 414,2 ± 199,8 pg/ml, die der Sham­s­96­Gruppe bei 393,3 ± 220,9 pg/ml.
In beiden CLP­48­Gruppen befand sich jeweils ein Tier, bei dem eine IL­10­Konzentration
oberhalb der Nachweisgrenze ermittelt werden konnte. In der CLP­TBC­48­Gruppe lag dieser
Einzelwert bei 517 pg/ml, woraus sich eine Durchschnittskonzentration von 86,2 ± 86,2 pg/ml
ergab (Abbildung 42). Der Einzelwert der CLP­s­48­Gruppe betrug 857 pg/ml
(Durchschnittskonzentration: 142,8 ± 142,8 pg/ml). In der CLP­TBC­96­Gruppe konnte bei
keiner Maus IL­10 im Plasma oberhalb der Nachweisgrenze festgestellt werden. Bei den
CLP­s­96­Mäusen wies ein Tier im Plasma IL­10 in einer Konzentration von 777 pg/ml auf.
Der Durchschnittswert dieser Gruppe lag bei 97,1 ± 97,1 pg/ml.

Ergebnisse 129
Die durchschnittliche Plasmakonzentration der Sham­ und CLP­Gruppen wies im Vergleich
zu­ und untereinander keine Signifikanz auf.
IL­10 (pg/ml)
700
600
500
400
300
200
100
0
Sham­
TBC­48
Sham­s­
48
Sham­
TBC­96
Sham­s­
96
CLP­
TBC­48
CLP­s­
48
CLP­
TBC­96
CLP­s­
96
Abbildung 42: Plasmakonzentration von IL­10 der Sham­ und CLP­Gruppen. Abgebildet
sind Mittelwerte ± SEM.
mit Sham­TBC­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einer Scheinoperation und einer
Bimosiamose­Applikation
Sham­s­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einer Scheinoperation und einer
Vehikel­Applikation
CLP­TBC­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einer CLP und einer
Bimosiamose­Applikation
CLP­s­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einer CLP und einer
Vehikel­Applikation
* = p < 0,05
In den 2hit­TBC­Gruppen wurde bei zwei von fünf bzw. sechs Tieren IL­10 oberhalb der
Nachweisgrenze festgestellt (2hit­TBC­48­Gruppe: 373,2 ± 228,5 pg/ml; 2hit­TBC­96­
Gruppe: 184,2 ± 116,6 pg/ml). Fünf von sieben Tieren der 2hit­s­48­Gruppe synthetisierten
dieses Zytokin, woraus sich eine durchschnittliche Konzentration von 935 ± 461,2 pg/ml
ergab. In der 2hit­s­96­Gruppe lag der Wert bei 473,8 ± 192,0 pg/ml, im Plasma von vier der
acht Mäuse konnte kein IL­10 ermittelt werden (Abbildung 43).

Ergebnisse 130
Die durchschnittlichen Plasmakonzentrationen waren im Gruppenvergleich (Sham­ vs. 2hit­
Gruppen) nicht signifikant.
IL­10 (pg/ml)
1.600
1.400
1.200
1.000
800
600
400
200
0
Sham­
TBC­48
Sham­s­
48
Sham­
TBC­96
Sham­s­
96
2hit­
TBC­48
2hit­s­48 2hit­
TBC­96
2hit­s­96
Abbildung 43: Plasmakonzentration von IL­10 der Sham­ und 2hit­Gruppen. Abgebildet sind
Mittelwerte ± SEM.
mit Sham­TBC­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einer Scheinoperation und einer
Bimosiamose­Applikation
Sham­s­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einer Scheinoperation und einer
Vehikel­Applikation
2hit­TBC­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einem 2hit und einer
Bimosiamose­Applikation
2hit­s­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einem 2hit und einer Vehikel­
Applikation

Ergebnisse 131
5.8 Messung der MPO­Aktivität in der Lunge
Da ein direkter Zusammenhang zwischen dem MPO­Gehalt im Gewebe und der Anzahl der
dort vorhandenen neutrophilen Granulozyten besteht, wurde zur Messung der Akkumulation
der Neutrophilen im Lungengewebe die Aktivität der MPO in der BAL bestimmt.
Die MPO­Aktivität der vier Sham­operierten Versuchsgruppen betrug im Mittel 0,34 ± 0,01
mU/ml/min (Abbildung 44).
Die durchschnittliche MPO­Aktivität in den Bimosiamose­behandelten CLP­Reihen war
geringer als der MPO­Gehalt der entsprechenden Vehikel­Gruppen. So lag das Messergebnis
der CLP­TBC­48­Gruppe bei 0,51 ± 0,02 mU/ml/min und der Wert der CLP­s­48­Mäuse bei
0,55 ± 0,05 mU/ml/min. In den 96h­Gruppen erhöhte sich die Aktivität der MPO bei den
CLP­TBC­96­Mäusen auf 0,57 ± 0,05 mU/ml/min und auf 0,72 ± 0,16 mU/ml/min in der
CLP­s­96­Gruppe (Abbildung 44).
Statistisch signifikante Messergebnisse (p < 0,05) konnten im Vergleich der Sham­ mit den
entsprechenden CLP­Gruppen ermittelt werden.

Ergebnisse 132
MPO (mU/ml/min)
1,0
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0,0
Sham­
TBC­48
*
Sham­s­
48
*
Sham­
TBC­96
*
Sham­s­
96
CLP­
TBC­48
*
CLP­s­
48
CLP­
TBC­96
CLP­s­
96
Abbildung 44: MPO­Aktivität in der BAL der Sham­ und CLP­Gruppen. Abgebildet sind
Mittelwerte ± SEM.
mit Sham­TBC­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einer Scheinoperation und einer
Bimosiamose­Applikation
Sham­s­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einer Scheinoperation und einer
Vehikel­Applikation
CLP­TBC­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einer CLP und einer
Bimosiamose­Applikation
CLP­s­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einer CLP und einer
Vehikel­Applikation
* = p < 0,05
Die Applikation von Bimosiamose bewirkte in den beiden 2hit­Gruppen eine Verringerung
der MPO­Aktivität im Vergleich zu den Vehikel­Gruppen (Abbildung 45). Das Messergebnis
der 2hit­TBC­48­Gruppe lag bei 0,49 ± 0,14 mU/ml/min und der 2hit­s­48­Gruppe bei 0,53 ±
0,08 mU/ml/min. In den 96h­Reihen erhöhte sich die Aktivität der MPO bei den 2hit­TBC­
96­Mäusen auf 1,06 ± 0,34 mU/ml/min und auf 1,11 ± 0,33 mU/ml/min in der 2hit­s­96­
Gruppe.

Ergebnisse 133
Statistisch signifikante Messergebnisse (p < 0,05) konnten im Vergleich der Sham­TBC­96­
und der 2hit­TBC­96­Gruppe sowie der Sham­s­96­ und der 2hit­s­96­Gruppe erhoben
werden.
MPO (mU/ml/min)
1,6
1,4
1,2
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
Sham­
TBC­48
Sham­s­
48
*
Sham­
TBC­96
Sham­s­
96
2hit­
TBC­48
*
2hit­s­48 2hit­
TBC­96
2hit­s­96
Abbildung 45: MPO­Aktivität in der BAL der Sham­ und 2hit­Gruppen. Abgebildet sind
Mittelwerte ± SEM.
mit Sham­TBC­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einer Scheinoperation und einer
Bimosiamose­Applikation
Sham­s­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einer Scheinoperation und einer
Vehikel­Applikation
2hit­TBC­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einem 2hit und einer
Bimosiamose­Applikation
2hit­s­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einem 2hit und einer Vehikel­
Applikation
* = p < 0,05

Ergebnisse 134
5.9 Histologische Auswertung
5.9.1 Lunge
Die histologischen Schnitte der Lungen wurden lichtmikroskopisch auf die Merkmale eines
interstitiellen Ödems und einer interstitiellen Granulozyteninfiltration semiquantitativ
ausgewertet und nach einer Punkteskala bewertet.
In allen Sham­operierten Gruppen fanden sich bei jeweils zwei von sechs bzw. sieben Tieren
eine geringgradige Ausprägung des interstitiellen Ödems (Tabelle 4), bei den restlichen
Mäusen konnten keine Anzeichen für eine interstitielle Verdickung festgestellt werden. Alle
CLP­Gruppen zeigten eine stärkere Ausprägung des Ödems als die entsprechenden Sham­
Tiere. Im Vergleich der CLP­Reihen untereinander wurde bei beiden Bimosiamose­
behandelten­Gruppen ein niedrigerer Score als bei den entsprechenden Vehikel­Gruppen
festgestellt (Tabelle 4). Die Unterschiede zwischen den 48h­ und 96h­Gruppen waren nicht
signifikant. Signifikante Ergebnisse in Bezug auf die Ausprägung eines interstitiellen Ödems
(p < 0,05) konnten zwischen den Gruppen Sham­s­48 und CLP­s­48 sowie Sham­s­96 und
CLP­s­96 ermittelt werden.
In allen Sham­operierten Tieren fanden sich keine Anzeichen einer Granulozyteninfiltration
in das Lungengewebe (Tabelle 4). Die Bimosiamose­behandelten­CLP­Gruppen wiesen
jeweils eine geringere Granulozyteninfiltration als die entsprechenden Vehikel­Gruppen auf,
wobei nur geringe Unterschiede zwischen den Zeitgruppen feststellbar waren. Signifikante
Unterschiede (p < 0,05) in der Ausprägung der Granulozyteninfiltration ergaben sich
zwischen den Gruppen Sham­s­48 und CLP­s­48, Sham­s­96 und CLP­s­96 sowie zwischen
den CLP­s­96­ und CLP­TBC­96­Tieren.

Ergebnisse 135
Tabelle 4: Lichtmikroskopische Befunde im Lungengewebe der Sham­ und CLP­Gruppen.
Nr.
Veränderungsgrad
Score
Gruppe
1. Sham­TBC­48 4 2 0
2. Sham­s­48 4 2 0
3. Sham­TBC­96 4 2 0
4. Sham­s­96 5 2 0
5. CLP­TBC­48 3 3 0
6. CLP­s­48 0 5 1
7. CLP­TBC­96 5 3 1
8. CLP­s­96 1 7 2
­
0
Interstitielles Ödem
Anzahl der Tiere
+
1
++
2
Ø
0,33
± 0,21
0,33
± 0,21
0,33
± 0,21
0,29
± 0,18
0,5
± 0,22
1,17
± 0,17
0,56
± 0,24
1,1
± 0,18
p < 0,05
vs.
­
0
Granulozyteninfiltration
Anzahl der Tiere
+
1
++
2
Ø
6 0 0 0
p < 0,05
vs.
Nr. 6 6 0 0 0 Nr. 6
6 0 0 0
Nr. 8 6 0 0 0 Nr. 8
4 2 0
Nr. 2 0 6 0
7 1 1
Nr. 4 1 9 0
0,33
± 0,21
1
Nr. 2
± 0
0,33
Nr. 8
± 0,24
0,9
Nr. 4, 7
± 0,1
mit Sham­TBC­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einer Scheinoperation und einer
Bimosiamose­Applikation
Sham­s­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einer Scheinoperation und einer
Vehikel­Applikation
CLP­TBC­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einer CLP und einer
Bimosiamose­Applikation
CLP­s­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einer CLP und einer
Vehikel­Applikation
∅ = Mittelwert ± SEM
In den Lungenpräparaten aller 2hit­Reihen konnte im Vergleich mit den entsprechenden
Sham­Gruppen eine tendenziell stärkere Ausprägung des Ödems festgestellt werden (Tabelle
5). Im Vergleich der 2hit­Gruppen untereinander wurde bei den Bimosiamose­behandelten
Tieren ein geringfügig niedrigerer Score als bei den entsprechenden Vehikel­Gruppen
festgestellt. Auch die Unterschiede innerhalb beider Zeitgruppen waren nicht signifikant.
In allen 2hit­Gruppen konnten Anzeichen einer Granulozyteninfiltration in das Lungen­
gewebe nachgewiesen werden (Tabelle 5). Diese Ergebnisse waren im Vergleich mit den

