Analytische Chemie für Biologen - Institut für Analytische Chemie

Analytische Chemie
für Biologen
1

Analytische Chemie für Biologen
1 2 3
Grundlagen
Protonierung/
Deprotonierung
Komplexierung
Red/Ox-Reaktionen
Elektrophorese
Chromatographie
Prozessgrößen
GC
HPLC
Quantitative
Analytik
Optische
Spektrometrie
Absorption (UV,IR)
Fluoreszenz
Luminiszenz
AS
Massen-
Spektrometrie
2

Analytische Chemie für Biologen I
Grundlagen
Deprotonierung/
Protonierung
Komplexierung
Red/Ox-Reaktionen
Gleichgewichte
HA + H 2 O ↔ H 3 O + + A - K a
B + H 2 O ↔ BH + + OH - K b
M + L ↔ ML K c
Red + O 2 + 2 H + ↔ Ox + H 2 O K RO
3

Literatur
„Fundamentals of Analytical Chemistry“
D.A.Skoog, D.M.West und F.J.Holler,
Saunders College Publishing,
Kapitel 4-16
„Analytikum“
Doerffel, Geyer Eds.,
VEB Deutscher Verlag für Grundstoffindustrie, Leipzig.
Kapitel 2
4

Gleichgewicht
RT ln K = −ΔG
[ ΔH
−T
S]
ΔG
= Δ
K Gleichgewichtskonstante
ΔG Freie Gibbs Energie
ΔH Enthalpie
ΔS Entropie
T Absolute Temperatur
R Allgemeine Gaskonstante
5

H2O
H2O
H2O
H2O
H2O
H2O H2O
H2O
HA
H2O
H2O
H2O
H2O
H2O
H2O
A- H2O
H2O
H2O
H2O
H2O
H2O
H2O
H2O
H2O
[ ΔH
−T
S]
ΔG
= Δ
RT ln K = −ΔG
H2O H2O
H2O
H2O H2O
H2O
H2O
H2O
H3O+
H2O
6

Deprotonierung (Säure-Dissoziation)
HA + H 2 O ↔ H 3 O + + A - K a
K a
+ − [ H O ][ A ]
= 3
[ HA]
7

Allgemeine Formulierung eines Gleichgewichtes
w W + x X ↔ y Y + z Z
K =
a
a
y
Y
x
X
a
a
z
Z
w
W
a : Aktivität einer Verbindung in Lösung
c : Konzentration / Molenbruch einer Verbindung in Lösung
[ ] :
8

Allgemeine Formulierung eines Gleichgewichtes
K ′
=
w W + x X ↔ y Y + z Z
i
K =
a = c γ
[ ] [ ]
[ ] [ ] w x
y z
Y Z
X W
i
i
a
a
y
Y
x
X
a
a
z
Z
w
W
c = a γ
i
i
i
K′
= K
w [ γ ] [ γ ]
[ ] [ ] z
w x
y
γ γ
y
z
x
9

Allgemeine Formulierung eines Gleichgewichtes
− log γ =
i
K′
= K
0.
5
2
zi 0.
5 zi
I
− log γ i =
1+
0.
33r
I
2
I
i
w [ γ ] [ γ ]
[ ] [ ] z
w x
y
γ γ
y
z
x
I
=
1
2
∑
n
c
n n z
2
Ionenstärke
10

− log γ
=
i
0.
5
2
zi I
11

Die Anwesenheit weiterer Ionen begünstigt
das Vorliegen dissoziierter (ionischer) Spezies
K‘ sp
K‘ á
K‘ w
12

ACN
ACN
H2O
H2O
H2O
HA
ACN ACN
H2O
H2O
ACN
H2O
H2O
ACN
ACN
H2O
H2O
H2O
[ ΔH
−T
S]
ΔG
= Δ
RT ln K = −ΔG
ACN
A -
H2O H2O
H2O
ACN
ACN
H2O
H2O
H2O H2O
H2O
H2O
H2O
H3O+
H2O
Polarität und Häufigkeit der Lösungsmittelkomponenten
beeinflussen ΔG und damit die Glgw. Konstante
13

