ACUE-MB-SKR-C5p - Institut für Analytische Chemie

Institut für Analytische Chemie
Analytisch Chemische Übungen
für Molekularbiologen und Genetiker
Beispiel C5 - HPLC
Analytik von Phenolcarbonsäuren
und
Bestimmung
chromatographischer Kenngrößen
Experimentelle Anleitung

1. Aufgabenstellung
GL 2009
Das vorliegende Beispiel ist als Einführung in die Methodik und Arbeitsweise der
quantitativen Analyse mittels HPLC gedacht, soll aber zusätzlich noch theroretische
Grundlagen praktisch vermitteln.
Das Beispiel gliedert sich in zwei Abschnitte. Im ersten Abschnitt werden die in
einer ausgegebenen Probe enthaltenen drei Naturstoffkomponenten quantitativ
bestimmt. Der zweite Abschnitt widmet sich der Bestimmung von allgemein
wichtigen chromatographischen Kenngrößen. Für das gesamte Beispiel sind zwei
Arbeitstage vorgesehen, wobei jeder Abschnitt an einem Arbeitstag leicht bewältigt
werden kann.
Falls es die Zeit erlaubt, können Aufgaben aus dem zweiten Abschnitt bereits am
ersten Arbeitstag ausgeführt werden. Bei der Bestimmung der Abhängigkeit der
Trennstufenhöhe von der Fließgeschwindigkeit ist allerdings zu beachten, dass der
experimentelle Teil an einem einzigen Tag durchzuführen ist. Weiters ist es
unbedingt notwendig, die Trennsäule am Ende eines jeden Arbeitstages mit
Methanol zu spülen.
Entsprechende Kalkulationen über den notwendigen Zeitbedarf sind daher bei
Abweichung vom vorgegebenen Schema angebracht.
In der ausgegebenen Probe sind folgende Analyten enthalten:
COOH
COOH
COOH
MeO
OH
OMe
OH
OH
OH
OMe
Syringasäure Protochatechusäure Vanillinsäure
(4-Hydroxy-3,5-dimethoxy- (3,4-Dihydroxybenzoesäure) (4-Hydroxy-3-methoxybenzoesäure)
benzoesäure)
Diese Substanzen zählen zur Gruppe der Phenylpropanoide und sind sehr weit verbreitete
Pflanzeninhaltsstoffe. Ihre Bedeutung liegt in ihrer Funktion als Sekundärmetabolite, wobei
sie auch antioxidative Eigenschaften aufweisen. Anzutreffen sind sie z.B. in Heidelbeeren,
Weizen, Kakaostrauch, der Vanilleschote und in verschiedenen Teesorten oder in
Heilpflanzen wie der Mistel, Steinklee oder dem Zitronenbaum.
Diese drei Substanzen werden in der ausgegeben Probe quantitativ bestimmt.
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1. Abschnitt (erster Arbeitstag)
Inbetriebnahme des HPLC-Systems ( Kap. 3.1 & 3.2)
Äquilibrierung der Trennsäule ( Kap. 4.1 & 4.2)
Analyse der Proben (Kap.6) und
Herstellung der Standardlösungen (Kap. 5)
Analyse der Standardlösungen (Kap. 6)
Erstellung der Eichfunktion und quantitative Auswertung
der Probe (Kap. 7)
Ergebnis
richtig ?
Ja
Reinigung der Trennsäule (Kap. 9)
Ausschalten der Geräte (Kap. 10)
Nein
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2. Abschnitt (zweiter Arbeitstag)
Inbetriebnahme des HPLC-Systems ( Kap. 3.1)
Äquilibrierung der Trennsäule ( Kap. 4.1 & 4.2)
Bestimmung von Peakkenngrößen (Kap. 8.1)
Abhängigkeit der Trennstufenhöhe von der
Fließgeschwindigkeit (Kap. 8.2)
Reinigung der Trennsäule (Kap. 9)
Ausschalten der Geräte (Kap. 10)
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2. Beschreibung des chromatographischen Systems
Das verwendete chromatographische System (Abb. 1) besteht aus einer Gradientenpumpe und
den entsprechenden Eluenten, einem Dosiersystem (Injektor) für die Einbringung der Probe in
das Trennsystem, einer Trennsäule und einem variablen Wellenlängendetektor.