Ergebnisse 136
entsprechenden Sham­Gruppen signifikant (p < 0,05), da bei diesen keine Einwanderung von
Granulozyten ermittelt werden konnte. Die Applikation von Bimosiamose bewirkte in den
Tieren der 2hit­Reihe eine tendenziell geringere Infiltration im Vergleich zu den
entsprechenden Vehikel­Gruppen. In zwei der sieben 2hit­s­48­Tiere konnte sogar eine
hochgradige Infiltration der Granulozyten in das Gewebe festgestellt werden.
Tabelle 5: Lichtmikroskopische Befunde im Lungengewebe der Sham­ und 2hit­Gruppen.
Nr.
Veränderungsgrad
Score
Gruppe
1. Sham­TBC­48 4 2 0
2. Sham­s­48 4 2 0
3. Sham­TBC­96 4 2 0
4. Sham­s­96 5 2 0
5. 2hit­TBC­48 1 5 0
6. 2hit­s­48 2 4 1
7. 2hit­TBC­96 2 4 1
8. 2hit­s­96 2 6 2
­
0
Interstitielles Ödem
Anzahl der Tiere
+
1
++
2
Ø
0,33
± 0,21
0,33
± 0,21
0,33
± 0,21
0,29
± 0,18
0,83
± 0,18
0,86
± 0,26
0,56
± 0,24
1
± 0,21
p < 0,05
vs.
­
0
Granulozyteninfiltration
Anzahl der Tiere
+
1
++
2
Ø
p < 0,05
vs.
6 0 0 0 Nr. 5
6 0 0 0 Nr. 6
6 0 0 0 Nr. 7
6 0 0 0 Nr. 8
1 5 0
0 5 2
1 6 0
0 10 0
0,83
± 0,17
1,29
± 0,18
0,86
± 0,14
1
± 0
mit Sham­TBC­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einer Scheinoperation und einer
Bimosiamose­Applikation
Sham­s­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einer Scheinoperation und einer
Vehikel­Applikation
2hit­TBC­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einem 2hit und einer
Bimosiamose­Applikation
2hit­s­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einem 2hit und einer Vehikel­
Applikation
∅ = Mittelwert ± SEM
Nr. 1
Nr. 2
Nr. 3
Nr. 4

Ergebnisse 137
Abbildung 46: Lunge einer Bimosiamose­behandelten Maus 48 Stunden nach der Scheinoperation,
keine morphologischen Veränderungen (Vergrößerung 400x).
Abbildung 47: Lunge einer Vehikel­behandelten Maus 96 Stunden nach der CLP,
interstitielles Ödem und Granulozyteninfiltration (Vergrößerung 400x).

Ergebnisse 138
5.9.2 Leber
Anhand der histologischen Schnitte konnten die Lebern der Versuchstiere auf die Ausprägung
eines interstitiellen Ödems, der Granulozyteninfiltration und der hydropischen
Zelldegeneration untersucht werden.
Bei allen Sham­operierten Mäusen konnten mit Ausnahme einer Sham­s­96­Maus keine
Veränderungen im Lebergewebe festgestellt werden (Tabelle 6). Die CLP­Gruppen wiesen
gering­ bis mittelgradig veränderte Lebern auf, wobei die Schädigung bei den Bimosiamose­
behandelten Tieren im Vergleich zu den Kontrollgruppen geringer ausgeprägt war. Teilweise
konnten signifikante Ergebnisse ermittelt werden. So betrug der Score­Mittelwert bei der
Ausprägung des interstitiellen Ödems in der CLP­TBC­48­Gruppe 0,33 ± 0,21 und bei den
CLP­s­48­Mäusen 1,17 ± 0,17 (p = 0,041). Beide CLP­96­Gruppen wiesen eine stärkere
Ausprägung des Ödems als die entsprechenden 48h­Gruppen auf.
Bei beiden Bimosiamose­behandelten CLP­Gruppen konnte keine Infiltration von
neutrophilen Granulozyten in das Lebergewebe beobachtet werden (Tabelle 6). Die
Infiltration in den Vehikel­Tieren war gering. Signifikante Ergebnisse lagen nicht vor. Die
hydropische Degeneration war in beiden CLP­TBC­Gruppen weniger ausgeprägt als in den
entsprechenden Vehikel­Gruppen, wobei beide 48h­Reihen geringere Schäden als die 96h­
Gruppen aufwiesen.
Die Ergebnisse der Sham­operierten Mäuse war teilweise signifikant im Vergleich zu den
entsprechenden CLP­Gruppen (interstitielles Ödem p < 0,05 für Sham­s­48 vs. CLP­s­48,
Sham­TBC­96 vs. CLP­TBC­96 und Sham­s­96 vs. CLP­s­96; hydropische Leber­
zelldegeneration p < 0,05 für Sham­TBC­96 vs. CLP­TBC­96 und Sham­s­96 vs. CLP­s­96).

Ergebnisse 139
Tabelle 6: Lichtmikroskopische Befunde im Lebergewebe der Sham­ und CLP­Gruppen.
Nr. Gruppe
Veränderungsgrad
Score
­
0
+
1
++
2
Ø
p < 0,05
vs.
­
0
+
1
++
2
Ø
p < 0,05
vs.
1. Sham­TBC­48 6 0 0 0 6 0 0 0 6 0 0 0
2. Sham­s­48 6 0 0 0 Nr. 6 6 0 0 0 6 0 0 0
3. Sham­TBC­96 6 0 0 0 Nr. 7 6 0 0 0 6 0 0 0 Nr. 7
4. Sham­s­96 6 1 0
5. CLP­TBC­48 4 2 0
6. CLP­s­48 0 5 1
7. CLP­TBC­96 2 7 0
8. CLP­s­96 0 6 3
Interstitielles Ödem Granulozyteninfiltration
Anzahl der Tiere Anzahl der Tiere
­
0
Hydropische Degeneration
Anzahl der Tiere
+
1
++
2
Ø
p < 0,05
vs.
0,14
± 0,15
Nr. 8 7 0 0 0 7 0 0 0 Nr. 8
0,33
± 0,21
Nr. 6 7 0 0 0 5 1 0
0,17
± 0,17
Nr. 7
1,17
± 0,17
Nr. 2, 5 0 5 1
1,17
± 0,17
3 3 0
0,5
± 0,22
0,78
± 0,15
Nr. 3, 8 9 0 0 0 2 7 0
0,78
± 0,15
Nr.3, 5
1,33
± 0,17
Nr. 4, 7 8 1 0
0,11
± 0,11
2 6 1
0,89
± 0,2
Nr. 4
mit Sham­TBC­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einer Scheinoperation und einer
Bimosiamose­Applikation
Sham­s­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einer Scheinoperation und einer
Vehikel­Applikation
CLP­TBC­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einer CLP und einer
Bimosiamose­Applikation
CLP­s­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einer CLP und einer
Vehikel­Applikation
∅ = Mittelwert ± SEM
In allen 2hit­Gruppen war das interstitielle Ödem in der Leber signifikant stärker ausgeprägt
als in den entsprechenden Sham­Gruppen (p < 0,05). Innerhalb der 2hit­Gruppen lag der Grad
dieser Schädigung bei den Vehikel­Tieren tendenziell höher als in den Bimosiamose­Gruppen
(Tabelle 7). So betrug der durchschnittliche Score, der die Ausprägung des interstitiellen
Ödems kennzeichnet, in der 2hit­TBC­48­Gruppe 1 ± 0,26, während in der 2hit­s­48­Gruppe
eine Ausprägung von 1,43 ± 0,34 vorhanden war. Ähnliche Werte wurden bei den 96h­Tieren
ermittelt.
Die Granulozyteninfiltration war bei den 2hit­Gruppen gering ausgeprägt. Durch die Substanz
Bimosiamose konnte in beiden Zeitgruppen die Einwanderung der PMN vermindert werden,

Ergebnisse 140
wobei in den 96h­Gruppen ein niedrigerer Score als bei den entsprechenden 48h­Tieren
ermittelt wurde. Die Ergebnisse der Sham­ und 2hit­Gruppen waren nicht signifikant.
Die hydropische Degeneration der Leberzellen war in allen vier 2hit­Gruppen fast gleichartig
ausgeprägt, wobei der durchschnittliche Score in den Bimosiamose­Gruppen leicht unter
denen der entsprechenden Vehikel­Gruppen lag. Im Vergleich zu den Sham­Gruppen war in
allen 2hit­Gruppen diese Schädigung stärker ausgeprägt, eine signifikante Erhöhung des
Scores bestand zwischen den Gruppen Sham­TBC­96 vs. 2hit­TBC­96 und Sham­s­96 vs.
2hit­s­96 (p < 0,05).
Tabelle 7: Lichtmikroskopische Befunde im Lebergewebe der Sham­ und 2hit­Gruppen.
Nr. Gruppe
Veränderungsgrad
Score
­
0
+
1
++
2
Ø
p < 0,05
vs.
­
0
+
1
++
2
Ø
p < 0,05
vs.
1. Sham­TBC­48 6 0 0 0 Nr. 5 6 0 0 0 6 0 0 0
2. Sham­s­48 6 0 0 0 Nr. 6 6 0 0 0 6 0 0 0
3. Sham­TBC­96 6 0 0 0 Nr. 7 6 0 0 0 6 0 0 0 Nr. 7
4. Sham­s­96 6 1 0
5. 2hit­TBC­48 1 4 1
6. 2hit­s­48 0 4 3
7. 2hit­TBC­96 2 2 3
8. 2hit­s­96 0 6 4
Interstitielles Ödem Granulozyteninfiltration
Anzahl der Tiere Anzahl der Tiere
0,14
± 0,15
1
± 0,26
1,43
± 0,2
1,14
± 0,34
1,4
± 0,16
­
0
+
1
++
2
Ø
p < 0,05
vs.
Nr. 8 7 0 0 0 7 0 0 0 Nr. 8
Nr. 1 5 1 0
Nr. 2 5 2 0
0,17
± 0,17
0,29
± 0,18
2 3 1
3 2 2
Nr. 3 7 0 0 0 2 4 1
Nr. 4 9 1 0
0,1
± 0,11
Hydropische Degeneration
Anzahl der Tiere
4 3 3
0,83
± 0,31
0,86
± 0,34
0,86
± 0,26
0,9
± 0,28
mit Sham­TBC­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einer Scheinoperation und einer
Bimosiamose­Applikation
Sham­s­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einer Scheinoperation und einer
Vehikel­Applikation
2hit­TBC­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einem 2hit und einer
Bimosiamose­Applikation
2hit­s­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einem 2hit und einer Vehikel­
Applikation
∅ = Mittelwert ± SEM
Nr. 3
Nr. 4

Ergebnisse 141
Abbildung 48: Leber einer Bimosiamose­behandelten Maus 96 Stunden nach der
Scheinoperation, keine morphologischen Veränderungen (Vergrößerung 400x).
Abbildung 49: Leber einer Vehikel­behandelten Maus 96 Stunden nach der CLP,
interstitielles Ödem und hydropische Degeneration (Vergrößerung 400x).

Ergebnisse 142
5.9.3 Niere
In den histologischen Schnitten der Niere wurde die Dichte der Mesangiumzellen in den
Glomeruli beurteilt (Glomerulumfülle). Zusätzlich wurde die Granulozyteninfiltration in das
Gewebe untersucht.
Tabelle 8 zeigt, dass in allen Sham­operierten Mäusen mit Ausnahme eines Tieres der Sham­
s­96­Gruppe eine physiologische Dichte der Mesangiumzellen festgestellt werden konnte. In
der CLP­TBC­48­Gruppe war dies ebenfalls der Fall (Score 2 ± 0). Die Vehikel­behandelten
CLP­Gruppen wiesen im Vergleich zu den entsprechenden Bimosiamose­Gruppen eine
tendenziell geringere Fülle der Glomeruli auf, wodurch sich der Score verringerte.
Eine Granulozyteninfiltration in das Nierengewebe konnte nur bei zwei Mäusen der Gruppe
CLP­s­48 festgestellt werden (Score 0,33 ± 0,21). Die Tiere der anderen Gruppen wiesen
keine Zellinfiltration auf.
Die Untersuchung der Nierenpräparate auf die Fülle der Glomeruli und die Granulozyten­
infiltration ergab keine Ergebnisse, die im Gruppenvergleich statistisch signifikant waren.