Tabellierte Konstanten verstehen sich als Werte
bei Raumtemperatur
in reinem Wasser
bei sehr geringer Ionenstärke
wenn nicht anders vermerkt
14

Protonierungs- /
Deprotonierungs-
Gleichgewichte
15

Deprotonierung (Säure-Dissoziation)
HA + H 2 O ↔ H 3 O + + A - K a
H 2 O + H 2 O ↔ H 3 O + + OH - K W = 10 -14
K a
K w 3
+ − [ H O ][ A ]
= 3
[ HA]
+ −
[ H O ][ ]
= OH
pK = −log
K
a
+ [ ]
pH = −log
H
pKW
= 14
a
16

Protonierung einer Base
B + H 2 O ↔ BH + + OH - K b
K b
=
+ − [ BH ][ OH ]
b
[ B]
pK =
−log
K
b
17

Protonierung einer Base
B + H 2 O ↔ BH + + OH - K b
Deprotonierung einer protonierten Base
BH + + H 2 O ↔ H 3 O + + B K a Base = Kw /K b
K b
=
K Base
a
Base
a
+ − [ BH ][ OH ]
=
[ B]
pK =
−log
K
b
+ [ H O ][ B]
3
+ [ BH ]
pK = pK − pK
w
b
b
18

Protonierung
B + H 2 O ↔ BH + + OH - K b
Deprotonierung einer protonierten Base
BH + + OH - ↔ B + H 2 O 1/K b
H 2 O + H 2 O ↔ H 3 O + + OH - K W
BH + + OH - + 2 H 2 O ↔ B + H 2 O + H 3 O + + OH -
BH + + H 2 O ↔ H 3 O + + B K a Base = Kw /K b
19

+
H3N
H3C C OH
O
H3C NH
HO
O
O
Cl 3C C OH
O
O
OH
CH2
O
O
OH
OH
pK a -Werte
4.75 Carbonsäuren
0.89 Trichloressigsäure
2 Aminosäuren
3.5 Amidosäuren / C-Terminus in Peptiden
1.27 Di-Carbonsäuren
20

H3C OH
O
N
O
H3C SH
OH
OH
pK a -Werte
12-14 Alkohole, Polyalkohole, Zucker
sehr geringe Acidität
9-10 Phenole
7-8 4-Nitro-Phenole
8 Thiole
21

R CH 2
H 2
C NH3
H 2
R C
CH2
R
NH
2
R
H 2C NH
CH R
2
O
R
C
O
R CH
NH3 9-11.5
9-10
pK a Base
primäres Amin (Ammonium)
sekundäres Amin (Ammonium)
tertiäres Amin (Ammonium)
protonierte Aminosäure
22

R
O
N H
NH 3
CH3 N
H
HO NH 3
5
5.5
-1
6
pK a Base
aromatisches Amin (Anilinium)
N in aromatischem System (Pyridinium)
Amid (nicht mehr basisch)
Hydroxylamin
23

Strukturelemente
-COOH
-OH
-HH 2 , -NHR, -NR 2
-NH
-CONH 2 , - CONHR
(a) wie in Anilin,
(b) wie in Pyridin
aromatisch (a)
α-Aminosäure
aromatisch (b)
Amide
molekulare
Umgebung
Carboxyl-Säure
α-Aminosäure
α-Amidosäure
aliphatisch
phenolisch
Mono-Nitro-Phenole
aliphatisch
pK a
4.5 – 5.5
1.8 – 2.5
3.5 – 4.0
12 - 14
9 – 10
7 - 8
9 – 11.5
4.5 – 5.5
9 - 10
5 – 6.5
0 bis -1
24

pK b = 9.0
pK a = 2
Aminosäuren
pK a =10.1
25

pK a =3.9
Aminosäuren
pK b = 10.5 pK b = 12.5
pK a =4.2
pK b = 6.0
26

Aminosäuren
pK a = 8.3
27

Aminosäuren
28

pK a -Werte ~13
Zucker
Glukose
Galaktose
29

Schwefelsäure
Phosphorsäure
Kohlensäure
Borsäure
Ammoniak
Hydroxylamin
Anorganische Säuren und Basen
und häufig eingesetzte Puffersysteme
H 2 SO 4
H 3 PO 4
H 2 CO 3
H 3 BO 4
NH 3
NH 2 OH
pK a 1
stark
(

