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Herstellung und Charakterisierung

eines liposomalen Carriersystems

für die inhalative Applikation von Sildenafil

LAURA SATTLER

INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades eines Dr. med. vet.

beim Fachbereich Veterinärmedizin der Justus-Liebig-Universität Gießen

édition scientifique

VVB LAUFERSWEILER VERLAG


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1. Auflage 2012

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1 Edition 2012

© 2012 by VVB LAUFERSWEILER VERLAG, Giessen

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Aus dem Klinikum Veterinärmedizin, Klinik für Pferde,

Innere Medizin, der Justus-Liebig-Universität Gießen

Betreuerin: Prof. Dr. med. vet. Kerstin Fey

und

dem Universitätsklinikum Gießen und Marburg, Standort Gießen

Medizinische Klinik und Poliklinik II

Betreuer: Prof. Dr. med. Werner Seeger

Herstellung und Charakterisierung

eines liposomalen Carriersystems

für die inhalative Applikation von Sildenafil

INAUGURAL-DISSERTATION

zur Erlangung des Grades eines

Dr. med. vet.

beim Fachbereich Veterinärmedizin

der Justus-Liebig-Universität Gießen

eingereicht von

Laura Sattler

Tierärztin aus Marburg

Gießen 2012


Mit Genehmigung des Fachbereichs Veterinärmedizin

der Justus-Liebig-Universität Gießen

Dekan: Prof. Dr. Dr. h.c. M. Kramer

Gutachter/in: Prof. Dr. med. vet. Kerstin Fey

Tag der Disputation: 17.07.2012

Prof. Dr. med. Werner Seeger


Schläft ein Lied in allen Dingen,

Die da träumen fort und fort,

Und die Welt hebt an zu singen,

Triffst du nur das Zauberwort.

(Joseph Freiherr von Eichendorff)


INHALTSVERZEICHNIS

IHALTSVERZEICHIS............................................................. I-III

1 EILEITUG UD ZIEL DER ARBEIT ....................................1

2 LITERATURÜBERSICHT.............................................................3

2.1 Aerosol-Therapie................................................................................................................ 3

2.1.1 Behandlung respiratorischer Erkrankungen .................................................................... 3

2.1.2 Inhalative Verabreichung von Arzneimitteln bei Tieren................................................. 4

2.2 Liposomen.......................................................................................................................... 5

2.2.1 Phospholipide und Sterole............................................................................................... 6

2.2.2 Bildung und Klassifizierung von Liposomen.................................................................. 8

2.2.3 Anwendungsmöglichkeiten von Liposomen................................................................... 9

2.2.4 Liposomen zur pulmonalen Applikation....................................................................... 11

2.2.4.1 Liposomen als Retardformulierungen zur pulmonalen Applikation.......................... 14

2.2.4.2 Schicksal von Liposomen im Respirationstrakt ......................................................... 19

2.2.5 Einsatz von Liposomen in der Veterinärmedizin.......................................................... 20

2.3 Pulmonale arterielle Hypertonie....................................................................................... 24

2.3.1 Einsatz von Sildenafil zur Behandlung der PAH .......................................................... 26

2.3.2 Pulmonale Hypertonie bei Tieren.................................................................................. 28

3 EIGEE UTERSUCHUGE .................................................30

3.1 MATERIAL UND METHODEN .................................................................................... 30

3.1.1 Substanzen und Lösungen............................................................................................. 30

3.1.1.1 DPPC.......................................................................................................................... 30

3.1.1.2 Cholesterol ................................................................................................................. 30

3.1.1.3 Rhodamin 6G ............................................................................................................. 31

3.1.1.4 Sildenafil .................................................................................................................... 31

3.1.1.5 Elektrolytlösungen ..................................................................................................... 32

3.1.1.6 Albumin-Lösung ......................................................................................................... 33

3.1.2 Vernebler....................................................................................................................... 33

3.1.2.1 Aeroneb ® Solo ............................................................................................................ 33

3.1.2.2 Pari LC Sprint ® Star ................................................................................................... 34

3.1.2.3 MicroSprayer ® ............................................................................................................ 34

3.1.3 Bestimmung der Aerosolpartikelgrößen ....................................................................... 35

3.1.4 Verneblerleistung .......................................................................................................... 36

3.1.5 Liposomen mit Rhodamin 6G ....................................................................................... 36

3.1.5.1 Herstellung der Liposomen ........................................................................................ 36

3.1.5.1.1 Filmmethode............................................................................................................ 37

3.1.5.1.2 Ethanolinjektions-Methode ..................................................................................... 38

3.1.5.1.3 Extrusion ................................................................................................................. 39

3.1.5.1.4 Zentrifugation.......................................................................................................... 39

3.1.5.6 Charakterisierung ....................................................................................................... 40

3.1.5.6.1 Größenmessung....................................................................................................... 40

3.1.5.6.2 Bestimmung von Verkapselungseffizienz und Verkapselungsrate......................... 40

3.1.5.6.3 Verneblungsstabilität............................................................................................... 42

3.1.6 Nachweis von Sildenafil mittels HPLC ........................................................................ 43

3.1.7 Untersuchungen zur Wiederfindung von Sildenafil...................................................... 43

3.1.7.1 Sildenafil in Eppendorf-Reaktionsgefäßen ................................................................ 44

3.1.7.2 Sildenafil in Falcon Tubes.......................................................................................... 44

3.1.7.3 Sildenafil in Glasgefäßen mit Schläuchen ................................................................. 44

I


INHALTSVERZEICHNIS

3.1.7.4 Clear C-FLEX ® System ............................................................................................. 46

3.1.8 Liposomen mit Sildenafil .............................................................................................. 47

3.1.8.1 Herstellung der Liposomen ........................................................................................ 47

3.1.8.2 Verneblung mit Pari LC Sprint ® Star und Microsprayer ........................................... 47

3.1.8.3 Charakterisierung ....................................................................................................... 49

3.1.8.3.1 Größenmessung....................................................................................................... 49

3.1.8.3.2 Bestimmung von Verkapselungseffizienz und Verkapselungsrate......................... 49

3.1.8.3.3 Wiederfindung nach Verneblung ............................................................................ 50

3.1.8.4 In vitro Freisetzungsversuche..................................................................................... 50

3.1.8.5 Untersuchungen an der isolierten, ventilierten und blutfrei perfundierten

Kaninchenlunge......................................................................................................... 51

3.1.8.5.1 Das Modell .............................................................................................................. 51

3.1.8.5.2 Präparation, Perfusion und Ventilation der Lunge.................................................. 52

3.1.8.5.3 Versuchsdurchführung ............................................................................................ 53

3.1.8.5.4 Aufbereitung der Proben und Lavagen ................................................................... 55

3.1.8.5.5 Berechnung der Stoffverteilung im Lungenmodell................................................. 55

3.1.9 Statistische Auswertung ................................................................................................ 56

3.2 ERGEBNISSE.................................................................................................................. 57

3.2.1 Charakterisierung der Vernebler ................................................................................... 57

3.2.1.1 Aerosolpartikelgrößen................................................................................................ 57

3.2.1.2 Output......................................................................................................................... 57

3.2.2 Liposomen mit Rhodamin 6G ....................................................................................... 58

3.2.2.1 Charakterisierung der Liposomen nach Extrusion und Verneblung .......................... 59

3.2.2.1.1 Verkapselungseffizienz ........................................................................................... 59

3.2.2.1.2 Wiederfindung nach Verneblung ............................................................................ 59

3.2.2.1.3 Verkapselungsrate ................................................................................................... 60

3.2.2.1.4 Medianer Volumendurchmesser ............................................................................. 62

3.2.2.2 Vergleich der Verneblereigenschaften des Aeroneb ® Solo bei der Verneblung von

R6G-Liposomen und isotoner Kochsalzlösung......................................................... 63

3.2.2.2.1 Aerosolpartikelgrößen............................................................................................. 63

3.2.2.2.2 Verneblungsdauer.................................................................................................... 64

3.2.2.2.3 Output...................................................................................................................... 65

3.2.3 Ergebnisse zur Wiederfindung von Sildenafil .............................................................. 65

3.2.3.1 Sildenafil in Eppendorf-Reaktionsgefäßen ................................................................ 65

3.2.3.2 Sildenafil in Falcon Tubes.......................................................................................... 66

3.2.3.3 Sildenafil in Glasgefäßen mit Schläuchen ................................................................. 67

3.2.3.4 Clear C-FLEX ® System ............................................................................................. 70

3.2.4 Liposomen mit Sildenafil .............................................................................................. 71

3.2.4.1 Charakterisierung der Liposomen nach Herstellung und Verneblung ....................... 71

3.2.4.1.1 Verkapselungseffizienz ........................................................................................... 72

3.2.4.1.2 Wiederfindung nach Verneblung ............................................................................ 72

3.2.4.1.3 Verkapselungsrate ................................................................................................... 72

3.2.4.1.4 Medianer Volumendurchmesser ............................................................................. 73

3.2.4.2 Eigenschaften von MicroSprayer ® und Pari LC Sprint ® Star bei Verneblung der

Sildenafil-Liposomen im Vergleich zu Aqua dest./ NaCl......................................... 74

3.2.4.2.1 Aerosolpartikelgrößen Pari LC Sprint ® Star ........................................................... 74

3.2.4.2.2 Output von MicroSprayer ® und Pari LC Sprint ® Star ............................................. 74

3.2.4.3 Freisetzung aus den Sildenafil-Liposomen in vitro.................................................... 76

3.2.4.3.1 Kontrolle Gesamtgehalt........................................................................................... 76

3.2.4.3.2 Kinetik der Sildenafilfreisetzung aus den Liposomen ............................................ 77

II


INHALTSVERZEICHNIS

3.2.4.4 Substanzübertritt von freiem und liposomal verkapseltem Sildenafil am Modell der

isolierten Kaninchenlunge......................................................................................... 78

3.2.4.4.1 Deposition von Sildenafil in der Lunge nach MicroSprayer ® -Verneblung ............ 78

3.2.4.4.2 Übertrittskinetiken von Sildenafil ins Perfusat ....................................................... 79

3.2.4.4.3 Wiederfindung des in der Lunge deponierten Sildenafils....................................... 81

4 DISKUSSIO ................................................................................82

4.1 KRITISCHE BETRACHTUNG DER METHODEN...................................................... 82

4.1.1 Verwendung von DPPC und Cholesterol zur Herstellung der Liposomen................... 82

4.1.2 Verwendung von R6G zur Herstellung und Charakterisierung von Liposomen .......... 84

4.1.3 Methoden zur Herstellung der Liposomen mit R6G..................................................... 85

4.1.4 Herstellung von Liposomen mit Sildenafil ................................................................... 86

4.1.5 Verneblung der Liposomen mit verschiedenen Verneblern.......................................... 87

4.1.6 Inhalative Applikation von Sildenafil ........................................................................... 90

4.1.7 Das Modell der isolierten, ventilierten, perfundierten Kaninchenlunge ....................... 91

4.2 DISKUSSION DER ERGEBNISSE................................................................................ 96

4.2.1 Liposomen mit R6G ...................................................................................................... 96