Ergebnisse 143
Tabelle 8: Lichtmikroskopische Befunde im Nierengewebe der Sham­ und CLP­Gruppen.
Nr.
Veränderungsgrad
Score
Gruppe
+
1
1. Sham­TBC­48 0 6
2. Sham­s­48 0 6
3. Sham­TBC­96 0 6
4. Sham­s­96 1 6
5. CLP­TBC­48 0 6
6. CLP­s­48 2 4
7. CLP­TBC­96 1 8
8. CLP­s­96 2 8
Fülle der Glomeruli
Anzahl der Tiere
++
2
Ø
2
± 0
2
± 0
2
± 0
1,86
± 0,15
2
± 0
1,67
± 0,21
1,89
± 0,11
1,8
± 0,13
p < 0,05
vs.
­
0
Granulozyteninfiltration
Anzahl der Tiere
+
1
++
2
Ø
6 0 0 0
6 0 0 0
6 0 0 0
6 0 0 0
6 0 0 0
4 2 0
0,33
± 0,21
9 0 0 0
10 0 0 0
p < 0,05
vs.
mit Sham­TBC­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einer Scheinoperation und einer
Bimosiamose­Applikation
Sham­s­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einer Scheinoperation und einer
Vehikel­Applikation
CLP­TBC­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einer CLP und einer
Bimosiamose­Applikation
CLP­s­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einer CLP und einer
Vehikel­Applikation
∅ = Mittelwert ± SEM
Im Vergleich der Sham­ mit den entsprechenden 2hit­Gruppen konnte bei den erstgenannten
eine stärkere Fülle der Glomeruli festgestellt werden (Tabelle 9). Die Ergebnisse der Sham­s­
48­ und der 2hit­s­48­Gruppe waren statistisch signifikant (p = 0,035). In den Bimosiamose­
behandelten 2hit­Gruppen wurde in Bezug auf die Glomerulifülle ein höherer Score als in den
entsprechenden Vehikel­Gruppen ermittelt. Bei den TBC­Gruppen verringerte sich der Score
mit zunehmender Zeitdauer. In den Vehikel­Gruppen nahm hingegen der Score bei der 96h­
Gruppe im Vergleich zur 48h­Gruppe zu.

Ergebnisse 144
Alle Sham­operierten Tieren wiesen keine Granulozyteninfiltration in das Nierengewebe auf.
Dieses Ergebnis konnte auch in der 2hit­TBC­48­Gruppe ermittelt werden. In der 96h­Gruppe
wurde in einer von sieben Mäusen eine geringgradige Infiltration beobachtet. Die
entsprechenden Vehikel­behandelten Gruppen wiesen einen tendenziell höheren bzw.
vergleichbaren Score auf (Tabelle 9). Signifikante Unterschiede in Bezug auf die
Granulozyteninfiltration waren zwischen den Sham­ und den 2hit­Gruppen und innerhalb der
beiden Reihen nicht nachweisbar.
Tabelle 9: Lichtmikroskopische Befunde im Nierengewebe der Sham­ und 2hit­Gruppen.
Nr.
Veränderungsgrad
Score
Gruppe
+
1
1. Sham­TBC­48 0 6
2. Sham­s­48 0 6
3. Sham­TBC­96 0 6
4. Sham­s­96 1 6
5. 2hit­TBC­48 2 4
6. 2hit­s­48 5 2
7. 2hit­TBC­96 4 3
8. 2hit­s­96 6 4
Fülle der Glomeruli
Anzahl der Tiere
++
2
Ø
2
± 0
2
± 0
2
± 0
1,86
± 0,15
1,67
± 0,21
1,29
± 0,2
1,43
± 0,2
1,4
± 0,16
p < 0,05
vs.
­
0
Granulozyteninfiltration
Anzahl der Tiere
+
1
++
2
Ø
6 0 0 0
Nr. 6 6 0 0 0
6 0 0 0
6 0 0 0
6 0 0 0
Nr.2 5 2 0
6 1 0
9 1 0
0,29
± 0,2
0,14
± 0,14
0,1
± 0,1
p < 0,05
vs.
mit Sham­TBC­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einer Scheinoperation und einer
Bimosiamose­Applikation
Sham­s­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einer Scheinoperation und einer
Vehikel­Applikation
2hit­TBC­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einem 2hit und einer
Bimosiamose­Applikation
2hit­s­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einem 2hit und einer Vehikel­
Applikation
∅ = Mittelwert ± SEM

Ergebnisse 145
Abbildung 50: Niere einer Bimosiamose­behandelten Maus 48 Stunden nach der Scheinoperation,
keine morphologischen Veränderungen (Vergrößerung 400x).
Abbildung 51: Niere einer Vehikel­behandelten Maus 96 Stunden nach der CLP im Rahmen
des 2hit­Modells, verminderte Glomerulumfülle (Vergrößerung 400x).

Ergebnisse 146
5.9.4 Milz
Die Milzpräparate der Versuchstiere wurden auf nekrotische Veränderungen, auf die
Abgrenzbarkeit der weißen zur roten Milzpulpa und auf die Lymphozytendichte in der weißen
Milzpulpa untersucht.
Nekrotische Veränderungen der Milz konnten in allen Sham­Mäusen mit Ausnahme einer
Sham­TBC­48­Maus nicht beobachtet werden (Tabelle 10). Bei den Bimosiamose­
behandelten CLP­Mäusen wurde in der 48h­Gruppe bei einer von sechs Mäusen eine gering­
gradige Nekrose und in der 96h­Gruppe ein Wert von 0,55 ± 0,18 festgestellt. Zwei von sechs
Vehikel­behandelten CLP­Tieren wiesen in der 48h­Gruppe eine gering ausgeprägte Nekrose
der Milzzellen auf. In der 96h­Gruppe lag der Score bei 0,3 ± 0,15. Im Vergleich der einzel­
nen Gruppen miteinander konnten keine statistisch signifikanten Ergebnisse ermittelt werden.
Bei allen Tieren der Sham­TBC­48­ und der Sham­s­48­Gruppe war die weiße gegen die rote
Milzpulpa abgegrenzbar (Tabelle 10). In der 96h­Zeitgruppe war bei einer von sechs
Bimosiamose­behandelten Sham­Mäusen die Pulpa nicht abgrenzbar (Score 1,17 ± 0,16), bei
den Vehikel­behandelten Tieren erhöhte sich der Score auf 1,29 ± 0,2. In den CLP­Gruppen
war der Wert im Vergleich zu der entsprechenden Sham­Gruppe erhöht, jedoch nicht
signifikant verändert. Beide Bimosiamose­behandelte Gruppen wiesen tendenziell niedrigere
Werte als die vergleichbaren Vehikel­Gruppen auf.
Die Dichte der Lymphozyten in der weißen Milzpulpa war bei den Bimosiamose­behandelten
Sham­Gruppen höher als bei den vergleichbaren Vehikelgruppen (Tabelle 10). Dieses Bild
setzte sich ebenfalls in den CLP­Gruppen fort.
Bei der gesamten histologischen Bewertung der Milz konnten keine statistisch signifikanten
Unterschiede zwischen den Tiergruppen festgestellt werden.

Ergebnisse 147
Tabelle 10: Lichtmikroskopische Befunde im Milzgewebe der Sham­ und CLP­Gruppen.
Nr. Gruppe
Veränderungsgrad
Score
­
0
+
1
1. Sham­TBC­48 5 1 0
++
2
Ø
0,17
± 0,17
p < 0,05
vs.
ja
1
nein
2
6 0
2. Sham­s­48 6 0 0 0 6 0
3. Sham­TBC­96 6 0 0 0 5 1
4. Sham­s­96 6 0 0 0 5 2
5. CLP­TBC­48 5 1 0
6. CLP­s­48 4 2 0
7. CLP­TBC­96 4 5 0
8. CLP­s­96 7 3 0
Nekrose Abgrenzbarkeit der Pulpa
Anzahl der Tiere Anzahl der Tiere
0,17
± 0,17
0,33
± 0,21
0,55
± 0,18
0,3
± 0,15
4 2
3 3
5 4
2 8
Ø
1
± 0
1
± 0
1,17
± 0,17
1,29
± 0,2
1,33
± 0,21
1,5
± 0,22
1,44
± 0,18
0,18
± 0,13
p < 0,05
vs.
Fülle der weißen Pulpa
Anzahl der Tiere
+
1
++
2
1 5
2 4
1 5
2 5
2 4
4 2
4 5
8 2
Ø
1,83
± 0,16
1,67
± 0,21
1,83
± 0,17
1,71
± 0,2
1,67
± 0,21
1,33
± 0,21
1,56
± 0,18
1,2
± 0,13
p < 0,05
vs.
mit Sham­TBC­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einer Scheinoperation und einer
Bimosiamose­Applikation
Sham­s­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einer Scheinoperation und einer
Vehikel­Applikation
CLP­TBC­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einer CLP und einer
Bimosiamose­Applikation
CLP­s­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einer CLP und einer
Vehikel­Applikation
∅ = Mittelwert ± SEM
Im Vergleich zu den scheinoperierten Tiergruppen wurden in jeder 2hit­Gruppe Nekrosen im
Milzgewebe beobachtet, die in den 96h­Gruppen stärker ausgeprägt waren als bei den
entsprechenden 48h­Tieren (Tabelle 11). Ein auffälliges Ergebnis konnte in den beiden 48h­
Gruppen festgestellt werden, da die nekrotischen Veränderungen in der 2hit­TBC­48­Gruppe
stärker ausgebildet waren als in der 2hit­s­48­Gruppe. Im Vergleich der einzelnen Reihen
miteinander konnte zwischen den Ergebnissen der Sham­s­96­ und der 2hit­s­96­Gruppe eine
Signifikanz nachgewiesen werden.

Ergebnisse 148
In den 2hit­Gruppen war die Milzpulpa im Vergleich zu der entsprechenden Sham­Gruppe
tendenziell schlechter abgrenzbar. Es konnte eine signifikanter Unterschied zwischen den
Gruppen Sham­s­96 und 2hit­s­96 festgestellt werden (p = 0,016).
Weiterhin wiesen die 2hit­96­Gruppen höhere Werte als die entsprechenden 2hit­48­Tiere auf.
Bei den 2hit­48­Mäusen konnte in der Vehikel­Gruppe eine geringfügig niedrigerer Score als
in der Bimosiamose­behandelten Gruppe ermittelt werden. In den 96h­Gruppen bewirkte die
Applikation von Bimosiamose jedoch eine verbesserte Abgrenzbarkeit der Pulpa im
Vergleich zur 2hit­s­96­Gruppe. Signifikante Ergebnisse wurden nicht festgestellt.
Die Dichte der Lymphozyten in der weißen Milzpulpa war bei den Bimosiamose­behandelten
Sham­Gruppen höher als bei den vergleichbaren Vehikel­Gruppen (Tabelle 11). Dieses Bild
setzte sich ebenfalls in den 2hit­Gruppen fort, wobei in den Sham­Gruppen ein höherer Score
als in den entsprechenden 2hit­Gruppen festgestellt wurde. Die Unterschiede zwischen den
vergleichbaren Zeitgruppen innerhalb des 2hit­Modells waren nicht signifikant.
Signifikante Ergebnisse für die Fülle der Milzpulpa (p < 0,05) ergaben sich im Vergleich der
Gruppen Sham­TBC­96 vs. 2hit­TBC­96 sowie Sham­s­96 vs. 2hit­s­96.

Ergebnisse 149
Tabelle 11: Lichtmikroskopische Befunde im Milzgewebe der Sham­ und 2hit­Gruppen.
Nr. Gruppe
Veränderungsgrad
Score
­
0
+
1
1. Sham­TBC­48 5 1 0
++
2
Ø
0,17
± 0,17
p < 0,05
vs.
ja
1
nein
2
6 0
2. Sham­s­48 6 0 0 0 6 0
3. Sham­TBC­96 6 0 0 0 5 1
4. Sham­s­96 6 0 0 0 Nr. 8 5 2
5. 2hit­TBC­48 3 3 0
6. 2hit­s­48 6 1 0
7. 2hit­TBC­96 3 4 0
8. 2hit­s­96 5 3 2
Nekrose Abgrenzbarkeit der Pulpa
Anzahl der Tiere Anzahl der Tiere
0,5
± 0,22
0,14
± 0,15
0,57
± 0,2
0,7
± 0,26
3 3
4 3
3 4
Ø
1
± 0
1
± 0
1,17
± 0,17
1,29
± 0,2
0,5
± 0,22
1,43
± 0,22
1,57
± 0,2
p < 0,05
vs.
+
1
++
2
1 5
2 4
1 5
Nr. 8 2 5
4 2
5 2
6 1
Nr. 4 0 10 2 Nr. 4 9 1
Fülle der weißen Pulpa
Anzahl der Tiere
Ø
1,83
± 0,16
1,67
± 0,21
1,83
± 0,17
1,71
± 0,2
1,33
± 0,21
1,29
± 0,18
1,14
± 0,14
1,1
± 0,1
p < 0,05
vs.
mit Sham­TBC­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einer Scheinoperation und einer
Bimosiamose­Applikation
Sham­s­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einer Scheinoperation und einer
Vehikel­Applikation
2hit­TBC­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einem 2hit und einer
Bimosiamose­Applikation
2hit­s­48 bzw. 96 = 48 bzw. 96h­Gruppe mit einem 2hit und einer Vehikel­
Applikation
∅ = Mittelwert ± SEM
Nr. 7
Nr. 8
Nr. 3
Nr. 4

Ergebnisse 150
Abbildung 52: Milz einer Bimosiamose­behandelten Maus 96 Stunden nach der
Scheinoperation, keine morphologischen Veränderungen (Vergrößerung 100x).
Abbildung 53: Milz einer Bimosiamose­behandelten Maus 96 Stunden nach der
Scheinoperation, keine morphologischen Veränderungen (Vergrößerung 400x).

