Antibiotika-haltige Knochenzemente: In vitro Untersuchungen der ...

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Antibiotika-haltige Knochenzemente: In vitro Untersuchungen der ...

Material und Methoden 34

Schallintensität beschallt, um die Keime von der Oberfläche der Testzylinder abzuschütteln.

Nach Aufnahme und Überführen der Suspension der abgeschallten Bakterien in ein kleines

Reagenzglas mit Korkstopfen (Reagenzglas Nr. 0) folgte eine Reihenverdünnung.

3.5.6.2 Eluat

Das Inkubationsgefäß, in dem sich jetzt nur noch das Magnetfischchen befand, wurde auf

einen separaten Magnetrührer gestellt, um den Bakterien-Bodensatz zu resuspendieren. Nach

Aufnahme und Überführen von 1ml des aufgerührten Eluats in ein kleines Reagenzglas mit

Korkstopfen (Reagenzglas Nr. 0) folgte eine Reihenverdünnung.

3.5.7 Reihenverdünnungstest und Ausplattierung

10 kleine Reagenzgläser mit Korkstopfen wurden mit jeweils 1,8ml steriler TSB beschickt,

anschließend mittels einer Mikroliterpipette 200µl aus Reagenzglas Nr. 0 (vorher kurz

aufgeschüttelt) in Reagenzglas Nr. 1 überführt (→ Konzentration 1: 10 1 = 1: 10), Reagenzglas

Nr. 1 wiederum kurz aufgeschüttelt, daraus 200µl entnommen, in Reagenzglas Nr. 2 überführt

(Konzentration 1: 10 2 = 1: 100) und die Verdünnung bis 1: 10 10 (= 1: 10 Milliarden)

fortgeführt.

Nach kurzem Aufschütteln des Reagenzröhrchens wurden jeweils 100µl der verdünnten

Bakteriensuspensionen mittels Mikroliterpipette aufgenommen, auf CLED-Agar getropft und

mittels Glasstab auf der gesamten Platte homogen verteilt. Die Inkubation der Agar-Platten

erfolgte bei 37°C im Brutschrank über 24-48h.

Die Spülflüssigkeiten wurden ohne Reihenverdünnung ausplattiert. Hier sollte bakterielles

Wachstum lediglich qualitativ nachgewiesen werden.

3.5.8 Auszählung

Nach der Bebrütung stellten sich die Staphylokokken als gelbe Kolonien dar. Die Ermittlung

der Keimzahl erfolgte durch Auszählen und Berechnung des Mittelwertes pro 100µl Eluat /

beschallte Ringerlösung, die Auswertung der Ergebnisse und die graphische Darstellung von

Mittelwert (mean) und Standardabweichung (sd) im Programm Origin 5.0 (Microcal

Software, Inc., Northampton).

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