4.2.1.1 Charakterisierung der R6G-Liposomen nach Extrusion und nach Verneblung......... 96

4.2.1.2 Verneblereigenschaften bei der Verneblung der R6G-Liposomen ............................ 97

4.2.2 Wiederfindung von Sildenafil und Auswahl eines geeigneten Schlauchmaterials ....... 99

4.2.3 Liposomen mit Sildenafil ............................................................................................ 101

4.2.3.1 Charakterisierung der Liposomen vor und nach Verneblung .................................. 101

4.2.3.2 Verneblereigenschaften bei der Verneblung der Sildenafil-Liposomen .................. 103

4.2.3.3 In vitro Freisetzungsversuche................................................................................... 104

4.2.3.4 Substanzübertritt am Modell der isolierten Kaninchenlunge................................... 106

5 ZUSAMMEFASSUG.............................................................111

6 SUMMARY ..................................................................................113

7 LITERATURVERZEICHIS.....................................................115

8 AHAG .....................................................................................130

8.1 Abkürzungen .................................................................................................................. 130

8.2 Abbildungsverzeichnis ................................................................................................... 133

8.3 Tabellenverzeichnis........................................................................................................ 135

8.4 Materialverzeichnis ........................................................................................................ 137

8.4.1 Substanzliste................................................................................................................ 137

8.4.2 Geräteliste.................................................................................................................... 138

8.4.3 Verbrauchsmaterialien und sonstiges.......................................................................... 140

III


1 EINLEITUNG UND ZIEL DER ARBEIT

1 EINLEITUNG UND ZIEL DER ARBEIT

Die pulmonale arterielle Hypertonie (PAH) ist eine fortschreitende Erkrankung des

Menschen, die durch einen erhöhten pulmonalarteriellen Druck charakterisiert ist, der zu

Rechtsherzversagen führt (Chin und Rubin 2008). Die Pathogenese der PAH ist komplex und

unvollständig verstanden, sie beinhaltet aber sowohl genetische als auch umweltbedingte

Faktoren, die die pulmonale vaskuläre Struktur und Funktion verändern (Badesch et al. 2007).

Der Anstieg des pulmonalen Gefäßwiderstandes wird durch eine Kombination aus

verschiedenen Mechanismen bedingt, zu denen Vasokonstriktion, proliferatives und

obstruktives Remodelling der pulmonalen Gefäßwände, Entzündung und Thrombose gehören

(Galié et al. 2009). Das rechte Herz passt sich dem erhöhten pulmonalarteriellen Druck bis zu

einem gewissen Grad an, schließlich kommt es aber zu einer Überlastung des rechten

Ventrikels mit nachfolgender Hypertrophie, Dilatation, eventuell Rechtsherzversagen und

damit zum Tod (Olschewski et al. 2001; Galié et al. 2009).

Die PAH ist eine chronische Erkrankung, die nicht geheilt werden kann (Olschewski et al.

2007; Chin und Rubin 2008; Galié et al. 2009). Durch eine supportive und medikamentelle

Mono- oder Kombinationstherapie können aber Symptome, körperliche Belastbarkeit und

Lebenserwartung der Patienten signifikant verbessert und eine klinische Verschlechterung

verzögert werden (McLaughlin 2002; McLaughlin et al. 2006; Olschewski et al. 2007; Galié

et al. 2009). Arzneimittel, die zur Behandlung der PAH eingesetzt werden, umfassen

Kalziumkanalblocker, Prostanoide, Endothelinrezeptor-Antagonisten und Phosphodiesterase

(PDE)-Typ-5 Inhibitoren. Sie alle zeigen vasodilatative Effekte in der Lunge und alle außer

den Kalziumkanalblockern haben auch antiproliferative Eigenschaften (Chin und Rubin

2008).

NO, ein potenter Vasodilatator, spielt eine Schlüsselrolle bei der Regulation des pulmonalen

Gefäßtonus. Sildenafil, ein oral zu verabreichender Phosphodiesterase (PDE)-5-Inhibitor, zielt

auf den Stickstoffmonoxid (NO)-Weg ab, indem es Effekte verstärkt, die der NO-vermittelten

Initiierung der Vasodilatation nachgeschaltet sind (Ramani und Park 2010). Sildenafil ist seit

2005 unter dem Handelsnamen Revatio ® (Pfizer) zur oralen Behandlung der PAH zur

Verbesserung der Leistungsfähigkeit zugelassen (Ramani und Park 2010;

Arzneimittelkommission der deutschen Ärzteschaft 2009). Nach oraler Einnahme liegt die

Bioverfügbarkeit von Sildenafil nur bei ca. 41 % (Nichols et al. 2002; Sheu et al. 2003). Ein

maximaler Effekt tritt erst nach 60 Minuten ein (Ghofrani et al. 2004c) und trotz der

pulmonalen Selektivität des Wirkstoffs (Michelakis et al. 2003; Barnett und Machado 2006)

- 1 -


1 EINLEITUNG UND ZIEL DER ARBEIT

konnte bei Versuchen mit Schafen bei höheren Dosen auch eine unerwünschte Senkung des

systemischen arteriellen Druckes beobachtet werden (Weimann et al. 2000).

Daraus ergibt sich die Überlegung, den Wirkstoff durch Inhalation direkt in die Lunge zu

verbringen. Der Vorteil der Inhalationstherapie besteht darin, dass hohe lokale

Wirkstoffkonzentrationen bei minimalen systemischen Nebeneffekten erreicht werden.

Außerdem wird durch die Inhalation ein schneller Wirkungseintritt erzielt (Le Brun et al.

2000; Khilnani und Banga 2008).

Bei einer tierexperimentellen Studie mit Schafen mit induzierter pulmonaler Hypertonie

konnte durch die Inhalation von vernebeltem freiem Sildenafil eine innerhalb von zwei

Minuten nach der Inhalation einsetzende selektive Senkung des pulmonalarteriellen Druckes

(pulmonary artery pressure, PAP) erzielt werden. Ein Nachteil war aber die kurze Wirkdauer.

Der PAP stieg nach Beendigung der Inhalation innerhalb weniger Minuten wieder auf den

Ausgangswert (Ichinose et al. 2001). Mit Controlled Release-Formulierungen, wie zum

Beispiel Liposomen, kann die Wirkdauer von Medikamenten in der Lunge verlängert werden

(Shek et al. 1994; Zeng et al. 1995).

Ziel dieser Arbeit war es daher, eine liposomale Formulierung des lipophilen PDE 5-

Inhibitors Sildenafil herzustellen und diese hinsichtlich ihrer Eignung als Controlled Release-

Formulierung zur pulmonalen Applikation zu untersuchen. Hierfür wurden zunächst

Liposomen mit einer einfach nachweisbaren Modellsubstanz, dem lipophilen

Fluoreszenzfarbstoff Rhodamin 6G, nach vier Methoden hergestellt. Die Vesikel wurden

hinsichtlich ihrer Farbstoffbeladung, Größe und Verneblungsstabilität untersucht. Die

Methode, die am besten zur Herstellung der Liposomen geeignet war, wurde gewählt und

weiter optimiert, um Liposomen mit Sildenafil herzustellen. Nach Charakterisierung und

Prüfung ihrer Verneblungsfähigkeit wurde die Sildenafilfreisetzung aus den Liposomen in

vitro und am Modell der isolierten, ventilierten und perfundierten Kaninchenlunge getestet.

- 2 -


2 LITERATURÜBERSICHT

2.1 Aerosol-Therapie

2 LITERATURÜBERSICHT

2.1.1 Behandlung respiratorischer Erkrankungen

Dass die Inhalation den schlüssigen therapeutischen Ansatz zur Behandlung respiratorischer

Erkrankungen darstellt, ist schon lange bekannt. Bereits vor 4000 Jahren wurden in Indien

Blätter der Pflanze Atropa belladonna, die eine Form des Bronchodilatators Atropin enthalten,

als Hustenmittel geraucht (Grossman 1994). Inhalation von Seeluft, heißen Dämpfen und

Aerosolen waren Heilmethoden, die Hippokrates (ca. 460 v. Chr. bis ca. 370 v. Chr.) zur

Behandlung von obstruktiven Lungenerkrankungen einsetzte. In der Zeit der industriellen

Revolution wurden wahrscheinlich erstmals „Asthma-Zigaretten“ (Gonda 2000) eingesetzt.

Diese enthielten Stramonium aus dem weißen Stechapfel (Datura stramonium). In der 2.

Hälfte des 20. Jahrhunderts wurden schließlich zahlreiche effektive Medikamente zur

Behandlung von Asthma in handlichen Verneblersystemen entwickelt, sodass die direkte

Verabreichung von Arzneistoffen in die Lunge zur Therapie von respiratorischen

Erkrankungen immer wichtiger wurde (Gonda 2000). In den letzten 20 Jahren wurden weitere

Fortschritte in der Aerosolforschung gemacht, was zu einem besseren Verständnis der

Mechanismen geführt hat, die der Partikelinhalation und der pulmonalen Partikeldeposition

zugrunde liegen (Scheuch et al. 2006). So können inzwischen viele respiratorische

Erkrankungen über Aerosole behandelt werden. Am weitesten verbreitet ist die Verneblung

von Bronchodilatatoren und Antiinflammatorika zur Behandlung von obstruktiven

Lungenerkrankungen wie Asthma und COPD. Durch hohe lokale Wirkstoffkonzentrationen

wird eine maximale Wirksamkeit bei minimalen systemischen Nebeneffekten erreicht.

Außerdem wird durch die Inhalation ein schneller Wirkungseintritt erzielt (Khilnani und

Banga 2008). Weitere Beispiele für Medikamente, die in Form von Aerosolen zur topischen

Therapie von Lungenerkrankungen eingesetzt werden können, sind Antibiotika (Lambros et

al. 1997; Klepser 2004; Traini und Young 2009; Falagas et al. 2010), antivirale Medikamente,

Immunsuppressiva, Vaccinen, Surfactant, Proteasen und Prostaglandine (Zeng et al. 1995;

Groneberg et al. 2003) sowie Antioxidantien (Borok et al. 1991; Buhl und Vogelmeier 1994;

Prousky 2008) und Cytostatika (Juliano und McCullough 1980). Bei der Gentherapie von

pulmonalen Erkrankungen, zum Beispiel von Lungenkrebs oder cystischer Fibrose, handelt es

ich um eine weitere medizinisch interessante Anwendungsmöglichkeit (Laube 2005).

- 3 -


2 LITERATURÜBERSICHT

2.1.2 Inhalative Verabreichung von Arzneimitteln bei Tieren

Laut Lehrbuch können zur inhalativen Behandlung von Pferden Ultraschall-, Piezo- und

Düsenvernebler sowie die für die Humanmedizin entwickelten Dosiersprays zur Inhalation

eingesetzt werden, um Wirkstoffe in die Bronchioli zu verbringen. Der große Vorteil dieser

Applikationsart besteht in der im Vergleich zur systemischen Gabe oftmals möglichen

Dosisreduktion und damit im geringeren Risiko unerwünschter Arzneimittelwirkungen. Dies

ist vor allem bei der langfristigen Applikation von Glukokortikoiden interessant. Weiter

mögliche Einsatzgebiete von Aerosolen sind parasympatholytisch wirksame

Bronchodilatatoren und in einzelnen Fällen evtl. die Mastzellstabilisatoren Cromoglycinsäure

oder Nedocromil zur Behandlung der equinen chronisch obstruktiven Bronchitis (Fey 2006).