Ergebnisse 151
Abbildung 54: Milz einer Vehikel­behandelten Maus 96 Stunden nach der CLP, verminderte
Abgrenzbarkeit und Fülle der Pulpa (Vergrößerung 100x).
Abbildung 55: Milz einer Vehikel­behandelten Maus 96 Stunden nach der CLP, Nekrose der
Milzpulpa (Vergrößerung 400x).

Diskussion 152
6 Diskussion
Bereits seit Mitte der 70er Jahre sind SIRS und MODS gefürchtete Spätkomplikationen bei
Traumapatienten. Trotz intensiver Bemühungen, die pathogenetischen Zusammenhänge der
Entstehung dieser Syndrome aufzuklären, blieb das MODS die führende Todesursache auf
chirurgischen Intensivstationen mit Mortalitätsraten von bis zu 70 % (RANGEL­FRAUSTO
et al. 1995).
Traumata mit hämorrhagischem Schock, bakterieller Infektion mit folgender Sepsis und
Hypoxie resultieren in der Aktivierung sämtlicher Abwehrsysteme. Die Pathogenese einer
Sepsis und eines hämorrhagischen Schocks sind identisch und die Dysregulation wird durch
die gleichen proinflammatorischen Mediatoren, wie TNF­α, IL­6 und IL­1, verursacht
(SHENKAR et al. 1994; ABRAHAM et al. 1995; ZALLEN et al. 1999). In hohem Maße
werden neutrophile Granulozyten aktiviert (DWENGER et al. 1993). Im Zusammenspiel mit
Adhäsionsmolekülen und Zytokinen sind die PMN die Hauptverantwortlichen für die
entstehenden sekundären Organschäden (KORTHUIS et al. 1994; TASAKI et al. 1999; VAN
GRIENSVEN 1999a; VAN GRIENSVEN et al. 2003). Eine Kombination aus Lungen­,
Nieren­, Leber­ und Herz­Kreislaufversagen (ARDS und MODS) kann für die hohen
Mortalitätsraten verantwortlich gemacht werden.
Die Migration der zirkulierenden neutrophilen Granulozyten in das Gewebe wird durch
spezifische granulozytär­endotheliale Interaktionen reguliert (VAN GRIENSVEN 1999a).
Der erste Schritt, das „Rolling“, wird durch Selektine vermittelt, die sich sowohl auf dem
Endothel (E­ und P­Selektine) als auch auf den neutrophilen Granulozyten (L­Selektine)
befinden (BARGATZE et al. 1994). Das L­Selektin der PMN spielt hierbei eine zentrale
Rolle, da es neben der initialen Adhäsionsfunktion auch eine Signalfunktion in die
neutrophilen Granulozyten hinein besitzt (SPERTINI et al. 1991b; SIMON et al. 1995). Nach
erfolgter Extravasation werden interstitiell inflammatorische Komponenten wie
Sauerstoffradikale, Zytokine und Proteasen freigesetzt, die die Organschäden verursachen.
Neutrophile Granulozyten sind Schlüsselzellen des SIRS und MODS; deshalb spielen auch
die Selektine eine zentrale Rolle in der Pathogenese dieser Syndrome. Ein Therapieansatz ist

Diskussion 153
die Verwendung von Substanzen, die die Selektine inhibieren und dadurch das „Rolling“ als
Initialschritt und somit die Neutrophilenmigration unterdrücken. Eine Möglichkeit ist der
Einsatz eines Antikörpers gegen L­Selektin (LEY et al. 1991; DORE et al. 1993; RAMOS et
al. 1997), wobei allerdings bei wiederholter Applikation an eine Erkennung des Antikörpers
als Antigen gedacht werden muss (VAN GRIENSVEN 1999b). Schon vor der Entwicklung
von Bimosiamose gab es Selektinantagonisten, die überwiegend aus Oligosacchariden
(DEKANY et al. 1997) oder glycosylierten Peptiden (CAPPI et al. 1996) bestanden. Die
Anwendbarkeit dieser Selektinantagonisten ist jedoch aufgrund mehrerer Nachteile sehr
beschränkt. Bimosiamose bewirkt eine kompetitive Hemmung der Bindung von Sialyl­
Lewis x ­Einheiten an E­, P­ und L­Selektine (DAVENPECK et al. 2000), wobei die
Bindungsstärke von Bimosiamose an die Selektine höher ist als von ihren natürlichen
Liganden. Vor diesem Hintergrund wurden in der vorliegenden Arbeit die Interaktionen
zwischen neutrophilen Granulozyten, Lymphozyten und Zytokinen sowie die daraus
entstehenden Organschäden untersucht und der mögliche Einfluss von Bimosiamose auf
Immunmodulation und Organprotektion bei der Entstehung des SIRS und MODS nach
Trauma und Sepsisinduktion dargestellt.
In der Arbeit wurde in einem „two­hit“­Modell an Mäusen die protektive Wirkung von
Bimosiamose untersucht. Als Kontrolltiere dienten Mäuse, denen statt dieser Substanz das
Vehikel von Bimosiamose appliziert wurde. Neben Tiergruppen, bei denen ausschließlich
eine Laparotomie (Scheinoperation) durchgeführt wurde, gab es Tiere, die einer Sepsisinduk­
tion mittels coecaler Ligatur und Punktion (CLP) unterzogen wurden. Das „two­hit“­Modell
bestand zusätzlich aus einer Femurfraktur, die mit einem hämorrhagischen Schock verbunden
war. 48 Stunden später erfolgte bei diesen Tieren der „second­hit“ in Form der CLP. Die
Beobachtungszeit nach der CLP bzw. Scheinoperation betrug 48 bzw. 96 Stunden.
Das Tiermodell bietet die Möglichkeit, die protektive Wirkung von Bimosiamose möglichst
realitätsnah zu untersuchen, da die Kombination aus einem hämorrhagischen Schock und
einer Sepsis bei Polytraumapatienten eine hohe Prävalenz zeigt. Durch die CLP entsteht ein
septischer Herd, von dem zeitweise Bakterien abgegeben werden. Diese intermittierende

Diskussion 154
Bakterienfreisetzung entspricht den pathologischen Veränderungen der meisten Sepsis­
Patienten.
Die Bewertung der möglichen protektiven Funktion von Bimosiamose erfolgte durch den
Vergleich der klinischen Parameter (Mortalität, Körpergewicht, Körpertemperatur und
Aktivität) der Versuchsgruppen. Die Inhibition des „Rollings“ der Granulozyten wurde
mittels Histologie und Messung der MPO­Aktivität verifiziert. Anhand der Konzentration von
TNF­α, IL­6, IL­12p70, MCP­1, IFN­γ und IL­10 im Plasma konnte die pro­ bzw.
antiinflammatorische Immunantwort nach einem definierten Zeitraum quantifiziert und der
Einfluss von Bimosiamose auf das Immunsystem untersucht werden. Weiterhin wurden die
Veränderungen in bestimmten Lymphozytenpopulationen und der Apoptoserate miteinander
verglichen. Die Bewertung der entstandenen Organschäden erfolgte semiquantitativ über die
histologischen Veränderungen in Lunge, Leber, Niere und Milz.
6.1 Klinische Parameter und Mortalität der Versuchstiere
Die Bimosiamose­Intervention änderte in allen Gruppen die Körpertemperatur und das
Aktivitätsniveau nicht signifikant. Individuelle Temperatur­ und Aktivitätsunterschiede
innerhalb der Gruppen ergaben sich durch moribunde Tiere, die innerhalb der nächsten
Versuchstage verstarben und somit vorher deutlich niedrigere Temperaturen aufwiesen.
In allen Versuchsgruppen zeigten sich ein bzw. zwei deutlichere Gewichtsverluste, die sich
zum Zeitpunkt nach der Induktion des traumatisch­hämorrhagischen Schocks und nach der
Induktion der polymikrobiellen Sepsis durch CLP bzw. nach der Scheinoperation befanden.
Diese Gewichtsabnahme ist unmittelbar auf die Manipulation am Tier und auf die Narkose
zurückzuführen. Die Applikation von Bimosiamose hatte in allen Tiergruppen keinen Einfluss
auf das Körpergewicht.
Eine signifikant erhöhte Überlebensrate nach Applikation von Bimosiamose konnte nur in
den CLP­48­Gruppen festgestellt werden. Bimosiamose konnte in dieser behandelten Gruppe

Diskussion 155
auch die Migration und Aktivierung der neutrophilen Granulozyten tendenziell inhibieren.
Dies ergab sich auch aus der Granulozyteninfiltration in Lungen­ und Lebergewebe. Durch
die relativ kurze Halbwertzeit von Bimosiamose von zwei bis vier Stunden lag in den CLP­
Gruppen mit einer Beobachtungszeit von 96 Stunden die Mortalität bei den Bimosiamose­
behandelten Tieren zwar unter der der CLP­s­96­Gruppe, der Unterschied war jedoch nicht
signifikant. In beiden 2hit­Zeitgruppen konnte durch die Bimosiamose­Intervention kein
Einfluss auf das Überleben der Tiere festgestellt werden. Da die Testsubstanz erst nach der
CLP appliziert worden war, ist anzunehmen, das durch den „first­hit“ in Form des
hämorrhagischen Schocks, ausgelöst durch die Fraktur und Hämorrhagie, der Anstieg der
proinflammatorischen Zytokine und die Migration der neutrophilen Granulozyten schon zu
diesem Zeitpunkt stattgefunden haben und Bimosiamose nur noch teilweise die
Neutrophilenmigration inhibieren konnte. Die Auswirkungen der Bimosiamose­Applikation
zum Zeitpunkt der Fraktur/Hämorrhagie könnten Inhalt weiterer Studien sein. Zusätzlich
bestand bei den 2hit­Gruppen die Gefahr, dass Bimosiamose im Stadium der
Immunsuppression verabreicht und sich ein CARS manifestieren könnte. Die Ergebnisse der
Mortalität dieser Arbeit glichen teilweise denen von ANAYA­PRADO et al. (2002), die in
einer Studie an Ratten, an denen ein hämorrhagischer Schock und eine Sepsisinduktion durch
LPS­Applikation durchgeführt worden war, eine verbesserte Überlebensrate nach
Bimosiamosegabe feststellten.
Auffallend war, dass auch in den Vehikel­behandelten CLP­ und 2hit­Kontrollgruppen die
Mortalität geringer als erwartet ausgeprägt war. Bei BREDDIN u. BÖTTCHER (2001) lag die
Mortalität der 2hit­Gruppen, die mit NaCl (0,9 %) behandelt worden waren, mehr als doppelt
so hoch wie die Mortalitätsraten der vergleichbaren Gruppen dieser Arbeit. Ein ähnliches
Verhältnis ergab sich zwischen den NaCl­behandelten­CLP­Gruppen (BEITZE­BREYHAN
2000) und den CLP­s­Tieren der vorliegenden Studie. KENNETH et al. (1998) verzeichneten
hingegen bei Ratten, bei denen eine CLP durchgeführt worden war, eine Überlebensrate von
100 %.