Eluent
Power
Detektor
Power
Pumpe
Drain
Abb. 1 : Schematische Darstellung des HPLC-Systems
Die Steuerung des HPLC-System erfolgt vom PC mit der Chromatographiesoftware
EZChrom elite.
2.1 Chromatographische Bedingungen
Eluent A: Wasser UHQ (ultra high quality) versetzt mit 2.0 mL Essigsäure/L + Methanol =
75 + 25 % v/v.
Eluent B: Methanol
Isokratische Elution mit 100 % A.
Fließgeschwindigkeit: 1.0 mL/min
Dosierschleifenvolumen: 20 µL
Trennsäule: LiChroCART LiChrospher RP 18, 125 x 4 mm i.D., 5 µm Partikelgröße
Detektion: UV-Absorption bei 270 nm
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3. Inbetriebnahme des Systems
Vor Inbetriebnahme der Apparatur sollte das Sammelgefäß für das Säuleneluat (Flasche mit
der Aufschrift „Waste“) entleert werden.
3.1. Inbetriebnahme
Eingeschaltet werden Pumpe, Detektor, Computer und Monitor.
Die Anmeldung am Betriebssystem des Computers als Benutzer erfolgt unter „Praktikum“
mit dem Kennwort „alle“.
Danach wird das Programm EZStart aufgerufen.
3.2. Erstellung eines persönlichen Methodenfiles
Im Rahmen des Praktikums verwendet jede Arbeitsgruppe ihr persönliches Methodenfile.
Unter File → Method → open öffnet sich ein Fenster zur Auswahl der Methode. Es wird die
Methode „PCA“ aufgerufen.
Über File → Method → Save as... wird das File unter „PCA-Name“ abgespeichert. Unter
Name kann der eigene Name oder eine Kombination von Namen angegeben werden (z.B.
PCA-Berger). Jede Arbeitsgruppe verwendet nur ein Methodenfile.
Dieses Methodenfile wird sowohl für die Datenaufnahme als auch für die Datenauswertung
verwendet.
4. Vorbereitung des chromatographischen Trennsystem
.
4.1. Spülen der Pumpe
Zum Entfernen von Luftblasen aus den Eluensleitungen zwischen Eluenten und Pumpe wird
das Drain-Ventil der Pumpe (befindet sich vorne in der Mitte der Gradientenpumpe; siehe
Abb. 1) durch eine halbe Umdrehung nach links geöffnet. Über Control → Instrument
Status wird die Seite „Pump“ ausgewählt.
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Auf dieser Seite wird die Schaltfläche „Turn On“ angeklickt und danach die Schaltfläche
„Purge“.
Es öffnet sich daraufhin folgendes Fenster:
Es werden nacheinander alle 4 Eluenten A, B, C und D in „Solvent selection“ ausgewählt,
mit „Purge On“ aktiviert und für die Dauer von 0,5 - 1 min aktiv gehalten.
Mit „Purge Off“ und „Close“ wird der Vorgang beendet.
Danach wird das Drain-Ventil wird durch eine (halbe) Umdrehung nach rechts geschlossen.
! Achtung: Das Drain-Ventil soll relativ fest geschlossen werden!
4.2. Äquilibrierung der Trennsäule
Zur Äqulibrierung der Trennsäule wird auf der Seite „Pump“ die Funktion „Manual Set“
aktiviert und folgende Parameter werden wie abgebildet eingestellt (Hinweis: %A wird über
die Eingabefelder %B, %C und %D gesteuert: A+B+C+D = 100 %): %A =100,
Max Pressure = 250 bar, Flow = 1.0 mL/min.
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Nach Eingabe der Parameter wird das Fenster mit „OK“ geschlossen.
Die Trennsäule wird 20 – 30 Minuten lang äquilibriert.