Ein Nachteil der Inhalationstherapie besteht darin, dass ein Teil der inhalativ verabreichten

Wirkstoffe resorbiert wird, sei es über die Mukosa der Atemwege oder nach Abschlucken von

Tracheobronchialsekret über den Magen-Darm-Trakt. In der Humanmedizin wird versucht,

Fehlapplikationen durch ein Training der sich selbst behandelnden Patienten möglichst gering

zu halten, indem die Betroffenen lernen, in welcher Phase der Einatmung sie das Aerosol aus

dem Dosierer freigeben müssen. Da dies bei Pferden ebenso wenig möglich ist wie eine

Inhalation über die Mundhöhle, muss regelmäßig mit Fehlapplikationen und somit mit einem

Verlust an Aerosol und damit einer Dosierungsungenauigkeit gerechnet werden (Fey 2006).

Weiterhin muss bei der inhalativen Verabreichung von Arzneimitteln an Pferde beachtet

werden, dass mit einer Kontamination der Luft in der Nähe des Patienten zu rechnen ist, da

diverse Masken und Aerosolapplikatoren, die auf dem Markt erhältlich sind, in der Regel

nicht dicht am Pferdekopf abschließen. Außerdem weist die Ausatemluft regelmäßig noch

erhebliche Substratkonzentrationen auf. Unproblematisch ist hingegen die inhalative

Verabreichung von isotonen Salzlösungen. Sie entfalten auf der Bronchialschleimhaut eine

osmotische Wirkung, so dass über das Bronchialepithel Wasser in das Bronchiallumen

ausgeschieden wird (Fey 2006).

Bei Katzen können Glukokortikoide wie bespielsweise Fluticasonproprionat mittels

Dosieraerosolgeräten (Dosierzerstäuber, metered dose inhalator, MDI) mit Zwischenstück

direkt in den Atemwegen appliziert werden. Vorteile sind auch hier die geringeren

systemischen Nebenwirkungen sowie die im Vergleich zur Tabletteneingaben bei vielen

Katzen einfachere Applikation. Alternativ ist eine speziell für Katzen entwickelte

Inhalationsmaske erhältlich. Beim Auslösen des MDI gelangt das Aerosol in den eingebauten

Spacer (Hawkins 2010). Spacer stellen einen Raum dar, in dem das vom MDI abgegebene

Aerosol aufgefangen wird. Von dort aus wird es dann vom Patienten inhaliert. Dies hat den

- 4 -


2 LITERATURÜBERSICHT

Vorteil, dass Aerosolerzeugung und Inhalation nicht exakt koordiniert werden müssen.

Außerdem wird bei der Passage durch den Spacer die Geschwindigkeit und die Partikelgröße

des Aerosols reduziert, wodurch ein größerer Anteil in die peripheren Regionen der Lunge

gelangt. Schließlich werden durch einen Spacer größere Aerosolpartikel abgefangen, die sonst

im Oropharynx deponieren würden. Dadurch werden Nebenwirkungen und lokale Irritationen

in diesem Bereich reduziert (Lavorini und Fontana 2009). Nach dem Auslösen des MDI wird

die Maske sofort vor das Gesicht der Katze gehalten, sodass Nase und Maul vollständig

bedeckt sind. Die nächsten sieben bis zehn Atemzüge sollte die Maske so verbleiben, um zu

gewährleisten, dass möglichst viel des im Spacer enthaltenen Aerosols eingeatmet wird und

der Wirkstoff in die Atemwege gelangt. Bei akuter Atemnot können auch Bronchodilatatoren

via MDI als Notfalltherapie zum Einsatz kommen (Hawkins 2010).

Durch die Verneblung von Kochsalzlösung kann auch bei Hunden und Katzen mit Pneumonie

eine Befeuchtung der Atemwege erreicht werden (Hawkins 2010).

2.2 Liposomen

Am „Institute of Animal Physiology“ in Babraham bei Cambridge (Großbritannien) haben

sich zahlreiche Forscher aus unterschiedlichen Bereichen ausführlich mit der Geschichte, den

Eigenschaften und den Einsatzmöglichkeiten von Liposomen beschäftigt. Eine poetische

Beschreibung der Vesikel hat Gregory Gregoriadis in Liposome Letters verfasst (Bangham

1993):

“Little fatty vesicles of bilayer fame

protean and elusive, fragile all the same,

aloof and enigmatic beneath your many skins,

unyielding to the vigour of thousands of spins,

descended from the pasture of Babraham we are told,

you never ceased to wrinkle, expand and then to fold

embracing sodium ions and such electrolytes.

Twinkling guide stars to throngs of acolytes

desirous of your membranous semi-barriers.

Precursors of bion, potential drug carriers.”

- 5 -


2.2.1 Phospholipide und Sterole

2 LITERATURÜBERSICHT

Liposomen wurden erstmals 1965 beschrieben (Bangham et al. 1965). Es handelt sich dabei

um (sub-)mikroskopische Vesikel, deren Durchmesser im Bereich von 20 nm bis zu 10 µm

liegen kann. Sie entstehen spontan, wenn Phospholipide in wässriger Phase gelöst werden.

Dabei entstehen Vesikel aus einer oder mehreren Lipid-Doppelschichten, die ein wässriges

Kompartiment einschließen (Ulrich 2002).

Die Lipid-Doppelschichten ähneln biologischen Membranen. Die am häufigsten zur

Herstellung von Liposomen eingesetzten Lipide sind Phospholipide, die in komplexer

Mischung die Hauptbestandteile der Zellmembranen von Tieren, Pflanzen und

Bakterienzellen darstellen. Liposomen werden meist nur aus einem einzigen Phospholipid

oder einer Mischung aus zwei bis drei Phospholipiden hergestellt. Phospholipide zeichnen

sich dadurch aus, dass sie eine hydrophile oder polare Kopfgruppe und einen hydrophoben

Schwanz haben, sie sind also amphiphil. Die allgemeine chemische Struktur der

Phospholipide ist in Abb. 1 dargestellt. Die polare Gruppe besteht aus einem

Glyceringrundgerüst, dessen dritte Hydroxylgruppe mit einem Phosphorsäurerest verestert ist.

Eine der übrigen Sauerstoffgruppen der Phosphorsäure kann weiter verestert sein mit

unterschiedlichen organischen Molekülen wie Glycerin, Cholin, Ethanolamin, Serin oder

Inositol. Die Hydroxylgruppen an Position 1 und 2 des Glycerins sind mit langkettigen

Fettsäuren verestert, die aus 10 bis 24 Kohlenstoffatomen mit 0 bis 6 Doppelbindungen

bestehen, wobei die Länge der Ketten und die Anzahl der Doppelbindungen entscheidende

Einflüsse auf die Eigenschaften der Phospholipide haben (Kulkarni et al. 1995; Vemuri und

Rhodes 1995).

- 6 -


2 LITERATURÜBERSICHT

Abb. 1: Schematischer Aufbau eines Phospholipids (modifiziert aus Vemuri und Rhodes

1995)

Durch Variationen der Kopfgruppe und der Fettsäuren ergeben sich viele verschiedene

Phospholipide, sowohl natürliche als auch synthetische, die zur Herstellung von Liposomen

genutzt werden können. Man kann zwischen kationischen, anionischen und neutralen Lipiden

unterscheiden, wobei die Wahl der einzusetzenden Lipide von der zu verkapselnden Substanz

und dem therapeutischen Ziel abhängt. Kationische Lipide werden oft bei der Gentherapie

eingesetzt, anionische und neutrale Lipide finden Verwendung bei der Herstellung von

wirkstoffbeladenen Vesikeln (Sharma und Sharma 1997), wobei neutrale und positiv geladene

Liposomen nach intravenöser Applikation den Vorteil haben, dass sie weniger schnell aus

dem Blut entfernt werden (Juliano und Stamp 1975; Gregoriadis und Davis 1979).

Zusätzlich zu den Phospholipiden wird auch oft Cholesterol in unterschiedlichen Mengen zur

Herstellung von Liposomen verwendet, um die Membranstabilität zu verbessern. In

Zellmembranen von Säugetieren ist Cholesterol das am häufigsten vorkommende Sterol

(Demel und de Kruyff 1976). Durch die Inkorporation von Cholesterol in die Membran von

Liposomen wird die Dichte der Fettsäureketten erhöht und ihre Mobilität reduziert. Dadurch

wird die Permeabilität wasserlöslicher Moleküle durch die Membran reduziert. Die Abnahme

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2 LITERATURÜBERSICHT

der Permeabilität ist in der Regel proportional zur Cholesterolkonzentration (Demel und de

Kruyff 1976; Sharma und Sharma 1997; Barenholz 2001; Kraske und Mountcastle 2001).

Außerdem verbessert Cholesterol die Stabilität der Membran in Gegenwart biologischer

Flüssigkeiten wie Blut oder Plasma (Gregoriadis und Davis 1979; Kirby et al. 1980; Damen et

al. 1981).

2.2.2 Bildung und Klassifizierung von Liposomen

Wenn Phospholipide in ein wässriges Medium gebracht werden, lagern sich die

Fettsäureketten einander an, wodurch das Wasser aus dieser hydrophoben Region

ausgeschlossen wird. Die hydrophilen Interaktionen der Phospholipid-Kopfgruppen mit

Wasser führen zur Bildung von Lipid-Doppelschichten in Form von multi- oder unilamellaren

Systemen, sogenannten Vesikeln (Lasic 1988; Vemuri und Rhodes 1995). Diese Interaktionen

macht man sich bei der erstmals von Bangham 1965 beschriebenen, auch in der eigenen

Arbeit angewendeten Filmmethode zunutze (Bangham et al. 1965). Dabei werden die

Phospholipide in einem organischen Lösungsmittel gelöst, dann unter Vakuum getrocknet und

der so entstandene dünne Lipidfilm schließlich unter Rühren oberhalb der

Phasenübergangstemperatur der Lipide hydriert. Dabei entstehen große multilamellare

Vesikel (MLV) mit sehr heterogener Größenverteilung und Lamellenanzahl, die bei Bedarf

durch unterschiedliche Methoden wie Ultraschallbehandlung oder Extrusion durch

Polycarbonatfilter weiterbehandelt werden können, um uniforme Liposomen zu erhalten

(Ulrich 2002).

Für die Klassifizierung der Liposomen stehen drei verschiedene Nomenklaturen zur

Verfügung (Vemuri und Rhodes 1995). So können Liposomen beschrieben werden anhand

- ihrer Größe: SUV (small unilamellar vesicles) sind ca. 0,025 – 0,05 µm groß, LUV

(large unilamellar vesicles) ca. 0,1 µm;

- der Anzahl der Lipiddoppelschichten: MLV (multilamellare Vesikel), die ca. 0,05 – 10

µm groß sind und ULV (unilamellare Vesikel) mit einer Größe von ca. 0,025 – 0,1

µm;

- der Herstellungsmethode: z. Bsp. REV (reversed-phase evaporation vesicle, ca. 0,5

µm groß), FPV (French press vesicle, ca. 0,05 µm groß), EIV (ether injection vesicle,

ca. 0,2 µm groß). Dieses Klassifizierungsmerkmal ist weniger gebräuchlich als die

beiden anderen.