Diskussion 156
6.2 Lymphozytensubpopulationen, NK­Zellen und Apoptoserate
Derzeit werden zwei funktionell verschiedene T­Helfer­Zell­Untergruppen unterschieden.
Während die TH1­Zellen eine vorrangige Rolle bei der zellulären Immunantwort (z.B. bei der
Immunreaktion vom verzögerten Typ) besitzen und v.a. IL­2 und IFN­γ sezernieren,
induzieren TH2­Zellen u.a. durch Bildung von IL­4 und IL­10 die humorale Immunantwort
mit Antikörperbildung durch B­Lymphozyten. Im Verlauf einer Sepsis treten nach zunächst
vorherrschenden phänotypischen TH1­Zellen vermehrt TH2­Lymphozyten auf, begleitet von
einem Anstieg der IL­10­Plasmakonzentration und einem Abfall der IL­2­ und IFN­γ­
Konzentration (sog. TH1/TH2­Shift) (AYALA et al. 1994).
In der hier vorgestellten Arbeit wurde anhand der Reaktion am Ohr der Maus nach
Sensibilisierung und Zweitantigenkontakt die Kontakthypersensibilität, also die Aktivität der
TH1­Lymphozyten, gemessen, was ein verbreitetes und etabliertes Verfahren darstellt
(DHABHAR u. MCEWEN 1997). Die Sepsis führte in allen Gruppen zu einer verminderten
Reaktion, wobei die Ergebnisse der Sham­ im Vergleich zu den entsprechenden CLP­ und
2hit­Gruppen signifikant waren. Dieses Ergebnis verdeutlicht, dass die Sepsis per se die T­
Zellen zugunsten ihrer Konzentration in der Zirkulation mobilisiert und diese nicht mehr der
lokalen Reaktion zur Verfügung stehen. Diese Ergebnisse passen aufgrund identischer
Beobachtungen gut zu vorangehenden Studien (DOUGHTY et al. 1996; OBERBECK et al.
2001; VAN GRIENSVEN et al. 2001). Die Gabe von Bimosiamose verbesserte die
Kontakthypersensibilität tendenziell, ohne allerdings zwischen den vergleichbaren Vehikel­
und Bimosiamose­Gruppen zu signifikanten Unterschieden zu führen. Eine Ausnahme ergab
sich jedoch beim Vergleich der CLP­48­Gruppen (p < 0,05). Die Bimosiamose­behandelte
CLP­Gruppe besaß eine signifikant stärkere Ohrschwellung als die Vehikel­Gruppe, was auf
die Wirkung von Bimosiamose zurückgeführt werden kann. Vermutlich übt Bimosiamose
einen aktivierenden Effekt auf TH1­Zellen aus. Weiterhin können Veränderungen der hier
gemessenen Plasmazytokinkonzentrationen, vor allem die des IL­10, eine Rolle bei der
Inhibition der T­Zellen spielen. Je höher die Konzentration des IL­10 individuell bei einer
Maus war, desto geringer war die Ohrschwellung ausgeprägt, da IL­10 eine inhibierende
Wirkung auf TH1­Zellen ausübt (LI et al. 1994). Mäuse, bei denen die IL­10­Konzentration

Diskussion 157
unter der Nachweisgrenze lag, wiesen im Vergleich zu Tieren mit einem höheren IL­10­Level
eine stärkere Ohrdicke auf. Die Typ­IV­Reaktion der Haut hat durchaus klinische Relevanz.
Eine eher anerge Reaktion bei chirurgischen Patienten korrellierte mit der Häufigkeit einer
Sepsis und mit der Mortalität (CHRISTOU 1985).
Die einzelnen Subpopulationen der T­Lymphozyten reagierten unterschiedlich auf die
Induktion einer Sepsis und die Applikation von Bimosiamose. In den Sham­operierten Tieren
verringerte die Bimosiamose­Gabe signifikant den prozentualen Anteil an CD4 + ­Zellen (TH0­,
TH1­ und TH2­Zellen), wobei in beiden 96h­Gruppen höhere Werte als in den entsprechenden
48h­Gruppen festgestellt werden konnten. Im Vergleich der CLP­ und 2hit­Gruppen
untereinander konnte durch die Applikation von Bimosiamose kein Einfluss auf die CD4 + ­
Zellen festgestellt werden. Auffällig war, dass in allen Gruppen 48 Stunden nach
Sepsisinduktion die Rate der CD4 + ­T­Zellen teilweise signifikant höher lag als nach 96
Stunden. Dies kann auf die einsetzende Immunsuppression zurückzuführen sein.
Nach der Sepsisinduktion kam es in den CLP­Gruppen im Vergleich zu den Sham­Gruppen
zu einem tendenziellen Abfall der CD8 + ­Zellen, der sich im zeitlichen Verlauf stärker
ausprägte. Diese Beobachtung konnte durch eine Studie an NMRI­Mäusen bestätigt werden
(VAN GRIENSVEN 2001). Erklärt werden kann dieser Abfall der CD8 + ­Zellen im Blut
durch den erhöhten Verbrauch dieser Zellart. In der 2hit­Reihe nahm in den 48h­Gruppen der
relative Gehalt der CD8 + ­Zellen zuerst ab, um im zeitlichen Verlauf wieder anzusteigen. Die
Normalwerte der Sham­Gruppen wurden nicht erreicht. Der Anstieg dieser Zellart in der 2hit­
Reihe ist zurückzuführen auf die vermehrte Ausdifferenzierung von CD8 + ­T­
Suppressorzellen, deren Ausbildung mit der Immunsuppression nach einem hämorrhagischen
Schock und der Sepsisinduktion vergesellschaftet ist (VAN GRIENSVEN 2001). Die
Applikation von Bimosiamose hatte in den CLP­ und 2hit­Gruppen keinen Einfluss auf den
Gehalt an CD8 + ­Zellen. Bei den scheinoperierten Mäusen mit einem Beobachtungszeitraum
von 48 Stunden ergab sich durch die Bimosiamose­Applikation ein signifikant verringerter
Gehalt dieser Zellart.

Diskussion 158
Bei einer polymikrobiellen Sepsis wird vor allem in den lymphatischen Organen eine erhöhte
Apoptoserate festgestellt, was eine mögliche Erklärung für eine spätere Immunparalyse sein
kann. So findet man erhöhte Apoptoseraten der unreifen Zellen im Knochenmark, in der Milz
und im Thymus. Allerdings können erst 24 Stunden nach CLP verringerte Zellzahlen in
diesen Geweben festgestellt werden (AYALA et al. 1996a). Die erhöhte Zahl an
apoptotischen Zellen war in früheren Studien fast ausschließlich auf CD4 + ­Zellen beschränkt,
wobei man annimmt, dass die vermehrte Apoptoserate der Lymphozyten durch Fas­Liganden
induziert wird (AYALA et al. 1999). Auch Makrophagen zeigen in späteren Sepsis­Phasen
vermehrt Apoptose, was neben ihrer Areaktivität zur Immunparalyse beiträgt (AYALA et al.
1996b). Durch die Analyse der apoptotischen bzw. spätapoptotischen und nekrotischen Zellen
konnte in dieser Studie gezeigt werden, dass die Gabe von Bimosiamose die Anzahl der
apoptotischen Zellen in allen Gruppen im Vergleich zu den entsprechenden Vehikel­Gruppen
teilweise signifikant verringerte. Auch bei den spätapoptotischen und nekrotischen Zellen
zeigte sich tendenziell dieser antiapoptotische Effekt.
Der Einfluss von Bimosiamose auf die Apoptose der Lymphozyten war auch in der
Proliferationsrate der T­Zellen sichtbar. Sie wurde durch die relative Zahl der „doppelt
positiven“ T­Lymphozyten (CD4 + CD8 + ­Zellen) dargestellt. Die Sepsisinduktion erhöhte in
allen 48h­Gruppen teilweise signifikant die Zahl der doppelt positiven Lymphozyten im
Vergleich zu den Sham­Gruppen. Dadurch stellt die Sepsis per se einen wichtigen Initiator
der Apoptose in T­Lymphozyten dar. 96 Stunden nach Sepsisinduktion bzw. Scheinoperation
konnte eine Verringerung des Gehalts an CD4 + CD8 + ­Zellen festgestellt werden. In den Sham­
Gruppen wurden dadurch wieder die Normalwerte erreicht, in den Gruppen mit einer
Sepsisinduktion kann es ein Hinweis auf eine Immunsuppression sein.
In allen Tiergruppen konnte ein stark erhöhter Anteil an NK­Zellen im peripheren Blut im
Vergleich zu vorangehenden Studien, in denen die Mäuse nach Sepsisinduktion bzw.
Scheinoperation mit NaCl­Lösung (0,9 %) behandelt worden waren, festgestellt werden
(BREDDIN u. BÖTTCHER 2001; WITTWER 2001). Dabei besaßen die Vehikel­
behandelten Tiere einen höheren Gehalt an NK­Zellen als Tiere der entsprechenden
Bimosiamose­Gruppen. Der erhöhte NK­Zell­Anteil aller Gruppen kann der Grund für die

Diskussion 159
verringerte Mortalität vor allem in den Vehikel­behandelten Sepsisgruppen sein. Dieses
beobachtete Verhältnis zwischen erhöhten NK­Zell­Konzentrationen und reduzierter
Mortalität wird auch in der Literatur beschrieben (UCHIDA et al. 1982; GRIFFITH et al.
1984; BLAZER et al. 1986; TARKKANEN et al. 1986; STEPHAN et al. 1987).
Möglicherweise dient die Konzentration der NK­Zellen somit als Prädiktor für die Mortalität
nach Sepsisinduktion und damit als Prognosefaktor für polytraumatisierte Patienten. Im
Gegensatz dazu beschreiben andere Autoren eine verringerte Mortalität nach Depletion der
NK­Zellen in einem zytokininduzierten Schock (HEREMANS et al. 1994; CARSON et al.
1999). Diese Ergebnisse belegen die negativen Auswirkungen, die eine erhöhte NK­Zell­
Proliferation mit sich bringen kann. Einen möglichen Mechansimus kann hierbei eine durch
NK­Zellen hervorgerufene Makrophagenaktivierung darstellen (UNANUE 1996). Somit ist
der Zusammenhang zwischen der NK­Zell­Konzentration und der Mortalität höchstwahr­
scheinlich multifaktorieller Natur und bedarf weiterer Erforschung.
6.3 Zytokine
Der Effekt von Bimosiamose auf die Zytokinspiegel im Plasma wurde untersucht, da die
Zytokine wichtige Mediatoren im Entzündungsgeschehen darstellen.
TNF­α spielt eine Schlüsselrolle in der Pathogenese des septischen Schocks. In diesem
Zustand können im Plasma erhöhte Konzentrationen dieses Zytokins gemessen werden,
wobei hohe TNF­α­Konzentrationen mit einem schlechten „Outcome“ korrelieren (CASEY et
al. 1993; SEEKAMP et al. 1998). Eine weitere Studie widerlegte diese Beobachtungen. Laut
GEBHARD et al. (2000) kann innerhalb der ersten 24 Stunden nach einem Trauma kein
Zusammenhang zwischen dem TNF­α­Spiegel im Plasma und dem Schweregrad des Traumas
hergestellt werden. TNF­α wird von Makrophagen, NK­Zellen und stimulierten neutrophilen
Granulozyten gebildet und wirkt als endogenes Pyrogen. Ferner bewirkt dieses Zytokin
zusammen mit IL­1β eine gesteigerte endotheliale Permeabilität (VAN GRIENSVEN et al.
1999), indem es die Expression von Adhäsionsmolekülen auf den Endothelzellen erhöht.

Diskussion 160
TNF­α hat Einfluss auf die Funktion der neutrophilen Granulozyten, da es die Zytotoxizität
und die Phagozytosefähigkeit dieser Zellen steigert (BONAVIDA 1998; OPPENHEIM 2001).
Es bewirkt weiterhin die Freisetzung anderer proinflammatorischer Zytokine wie IL­1, IL­6
und IL­8. Eine hohe IL­6­Konzentration inhibiert allerdings die TNF­α­Produktion, so dass
hierbei von einer negativen Rückkopplung gesprochen werden kann.
Die Applikation von Bimosiamose hatte in den Sham­ und in den CLP­Gruppen keinen
Einfluss auf die TNF­α­Konzentration. In diesen beiden Reihen lag nur zwischen der
Bimosiamose­behandelten Sham­ und der CLP­48­Gruppe eine signifikante Konzentrations­
erhöhung vor.
Innerhalb der 2hit­Gruppen wurde die TNF­α­Konzentration durch die Applikation von
Bimosiamose tendenziell gesenkt. In beiden 96h­Gruppen verringerte sich die Konzentration
im Vergleich zu der entsprechenden 48h­Gruppe, die Normalwerte der scheinoperierten Tiere
wurden jedoch nicht erreicht. Die Konzentrationsverminderung kann durch die beginnende
Immunsuppression erklärt werden. Die Erhöhung der TNF­α­Konzentration beider 2hit­TBC­
Gruppen waren statistisch signifikant zu den Plasmaspiegeln der entsprechenden Sham­
Gruppen. Die erhöhten TNF­α­Konzentrationen der 2hit­48­Gruppen waren wie in der CLP­
s­48­Gruppe mit erhöhten IL­6­Werten verbunden.
Die Applikation von Bimosiamose verringerte vor allem in den 2hit­Gruppen die
Konzentration dieses Zytokins, da die Migration und Aktivierung der neutrophilen
Granulozyten und infolge dessen die Ausprägung der Entzündungsreaktion vermindert
werden konnten. Der erwartete Konzentrationsrückgang in der Bimosiamose­behandelten
CLP­48­Gruppe blieb aus unbekannten Gründen aus. Anhand der unterschiedlichen TNF­α­
Konzentrationen ist erkennbar, dass dieses Zytokin nach der Sepsisinduktion durch die CLP
und in etwas höherer Konzentration als Antwort auf das „two­hit“­Modell gebildet wurde.
Dabei korrelierten hohe Plasmakonzentrationen mit einer gesteigerten Lungenpermeabilität,
einer vermehrten Granulozyteninfiltration und Ödembildung in der Lunge sowie mit einer
Steigerung der Leberdegeneration. Vor allem bei der Gruppe CLP­s­48, die einen hohen
TNF­α­Spiegel aufwies, konnte eine erhöhte Mortalität im Vergleich zu anderen Gruppen