! Für eine optimale Zeitausnutzung sollte danach mit der Dosierung der Probe
begonnen werden (siehe Kap.6). Jede Probe wird 4 x dosiert. Zwischen den
Analysenläufen werden die Standardlösungen hergestellt!
5. Herstellung der Standardlösungen
.
5.1 Herstellung der Einkomponentenstandardlösungen (Stammlösungen)
Für jede Substanz wird ein eigener 25 mL Meßkolben verwendet, in dem die
Standardsubstanz direkt eingewogen wird. Insgesamt werden 3 Meßkolben benötigt. Um den
Fehler bei der Einwaage gering zu halten, werden ca. 50 mg bis maximal 100 mg
Reinsubstanz eingewogen. Danach werden die Substanzen in ca. 10 - 15 mL Methanol
gelöst. Für die vollständige Lösung der Standardsubstanzen ist es von Vorteil, die Kolben für
ca. 2 Minuten in das Ultraschallbad zu stellen. Danach wird mit Wasser (entionisiert oder
bidestilliert) bis zur Marke aufgefüllt und mehrmals durchgemischt. Es muß eine klare
Lösung vorliegen
5.2. Herstellung der Mehrkomponentenstandardlösungen (Mischstandards)
Aus den Einkomponentenstandardlösungen werden danach die zur Eichung für die HPLC
verwendeten Standardlösungen hergestellt, die immer alle 3 Komponenten enthalten
(Mehrkomponentenmischungen). Jede Komponente soll den Konzentrationsbereich von 50 –
250 µg/mL abdecken. Die einzelnen Standardsubstanzen in den Mischungen können die
gleiche Konzentration oder unterschiedliche Konzentrationen aufweisen. Es werden
mindestens 5 Mehrkomponentenstandardlösungen (z.B. 50, 100, 150, 200, 250 µg/mL von
jeder Komponente in der Mischung) hergestellt. Diese Standardlösungen werden entweder
aus einer konzentrierten Mehrkomponentenstandardlösung durch Verdünnen erhalten oder
jeweils aus den Einkomponentenstandardlösungen hergestellt. Die Verdünnungen werden
mittels verstellbarer Kolbenhubpipetten (100 µL und 1 mL) in 1,5 mL Eppendorfgefäßen
hergestellt. Verdünnt wird mit destilliertem Wasser.
Von jeder Standardlösung sollten mindestens 300 µL für die Eichung vorhanden sein.
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6. Analyse der Proben und Standardlösungen
6.1. Vorbereitung des Datensystems
Der folgende Vorgang wird allgemein für die Analyse von Standard- bzw. Probelösungen
durchgeführt:
Über Control → Single Run öffnet sich folgendes Fenster:
In dem geöffneten Fenster kann unter „Sample ID“ eine Beschreibung der Probe abgelegt
(z.b. Probe Berger, Standard 70 µg/mL .... ) werden.
Unter „Data File“ wird der Filename eingegeben. Eine Verknüpfung mit dem eigenen
Namen erscheint im Rahmen des Praktikums sinnvoll (z.B. Berger1, Berger2,.... Berger-
STD1, Berger-STD 200...). Unter diesem Namen wird das Datenfile nach Ende des
Analysenlaufes automatische abgespeichert und kann danach zur Auswertung geöffnet
werden. Die Funktionen „Print method report“ und „Calibrate“ sind deaktiviert.
Danach wird „Start“ angeklickt. Die Datenaufnahme startet hierbei noch nicht, sondern erst
nach Dosierung der Probe.
Wenn am unteren Rand des Programmfensters die Nachricht „Waiting for Trigger“
erscheint, kann mit der Dosierung der Probe bzw. Standards begonnen werden (siehe
Abschnitt 6.2).
Ein Analysenlauf dauert 10 Minuten (automatische Beendigung), danach kann erneut ein
Analysenlauf gestartet werden.
Hinweis: Einstellung der Zeitachse für die Darstellung des Chromatogramms.