Puffer:
System aus
Säure / Säureanion
und/ oder
Base / Basenkation
Pufferwirkung ist nur gegeben in einem Bereich von
pH = pK a ±1 bzw. pH = pK a Base ±1
der enthaltenen Puffer-Teilsysteme
Na + Acetat - oder NH 4 + Cl - oder NH4 + Acetat -
31

Dissoziations/Protonierungsgrad
„Speziesbrüche“
32

d
α
=
− [ A ]
− [ HA]
+ [ A ]
Dissoziationsgrad
K a
=
− + [ A ][ H O ]
3
[ HA]
33

d
α
=
− [ A ]
− [ HA]
+ [ A ]
Dissoziationsgrad
d
α
1
=
1+
10
( pK pH )
a −
K a
=
− + [ A ][ H O ]
3
[ HA]
34

α
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
Dissoziationsgrad
pK = 4.0
HA
pK a,i = 4.0
A -
pK a,j = 4.5
pK = 4.5
0,0
0 2 4 6 8
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
6 8 10 12 14
pH
Protonierungsgrad
pK = 9.0
pK = 9.5
HB +
35

α
p
=
+ [ BH ]
[ BH ] + [ B]
Protonierungsgrad
α
p
K Base
a
1
=
Base
( pH − pK a 1+
10
)
=
+ [ B][
H 3O
]
+ [ BH ]
36

α
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
Dissoziationsgrad
pK = 4.0
HA
pK a,i = 4.0
A -
pK a,j = 4.5
pK = 4.5
0,0
0 2 4 6 8
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
6 8 10 12 14
pH
Protonierungsgrad
pK = 9.0
pK = 9.5
HB +
37

α
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
Dissoziationsgrad
pK = 4.0
HA
pK a,i = 4.0
A -
pK a,j = 4.5
pK = 4.5
0,0
0 2 4 6 8
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
6 8 10 12 14
pH
Protonierungsgrad
pK = 9.0
pK = 9.5
HB +
38

x i (n)
" Grad"
= Speziesbruch
HA - A =
H 2 A
= x
( n)
=
[ Spezies n]
∑[
Spezies k]
pKa 1 = 1.5; pKa 2 = 6.5
k
39

Spezies-Brüche x i (n)
=
1+
10
1
+ 10
H 2 A
x
a1
a1
−
=
1+
10
( pH − pK ) ( 2 pH − pK pK )
HA−
x −
=
1+
10
1
( pH − pK ) ( pK pH )
a 2 + 10
A=
x 2
1
a1
a 2
( pK − pH ) ( pK + pK − pH )
a 2 + 10
a1
a 2
40

total A−
A−
k = x k +
Chromatographie
x
HA
k
HA
Ionenaustausch-Chromatographie:
Reversed-Phase Chromatographie:
k
k
ki = ∑n
x
〉 0 k ≈ 0
A−
HA
≈ 0 k 〉 0
A−
HA
n
i
k
n
i
41

total A−
A−
k = x k +
Chromatographie
x
HA
k
HA
Ionenaustausch-Chromatographie:
Reversed-Phase Chromatographie:
total A−
A−
HA HA
μ = x μ + x μ
k
k
Elektrophorese
ki = ∑n
x
〉 0 k ≈ 0
A−
HA
≈ 0 k 〉 0
A−
HA
n
i
μi = ∑n
k
n
i
x μ
n
i
n
i
42