- 8 -


2 LITERATURÜBERSICHT

2.2.3 Anwendungsmöglichkeiten von Liposomen

Nach der zufälligen Entdeckung der Liposomen wurde schon bald ihr potentieller Nutzen als

Vehikel zur systemischen Medikamentenapplikation erkannt und kontinuierlich weiter

erforscht (Sessa und Weissmann 1968; Gregoriadis 1976; Lasic 1998). In den 1970er Jahren

entstand erstmals die Idee, dass Liposomen als Medikamententräger genutzt werden können,

um den therapeutischen Index von Medikamenten zu modifizieren, indem deren Toxizität

reduziert und/ oder ihre Effizienz erhöht wird. Intensive Forschung in den 80er und 90er

Jahren (Übersicht bei Gregoriadis 2008) brachte ein detaillierteres Verständnis, das zu

Liposomen mit erhöhter Stabilität in vitro und in vivo, verbesserter Biodistribution und

optimierter Verweildauer der Liposomen im Organismus führte (Lian und Ho 2001). Die

vielversprechenden Ergebnisse gaben Anlass zu weiteren Untersuchungen (allein im Jahr

2003 wurden fast 2000 paper und 150 reviews über Liposomen veröffentlicht, s. Torchilin

2005), sodass heute liposomale Formulierungen für eine Reihe von Wirkstoffen zur

Verfügung stehen, vor allem für Chemotherapeutika, Antibiotika und Impfstoffe (Lasic 1998).

Der Einsatz von Liposomen in der Medizin eröffnet vielfältige therapeutische Möglichkeiten,

von denen hier die wichtigsten genannt werden sollen (Kulkarni et al. 1995; Sharma und

Sharma 1997; Lasic 1998; Goyal et al. 2005):

- durch die Verkapselung von Medikamenten in Liposomen können unerwünschte

Arzneimittelwirkungen auf gesundes Gewebe vermieden und so Nebenwirkungen der

Therapie minimiert werden;

- durch die unterschiedlichen Kompartimente können sowohl hydrophile (im inneren

wässrigen Kompartiment) als auch lipophile Substanzen (in der Lipidschicht)

verkapselt werden (s. Abb. 2);

- die physikochemischen Eigenschaften der Liposomen können verändert werden,

sodass sowohl geladene als auch ungeladene Stoffe aufgenommen werden können;

- Liposomen werden aus natürlichen Bestandteilen hergestellt. Sie sind also

bioabbaubar, wenig immunogen und zeigen höchstens eine geringe systemische

Toxizität;

- für unterschiedliche Anwendungsbereiche können verschiedene Größen der

Liposomen hergestellt werden;

- durch die liposomale Verkapselung von Medikamenten kann eine kontrollierte und

verzögerte Arzneimittelfreisetzung und außerdem ein Schutz der Medikamente vor zu

schnellem Abbau erzielt werden;

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2 LITERATURÜBERSICHT

- ein Targeting, zum Beispiel über Antikörper auf der Liposomenmembran, erlaubt eine

gezielte Ansprache von erkrankten Geweben und eine erhöhte Aufnahme der Vesikel

durch die Zielzellen unter Schonung des Gesamtorganismus (s. Abb. 2);

- die Verweildauer der Liposomen und somit der Medikamente im Blut oder anderen

Kompartimenten des Körpers kann durch Oberflächenmodifikationen der Liposomen,

z. B. durch Anlagerung von Polyethylenglykol (PEG), verlängert werden (s. Abb. 2).

Abb. 2: Modellhafte Darstellung der Verkapselung einiger Substanzen in unterschiedlichen

Kompartimenten eines unilamellaren Liposoms sowie verschiedener Möglichkeiten der

Oberflächenmodifikation. PEG: Polyethylenglykol

Nachteile des Systems können u.a. sein:

- Freisetzung der verkapselten Substanzen während der Lagerung,

- langsame Freisetzung und Absorption, wodurch der Wirkungseintritt verzögert werden

kann,

- Schwierigkeit einer genauen Dosierung,

- Aufnahme der Liposomen durch das retikuloendotheliale System,

- Variationen zwischen einzelnen Chargen,

- Probleme bei der Herstellung großer Mengen und bei einer eventuell notwendigen

Sterilisation.

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2 LITERATURÜBERSICHT

Durch die große Variabilität der Liposomen in Bezug auf Lipidzusammensetzung, Größe,

Ladung, Verkapselung unterschiedlichster Substanzen und vielfältiger Modifikationen der

Oberfläche können die Vesikel Anforderungen erfüllen, die verschiedene Applikationsformen

stellen. So können liposomale Formulierungen inhalativ, intravenös, transdermal oder oral

angewendet werden (Ulrich 2002). Im Folgenden wird schwerpunktmäßig die für die eigene

Arbeit relevante inhalative Verabreichung der Liposomen näher betrachtet.

2.2.4 Liposomen zur pulmonalen Applikation

Die pulmonale Verabreichung von Liposomen als Aerosol kann sowohl bei respiratorischen

Erkrankungen als auch zur systemischen Therapie zum Einsatz kommen. Liposomen sind

eines der am intensivsten erforschten Systeme zur kontrollierten Verabreichung von

Medikamenten in die Lunge.

Eines der ersten pharmazeutischen Produkte auf Liposomenbasis, die auf den Markt kamen,

war das Alveofact ® (Dr Karl Thomae GmbH, Biberach, Deutschland), ein synthetisches

Lungensurfactant zur pulmonalen Instillation zur Behandlung des Respiratory-Distress-

Syndroms (RDS) (Müller et al. 2000). Durch die Verkapselung von Wirkstoffen in

Liposomen soll ihre pulmonale Anwendbarkeit verbessert werden. Untersucht wurde dies

zum Beispiel mit Zytostatika, Bronchodilatatoren, antimikrobiellen und antiviralen

Medikamenten, Antiasthmatika, Antioxidantien und Substanzen mit systemischer Wirkung

(Zeng et al. 1995; Salama et al. 2009). Die inhalative Therapie infektiöser, immunologischer

und genetischer Erkrankungen der Lunge hat gegenüber systemischer Behandlung den

Vorteil, dass die pulmonale Deposition der Wirkstoffe systemische Nebeneffekte deutlich

reduzieren kann (Schreier 1994). Grundsätzliche Schwierigkeiten der inhalativen Applikation

bestehen aber darin, dass

- Patienten trainiert werden müssen, um das Atmen und die Inhalation der Aerosole

koordinieren zu können;

- viele Wirkstoffe durch eine schnelle Elimination aus der Lunge eine kurze Wirkdauer

haben. Dies macht ein häufiges Nachdosieren nötig, was wiederum oft für systemische

Nebeneffekte verantwortlich ist;

- einige schlecht wasserlösliche Medikamente lokale Irritationen und Entzündungen der

Luftwege verursachen können oder eine Anwendung als Aerosol ganz ausschließen;

- intrazelluläre Pathogene durch unzureichende cytosolische Penetration nur schwer

erreicht werden können.

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2 LITERATURÜBERSICHT

Durch Liposomen können einige dieser Probleme, die bei der Verabreichung konventioneller

Aerosole auftreten, reduziert werden, da Liposomen

- für eine relativ uniforme Verteilung der Wirkstoffe in den Alveolen sorgen;

- als Lösungsmatrix für schlecht lösliche Substanzen dienen können;

- ein pulmonales Reservoir für verzögerte Freisetzung sein können;

- die intrazelluläre Aufnahme von Medikamenten, vor allem in Alveolarmakrophagen,

Somit können

erleichtern können.

- lokale Irritationen des Lungengewebes verhindert und eine pulmonale Toxizität

reduziert;

- lokal länger therapeutische Wirkstoffspiegel erhalten und die Behandlungsfrequenz

reduziert sowie

- höhere intrazelluläre Wirkstoffkonzentrationen erzeugt werden (Schreier et al. 1993;

Mansour et al. 2009).

Bevor liposomale Aerosole als Vehikel für den Arzneimitteltransport für klinische Zwecke

genutzt werden können, musste natürlich gezeigt werden, dass die Vehikel selbst ungefährlich

sind. Auch wenn davon ausgegangen werden kann, dass die Inhalation von Liposomen nicht

toxisch ist, da das Phospholipid Dipalmitoyl-Phosphocholin (DPPC), das häufig für die

Herstellung von Liposomen verwendet wird, ungefähr 70-80% des natürlichen

Surfactantpools darstellt, könnte die langfristige Inhalation von Liposomen theoretisch zu

unerwünschten Wirkungen führen. Durch die exogenen Phospholipide können zum Beispiel

Lipidpneumonien, Zellschädigungen (Peroxidation mit der Produktion freier Fettsäuren),

schädliche Auswirkungen auf die Luftwege (Bronchospasmen) oder Suppression von

Alveolarmakrophagen ausgelöst werden (Myers et al. 1993). Daher haben sich zahlreiche

Studien mit den akuten und chronischen Auswirkungen von Liposomen bzw. liposomalen

Aerosolen auf Zellen, Tiere oder Menschen befasst.

In einer Studie wurde die in vitro Toxizität von Liposomen und ihre funktionellen und

morphologischen Interaktionen mit Lungenalveolarmakrophagen von Ratten untersucht,

indem die Alveolarmakrophagen 1 bis 24 Stunden lang unterschiedlichen Konzentrationen

von Liposomen (1 bis 10 µmol) ausgesetzt wurden. Dabei konnten keine schädlichen

Auswirkungen der Liposomen auf die Makrophagen in Bezug auf die untersuchten Parameter

- 12 -


2 LITERATURÜBERSICHT

Viabilität, Phagocytose- und Tötungsaktivität festgestellt werden (Gonzalez-Rothi et al.

1991).

Diese Beobachtungen konnten in tierexperimentellen Studien bestätigt werden. Dabei

inhalierten Mäuse für eine Stunde am Tag fünf Tage pro Woche über einen Zeitraum von vier

Wochen Liposomen oder Salzlösung. Es zeigten sich keine negativen Auswirkungen auf die

Gesundheit oder das Überleben der Tiere, keine histopathologischen Veränderungen der

Lungen und keine Veränderungen in Funktion oder Morphologie der Alveolarmakrophagen

(Myers et al. 1993). Eine andere tierexperimentelle Untersuchung befasste sich mit den

Auswirkungen von inhalierten liposomalen Aerosolen auf Lungenfunktion und Blutgase. Die

Forscher ließen Schafe 30 Minuten lang über einen Tracheotubus Liposomen mit

unterschiedlicher Lipidzusammensetzung bzw. Salzlösung als Kontrolle inhalieren und

analysierten dabei die dynamische Compliance der Lunge, die Lungenresistance sowie die

Blutgase (paO2 und paCO2). Während des gesamten Beobachtungszeitraums von sechs

Stunden post inhalationem blieben alle Parameter im normalen physiologischen Bereich

(Schreier et al. 1992).