In manchen Fällen (z.B. bei der Aufnahme von Chromatogrammen bei unterschiedlichen
Fließgeschwindigkeiten in Abschnitt 8.2.) ist es notwendig, die Zeitachse zur Darstellung der
Chromatogramme zu ändern. Dazu wird der Cursor an einer Stelle im Chromatogrammfenster
positioniert und durch Drücken der rechten Maustaste das Kontextmenü aufgerufen. Es wird
„Axis Setup“ ausgewählt und in dem sich nun öffenden Fenster wird entweder „Autoscale“
ausgewählt oder ein Wert für die Zeitachse eingegeben.
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Beispielchromatogramm:
Neben dem Chromatogramm (grüne Linie) werden auch die Basislinie (rot) bzw. die Marker
für Peakanfang (hellblau) und Peakende (gelb) angezeigt (nach Auswertung des
Chromatogramms).
6.2. Anleitung zur Dosierung von Probe und Standard
Der Schalthahn des Dosiersystems wird entgegen dem uhrzeigersinn von der Stellung „Inject“
in die Stellung „Load“ gedreht. Ein zügiges Umschalten ist notwendig, da zwischen den
beiden Positionen keine Eluentenförderung möglich ist und der Druck bis zum eingestellten
Druckmaximum der Pumpe ansteigen kann (bewirkt ein automatisches Abschalten der
Pumpe).
In die 100 µL Hamilton Dosierspritze werden ca. 40 µL Probe- oder Standardlösung
aufgezogen 1 . Diese Lösung wird verworfen und danach werden nochmals ca. 80 – 100 µL
Lösung aufgezogen. Vorne in der Mitte des Dosiersystems befindet sich eine kleine
kreisrunde Öffnung, in die nun die Dosierspritze eingeführt wird, bis ein fester Widerstand
spürbar ist. Das gesamte Volumen wird dosiert (ohne Luftblasen !). Danach wird die
Dosierspritze wieder herausgezogen und der Schalthahn wiederum zügig in die Position
„inject“ gedreht.
Dadurch gelangt die Probelösung von der Dosierschleife auf die Trennsäule und die
Datenaufnahme wird gleichzeitig gestartet.
Bei Dosierung der Standardlösungen sollte mit der Lösung geringster Konzentration
begonnen werden.
Die Probe wird viermal und die einzelnen Standardlösungen werden einmal dosiert.
1 Für ein sauberes Arbeiten ist es von Vorteil, die Dosierspritze nach jeder Dosierung mit Methanol
oder einer Methanol/Wasser Mischung zu spülen bzw. vor jeder Dosierung die Dosierspritze einmal
mit der zu dosierenden Lösung zu spülen.
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7. Datenauswertung
7.1. Allgemeine Vorbemerkungen
Während der Datenaufnahme mit dem Programm EZStart kann keine Auswertung der bereits
aufgenommenen Chromatogramme durchgeführt werden. Für die Auswertung während der
Datenaufnahme wird das Programm EZStart–offline (Aufruf vom Desktop) verwendet.
Die Kalibrierung des chromatographischen Systems erfolgt mit dem Programm EZ-Start
offline. Nach dem Aufruf von EZStart-offline wird zuerst über File → Method → open
das persönliche Methodenfile geladen. Datenfiles können über File → Data → open
aufgerufen werden.
7.2. Kalibrierung des chromatographischen Systems und quantitative Analyse
(i) Peaktabelle
Bevor die quantitative Auswertung der Probenchromatogramme durchgeführt werden kann,
muß die Eichfunktion für jede zu bestimmende Substanz erstellt werden.
Dazu wird über Method → Peaks/Groups die folgende Peaktabelle für die Methode geöffnet.
Auf der Seite „Named Peaks“ sind für jede zu bestimmende Substanz (Protochatechusäure,
Vanillinsäure, Syringasäure) folgende Felder maßgeblich:
Name: Name der Verbindung (Jede Verbindung wird nur einmal angeführt).
Ret. Time: Retentionszeit des Peaks (Wo kann die aktuelle Retentionszeit abgelesen
werden?). Es wird die mittlere Retentionszeit eingegeben.