Diskussion 161
nachgewiesen werden. Allerdings muss erwähnt werden, dass sämtliche Parameter von Tieren
erhoben wurden, die 48 bzw. 96 Stunden nach der Sepsisinduktion noch am Leben waren, so
dass Rückschlüsse von den gemessenen Konzentrationen auf die Ursachen der Mortalität nur
sehr begrenzt möglich sind. Zusätzlich vertreten KENNETH et al. (1998) die Meinung, dass
für den Grad der Organschädigung bei SIRS und MODS nicht der Plasmaspiegel von TNF­α,
sondern dessen Konzentration im Organparenchym entscheidend ist.
IL­6 ist derzeit einer der besten prognostischen Marker bezüglich des „Outcomes“ bei
Patienten mit septischem Schock, SIRS oder MODS (REMICK et al. 2002). Hohe IL­6­
Plasmakonzentrationen sind dabei mit einer schlechten Prognose für die Patienten assoziiert
(GEBHARDT et al. 2000). Das Zytokin wird hauptsächlich von Monozyten, Makrophagen,
B­ und T­Lymphozyten sowie Endothelzellen gebildet, die Synthese kann durch TNF­α und
IL­1 gesteigert werden. IL­6 erhöht die Proliferationsrate von Lymphozyten und fördert die
Aktivität der NK­Zellen. Desweiteren ist es das zentrale Zytokin der „acute­phase­response“
nach Trauma oder Infektion, das die Bildung der Akut­Phase­Proteine in den Hepatozyten
anregt (KELLER et al. 1996).
In den scheinoperierten Tiergruppen konnten durch die Applikation von Bimosiamose keine
signifikanten Konzentrationsunterschiede festgestellt werden. Alle CLP­Gruppen wiesen im
Vergleich zu den entsprechenden Sham­Tieren signifikant höhere IL­6­
Plasmakonzentrationen als Ausdruck der Sepsis auf, was mit einer erhöhten Mortalität
assoziiert war. 48 Stunden nach Sepsisinduktion war in beiden CLP­Behandlungsgruppen
eine signifikante Konzentrationserhöhung messbar. Durch Bimosiamose konnte ein
tendenziell geringerer Anstieg ermittelt werden. Im zeitlichen Verlauf wurde 96 Stunden nach
Sepsisinduktion bei den überlebenden Tieren ein Absinken der Plasmakonzentration von IL­6
festgestellt.
Die 2hit­Gruppen wiesen wie die CLP­Gruppen signifikant höhere IL­6­Konzentrationen als
die entsprechenden Sham­Gruppen auf. Zusätzlich konnte in den 2hit­Gruppen 48 Stunden
nach Sepsisinduktion eine höhere Plasmakonzentration als in den entsprechenden CLP­
Gruppen festgestellt werden. Dieses Ergebnis zeigt, dass IL­6 als ein Marker für die Intensität

Diskussion 162
des Traumas steht. Die Applikation von Bimosiamose hatte keinen Einfluss auf die IL­6­
Konzentration der 2hit­Gruppen, was durch die früher einsetzende Zytokinsekretion infolge
der Fraktur/Hämorrhagie erklärt werden kann. 96 Stunden nach der CLP verringerten sich in
beiden Behandlungsgruppen des „two­hit“­Modells die IL­6­Konzentrationen. Sie lagen
jedoch um das 2,5­fache höher als in den CLP­Gruppen.
IL­6 wird hauptsächlich in der akuten Phase der Immunantwort ausgeschüttet. Der
Konzentrationsrückgang in allen 96h­Gruppen ist auf die kurze Halbwertzeit dieses Zytokins
und auf die beginnende Immunsuppression zurückzuführen.
Das Zytokin IL­12p70 wurde stellvertretend für das IL­12 gemessen. Es induziert zusammen
mit IFN­γ die Differenzierung der T­Lymphozyten zu TH1­Zellen und löst dadurch die
zelluläre Immunantwort aus (ROMANI et al. 1997). Eine verminderte IL­12­Synthese führt
bei Trauma­Patienten zu einer Verlagerung der Immunantwort. Durch die vermehrte
Differenzierung der TH2­Zellen durch IL­4 wird die humorale Immunantwort stärker
ausgebildet, was zu einem schlechteren Outcome der Patienten führt (SPOLARICS et al.
2003). Die Prognose von Patienten mit einem hohen IL­12­Spiegel konnte als günstiger
eingestuft werden als von Patienten mit niedriger Plasmakonzentration, da weniger
Komplikationen durch Infektionen auftraten.
Die IL­12p70­Plasmakonzentration konnte in allen Tiergruppen durch Applikation von
Bimosiamose nicht beeinflusst werden. Im zeitlichen Verlauf nahm in den Behandlungsreihen
der Sham­ und 2hit­Gruppen die Plasmakonzentration zu. Alle Gruppen, bei denen die CLP
als „one­hit“ durchgeführt wurde, zeigten im Vergleich zu den scheinoperierten Tieren
tendenziell verringerte Plasmakonzentrationen. Dies kann durch einen Wechsel der
Immunantwort in Richtung TH2­Zellen (humorale Immunantwort) erklärt werden. Die
erhöhten Konzentrationen der 96h­Gruppen ergaben sich aus der Tatsache, dass IL12p70 ein
T­Zell­abhängiges Zytokin ist. Da aktivierte T­Lymphozyten erst nach drei Tagen aktiv sind,
wird erst ab diesem Zeitpunkt vermehrt IL12p70 synthetisiert.

Diskussion 163
ECHTENACHER et al. (2001) beschrieben, dass IL­12 und IFN­γ zwar für die Immun­
antwort gegen Lipopolysaccharide und für die Resistenz gegen Infektionen notwendig sind.
Eine Verminderung oder ein Fehlen dieser Zytokine hat jedoch keinen Einfluss auf die
Mortalität nach einer CLP bei Mäusen.
Beim MCP­1 handelt es sich um ein Chemokin, das vor allem von Monozyten, Makrophagen
und Endothelzellen nach Stimulation mit LPS, TNF­α, IL­1 oder IFN­γ synthetisiert wird
(YOSHIMURA u. LEONARD 1992). Für die Entstehung der Organdysfunktion nach
hämorrhagischen Schock und Sepsis ist MCP­1 ein besonders wichtiges Zytokin, weil es
chemotaktisch auf Monozyten, Lymphozyten, NK­Zellen und indirekt auch auf neutrophile
Granulozyten wirkt und eine verstärkte Expression von Adhäsionsmolekülen verursacht.
Zeitlich ist es dem IL­6 nachgeordnet (OPPENHEIM 2001; VAN GRIENSVEN et al. 2003).
Die Anwesenheit von IL­1 und TNF­α stimuliert die Freisetzung von MCP­1.
Bei allen scheinoperierten Tieren konnten im Plasma niedrige MCP­1­Konzentrationen
gemessen werden, wobei kein Einfluss durch Bimosiamose feststellbar war. 48 Stunden nach
der CLP als „one­hit“ konnte in der Vehikel­behandelten Tiergruppe eine etwa 11fache
Erhöhung der Zytokinkonzentration festgestellt werden, die durch Applikation von
Bimosiamose in der CLP­TBC­48­Gruppe auf die zweifache Plasmakonzentration der Sham­
Tiere absank. Bereits 96 Stunden nach der CLP lagen die Werte in beiden Behandlungs­
gruppen wieder im Normalbereich, was eine signifikante Verringerung der Konzentration
darstellte.
Vor allem in den CLP­48­Gruppen ergaben sich größere Differenzen zwischen den
Behandlungsgruppen, die auf die Wirkung von Bimosiamose zurückzuführen waren. Da
TNF­α die Synthese von MCP­1 stimuliert, ergab sich eine Abhängigkeit der MCP­1­ von der
TNF­α­Konzentration, die sich in fast allen CLP­ und 2hit­Gruppen widerspiegelte.
In beiden 2hit­48­Behandlungsgruppen stiegen die MCP­1­Werte im vergleichbaren Maße an,
lagen jedoch weit unterhalb der durchschnittlichen Konzentration der Vehikel­behandelten
CLP­Tiere mit einer Beobachtungszeit von 48 Stunden, was auf die frühe Induktion von

Diskussion 164
MCP­1 durch die Femurfraktur, die Hypovolämiephase sowie durch die einsetzende Anergie
erklärt werden kann. Eine Wirkung von Bimosiamose konnte in den 2hit­48­Gruppen nicht
ermittelt werden. Da MCP­1 ein Zytokin darstellt, das zu Beginn einer Entzündung verstärkt
synthetisiert wird, sank seine Konzentration in beiden 2hit­Gruppen mit einer
Beobachtungszeit von 96 Stunden signifikant ab.
BONE­LARSON et al. (2000) bestätigten, dass erhöhte Konzentrationen von MCP­1 mit
einer geringeren Mortalität nach Sepsisinduktion einhergingen. Diese Beobachtung konnte
jedoch vor allem in der Vehikel­behandelten CLP­48­Gruppe nicht gemacht werden, da die
Mortalität dieser Gruppe im Vergleich zur Bimosiamose­Gruppe signifikant erhöht war. Eine
Hemmung von MCP­1 führte bei BONE­LARSON et al. (2000) zu einer verringerten
Überlebensrate nach CLP, was auf eine geringere Chemotaxis und Aktivierung von
Makrophagen und neutrophilen Granulozyten zurückzuführen war. Durch die Applikation
von Anti­MCP­1­Antikörpern verringerte sich die Konzentrationen von IL­12 und IL­13,
während IL­10 und TNF­α anstieg. MCP­1 übt folglich eine schützende Funktion auf Gewebe
und Organe aus, indem es die Synthese anti­inflammatorischer und immunstimulierender
Zytokine steigert (MATSUKAWA et al. 2000). Fraglich ist, ob die relativ geringe Mortalität
der 2hit­Gruppen auf die schon vorhandene Konzentrationserhöhung von MCP­1 durch die
Fraktur/Hämorrhagie zurückzuführen ist.
IFN­γ ist als ein proinflammatorisches Zytokin bei der Pathogenese der Sepsis von
Bedeutung. Es wird hauptsächlich von T­Zellen (CD8 + ­T­Zellen und TH1­Zellen),
Makrophagen und NK­Zellen synthetisiert. Der entscheidende Effekt von IFN­γ ist die
Aktivierung von Makrophagen und neutrophilen Granulozyten, wodurch die Immunabwehr
gegen bakterielle Infektionen gesteigert wird. Zusätzlich verstärkt es die Synthese von TNF­
α, IL­6 und IL­1ß (LIN et al. 1999). IFN­γ stimuliert die Differenzierung und Aktivität der
TH1­Zellen (QUI et al. 2001), inhibiert jedoch die Produktion von IL­4 der TH2­Zellen. NK­
Zellen werden durch das Interferon stimuliert und zur eigenen IFN­γ­Synthese angeregt,
wodurch weitere NK­Zellen aktiviert werden.