Fluoreszenz
Oregon Green 488
Rhodamine Green
Carboxyfluorescein
Intensität des Fluoreszenzlichtes ist in vielen
Fällen pH-abhängig:
Reproduzierbarkeit der FL-Messung
Fluoreszenzlabel als pH-Sonde
43

UV/Vis – Absorption
Unterschiede in der
Wellenlänge des Absorptionsmaximums
zwischen einzelnen Spezies
44

Säure-Basen Titration
45

Konzept jeder Titration
Bestimmung eines „Äquivalenzpunktes“
Äquivalenzpunkt heißt:
Molzahl des Analyts (Titrand) = Molzahl des Titrators
n Titrand = n Titrator
Dadurch wird die Bestimmung von Analytmengen möglich
Wie lässt sich der Äquivalenzpunkt finden?
Durch starke Änderung in einer Systemeigenschaft
(z.B.: im pH Wert der Lösung, im Vorliegen freien Metalls etc.)
46

Säure-Basen-Titration
Starke Säure (HCl) wird mit starker Base (NaOH) titriert
C tot = 0.001 M
C tot = 0.1 M
Äquivalenzpunkt
NaOH
= 1
Molzahl des Analyts (Titrand) = Molzahl des Titrators
n
n
HCl
47

Säure-Basen-Titration
Starke Säure (HCl) wird mit starker Base (NaOH) titriert
C tot = 0.001 M
C tot = 0.1 M
C tot = 0.1 M
C tot = 0.001 M
Äquivalenzpunkt
Änderung der Systemeigenschaft am Äquivalenzpunkt starker Sprung im pH Wert
48

Konzept einer Titration
(1) Bestimmung des Äquivalenzpunktes
Am Äquivalenzpunkt:
Molzahl des Analyts (Titrand) = Molzahl des Titrators
Dadurch ist die Bestimmung der Analytmenge möglich
(2) Wie lässt sich der Äquivalenzpunkt finden? starker Sprung im pH Wert
(3) Wie lässt sich der Sprung im pH Wert feststellen?
Messung mit pH-Elektrode oder
Einsatz eines Indikators (Reporter System)
zeigt bei Überschreiten eines bestimmten pH Wertes
eine Farbänderung
49

Konzept einer Titration
(4) Welcher pH Wert soll die Schwelle für die Farbänderung des Indikators sein?
pH Wert am Äquivalenzpunkt: pH Ä.P.
(5) Wie findet man einen Indikator, dessen Farbumschlag bei einem pH
Wert liegt, der dem pH des Äquivalenzpunktes entspricht?
Farbumschlag des Indikators findet statt, wenn
pH der Lösung = pK a Ind ±1
(6) Also: Der pH Wert für den Umschlagspunkt des Indikators, pH U.P. soll
ähnlich sein dem pH Wert am Äquivalenzpunkt
des Titrand/Titrator Systems
pH U.P. ~ pH Ä.P.
50

Säure-Basen-Titration
Starke Säure (HCl) wird mit starker Base (NaOH) titriert
C tot = 0.001 M
C tot = 0.1 M
C tot = 0.1 M
pH
Ctot = 0.001 M
Äquiv
Äquivalenzpunkt
Änderung der Systemeigenschaft am Äquivalenzpunkt starker Sprung im pH Wert
51

pH Werte am Äquivalenzpunkt
Starke Säure (titriert mit starker Base)
äqu 1
pH = pKW
= 7
2
schwache Säure (titriert mit starker Base)
1
2
( pK + pK + C )
äqu
pH = W a log
starke Base (titriert mit starker Säure )
pH
schwache Base (titriert mit starker Säure )
1
2
äqu
= pKW
1
2
= 7
( pK − pK − C )
äqu
pH = W b log
S
B
52