Auch zur Wirkung von liposomalen Aerosolen bei Menschen gibt es Untersuchungen. Bei

fünf Freiwilligen, die eine Stunde lang Liposomen inhaliert hatten, die die antivirale Substanz

Enviroxim enthielten, konnten keine ungünstigen Effekte beobachtet werden (Gilbert et al.

1988). In einer anderen Studie mit zehn Freiwilligen, die eine Stunde lang Liposomen ohne

Wirkstoffe inhalierten, konnte gezeigt werden, dass Lungenfunktion und Allgemeinbefinden

durch die Inhalation nicht beeinträchtigt wurden (Thomas et al. 1991). Eine weitere

Untersuchung zeigte an gesunden Freiwilligen, dass die Inhalation von mit Beclomethason

beladenen Liposomen, die aus dem Phospholipid Dilauroyl-Phosphatidylcholin (DLPC)

hergestellt worden waren, gut toleriert wurde und keine pulmonalen oder systemischen

Nebeneffekte auftraten (Waldrep et al. 1997). Bei gesunden Freiwilligen, die Amikacin-

haltige Liposomen inhalierten, die mit 99m Tc markiert waren, konnten keine signifikanten

Veränderungen in Labor-, Vital- oder Lungenfunktionsparametern der Probanden festgestellt

werden (Weers et al. 2009).

In weiteren Studien konnten sogar positive Effekte der liposomalen Verkapselung von

Wirkstoffen in Bezug auf Verträglichkeit und Wirkdauer im Vergleich zum freien Wirkstoff

nachgewiesen werden. Eine Studie zeigte, dass die liposomale Formulierung des

Virostatikums Enviroxim 10 bis > 50-fach weniger toxisch auf Zellen aus Gewebekulturen

gewirkt hat als freies Enviroxim. Dabei zeigten sich in vivo keine histopathologischen

Veränderungen in Lungen von Mäusen, die 24 bzw. 72 Stunden vorher mit vernebelten leeren

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2 LITERATURÜBERSICHT

bzw. Enviroxim-haltigen Liposomen behandelt worden waren (Wyde et al. 1988). Eine

andere Arbeitsgruppe konnte nachweisen, dass all-trans-Retinsäure (all-trans-retinoic acid,

ATRA), die zur Krebstherapie eingesetzt wird, in liposomal verkapselter Form von Mäusen in

deutlich höherer Konzentration toleriert wird als der freie Wirkstoff. Außerdem wurde durch

die Verkapselung der zelluläre und mikrosomale Metabolismus von ATRA reduziert. Nach

ein- oder mehrfacher Behandlung der Mäuse mit liposomalem ATRA wurden keine makro-

oder mikroskopischen Veränderungen der Lunge festgestellt, und auch die

Leberfunktionstests waren unauffällig. Hierdurch konnte gezeigt werden, dass liposomales

ATRA im Vergleich zur freien Form nicht toxisch ist (Parthasarathy et al. 1999).

Obwohl sich die meisten Untersuchungen auf eine kurzzeitige bzw. einmalige Anwendung

von Liposomen beschränken, bestätigt zumindest die tierexperimentelle Studie, die über einen

Zeitraum von vier Wochen durchgeführt wurde (Myers et al. 1993) die Behauptung von

Schreier et. al., dass die pulmonale Applikation von Liposomen auch bei langfristiger

Anwendung ungefährlich ist (Schreier et al. 1993).

2.2.4.1 Liposomen als Retardformulierungen zur pulmonalen Applikation

Die Inhalation von vernebelten Medikamenten ist eine gängige Methode zur Behandlung

pulmonaler Erkrankungen. Da die Wirkdauer der Medikamente aber oft relativ kurz ist, sind

häufig mindestens drei bis vier Inhalationen pro Tag nötig. Bei der Behandlung der

pulmonalen Hypertonie mit Iloporost-Aerosolen sind es sogar sechs bis zwölf Inhalationen

täglich (Olschewski et al. 2000). Mit Controlled Release-Formulierungen, wie zum Beispiel

Liposomen, kann die Wirkdauer der Medikamente in der Lunge verlängert werden (Shek et

al. 1994; Zeng et al. 1995). Dadurch kann die Behandlungsfrequenz gesenkt werden, was zu

einer Reduktion von systemischen Nebeneffekten führt (Taylor und Newton 1992; Mansour et

al. 2009).

Über die Geschwindigkeit der Wirkstofffreisetzung kann die Wirkdauer gesteuert werden. Es

sind einige Faktoren bekannt, die die Wirkstofffreisetzung und die Absorption der

verkapselten Moleküle in der Lunge beeinflussen (Zeng et al. 1995), wie Lipidmenge und

Ladung der Liposomen (Woolfrey et al. 1988) oder Lipidzusammensetzung,

Cholesterolgehalt und Größe der Vesikel (Abra et al. 1990; Fielding und Abra 1992).

Auch Faktoren, die die Deposition der Liposomen im Respirationstrakt bestimmen, können

Effekte auf die Freisetzung und Absorption von Wirkstoffen aus den Vesikeln haben. Die

Partikelgröße und Größenverteilung des Aerosols, die Art der Aerosolapplikation und das

Atemmuster des Patienten bestimmen die Clearance und somit die Verweildauer der

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2 LITERATURÜBERSICHT

inhalierten Partikel (Zeng et al. 1995). In unterschiedlichen Bereichen der Lungen wirken

unterschiedliche Reinigungsmechanismen, die inhalierte Partikel unterschiedlich schnell

entfernen. Der mukoziliäre Transport nimmt zu den tieferen Atemwegen hin ab. Partikuläre

Carrier, die in Regionen mit ausgeprägtem mukociliärem Transport deponiert werden, werden

also schnell entfernt. Damit Retardformulierungen wie zum Beispiel Liposomen ihre Wirkung

entfalten können, müssen sie also in den tieferen Regionen der Lunge deponiert werden, wo

der mukoziliäre Transport minimal und ihre Verweildauer in der Lunge somit länger ist

(Taylor und Newton 1992; Zeng et al. 1995). Da der Gesamtquerschnitt der Atemwege mit

zunehmender Eindringtiefe in den Atemtrakt zunimmt, wodurch die

Strömungsgeschwindigkeit abnimmt, strömt ein Aerosol schnell durch die zentralen

Atemwege und langsam durch die peripheren Strukturen des Atemtrakts. Die

geschwindigkeitsabhängige Impaktion führt also vor allem zur Abscheidung von großen

Partikeln in den zentralen Atemwegen. Dagegen sind die zeitabhängigen

Transportmechanismen Diffusion und Sedimentation überwiegend für die Deposition von

kleineren Teilchen in der Lungenperipherie verantwortlich. Im Bereich der kleinen Atemwege

führen alle drei Mechanismen zur Abscheidung von Teilchen. Daraus wird ersichtlich, dass

der Ort der Teilchenablagerung im Atemtrakt mit zunehmender Teilchengröße aus der

Lungenperipherie in Richtung zentraler Atemwege verschoben wird. Um bei einer

therapeutischen Anwendung von Aerosolen die Deponierung von Teilchen in der

gewünschten Region des Atemtraktes zu maximieren, kann man die physiologischen

Parameter, also die Strömungsverhältnisse im Atemtrakt, die abhängig sind von

Atemzugdauer und Strömungsgeschwindigkeit, über Atemmanöver regulieren. Die

physikalischen Parameter, also die Teilcheneigenschaften wie Größe und Dichte, können

ebenfalls variiert werden (Scheuch et al. 2006). Dabei ist eine periphere Deposition bei einer

Partikelgröße von 3 – 5 µm maximal (Voshaar et al. 2001; Scheuch et al. 2006).

Durch Variation dieser Parameter soll eine optimale Freisetzungsgeschwindigkeit erreicht

werden, die eine maximale Wirkdauer gewährleistet. Eine zu schnelle Freisetzung führt zu

einer verkürzten Wirkdauer. Eine zu langsame Freisetzung kann bei Wirkstoffen mit einer

minimalen effektiven Dosis dazu führen, dass kein therapeutisches Level am Wirkort erreicht

wird (Fielding und Abra 1992).

Mit Hilfe der Gammaszintigraphie können Deposition und Clearance von radioaktiv

markierten Liposomen im Respirationstrakt untersucht werden. Diese Untersuchungen haben

gezeigt, dass Liposomen effektiv in der Lunge deponiert werden, wo sie auch für längere Zeit

intakt verbleiben (Taylor und Newton 1992). Mit DPPC-Liposomen, die mit 99m Tc markiert

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2 LITERATURÜBERSICHT

waren und die von Freiwilligen inhaliert wurden, konnte gezeigt werden, dass 20 Stunden

nach der Inhalation noch ca. 60 % der deponierten Aktivität in den Alveolen vorhanden war

(Farr et al. 1985). Passend dazu konnte eine andere Arbeitsgruppe 24 bzw. 48 Stunden nach

der Inhalation von Liposomen aus DPPC und Cholesterol noch 60,4 % bzw. 38,3 % der

deponierten Radioaktivität in den Lungen der Probanden nachweisen (Weers et al. 2009). Bei

einer weiteren Studie waren es nach 24 Stunden noch 79 % bzw. 83 % für Liposomen aus den

beiden Phospholipiden DPPC und DLPC (Saari et al. 1999). Dass bei der Studie von Saari et

al. nach 24 Stunden noch ca. 80 % der Radioaktivität nachgewiesen werden konnten, während

es bei Farr et al. und Weers et al. nur jeweils ca. 60 % waren, kann an der Lokalisation der

Deposition der Partikel liegen, da diese die Clearance der Partikel beeinflusst (Farr et al.

1985). Die Deposition ist von der Aerosolpartikelgröße und dem Atemmuster der Probanden

abhängig. Da bei allen drei Studien Düsenvernebler verwendet wurden und die

Aerosolpartikel bei Weers et al. und Saari et al. mit 1,6 µm bzw. 1,3 µm ähnlich groß waren,

kommen die Unterschiede wahrscheinlich durch die individuellen Atemmanöver zustande.

Bei diesen Studien ist allerdings nicht geklärt, ob die Lipide frei oder noch in Form von

Liposomen vorliegen. Aufschlussreicher scheint für diese Fragestellung eine Studie zu sein,

bei der ebenfalls gesunde Freiwillige Liposomen aus Phosphatidylcholin (PC) inhalierten, die

in ihrem wässrigen Kompartiment den radioaktiven Marker

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99m Tc-DTPA

(Diethylenaminpentaessigsäure) enthielten. Hier konnten nach 24 Stunden noch ca. 45 % der

deponierten Radioaktivität in der Lunge nachgewiesen werden. Dies lässt darauf schließen,

dass noch intakte Vesikel in den Alveolen vorhanden waren, die den Marker enthielten, da

freies 99m Tc-DTPA mit einer Halbwertszeit von 75 Minuten aus den Atemwegen entfernt wird

(Barker et al. 1994).

