Antibiotika-haltige Knochenzemente: In vitro Untersuchungen der ...

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Antibiotika-haltige Knochenzemente: In vitro Untersuchungen der ...

Material und Methoden 37

3.6.6 Probenentnahme

Für die Probenentnahme wurde zu den oben angeführten Zeitpunkten jeweils ein Gefäß aus

dem Versuch entfernt.

3.6.6.1 Testzylinder

Je ein Testzylinder wurde mit einer sterilen Pinzette dem Inkubationsgefäß entnommen, in ein

Reagenzglas mit 5ml steriler Ringerlösung überführt, Alukappe und Reagenzglasöffnung

abgeflämmt und das Reagenzglas während 3 Sekunden mit dem Schüttelgerät aufgeschüttelt,

um locker anhaftende Bakterien von der Testzylinderoberfläche zu entfernen. Nach

einmaliger Wiederholung dieses Vorgangs wurde der Testzylinder in ein Reagenzglas mit 1ml

Ringerlösung überführt und während 1 Minute im Ultraschallbad bei maximaler

Schallintensität beschallt, um die Keime von der Oberfläche der Testzylinder abzuschütteln.

Nach Aufnahme und Überführen der Suspension der abgeschallten Bakterien in ein kleines

Reagenzglas mit Korkstopfen (Reagenzglas Nr. 0) folgte eine Reihenverdünnung.

3.6.6.2 Eluat

Das Inkubationsgefäß, in dem sich jetzt nur noch das Magnetfischchen befand, wurde auf

einen separaten Magnetrührer gestellt, um den Bakterien-Bodensatz zu resuspendieren. Nach

Aufnahme und Überführen von 1ml des aufgerührten Eluats in ein kleines Reagenzglas mit

Korkstopfen (Reagenzglas Nr. 0) wurde eine Reihenverdünnung durchgeführt.

3.6.7 Reihenverdünnungstest und Ausplattierung

10 kleine Reagenzgläser mit Korkstopfen wurden mit jeweils 1,8ml steriler TSB beschickt,

anschließend mittels einer Mikroliterpipette 200µl aus Reagenzglas Nr. 0 (vorher kurz

aufgeschüttelt) in Reagenzglas Nr. 1 überführt (→ Konzentration 1: 10 1 = 1: 10), Reagenzglas

Nr. 1 wiederum kurz aufgeschüttelt, daraus 200µl entnommen, in Reagenzglas Nr. 2 überführt

(Konzentration 1: 10 2 = 1: 100) und die Verdünnung bis 1: 10 10 (= 1: 10 Milliarden)

fortgeführt.

Für die Ausplattierung wurde das jeweilige Reagenzglas kurz aufgeschüttelt, daraus 100µl

mittels Mikroliterpipette aufgenommen, auf CLED-Agar getropft und mittels Glasstab auf der

gesamten Platte gleichmäßig verteilt. Die Inkubation der Agar-Platten erfolgte bei 37°C im

Brutschrank während 24-48h.

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