Konzept einer Titration
(4) Welcher pH Wert soll die Schwelle für die Farbänderung des Indikators sein?
pH Wert am Äquivalenzpunkt: pH Ä.P.
(5) Wie findet man einen Indikator, dessen Farbumschlag bei einem pH
Wert liegt, der dem pH des Äquivalenzpunktes entspricht?
Farbumschlag des Indikators findet statt, wenn
pH der Lösung = pK a Ind ±1
(6) Also: Der pH Wert für den Umschlagspunkt des Indikators, pH U.P. soll
ähnlich sein dem pH Wert am Äquivalenzpunkt
des Titrand/Titrator Systems
pH U.P. ~ pH Ä.P.
53

Säure/Basen - Indikator
K Ind
=
− + [ Ind ][ H ]
[ HInd ]
54

K Ind
=
− + [ Ind ][ H ]
[ HInd ]
Indikator-System
d 1
α
=
1+
10
α d < 0.1 rot pH ≤ pK a –1
α d > 0.9 blau pH > pK a + 1
Umschlagintervall 2 pH Einheiten
α d < 0.3 farblos pH ≤ pK a –0.5
α d > 0.3 blau pH > pK a –0.5
Umschlagintervall 0.3 pH Einheiten
Umschlag: pH UP = pK a Ind
( pK pH )
a −
55

Säure-Basen-Titration
56

Säure-Basen-Titration
Schwache Säure (HAc) wird mit starker Base (NaOH) titriert
Wendepunkt im Pufferbereich: pH W.P. = pK a
57

Schwache Säuren (HAc) werden mit starker Base (NaOH) titriert
Wendepunkt im Pufferbereich: pH W.P. = pK a
58

Schwache Säuren (HAc) werden mit starker Base (NaOH) titriert
Äquivalenzpunkte: pH Ä.P. = 0.5 (pK w + pK a + log C)
C = 0. 1 M
59

pH Werte am Äquivalenzpunkt
Starke Säure (titriert mit starker Base)
äqu 1
pH = pKW
= 7
2
schwache Säure (titriert mit starker Base)
1
2
( pK + pK + C )
äqu
pH = W a log
starke Base (titriert mit starker Säure )
pH
schwache Base (titriert mit starker Säure )
1
2
äqu
= pKW
1
2
= 7
( pK − pK − C )
äqu
pH = W b log
S
B
60

Schwache Basen (B) werden mit starker Säure (HCl) titriert
Wendepunkt im Pufferbereich: pH W.P. = pK a Base
pK a Base = 14-pKb
61

Schwache Basen (B) werden mit starker Säure (HCl) titriert
Äquivalenzpunkte: pH Ä.P. = 0.5 (pK w -pK b - log C)
C = 0. 1 M
pK a Base = 14-pKb
62

pH Werte am Äquivalenzpunkt
Starke Säure (titriert mit starker Base)
äqu 1
pH = pKW
= 7
2
schwache Säure (titriert mit starker Base)
1
2
( pK + pK + C )
äqu
pH = W a log
starke Base (titriert mit starker Säure )
pH
schwache Base (titriert mit starker Säure )
1
2
äqu
= pKW
1
2
= 7
( pK − pK − C )
äqu
pH = W b log
S
B
63

pH Start
Startpunkt
Säure-Basen-Titration
Starke Säure (HCl) wird mit starker Base (NaOH) titriert
C tot = 0.001 M
C tot = 0.1 M
C tot = 0.1 M
C tot = 0.001 M
64

pH Werte am Startpunkt
starke Säure
schwache Säure
starke Base
schwache Base
Start
pH = − log
1
2
C
S
( pK − C )
Start
pH = a log
Start
pH = pK w + log
1
2
C
B
S
( pK − C )
Start
pH =
pK w − b log
B
65

Schwache Säuren (HAc) werden mit starker Base (NaOH) titriert
Startpunkte: pH S.P. = 0.5 (pK a - log C)
66

Zweibasige Säure (H 2 A) wird mit starker Base (NaOH) titriert
pK a 1 = 3
pH SP = 2
ÄP1
pK a 2 = 7
ÄP2
pH ÄP2 = 10
C = 0.1 M
67