Teil 4

Polymerasekettenreaktion (PCR)
Denaturierung
Annealing
Elongation
5´
5´ 3´
3´ 5´
5´ 3´
3´ 5´
5´ 3´
3´ P
5´
5´ 3´
3´
5´
3´
+
30 – 50 Zyklen
3´
3´
3´ 5´
5´
5´ 3´
3´ 5´
P
3´
5´
5´
3´
5´

Vervielfachung in der Theorie
Zykluszahl Zahl der Kopien des
doppelsträngigen Templats
0 1
1 2
2 4
3 8
4 16
5 32
6 64
7 128
8 256
9 512
10 1 024
20 1 048 576
30 1 073 741 824

Apparat
Thermocycler
min

Zweistufige / dreistufige PCR

Polymerasen

Reaktionsmix
Puffer
MgCl 2
Desoxynukleotide
Primer
Polymerase
Templat

Primer design
Search in nucleotide sequence database
GenBank, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank

BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) -
Algorithmus

Anforderungen an die Primer
• mindestens 17 Nukleotide lang
• ausgeglichener G/C- zu A/T Gehalt
• Schmelzpunkt zwischen 55 und 80 °C
• möglichst gleicher Schmelzpunkt für beide Primer
• keine Haarnadelstruktur
• keine Dimerbildung

Detektion mittels Agarosegelelektrophorese
Nachteile:
Agarose
• hohes Kontaminationsrisiko
• keine exakte Quantifizierung möglich

Amplifikationseffizienz in der Praxis

Quantitative kompetitive PCR
Zugabe eines internen Standards
• wird in unterschiedlichen Konzentrationen zugesetzt
• hat gleiche Sequenz wie Templat
• geringfügig kürzer oder länger als Templat

Real-time PCR mit Sybr Green
PCR
Unbound Sybr Green
Bound Sybr Green

Threshold cycle (Ct-Wert)

Schmelzkurvenanalyse

Ergebnis einer Schmelzkurvenanalyse
(weitere Möglichkeit: Sequenzierung)

Real-time PCR mit einer TaqMan Sonde
Denaturierung
Annealing
Elongation
h
h
h
Taq

eal-time PCR Instrumente

Optimierung von PCR Assays
Grobe Abschätzung der Annealingtemperatur:
Tm = 4 * (G + C) + 2 * (A + T)

Hot-start PCR

Amplifikationseffizienz
E=10 -1/slope
E%=(E-1) x 100

Multiplex Assays
Singleplex Assay
In einem Well:
• 1 Templat
• 2 Primer
• 1 Fluoreszenzmarkierte Sonde
• Mix
Herausforderung:
• Design von 4 kompatiblen Primern und 2 Sonden
• Hohe Amplifikationseffizienz bei unterschiedlichen Mengenverhältnissen
der beiden Template (großer Optimierungsaufwand)
Vorteile des Duplex Assays:
• Kostenersparnis
• Zeitersparnis
• Geringere Menge an Proben-DNA
• Geringere Kontaminationsgefahr
Duplex Assay
In einem Well:
• 2 Template
• 4 Primer
• 2 Fluoreszenzmarkierte Sonden
• Mix

Leistungsfähigkeit der PCR
• exponentielle Amplifikation (in Theorie)
theoretisch nach n Zyklen 2 n fache Vervielfachung des
Templats
• niedrige Nachweisgrenze
theoretisch reicht 1 Templatmolekül aus
• hohe Spezifität

Kontaminationsproblematik
• Kreuzkontaminationen von Probe zu Probe bei der
DNA-Isolierung
• Rückkontamination aus bereits amplifizierter DNA

Kontrollen
Positivkontrollen
Negativkontrollen