Auch durch direkte Messungen des pulmonal applizierten Wirkstoffes lässt sich eine längere

Verweildauer von liposomal verkapseltem im Vergleich zu freiem Wirkstoff feststellen. Dazu

untersuchten zum Beispiel Demaeyer et al. bronchoalveoläre Lavagen (BAL) zu

unterschiedlichen Zeitpunkten nach intratrachealer Applikation von radioaktiv markiertem

Gentamicin in Kaninchenlungen. Dabei zeigte sich eine Stunde nach der Instillation sowohl

für das freie, als auch für das liposomale Gentamicin (Liposomen aus PC) eine Peak-

Konzentration in der BAL (freies Gentamicin: 1572 ± 139 µg; liposomales Gentamicin: 1214

± 330 µg). Nach einem Tag konnte aber nur für den verkapselten Wirkstoff noch messbare

Radioaktivität in der BAL detektiert werden (Demaeyer et al. 1993). Eine andere

Arbeitsgruppe analysierte die Menge von radioaktiv markiertem, endotracheal in Kaninchen

appliziertem freiem sowie in ebenfalls radioaktiv markierten Liposomen verkapseltem


2 LITERATURÜBERSICHT

Fentanyl in den Lungen, die zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach der Applikation

entnommen wurden. Es wurden drei verschiedene Liposomenformulierungen untersucht.

Dabei waren 50 %, 70 % bzw. 90 % der in der Formulierung enthaltenen Radioaktivität in

den Liposomen aus DPPC verkapselt, der Rest lag in Form von freiem Fentanyl vor. Nach der

Applikation von 300 µg freiem bzw. liposomalem Wirkstoff fiel die Wirkstoffmenge in den

Lungen umso langsamer ab, je mehr Wirkstoff ursprünglich liposomal verkapselt war. Nach

24 Stunden konnten schließlich bei den Tieren, die mit freiem Fentanyl behandelt worden

waren, nur noch 0,0023 ± 0,00013 µg Fentanyl in den Lungen gemessen werden. Bei der

Liposomenformulierung, die 50 % des enthaltenen Wirkstoffs verkapselt hatte, waren es 2,7 ±

0,49 µg und bei der Formulierung mit 70 % verkapseltem Wirkstoff 26,9 ± 12,6 µg. Bei den

Liposomen, die 90 % des enthaltenen Wirkstoffs verkapselt hatten, konnten nach 24 Stunden

noch 77,1 ± 47,3 µg Fentanyl in den Lungen gemessen werden. Hierbei konnten sogar nach

48 Stunden noch 55,6 ± 16,8 µg gefunden werden (Tan et al. 1996). Mit einer ähnlichen

Methode wurde die Verweildauer von freiem Atropin und dem Wirkstoff in Liposomen aus

dem Phospholipid DPPC und Cholesterol in Kaninchenlungen untersucht. Auch hier wurde

die freie Substanz deutlich schneller aus den Lungen entfernt, als die liposomal verkapselte.

Eine Stunde nach der Applikation konnten nur noch 18,8 % der applizierten Menge des freien

Wirkstoffs in den Lungen wiedergefunden werden, während es bei den Liposomen 53,2 %

waren. Nach 48 Stunden waren es bei der liposomalen Formulierung noch 20,9 %, während

sich nur noch 4,1 % bei dem freien Wirkstoff nachweisen ließen (Meisner et al. 1989). Juliano

et al. untersuchten zu unterschiedlichen Zeitpunkten die Lungen von Ratten, nachdem diesen

radioaktiv markiertes freies bzw. liposomal verkapseltes Cytosin-Arabinosid appliziert

worden war. Sie stellten fest, dass die liposomale Verkapselung des Wirkstoffs zu einer

Verlängerung der Verweildauer in der Lunge mit einer Halbwertszeit von 8 Stunden führte,

während der freie Wirkstoff mit einer Halbwertszeit von 40 Minuten aus der Lunge entfernt

wurde (Juliano und McCullough 1980).

Neben der Messung der Verweildauer von Liposomen bzw. liposomal verkapselten

Wirkstoffen in der Lunge können auch Unterschiede in der Pharmakokinetik von pulmonal

applizierten freien bzw. liposomal verkapselten Wirkstoffen gemessen werden. In der oben

genannten Studie von Juliano et al. an Rattenlungen konnte auch gezeigt werden, dass das

Plasmalevel nach Applikation von freiem Cytosin-Arabinosid schnell anstieg, ein Maximum

nach ca. einer Stunde erreichte und dann wieder abfiel. Mit der liposomalen Formulierung

wurde ein langsamer Anstieg über ca. eine Stunde auf ein Level, das bei ca. 20 % des Peak-

Levels von freiem Wirkstoff lag, erreicht. Diese Konzentration blieb über mehrere Stunden

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2 LITERATURÜBERSICHT

relativ konstant (Juliano und McCullough 1980). Ähnliche Ergebnisse berichteten Meisner et

al. in ihrer Studie nach pulmonaler Applikation von Atropin (Meisner et al. 1989). In

weiteren Untersuchungen mit gesunden Freiwilligen konnte gezeigt werden, dass die

liposomale Verkapselung von Cromoglycat zu einer verlängerten Nachweisbarkeit des

inhalierten Wirkstoffes im Plasma im Vergleich zu seiner freien Form führte. Der freie

Wirkstoff bewirkte eine maximale Plasmakonzentration von ca. 30 ng/ml nach zwei Stunden,

die danach wieder relativ steil abfiel. 24 Stunden nach der Inhalation konnte die Substanz im

Plasma der Probanden nicht mehr nachgewiesen werden. Nach Inhalation des liposomalen

Cromoglycats entstand nach einer Stunde ein Plasmapeak bei ca. 5 ng/ml. Die

Plasmakonzentration fiel über sechs bis acht Stunden auf ca. 1 ng/ml ab und bildete dort ein

Plateau. Auch nach 24 und 25 Stunden war noch knapp 1 ng/ml des Wirkstoffs im Plasma

messbar (Taylor et al. 1989). In einer Studie mit Schafen konnte gezeigt werden, dass die

Plasmahalbwertszeit von pulmonal appliziertem Amikacin von 117 Minuten bei freiem auf

über 3 bzw. über 10 Stunden bei liposomal verkapseltem Wirkstoff verlängert werden konnte,

abhängig vom Cholesterolgehalt der Liposomen (Schreier et al. 1992). Demaeyer et al.

zeigten neben der verlängerten Nachweisbarkeit des Gentamicins in der bronchoalveoläre

Lavage als weitere Folge der liposomalen Verkapselung des Wirkstoffs ein niedrigeres und

konstantes Plasmalevel im Vergleich zu freiem Gentamicin. Der freie Wirkstoff erzeugte ca.

30 Minuten nach der intrabronchialen Verabreichung eine Peak-Konzentration im Plasma von

ca. 1,5 µg/ml, während die liposomale Form keinen Peak bewirkte und ein Plasmalevel von

0,25 µg/ml während des gesamten untersuchten Zeitraums von 24 Stunden nicht überschritt

(Demaeyer et al. 1993).

Schließlich führt die Verkapselung von Wirkstoffen in Liposomen auch zu einer veränderten

Pharmakodynamik. Dies gilt sowohl für systemisch wirkende Substanzen wie Insulin als auch

für Wirkstoffe mit lokaler Wirkung in der Lunge. Huang et al. berichten, dass das

Blutglukoselevel von diabetischen Mäusen nach Inhalation von einer Mischung aus freiem

Insulin und Liposomen um ca. 80 % nach zwei Stunden gesenkt werden konnte. Fünf Stunden

nach der Inhalaion hatte es wieder das Ausgangsniveau erreicht. War das Insulin hingegen in

den Liposomen verkapselt, sank das Blutglukoselevel über einen Zeitraum von fünf Stunden

kontinuierlich um insgesamt 200 % und war auch nach sechs Stunden noch auf diesem

Niveau (Huang und Wang 2006). Bei einer durch Verneblung von Histamin induzierten

Bronchokonstriktion bei Meerschweinchen führte die liposomale Verkapselung der β2-

Agonisten Metaproterenol-Sulfat (MPS) bzw. Albuterol nicht nur zu einer Senkung der

kardiovaskulären Nebenwirkungen, sondern auch zu einer deutlichen Verlängerung der

- 18 -


2 LITERATURÜBERSICHT

bronchodilatatorischen Wirkung im Vergleich zu den freien Wirkstoffen. Während der

bronchodilatatorische Effekt von freiem MPS nach zwei Stunden nachließ und zehn bis zwölf

Stunden nach der Verabreichung wieder den Kontrollwert erreicht hatte, persistierte der

bronchodilatatorische Effekt des liposomalen MPS noch nach zehn bis zwölf Stunden

(McCalden et al. 1989). Bei Albuterol konnte durch die liposomale Verkapselung des

Wirkstoffs lediglich eine Verlängerung der Wirkdauer von ein bis zwei auf zwei bis drei

Stunden erreicht werden, bei höheren Dosen auch bis zum Versuchsende nach vier Stunden

(McCalden und Radhakrishnan 1991).

Insgesamt verdeutlichen diese Studien, dass die liposomale Verkapselung die pulmonale

Retention von Wirkstoffen erhöhen und ihre Wirkdauer verlängern kann, während

extrapulmonale Effekte vermindert werden.

2.2.4.2 Schicksal von Liposomen im Respirationstrakt

Die Dauer der Wirkstofffreisetzung aus Liposomen wird in vivo stark von deren Stabilität und

Aufenthaltsdauer in der Lunge beeinflusst (Taylor und Farr 1993). Wie Liposomen aus dem

Respirationstrakt beseitigt werden hängt wie bei anderen inhalierten Partikeln davon ab, an

welche Stelle sie deponiert werden (McCalden 1990), was wiederum weniger von der Größe

der Liposomen, sondern im Wesentlichen von der Größe der Aerosoltröpfchen bestimmt wird

(Farr et al. 1985; Taylor und Newton 1992; Schreier et al. 1993). Physikochemische

Eigenschaften der Liposomen wie Hygroskopizität und elektrische Ladung können aber sehr

wohl einen Einfluss auf die Deposition eines liposomalen Aerosols haben. Da Liposomen

empfindlich gegenüber osmotischen Einflüssen sind und außerdem eine positive oder

negative Ladung tragen können, können Wasserverlust oder elektrostatische Interaktionen

aufgrund von Verdunstung sowohl die Deposition der Liposomen als auch die Retention

verkapselter Substanzen beeinflussen. Bei lyophilisierten Liposomen, die in Form von

Pulvern vernebelt werden, kann es außerdem zur Aggregation der Pulverpartikel kommen.

Dies führt zu einer vermehrten Deposition in den größeren Atmwegen und weniger in den

peripheren Lungenregionen (Schreier et al. 1993).

Inhalierte Partikel, also auch Liposomen, die im Tracheobronchialbaum deponiert werden,

werden durch die mukoziliäre Clearance in Richtung Oropharynx transportiert, wo sie

zusammen mit direkt im Oro-/ Nasopharynx deponierten Partikeln ausgehustet oder

verschluckt werden (Farr et al. 1985; Myers et al. 1993; Schreier et al. 1993).

Der wichtigste Reinigungsmechanismus in den Alveolen ist die Aufnahme von Partikeln in

Alveolarmakrophagen (Kellaway und Farr 1990; McCalden 1990; Schreier et al. 1993). Die

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2 LITERATURÜBERSICHT

Aufnahme von Liposomen in diese Zellen konnte sowohl an isolierten Alveolarmakrophagen

(Gonzalez-Rothi et al. 1991; Poelma et al. 2002) als auch in vivo mit vernebelten Liposomen

an Mäusen (Myers et al. 1993) und instillierten Liposomen an Ratten (Poelma et al. 2002)

gezeigt werden.