Window: Er gibt das Ausmaß für mögliche Retentionszeitschwankungen an. Die Peaks der
Analyten müssen innerhalb dieses Retentionszeitfensters liegen, um als solche erkannt zu
werden. Das Retentionszeitfenster wird von der eingegeben Retentionszeit automatisch
berechnet (durch Anklicken des Eingabefensters).
Units: Einheiten der Quantifizierung: sie werden zwechmäßigerweise in µg/mL oder mg/L
angegeben.
Quantitate: Die Quantifizierung erfolgt wahlweise durch Auswertung des
Peakflächenintegrals (-> Area) oder Berechnung der Peakhöhe (-> Height). In den meisten
Fällen erfolgt die Auswertung über das Peakflächenintegral.
Fit Type: Allgemein sind lineare Eichfunktionen zu erwarten.
Calib Flag: Bei Replace werden bei einer Neuauswertung der Standardchromatogramme die
neuen Eichfaktoren übernommen.Bei Average erfolgt eine Mittelung der Eichfaktoren.
Bei Vorliegen von mehreren Standardchromatogrammen gleicher Konzentration sollte
Average gewählt werden, sonst Replace.
Level 1...10: Hier sind die Konzentrationen der einzelnen Standardlösungen einzusetzen
(z.B.: Level 1 = 20, Level 2 = 50 usw.).
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Nach Eingabe aller Daten wird das Methodenfile abgespeichert.
(ii) Kalibrierung und Auswertung der Standardchromatogramme
Zur Berechnung der Eichfaktoren werden nacheinander über Analysis → Analysis/Single
Level Calibration die Chromatogramme der Standards aufgerufen.
Es erscheint folgendes Fenster:
Unter „Data file“ wird der Filename des jeweiligen Standardchromatogramms angegeben.
Die Funktion „Calibrate“ wird aktiviert und unter „Calibration level“ wird die Zuordnung
des Chromatogramms zu den Konzentrationsangaben in der Peaktabelle (Level 1....10)
hergestellt.
Alle anderen Funktionen bleiben deaktiviert.
Durch Anklicken von „Start“ wird der Auswertevorgang gestartet.
Dieser Vorgang wird mit allen Chromatogrammen der Eichstandards durchgeführt.
Nach Auswertung des letzten Standardchromatogramms wird unter Method → Review
Calibration eine graphische Darstellung der Eichfunktion aufgerufen.
Es erscheint folgendes Fenster:
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Die Eichfunktionen der einzelnen Substanzen werden auf ihre Linearität und Korrelation
überprüft (Auswahl der jeweiligen Eichfunktion im rechten oberen Feld des Fensters).
Für den Ausdruck der Eichfunktionen wird eines der rechten weißen Felder mit der rechten
Maustaste angeklickt. Daraufhin öffnet sich folgendes Kontextmenu:
Zum Ausdrucken der Eichfunktion einer einzelnen Substanz wird „Print Current
Peak/Group“ angeklickt, für den Ausdruck aller Substanzen der Methode „Print All
Peaks/Groups“.
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(ii) Auswertung der Probenchromatogramme
Die quantitative Auswertung der Probenchromatogramme wird ebenfalls mit EZStart-offline
durchgeführt. Es stehen zwei unterschiedliche Methoden für die Datenauswertung zur
Verfügung.
Methode A: Automatische Auswertung
Über File → Data → open wird das auszuwertende Datenfile aufgerufen und mit Analysis
→ Analyze wird eine Auswertung des Chromatogramms durchgeführt.
Eine Vorschau der Auswertung ist über „Reports → View → External Standard“ möglich.
Über Reports → Print → External Standard wird der quantitative Analysenreport
ausgedruckt.
Es ist aber auch hier ist die korrekte Peakerkennung bzw. Peakintegration zu überprüfen !
Bei nicht korrekten Integrationsgrenzen wird manuell integriert.
Manuelle Integration:
Aus der Taskleiste am unteren Bildschirmrand wird Manual Baseline ( ) angeklickt.