Diskussion 165
In der vorliegenden Arbeit lag die Konzentration von IFN­γ in fast allen Gruppen bei mehr als
der Hälfte der Tiere unterhalb der Nachweisgrenze von 20 pg/ml. Demnach besteht kein
Einfluss von IFN­γ auf die Entstehung einer Sepsis. Die Applikation von Bimosiamose
beeinflusste die Zytokinkonzentration nicht.
Erhöhte IL­10­Plasmaspiegel können vor allem bei Patienten mit Sepsis bzw. septischem
Schock und bei Traumapatienten gefunden werden. In der frühen posttraumatischen Phase ist
die Synthese von IL­10 auf neutrophile Granulozyten (WOLK et al. 1999), später auf TH2­
Zellen zurückzuführen (NEIDHARDT et al. 1997). Es inhibiert die T­Zell­ und
Makrophagenfunktion. Die Schwere der Verletzung und die Wahrscheinlichkeit für das
Auftreten von Komplikationen wie Sepsis, ARDS und MODS korrelieren mit der Höhe der
IL­10­Konzentration im Plasma (MARCHANT et al. 1994; NEIDHARDT et al. 1997). Diese
Tatsache ist vor allem auf die immunsuppressiven Eigenschaften von IL­10 zurückzuführen.
LATIFI et al. (2002) und SCHNEIDER et al. (2004) schrieben IL­10 einerseits eine
antiinflammatorische Funktion zu, andererseits betrachteten sie IL­10 als ein Zytokin, das die
frühe Entzündungsantwort nach Auftreten eines SIRS inhibieren und somit das „Outcome“
verbessern kann. Zudem bestimmt es den zeitlichen Übergang von einer frühen reversiblen
Sepsis zu einem irreversiblen septischen Schock.
Im Falle einer Überproduktion von IL­10 kann es zur Entwicklung eines CARS kommen
(BONE 1996b). Läuft die Immunreaktion im physiologischen Ausmaß ab, so wird, wie oben
bereits beschrieben, zuerst TNF­α freigesetzt, das die Produktion weiterer
proinflammatorischer Zytokine wie IL­1 und IL­6 anregt und gleichzeitig eine
Gegenregulation der Immunantwort durch IL­10­Sekretion auslöst (OPPENHEIM 2001).
Im Verlauf einer Sepsis treten nach zunächst vorherrschenden TH1­Zellen vermehrt TH2­
Zellen auf, die IL­10 synthetisieren. Das IL­10 vermindert dabei die Zytokinproduktion der
Erstgenannten. In den Sham­operierten Bimosiamose­Gruppen dieser Arbeit konnte jeweils
im Plasma eines Tieres eine IL­10­Konzentration oberhalb der Nachweisgrenze ermittelt
werden, in den Vehikel­behandelten Gruppen gelang der Nachweis in drei von sechs bzw.
sieben Proben. In den CLP­Gruppen konnte in je einem Tier bzw. in keiner Probe das Zytokin

Diskussion 166
ermittelt werden. Ähnliche Ergebnisse wurden in den Bimosiamose­behandelten 2hit­
Gruppen erzielt. Bei den 2hit­Gruppen, die einer Vehikelbehandlung unterzogen worden
waren, konnte nach einer Beobachtungszeit von 48 Stunden in fünf von sieben Tieren IL­10
nachgewiesen werden, nach 96 Stunden gelang der Nachweis im Plasma bei vier von acht
Tieren. Vor allem in den 2hit­Gruppen konnte ein Einfluss von Bimosiamose auf die Anzahl
der IL­10­positiven Tiere und damit auf die Schwere der Sepsis bzw. des septischen Schocks
festgestellt werden. Ein Wechsel der TH1­ zur TH2­Antwort war vermutlich bei diesen Tieren
schon vollzogen. Zusätzlich wurde der aktivierende Einfluss von Bimosiamose auf die TH1­
Zellen sichtbar. In den Sham­ und CLP­Gruppen handelte es sich um Zufallsbefunde, durch
die keine eindeutige Wirksamkeit von Bimosiamose nachgewiesen werden konnte.
6.4 Organpathologie
In der Pathophysiologie des Polytraumas beeinflusst das „Organ im Schock“ fundamental den
posttraumatischen Verlauf des Patienten. Die Lunge ist, gefolgt von der Leber und den
Nieren, eines der ersten Organe, die eine Dysfunktion aufweist (REGEL et al. 1996). Um
einen Lungenschaden quantifizieren zu können, gibt es mehrere Methoden, wovon vor allem
die Quantifizierung eingewanderter neutrophiler Granulozyten mittels MPO­Bestimmung
oder Histologie von Bedeutung sind. Nach PETERSON (1992) ist die Verwendung zweier
unterschiedlicher Methoden ausreichend, um eine pathophysiologisch signifikante
Veränderung der endothelialen Permeabilität in vivo nachzuweisen.
Nach Induktion der polymikrobiellen Sepsis lag die MPO­Konzentration in allen CLP­ und
2hit­Gruppen meist signifikant höher als bei den entsprechenden Sham­Tieren. Alle Gruppen
mit einer Beobachtungszeit von 96 Stunden wiesen zudem höhere Werte auf als die
vergleichbaren 48h­Gruppen, was auf die länger andauernde Migration von neutrophilen
Granulozyten hinweist. Durch die Applikation von Bimosiamose konnte ein geringes
Absinken der MPO­Konzentration verzeichnet werden. Ähnliche Ergebnisse erhielten
ANAYA­PRADO et al. (2002), die bei Bimosiamose­behandelten Ratten nach
hämorrhagischem Schock und Sepsisinduktion ein Absinken der MPO­Aktivität im Vergleich

Diskussion 167
zu Vehikel­behandelten Tieren nachweisen konnten. Bei einer MPO­Bestimmung in der BAL
muss allerdings immer bedacht werden, dass es zu Abweichungen der Messergebnisse
kommen kann, da in der Lavageflüssigkeit ausschließlich neutrophile Granulozyten
vorhanden sind, die sich im luftführenden System der Lunge befanden; Granulozyten aus dem
Interstitium fließen nicht in die Beurteilung ein.
Alle Sham­operierten Gruppen zeigten bei der histologischen Untersuchung keine Infiltration
von neutrophilen Granulozyten in das Lungengewebe. Auch die Ausprägung eines
geringgradigen Lungenödems war in diesen Gruppen auf Einzeltiere beschränkt. Die Sepsis
verursachte in den CLP­ und 2hit­Gruppen ausgeprägtere Organveränderungen, was durch
weitere Studien bestätigt werden kann (BEITZE­BREYHAN 2000; WITTWER 2001). In
allen Bimosiamose­behandelten Gruppen waren diese Schäden tendenziell geringer
ausgeprägt als unter der Vehikel­Applikation, was auf einen protektiven Effekt von
Bimosiamose vor sekundärer Lungenschädigung schließen lässt. Ein deutlicher Unterschied
zwischen den entsprechenden 48h­ und 96h­Guppen konnte nicht festgestellt werden. Die
Ausprägung der pathologischen Veränderungen war bei den CLP­Tieren etwas geringer als
bei den 2hit­Gruppen.
Die meist geringen Veränderungen der Leber im Vergleich zum Ausmaß der
Lungenschädigung passen zu klinischen Beobachtungen, in denen die Lunge im zeitlichen
Verlauf vor anderen Organsystemen funktionell beeinträchtigt wird (REGEL et al. 1996). Das
interstitielle Ödem war in allen Bimosiamose­behandelten CLP­ und 2hit­Gruppen tendenziell
geringer ausgeprägt als in den entsprechenden Vehikel­Gruppen. Weiterhin wiesen die 2hit­
Reihen eine stärkere Ausprägung als die vergleichbaren CLP­Gruppen auf. Eine
geringgradige, reversible Leberschädigung nach CLP wurde auch von KENNETH et al.
(1998) beschrieben.
Die Ansammlung von Ödemflüssigkeit im interstitiellen Raum der Organe entsteht durch die
Aktivierung neutrophiler Granulozyten, die eine Schädigung des Endothels durch Produkte
des „Respiratory Burst“ und somit eine erhöhte Permeabiliät hervorrufen. Zusätzlich wird das
Organparenchym durch Stoffwechselprodukte der PMN wie beispielsweise Sauerstoffradikale

Diskussion 168
beeinträchtigt, was zur Ödembildung beiträgt. Bimosiamose verhindert die Migration und die
Aktivierung neutrophiler Granulozyten. Dies läßt sich in den histologischen Präparaten auch
anhand der verminderten Granulozyteninfiltration in den Lebern der Bimosiamose­
behandelten CLP­ und 2hit­Tiere feststellen. Die stärkere Ausprägung des Ödems in den 2hit­
Gruppen kann durch den hämorrhagischen Schock beim „first­hit“ erklärt werden. Durch den
Ischämie­bedingten Sauerstoffmangel tritt der anaerobe Stoffwechsel in den Vordergrund, der
sowohl das Leberparenchym als auch das Kapillarendothel schädigt und eine Ödembildung in
den Organen begünstigt.
Die pathohistologische Untersuchung der Leberpräparate umfasste zusätzlich die Feststellung
und Quantifizierung der hydropischen Degeneration der Leberzellen. Bei dieser Form der
Schädigung handelt es sich um einen gestörten Wasserstoffwechsel der Zelle, der sich vor
allem aufgrund eines nicht ausreichenden Sauerstoffangebots und einer energetischen
Insuffizienz entwickelt (ORTEN u. NEUHAUS 1982). Durch die mangelhafte Versorgung
der Zelle wird der „point of no return“ überschritten. Die Zellfunktion wird dauerhaft
beeinträchtigt, was zur Apoptose führen kann. In allen Sham­operierten Tieren konnten keine
Anzeichen einer hydropischen Degeneration festgestellt werden. Die Lebern der
Bimosiamose­behandelten CLP­Gruppen wiesen geringere Zelldegenerationen auf als die
Lebern der Vehikel­Gruppen, wodurch ein protektiver Effekt von Bimosiamose angenommen
werden kann. ANAYA­PRADO et al. (2002) konnten durch die Gabe von Bimosiamose an
Ratten nach Sepsisinduktion die gleiche schützende Wirkung gegen Leberschäden
beobachten. Weiterhin wurde in der vorliegenden Arbeit in den 96h­Reihen eine stärkere
Ausprägung der Degeneration als in den 48h­Gruppen festgestellt. Die Leberpräparate aller
2hit­Gruppen wiesen stärkere degenerative Schädigungen auf als die entsprechenden CLP­
Gruppen. Im Vergleich der 2hit­Tiere untereinander konnten nur geringfügige Unterschiede in
der Ausprägung der Degeneration ermittelt werden. Bimosiamose hatte keinen Einfluss auf
diese Organveränderungen. Dies bestätigt die Aussage, dass eine hydropische Degeneration
besonders nach einer Hypoxie auftritt, die in diesem Fall durch den Blutverlust beim „first­
hit“ entstanden ist. Die hydropische Degeneration der Leber ist ein typischer Spätschaden
nach Ischämie­Reperfusion.

Diskussion 169
Zusätzlich stellt TNF­α ein wichtiges Zytokin bei der Apoptoseinduktion von Leberzellen
nach einer Ischämie dar (RUDIGER et CLAVIEN 2002). Auch in der vorliegenden Arbeit
konnte bei erhöhten TNF­α­Konzentrationen eine verstärkte Apoptose der Leberzellen
festgestellt werden.
CERRA et al. (1980) beschrieben die Niere als eines der letzten Organe, das bei einem
Multiorganversagen affektiert wird. Dabei hatte die Sepsisinduktion vor allem Auswirkungen
auf die Dichte der Mesangiumzellen in den Glomeruli. In allen CLP­ und 2hit­Gruppen
bewirkte die Gabe von Bimosiamose eine geringere Schädigung dieser Zellen. Statistisch
signifikante Ergebnisse konnten jedoch in den wenigsten Fällen ermittelt werden. Bei einigen
Tieren konnte nach Sepsisinduktion eine Granulozyteninfiltration in das Nierengewebe
beobachtet werden. Dadurch bildeten sich jedoch keine Gruppenunterschiede aus, die für die
Beeinflussung des Nierenversagens durch Bimosiamose relevant wären.
Bei der histologischen Untersuchung der Milz auf nekrotische Veränderungen wurden erhöhte
Werte für die CLP­ und 2hit­Gruppen festgestellt, so dass auf eine Initiierung der Nekrosen
durch Sepsis geschlossen werden kann, wobei die Milz ein Bauchorgan mit Nähe zum
septischen Herd ist. Bimosiamose hatte keinen Einfluss auf das Ausmaß der nekrotischen
Veränderungen oder die Anzahl der betroffenen Tiere. Es handelte sich meist um
Zufallsbefunde. Die Abgrenzbarkeit der weißen zur roten Milzpulpa war bei den
Bimosiamose­behandelten Tieren deutlicher als bei den Vehikel­Tieren, die Ergebnisse waren
jedoch selten signifikant. Ähnliche Ergebnisse konnten bei der Beurteilung der Fülle der
weißen Milzpulpa erhoben werden. Die Dichte der T­ und B­Lymphozyten in der weißen
Pulpa war bei allen Vehikel­Gruppen nach Sepsisinduktion geringer als bei den
Bimosiamose­Gruppen, da es durch die Aktivierung des Immunsystems zu einer erhöhten
Migration der Lymphozyten aus der Milz in das Blutgefäßsystem und somit zu einer
Abnahme der Zellen in den Lymphfollikeln kam.