Neben diesen beiden Mechanismen, die auch andere inhalierte Partikel betreffen, existiert für

Liposomen noch ein weiterer Reinigungsmechanismus. Mit radioaktiv markierten

Liposomenkomponenten konnte nachgewiesen werden, dass die Übertrittskinetiken von

liposomalen Phospholipiden und Cholesterol aus den Alveolen über das Lungengewebe in die

Zirkulation zwar etwas langsamer, aber doch vergleichbar zu nicht-liposomalem Surfactant

sind. Das lässt vermuten, dass die Liposomen in den Alveolen abgebaut werden und in den

Pool von Surfactant-Phospholipiden aufgenommen werden (McCalden 1990). Liposomale

und endogene Phospholipide werden dann vor allem von Typ-II-Alveolarzellen aufgenommen

und dort recycelt oder abgebaut (Kellaway und Farr 1990; Schreier et al. 1993; Poelma et al.

2002).

2.2.5 Einsatz von Liposomen in der Veterinärmedizin

Einige der Effekte, die durch die Verkapselung von Wirkstoffen in Liposomen entstehen,

konnten auch bei der Anwendung von Liposomen in der Veterinärmedizin gezeigt werden.

a) Vermehrte Aufnahme von Wirkstoffen in erkrankte Gewebe unter Reduktion

systemischer Nebenwirkungen:

- Bei Pferden wurde in zahlreichen Studien der Einfluss der liposomalen Verkapselung

von Diclofenac zur topischen Behandlung von degenerativen Gelenkerkrankungen

(Lynn et al. 2004) oder experimentell induzierten subkutanen Infektionen (Caldwell et

al. 2004; Levine et al. 2009) bzw. Osteoarthritiden (Frisbie et al. 2009) untersucht, bei

denen das nichtsteroidale Antiphlogistikum (NSAID) in Form einer Creme auf die

Haut aufgetragen wurde. Dabei konnte gezeigt werden, dass durch die liposomale

Formulierung lokal ein länger anhaltender therapeutischer Wirkstoffspiegel erzielt

werden kann, während die Wirkstoffkonzentration im Plasma reduziert wird. Somit

sinkt das Risiko für systemische Nebenwirkungen wie gastrointestinale Ulzera, renale

Toxizität und lokale Reaktionen an der Injektionsstelle, die nach systemischer

Applikation von NSAIDs auftreten können (Anderson et al. 2005).

- Nach intravenöser Applikation beim Pferd zeigten radioaktiv markierte Liposomen

eine gute Verträglichkeit und ein reproduzierbares Organverteilungsmuster bei

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2 LITERATURÜBERSICHT

gesunden Tieren. Untersuchungen zur Biodistribution zeigten eine Anreicherung des

radioaktiven 99m Tc in Lunge, Nieren, Leber und Milz. Da man aufgrund von

Untersuchungen an anderen Spezies davon ausgehen kann, dass sich ungebundenes

99m Tc nicht in Lunge, Leber und Milz anreichert, könnten Liposomen eingesetzt

werden, um Wirkstoffe gezielt in diese Organe zu bringen (Targeting). Durch

Anlagerung einer Schutzschicht aus Polyethylenglycol (PEG) an die Liposomen wird

eine lange Verweildauer der Vesikel im Gefäßsystem erreicht. Durch diese lange

vaskuläre Phase der Liposomen und ihre Fähigkeit zur Paravasation in Gewebe mit

erhöhter vaskulärer Permeabilität können radioaktiv markierte Vesikel außerdem eine

nützliche Methode zur Detektion von Infektionen, Entzündungen und Neoplasien

mittels Szintigraphie darstellen (Underwood et al. 2011).

- Da Liposomen neben einer langen Verweildauer im Gefäßsystem auch eine selektive

intratumorale Akkumulation aufweisen, gibt es auch einen vielversprechenden Ansatz,

liposomales Doxorubicin als Radiosensitizer zur Behandlung des fortgeschrittenen

felinen Fibrosarkoms zu nutzen (Kleiter et al. 2010).

- Die dermale Anwendung des Lokalanästhetikums Lidocain, das in Liposomen

verkapselt war, führte in einer Untersuchung an Katzen nicht zu toxischen

Plasmakonzentrationen des Wirkstoffs (Fransson et al. 2002).

b) Vermehrte Aufnahme liposomal verkapselter Substanzen in Zielzellen:

- Bei Schafen, die mit freiem und liposomal verkapseltem Ampicillin behandelt worden

waren, zeigte sich bei der liposomalen Formulierung eine bessere Aufnahme des

Antibiotikums in neutrophile Granulozyten und Monocyten, in denen der Wirkstoff

zudem vier mal so lange nachgewiesen werden konnte wie nach Behandlung mit dem

freien Wirkstoff (Yazar et al. 2006).

- Auch die Aufnahme von Enrofloxazin in Neutrophile und Makrophagen, die aus

anatolischen Hirtenhunden isoliert worden waren, war bei liposomalem Enrofloxazin

effektiver im Vergleich zu der freien Form. Dies verbesserte die antibakterielle

Wirksamkeit des Antibiotikums gegenüber intrazellulären Staphylococcus aureus-

Infektionen (Baş et al. 2002; Degim et al. 2002).

- Die liposomale Verkapselung des Immunmodulators Muramyltripeptid-

Phosphatidylethanolamin, der zur Behandlung des caninen Hämangiosarkoms der

Milz eingesetzt wird, führt zu einer vermehrten Aufnahme des Wirkstoffs in

Monozyten und Makrophagen und verlängert seine Halbwertszeit in der Zirkulation.

Dadurch wird die tumorizide Aktivität der Monozyten erhöht. Außerdem steigen die

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2 LITERATURÜBERSICHT

Plasmakonzentrationen von TNF-α und IL-6 sowie anderer Zytokine. In Kombination

mit einer Splenektomie und einer systemischen Chemotherapie können durch eine

Behandlung mit dem liposomalen Immunmodulator die krankheitsfreie Zeit und die

Überlebenszeit erkrankter Hunde signifikant verlängert werden. Die Ergebnisse dieser

Studie zeigen, dass liposomales Muramyltripeptid-Phosphatidylethanolamin eine

signifikante antimetastatische Aktivität bei hochgradig malignen, kaum auf

Chemotherapie reagierenden, spontan auftretenden Hämangiosarkomen der Milz beim

Hund hat (Vail et al. 1995).

c) Verlängerung der Verweildauer und Wirkdauer liposomal verkapselter Substanzen im

Körper:

- Nach der intravenösen Behandlung von Kühen mit Ceftiofur und liposomalem

Ceftiofur zeigte sich bei den mit der liposomalen Formulierung behandelten Tieren

eine Plasmahalbwertszeit des Antibiotikums von über 30 Stunden. Dies entspricht

einer Verdoppelung der Plasmahalbwertszeit von freiem Ceftiofur. Dadurch könnte

die Behandlung der bovinen Mastitis auf eine einmalige Applikation des Wirkstoffs

reduziert werden. In der Folge könnten die Behandlungskosten gesenkt, die

Behandlungscompliance verbessert, der Stress für die Tiere reduziert und das

Wohlbefinden der Tiere gefördert werden (Liu et al. 2011).

- Bei der lokalen Schmerztherapie von Blaukronenamazonen mit Butorphanol wurde

durch die Verkapselung des Wirkstoffs in Liposomen eine Verlängerung der

Wirkdauer im Vergleich zu freiem Butorphanol erzielt. Bei der liposomalen

Formulierung konnten über drei bis fünf Tage analgetische Effekte beobachtet werden,

während sich das Schmerzverhalten von Tieren, die mit freiem Butorphanol behandelt

worden waren, nicht signifikant von dem der mit Kochsalzlösung behandelten

Kontrolltiere unterschied. Der Vergleich dieser Ergebnisse wird allerdings durch den

Einsatz von unterschiedlichen Konzentrationen und Applikationsformen zur

Behandlung der Tiere erschwert (liposomale Formulierung: 10 mg/kg oder 15 mg/kg

subkutan; freies Butorphanol: 5 mg/kg intramuskulär). Auch anhand der

Plasmakonzentrationen konnte eine Wirkstofffreisetzung aus den Liposomen über fünf

Tage gezeigt werden. Die Plasmakonzentrationen des freien Wirkstoffs waren schon

nach 24 Stunden vernachlässigbar. Auch hier unterschieden sich aber die eingesetzten

Wirkstoffdosen (liposomale Formulierung: 15 mg/kg; freies Butorphanol: 2 mg/kg).

Der Einsatz der liposomalen Formulierung könnte ebenfalls dazu beitragen, über eine

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2 LITERATURÜBERSICHT

verminderte Injektionsfrequenz den Behandlungsstress für die Tiere zu reduzieren

(Sladky et al. 2006).

- Bei Hunden konnte eine längere Verweildauer von Hydromorphon im Plasma durch

Verkapselung des Wirkstoffs in Liposomen erzielt werden. Aus einer früheren Studie

war bekannt, dass Hydromorphon in konventionellen Formulierungen sowohl nach

intravenöser als auch nach subkutaner Applikation schnell eliminiert wurde. Die

Halbwertszeit lag dosisabhängig bei 0,6 (applizierte Dosis: 0,1 mg/kg) bis 1,1

(applizierte Dosis: 0,5 mg/kg) Stunden. Nach intravenöser Applikation von 0,5 mg/kg

Hydromorphon in Liposomen lag die Halbwertszeit ebenfalls nur bei 0,52 Stunden.

Nach der subkutanen Verabreichung von 1,0 mg/kg des Wirkstoffs konnte durch die

Verkapselung in Liposomen eine Halbwertszeit von 5,22 Stunden erreicht werden, bei

einer verabreichten Dosis von 2,0 mg/kg waren es 31,5 Stunden und bei einer Dosis

von 3,0 mg/kg wurde der Wirkstoff mit einer Halbwertszeit von 24,1 Stunden

eliminiert (Smith et al. 2008).

d) Reduktion der Toxizität schlecht verträglicher Substanzen:

- Durch die liposomale Verkapselung von Cisplatin, einem sowohl in der Human- als

auch der Veterinärmedizin weit verbreitet eingesetzten Chemotherapeutikum, konnte

an klinisch gesunden Hunden gezeigt werden, dass durch diese Formulierung die

Toxizität des Wirkstoffs reduziert wurde. Unverkapseltes Cisplatin führt

dosisabhängig zu toxischen Effekten. Durch die Verkapselung in Liposomen konnte

das Doppelte der maximal tolerierten Dosis von freiem Wirkstoff sicher verabreicht

werden (Marr et al. 2004).