Der Cursor wird an den Peakanfang positioniert und die linke Maustaste wird gedrückt.
Danach wird der Cursor an das Peakende positioniert und wiederum wird die linke Maustaste
gedrückt. Bei dem darauf erscheinenden Fenster wird die Schalfläche „Analyze now“
angeklickt. Nach dieser Neuauswertung kann der Analysenreport über Reports → Print →
External Standard ausgedruckt werden.
Methode B: Manuelle Auswertung
In dem oben abgebildeten Fenster wird „Concentration Calculator“ aufgerufen.
Unter „Area“ werden nun die Peakflächen (oder die Peakhöhen, falls eine Eichung über die
Peakhöhe durchgeführt wurde) aus dem Probenreport eingegeben (Ausdruck über Reports
→ Print → Area%). Mit „Calculate“ wird die Berechnung gestartet.
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Ergebnisabgabe:
Aus den Analysenergebnissen werden die Mittelwerte berechnet und im Analysenblatt
eingetragen. Diese werden dem Praktikumsbetreuer zur Überprüfung vorgelegt.
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8. Bestimmung von chromatographischen Kenngrößen
8.1 Bestimmung der Peakkenngrößen
Folgende Peakkenngrößen werden bestimmt:
Kapazitätsfaktor für jede Komponente (ki)
Theoretische Bodenzahl für jeden Analytpeak (Ni)
Peakasymmetriefaktor (A) bei 10% Peakhöhe
Auflösung zu den benachbarten Peaks (Rs)
Zur Berechnung der Kenngrößen wird die Retentionszeit einer unverzögerten Komponente
(t0 ) benötigt. Diese wird rechnerisch unter vereinfachten Annahmen ermittelt.
Der externe Beitrag zum Totvolumen (Kapillarleitungen, Zellvolumen des Detektors usw. )
wird vernachlässigt und nur das Volumen der Trennsäule wird in die Berechnung mit
einbezogen. Für die Porosität der Trennsäule wird ein Wert von 0,75 verwendet.
Nach welcher Zeit wird eine unverzögerte Substanz bei einer Fließgeschwindigkeit von 1,0
mL/min von der Trennsäule eluieren?
Die Formeln zur Berechnung der Kenngrößen sind dem theoretischen Teil des Skriptums zu
entnehmen. Die Peakkenngrößen können aus einem bereits vorhandenen Chromatogramm
von Probe oder Standard bestimmt werden. Die benötigten Variablen sind die Retentionszeit
und die Peakbreite bei der halben Peakhöhe (σ wird daraus berechnet).
Vorgangsweise
Es wird das persönliche (PCA)-Methodenfile verwendet und ein Chromatogramm (Probe
oder Standard) geöffnet . Mit Analysis → Analyze wird die Auswertung des
Chromatogramms durchgeführt. Über Report → View (Print) → Method Custom Report
werden die Werte für Peakbreite und Peakasymmetriefaktor angezeigt.
8.2. Einfluß der Fließgeschwindigkeit auf die Trennstufenhöhe (Trennstufenzahl)
.
Als Methodenfile wird für diesen Abschnitt die Methode „HU“ verwendet (Aufruf über File
→ Method → open). Die Erstellung eines persönlichen Methodenfiles ist von Vorteil.
Wegen der Temperaturabhängigkeit des Trennsystems muss diese Aufgabe an einem Tag
ohne Verzögerungen durchgeführt werden.
Es wird eine Standardlösung benötigt, die nur Protochatechusäure enthält (Konzentration ca.
100 µg/mL).
Es werden Chromatogramme bei einer Fließgeschwindigkeit von 1,5 – 1.0 – 0,7 – 0,4 -0,3
0,2 – 0,1 mL/min aufgenommen (in dieser Reihenfolge). Es empfiehlt sich, bereits nach dem
ersten aufgenommenen Chromatogramm (1,5 mL/min) mit der Auswertung zu beginnen (mit
EZStart-offline).