Diskussion 170
6.5 Abschließende Diskussion
Da eine angemessene Kausaltherapie der Sepsis, SIRS und MODS bisher unbekannt ist,
erfolgte die Behandlung mittels einer Kombination aus Schockbekämpfung, einer Antibiose
bei nachgewiesener Infektion und bestmöglichem intensivmedizinischen Management
(DEITCH u. GOODMANN 1999). Die Kenntnis experimenteller Therapieversuche kann
dazu beitragen, regulierend eingreifende Therapiemöglichkeiten zu erforschen.
Zusammenfassend kann gesagt werden, dass der Einfluss von Bimosiamose sich meist
deutlicher in den CLP­Gruppen als in den 2hit­Gruppen zeigte. Diese Beobachtung ist auf die
Tatsache zurückzuführen, das die Applikation der Substanz im „two­hit“­Modell zu einem
Zeitpunkt erfolgte, bei dem das Immunsystem durch den vorangegangenen hämorrhagischen
Schock und die Fraktur schon aktiviert und die Extravasation der neutrophilen Granulozyten
bereits fortgeschritten war. Zusätzlich nahm die Wirkung von Bimosiamose im zeitlichen
Verlauf ab, so dass in den CLP­Gruppen mit einer Beobachtungszeit von 48 Stunden sein
Einfluss auf Blut­ und Organparameter oft am deutlichsten zu erkennen war. Klinische
Parameter sowie die Mortalität wurden durch Bimosiamose tendenziell verbessert. Eine
Ausnahme ergab sich bei der Mortalität der CLP­48­Gruppen. Die Vehikel­behandelten Tiere
zeigten in dieser Gruppe eine signifikant erhöhte Mortalität, was mit den Ergebnissen von
ANAYA­PRADO et al. (2002) übereinstimmt.
Der relative Gehalt der CD4 + ­ und CD8 + ­Lymphozyten wurde durch die Applikation von
Bimosiamose in den CLP­ und 2hit­Gruppen nicht beeinflusst. ANAYA­PRADO et al. (2002)
bestätigen diese Beobachtung. Der antiapoptotische Effekt von Bimosiamose konnte
einerseits durch den Rückgang des relativen Gehalts an apoptotischen, spätapoptotischen und
nekrotischen Zellen und andererseits durch den verminderten Gehalt doppeltpositiver T­
Zellen dargestellt werden. Das Vorhandensein des stark erhöhten NK­Zell­Anteils in allen
Gruppen und seine möglichen Auswirkungen auf die Überlebensrate konnten nicht
abschließend geklärt werden.

Diskussion 171
Die immunmodulatorische Wirksamkeit von Bimosiamose in Bezug auf die gemessenen
Zytokinkonzentrationen im Plasma konnte nicht eindeutig festgestellt werden, da die
Zytokinkonzentration der einzelnen Gruppen selten signifikant zueinander waren. So konnten
beim TNF­α, das als „Schlüsselzytokin des septischen Schocks“ bezeichnet wird, keine
signifikanten Konzentrationsunterschiede gemessen werden. Tendenziell lag jedoch bei
mehreren proinflammatorischen Zytokinen durch Applikation von Bimosiamose ein
Konzentrationsrückgang vor.
Die Migration von neutrophilen Granulozyten in das Organparenchym und die dadurch
verursachten sekundären Organschäden konnten durch Bimosiamose herabgesetzt werden.
Laut den genannten Ergebnissen bedarf es weiterer Studien, bevor Bimosiamose als sinnvolle
Alternative zur Therapie des dysregulierten Immunsystems eingesetzt werden kann.
Forschungsschwerpunkte könnten eine Erhöhung der verabreichten Menge von Bimosiamose
sein. In dieser Arbeit wurde den Tieren eine intravenöse Bolusinjektion 60 min nach der CLP
bzw. Scheinoperation in einer Konzentration von 5 mg/kg verabreicht. Andere Studien, die
die Wirksamkeit von Bimosiamose bestätigen konnten, verabreichten die Substanz in einer
Konzentration von 25 mg/kg 30 min nach der Hämorrhagie zum Zeitpunkt der Reperfusion,
aber 20 Stunden vor der LPS­Applikation (ANAYA­PRADO et al. 2002), so dass die
Hämorrhagie­bedingte Aktivierung des Immunsystems unterdrückt werden konnte. In einer
Arbeit von HICKS et al. (2005) wurde Bimosiamose (Dosierung: 25 mg/kg) 15 min vor der
Induktion einer Peritonitis durch 3%iges Thioglycolat verabreicht. Auch hier wurde die
antiinflammatorische Wirkung von Bimosiamose nachgewiesen.
Die Applikation von Bimosiamose vor Sepsisinduktion oder Hämorrhagie könnte die
Wirksamkeit der Substanz zwar verbessern, aber das Modell wäre weniger realitätsnah, da die
Medikation von Polytraumapatienten vor Einsetzen des Traumas oder am Unfallort nicht
möglich ist. Sinnvoll wäre, im „two­hit“­Modell eine zweimalige Gabe von Bimosiamose
vorzusehen. Die erste Applikation würde nach der Fraktur/Hämorrhagie und die zweite Gabe
nach der CLP erfolgen. Da Bimosiamose im Gegensatz zu anderen Selektinantagonisten, wie
z.B. monoklonalen Antikörpern gegen L­Selektin, mehrmals verabreicht werden kann, ohne

Diskussion 172
dass Nebenwirkungen zu befürchten sind, stellt diese Vorgehensweise ein realitätsnahes
Modell dar, weil auch die Folgen eines Polytraumas bei den Patienten zeitlich versetzt zum
auslösenden Schaden auftreten.

Zusammenfassung 173
7 Zusammenfassung
Binja Bergmann (2006)
Wirkung eines Pan­Selektinantagonisten auf die inflammatorische Immunreaktion in einem
multi­hit­Traumamodell der Maus mit nachfolgender Sepsis.
Bei der Entstehung des Systemischen­Entzündungsantwort­Syndroms (SIRS) und des
Multiorgan­Dysfunktions­Syndroms (MODS) nach Hämorrhagie und Sepsis spielen
pathophysiologisch die neutrophilen Granulozyten eine entscheidende Rolle. Sie gelangen,
von Zytokinen chemotaktisch geleitet, über das Endothel ins Organparenchym, wo sie
schädliche Wirkung ausüben und schließlich zu einem MODS führen können. An der
Interaktion zwischen neutrophilen Granulozyten und dem Endothel sind Adhäsionsmoleküle
wie L­Selektin und Zytokine beteiligt. Selektine und ihre Liganden fördern das „Rolling“ der
Granulozyten und erleichtern die Adhäsion und Migration durch das Endothel.
Das Ziel dieser Studie war, den Einfluss von Bimosiamose auf die Überlebensrate, auf
klinische Untersuchungsparameter, T­Zell­„subsets“, Plasmakonzentrationen von pro­ und
antiinflammatorischen Zytokinen, auf die Adhäsion von Granulozyten und auf die
Organmorphologie zu ermitteln. Zu diesem Zweck wurde ein multi­hit­Traumamodell der
Maus verwendet. Die Sepsisinduktion erfolgte durch coecale Ligatur und Punktion (CLP), der
48 Stunden vorher eine Femurfraktur vorausging. Die Fraktur war mit einem
hämorrhagischen Schock kombiniert.
Der protektive Effekt von Bimosiamose durch Inhibition des L­Selektins und somit durch
Unterdrückung der Neutrophilenmigration in das Gewebe konnte nicht eindeutig festgestellt
werden. Die Wirkung von Bimosiamose war in den CLP­Gruppen zumeist stärker ausgeprägt
als in den 2hit­Gruppen. Die Überlebensrate und die klinischen Parameter wurden durch
Bimosiamose tendenziell verbessert. Die Vehikel­behandelte CLP­Gruppe mit einer
Beobachtungszeit von 48 Stunden zeigte als einzige Gruppe eine signifikant erhöhte

Zusammenfassung 174
Mortalität. In der vergleichbaren Bimosiamose­behandelten Gruppe schienen protektive
Effekte vorhanden zu sein, die sich jedoch nicht in allen untersuchten Parametern äußerten.
Der Gehalt an CD4 + ­ und CD8 + ­Lymphozyten wurde durch die Applikation von
Bimosiamose nicht beeinflusst und der antiapoptotische Effekt war durch den verminderten
Gehalt an apoptotischen und nekrotischen Zellen darstellbar. Die Plasmakonzentration
mehrerer proinflammatorischer Zytokine konnte durch Bimosiamose herabgesetzt werden.
Dieser Rückgang war jedoch nicht signifikant. Jedoch zeigten sich durch Bimosiamose
gewebsprotektive Effekte, die auf eine verminderte Neutrophilenmigration zurückzuführen
waren. Diese ließ sich zusätzlich anhand der verminderten Myeloperoxidaseaktivität in der
bronchoalveolären Lavage (BAL) darstellen. Die histologischen Ergebnisse bestätigten diese
Beobachtungen.

Summary 175
8 Summary
Binja Bergmann (2006)
Effect of a Pan­Selectinantagonist on the inflammatory immune reaction in a multi­hit­
model of mice followed by sepsis.
Neutrophil leucocytes play a decisive role in the pathogenesis of the systemic inflammatory
response syndrome (SIRS) and the multiple organ dysfunction syndrome (MODS) as a result
of hemorrhage and sepsis. Chemotactically conducted by cytokines the neutrophil leucocytes
migrate through the endothelium to get into the parenchyma, where they have a damaging
effect and finally cause a MODS. The interaction between granulocytes and the endothelial
layer is mediated by different adhesion molecules like L­selectin and cytokines. Selectins and
their ligands support granulocyte rolling and facilitate the subsequent firm adhesion and
migration through the endothelium.
The aim of this study was to determine the effect of the selectin inhibitor Bimosiamose on
survival probability, clinical parameters, T­cell­subsets, plasma levels of pro­ and
antiinflammatory cytokines, leukocyte adhesion and organ morphology. For this purpose a
multi­hit­model of systemic damage in mice was used. Sepsis was induced by caecal ligation
and puncture (CLP), which was preceded by a femur fracture 48 hours ago. This fracture was
combined with a hemorrhagic shock.
The protective effect of Bimosiamose on migration of neutrophils by inhibiting L­selectin
could not be identified definitely. The effect of Bimosiamose was in 2hit­groups less
significant than in CLP­groups. Mice treated with Bimosiamose showed insignificantly
improved survival probability and clinical parameters. One of the main results was the
significant high mortality rate within the vehicle­treated CLP­group with a time period of
investigation of 48 hours. In the corresponding Bimosiamose­treated group protective effects
seemed to be existing. However, they did not occur in all of the examined parameters.

Summary 176
The application of Bimosiamose did not influence the percentage of CD4 + ­ and CD8 + ­
lymphocytes and its antiapoptotic effect could be demonstrated through decreased rates of
apoptotic and necrotic cells. Some proinflammatory cytokines showed less plasma levels in
Bimosiamose­treated groups; but the decline was not significant. Nevertheless, Bimosiamose
protected to some extend against secondary organ failure by reducing the migration rate of
neutrophils. This protective effect could be demonstrated through decreased myeloperoxidase
activity in broncho­alveolar lavage (BAL). The histological results confirmed the protective
effects.

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Danksagung 219
10 Danksagung
Herrn Prof. Dr. med. vet. M. Kietzmann danke ich für die bereitwillige Übernahme der
Betreuung und die schnelle Korrektur. Vielen Dank für Ihre Geduld und Ihren Einsatz.
Prof. Dr. rer. biol. human. M. van Griensven: Martijn, auch Dir gilt ein „Dankeschön“.
Durch Deine gute Zusammenarbeit konnten meine Fragen und Probleme während der
Experimente und der anschließenden Auswertung erfolgreich geklärt werden. Meine Hilferufe
per Mail wurden auch in Wien von Dir schnell erhört und beantwortet.
Frau Dr. Tanja Barkhausen, Frau Diana Dudacy und Frau Claudia Pütz möchte ich für die
gute Unterstützung im Labor und für die schnelle Anfertigung der histologischen Präparate
danken.
Herrn Dr. Hoy danke ich für die Beratung in statistischen Dingen.
Ilke und Uwe, an Euch geht ebenfalls ein großer Dank für das Korrekturlesen und für die
Beantwortung der vielen Computer­Fragen.
Ganz besonders danke ich meiner Mutter, auf deren moralische, kulinarische und tatkräftige
Unterstützung ich sowohl während des Tiermedizinstudiums als auch bei der Anfertigung der
Doktorarbeit zu jeder Zeit zählen konnte.
Dr. med. vet. Thomas Grammel, Dir danke ich für die flexiblen Arbeitszeiten während der
Doktorarbeit. Nur dadurch war es möglich, sowohl Praxiserfahrung im Kleintierbereich zu
sammeln, als auch dem ersehnten Doktortitel näher zu kommen.

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