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(i) Einstellung der Fließgeschwindigkeit und Datenaufnahme
Nach Aufruf der Methode wird über Method → Instrument Setup die Seite „Pump“
aufgerufen:
In der Mitte der Seite wird in dem Fenster „Pump A“ die jeweils gewünschte
Fließgeschwindigkeit (Flow Rate) eingetragen. Anschließend wird die Methode unter File →
Method → Save gespeichert.
Über Control → Single Run wird der chromatographische Lauf gestartet.
Nach vollständiger Elution des Peaks der Protochatechusäure wird die Datenaufnahme über
Control → Stop Run abgebrochen.
Diese Vorgangsweise wird bei allen Fließgeschwindigkeiten durchgeführt..
(ii) Auswertung der Chromatogramme
Über Analysis → Analyze wird die Peakberechnung gestartet und über Report → View
(Print) → Method Custom Report werden die Retentionszeit und die Peakbreite bei halber
Peakhöhe angezeigt.
Die Formeln zur Berechnung der Trennstufenzahl bzw. Trennstufenhöhe sind im
theoretischen Teil des Skriptums zu finden.
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9. Reinigung der Trennsäule
Am Ende der praktischen Arbeiten des jeweiligen Arbeitstages wird die Trennsäule gereinigt.
Dazu wird über Control → Instrument Status auf der Seite „Pump“ über „Manual Set“
der Eluent auf 100 % B (Methanol) gestellt (Fließgeschwindigkeit 1,0 mL/min).
Die Trennsäule wird unter diesen Bedingungen 20 min – 25 min gespült.
Danach wird die Pumpe gestoppt (→ „Turn Off“).
10. Ausschalten der Geräte
Nach Beendigung aller Arbeiten wird das Programm beendet, der Computer
heruntergefahren und Pumpe, Detektor und Monitor werden ausgeschaltet.
11. Protokoll
Das Protokoll, welches handschriftlich auszufertigen ist, sollte so detailliert ausgeführt
werden, um eine Überprüfung des Zustandekommens der Analysenergebnisse zu
gewährleisten. Anhand diese Protokolls sollte es auch möglich sein, die Analyse zu einer
anderen Zeit mit einem anderen Gerät durchführen zu können. Dies erfordert eine genaue
Angabe der Arbeitsvorschrift und der operativen Kenngrößen.
Nicht erforderlich (gewünscht) ist eine Beschreibung der Bedienung der Software für dieses
Gerät und eine Abhandlung über den theoretischen Hintergrund der Chromatographie (dies
wird als bekannt vorausgesetzt !).
Im Detail soll das Protokoll folgende Punkte beinhalten:
• Aufgabenstellung
• Beschreibung des Versuchsaufbaus unter Angabe der experimentellen
(chromatographischen) Kenngrößen.
• Beschreibung der Herstellung der verwendeten Standards
• Analysenergebnisse vonProbe und Standards in Tabellenform (Konzentration/
Peakfläche oder Peakhöhe)
• Graphische Darstellung der Eichfunktionen für jeden Analyt mit Angabe des
Korrelationskoeffizienten und der Gleichung für die Eichfunktion .
• Exemplarisch wird ein Chromatogramm der ausgegebenen Probe und eines Standards
eingeklebt (es soll nicht der gesamte ausgedruckte Datenreport eingeklebt werden !).
In einer abschließenden Zusammenfassung wird das Ergebnis der quantitativen Analyse mit
der richtigen Anzahl an signifikanten Stellen angegeben (Mittelwert, Standardabweichung
bzw Vertrauensbereich).
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Inventarliste
4 Stück 20 mL oder 25 mL Meßkolben
100 µL Hamilton Dosierspritze
Verstellbare Kolbenhubpipette Modell VWR (100 – 1000 µL)
Verstellbare Kolbenhubpipette Modell VWR (10 – 100 µL)
1,5 mL Eppendorfgefäße
Rack für Eppendorfgefäße
5 Stück 20 mL Gefäße
3 Standardsubstanzen (Protochatechusäure, Vanillinsäure, Syringasäure)
1 Spritzflasche Dest. Wasser
1 Spritzflasche Methanol
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