- In der Geflügelindustrie stellen Infektionen mit Escherichia coli ein großes

ökonomisches Problem dar. Dagegen könnte eine nicht serotyp-spezifische Vakzine

eingesetzt werden. Dafür bietet sich die innere Oligosaccharid-Lipid A Region

bakterieller Lipopolysaccharide (LPS) an, da sie gut konserviert und stark immunogen

ist. Diese ist aber toxisch. Durch die Verkapselung der LPS-Komponenten in

Liposomen konnte ihre Toxizität in vitro signifikant reduziert werden. Hühner, die mit

dem liposomalen LPS geimpft worden waren, vertrugen die Impfung gut und bildeten

einen konzentrationsabhängigen Antikörpertiter aus. Nach Infektion der Tiere mit

einem virulenten E. coli-Stamm zeigten geimpfte Tiere signifikant weniger

infektionsbedingte klinische Symptome, eine niedrigere Mortalität und weniger

postmortale Veränderungen als ungeimpfte Tiere (Dissanayake et al. 2010).

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2 LITERATURÜBERSICHT

e) Steigerung der Effizienz immunologischer Adjuvantien durch Regulation der humoralen

und zellulären Immunität:

- In zwei Studien konnte durch die liposomale Verkapselung von Glycyrrhizinsäure

bzw. Epimediumpolysacchariden plus Propolisflavonen die Wirkung dieser

immunologischen Adjuvantien verstärkt werden. Dazu wurden 14 Tage alte Hühner

gegen die Newcastle-Krankheit geimpft. Anschließend wurden ihnen die Adjuvantien

in freier bzw. liposomal verkapselter Form injiziert. Durch die Gabe der

Epimediumpolysaccharide plus Propolisflavone wurden die Antikörper-Titer, die

Proliferation der T-Lymphocyten und die Konzentrationen von Interferon-γ und

Interleukin-6 erhöht. Durch die liposomale Verkapselung dieser Substanz konnten

diese Effekte nochmals signifikant verstärkt werden. Außerdem waren Mortalität und

Morbidität geringer als in den Kontrollgruppen (Fan et al. 2012). Durch die

Glycyrrhizinsäure wurden die Antikörpertiter und die Konzentrationen der

Immunglobuline IgG und IgM in den geimpften Tieren erhöht. Außerdem wurden die

Lymphocytenproliferation und die Anteile von CD4- und CD8-positiven Zellen

verstärkt. Auch diese Effekte konnten durch die liposomale Verkapselung des

Wirkstoffs signifikant verstärkt werden (Zhao et al. 2011).

2.3 Pulmonale arterielle Hypertonie

Die pulmonale arterielle Hypertonie (PAH) des Menschen ist eine fortschreitende

Erkrankung, die charakterisiert ist durch einen erhöhten pulmonalarteriellen Druck, der zu

Rechtsherzversagen führt. Unter der Bezeichnung PAH werden Krankheiten subsummiert, die

durch eine primäre Veränderung der kleinen Pulmonalarterien gekennzeichnet sind (Chin und

Rubin 2008). Diesen Veränderungen können verschiedene Auslöser zugrunde liegen,

aufgrund derer das Krankheitsbild der PAH in fünf verschiedene Kategorien eingeteilt wird

(Simonneau et al. 2009):

- idiopathisch,

- erblich (Mutationen im BMPR2-Gen, Mutationen im ALK-1 oder Endoglin-Gen oder

unbekannte Ursachen),

- medikamenten- oder toxininduziert,

- assoziiert mit verschiedenen Krankheiten (Kollagenosen, HIV-Infektionen, portale

Hypertension, kongenitale Herzerkrankungen, Schistosomiasis, chronische

hämolytische Anämie),

- als persistierende pulmonale Hypertonie der Neugeborenen.

- 24 -


2 LITERATURÜBERSICHT

Die der PAH zugrunde liegenden Gefäßveränderungen treten sowohl bei der idiopathischen

Form als auch in Assoziation mit anderen Erkrankungen oder Expositionen auf. Sie stellen

wahrscheinlich eine Reaktion auf die oben genannten umwelt- oder krankheitsbedingten

Auslöser gekoppelt mit genetisch determinierten Prädispositionen dar (Chin und Rubin 2008).

Der PAH liegt eine multifaktorielle Pathogenese zugrunde, bei der Vasokonstriktion,

Remodeling der pulmonalen Gefäßwände und Thrombose zu einem erhöhten

Gefäßwiderstand beitragen (Humbert et al. 2004).

Es handelt sich bei der PAH um eine chronische Erkrankung, die nicht geheilt werden kann

(Olschewski et al. 2007; Chin und Rubin 2008; Galié et al. 2009). Vor Einführung der

Therapie mit Vasodilatoren führte progressives Rechtsherzversagen meist zum Tod der

Patienten innerhalb von 2,8 Jahren nach Diagnosestellung (D'Alonzo et al. 1991). Die

Behandlung der PAH hat sich aber in den letzten 15 Jahren rasant weiterentwickelt (Ramani

und Park 2010). Vor 1996 hat sich die Therapie auf eine symptomatische Kontrolle, die ein

Management des Rechtsherzversagens mit Diuretika und Digoxin, Sauerstofftherapie zur

Korrektur der Hypoxämie und den Einsatz von Kalziumkanalblockern beinhaltete, fokussiert.

Die Erkenntnis, dass das Fortschreiten der PAH charakterisiert ist durch Gefäß-Remodeling

und ein Ungleichgewicht zwischen proliferativen und anti-inflammatorischen Mediatoren

führte zur Anerkennung der Wichtigkeit von Endothelin, Prostacyclin und Stickstoffmonoxid

(NO) in Initiation und Progression der Erkrankung. Diese Schlüssel-Signalwege dienen jetzt

als Ziele für krankheitsspezifische Behandlungen, die das PAH-Management revolutioniert

haben (Ramani und Park 2010).

So bilden heute Wirksstoffe aus drei Klassen die Säulen der spezifischen medikamentellen

Therapie der PAH: Prostazyklin-Analoga, Endothelinrezeptor-Antagonisten und

Phosphodiesterase (PDE)-5-Inhibitoren. Ein aktueller, ausführlicher Überblick über den

Einsatz dieser Arzneimitteln kann der einschlägigen Literatur entnommen werden (Galié et al.

2009; Agarwal und Gomberg-Maitland 2011; Fukumoto und Shimokawa 2011; Stamm et al.

2011).

Alle diese Wirkstoffe zeigen vasodilatative und antiproliferative Effekte in der Lunge (Chin

und Rubin 2008). Im Folgenden wird auf den PDE-5-Inhibitor Sildenafil näher eingegangen,

da dieser im experimentellen Teil der vorliegenden Arbeit eingesetzt wurde.

- 25 -


2 LITERATURÜBERSICHT

2.3.1 Einsatz von Sildenafil zur Behandlung der PAH

Sildenafil, ein oral zu verabreichender Phosphodiesterase (PDE)-5-Inhibitor, zielt auf den

Stickstoffmonoxid (NO)-Weg ab, indem es Effekte verstärkt, die der NO-vermittelten

Initiierung der Vasodilatation nachgeschaltet sind (Ramani und Park 2010).

NO wird in der Lunge konstitutiv durch die NO-Synthase (NOS), die in Gefäßendothelzellen

und Atemwegsepithelzellen lokalisiert ist, aus L-Arginin produziert (Ghofrani et al. 2004a;

Ramani und Park 2010). Das labile Gas NO diffundiert dann frei über Kapillarmembranen in

die glatten Gefäßmuskelzellen und aktiviert dort Guanylatcyclasen, die auf zellulärer Ebene

die Konversion von GTP zu cGMP stimulieren. Intrazelluläres cGMP hat viele Effekte auf die

Zellphysiologie, die in Abb. 3 dargestellt sind (Barnett und Machado 2006; Ramani und Park

2010). Insbesondere sind dies:

- Regulation von Ionenkanälen, die in einer Vasodilatation resultiert;

- Veränderung der Konzentration intrazellulärer cyklischer Nukleotide (cyklisches

Adenosinmonophosphat, cAMP). Indem die Konversion von cAMP zu AMP gehemmt

wird, steigt die cAMP-Konzentration, was eine Vasodilatation bewirkt;

- Aktivierung von Proteinkinasen (PKA und PKB) durch cGMP und cAMP, wodurch die

Proliferation glatter Muskelzellen gehemmt wird.

Die intrazellulären Spiegel der second Messenger cAMP und cGMP werden durch

Phosphodiesterasen reguliert. Zurzeit sind elf verschiedene Isoenzyme der PDE-Familie

identifiziert, die in ihrer Substratselektivität, Gewebelokalisation und ihren Wirkmechanismen

variieren (Kass et al. 2007). PDE-5 wird in der systemischen Zirkulation kaum exprimiert

(Ramani und Park 2010), die Expression in den glatten Muskeln der pulmonalen Gefäße ist

aber weit verbreitet. Es ist das am häufigsten vorkommende cGMP-metabolisierende Enzym

in der Lunge. Dort limitiert es die vasodilatativen und antiproliferativen Effekte von cGMP-

induzierten vasoaktiven Faktoren wie NO und natriuretischen Peptiden auf die pulmonalen

Blutgefäße (Sebkhi 2003). Diese Eigenschaft und die Tatsache, dass es bei der PAH zu einer

Hochregulierung von PDE-5 kommt (MacLean et al. 1997; Black et al. 2001; Murray et al.

2002; Rondelet 2004; Wharton et al. 2005), machen das Enzym zu einem attraktiven Ziel für

die pharmakologische Manipulation von Tonus und Struktur der pulmonalen Gefäße (Sebkhi

2003). Da PDE-Inhibitoren die Spiegel von cAMP und cGMP regulieren, können sie

therapeutisch genutzt werden, um Prostanoid- und NO-vermittelte vaskuläre Effekte zu

verstärken und zu verlängern (Ghofrani et al. 2004a). Sildenafil bewirkt durch eine selektive

Hemmung der PDE-5 den Abbau von cGMP und verlängert so dessen Wirkung (Barnett und

Machado 2006). Da dies nur in Gefäßen mit signifikanter NO-Produktion, also in gut

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2 LITERATURÜBERSICHT

ventilierten Lungenbereichen geschieht, entsteht kein Ventilations-Perfusions-

Ungleichgewicht (Chin und Rubin 2008).

Abb 3: Schematische Darstellung der vasodilatativen und antiproliferativen Effekte von

Sildenafil (modifiziert und kombiniert aus Barnett und Machado 2006 und Ghofrani et al.

2004a)

AMP: Adenosinmonophosphat

Ca ++ : Calcium

cAMP: cyclisches Adenosinmonophosphat

cGMP: cyclisches Guanosinmonophosphat

GMP: Guanosinmonophosphat

GTP: Guanosintriphosphat

K + : Kalium

NO: Stickstoffmonoxid

NOS: NO-Synthase

O2: Sauerstoff

PDE: Phosphodiesterase

PKA: Proteinkinase A

PKG: Proteinkinase G

Inzwischen konnte in zahlreichen Studien gezeigt werden, dass Sildenafil effektiv den

pulmonalen Gefäßwiderstand reduziert. Ergebnisse dazu liefern tierexperimentelle Studien an

Lämmern mit U46619-induzierter PAH (Weimann et al. 2000) und an Mäusen mit Hypoxie-

induzierter (Zhao et al. 2001) bzw. Monocrotalin-induzierter PAH (Schermuly 2003). Zudem

wurde der Effekt in klinischen Studien an Patienten mit chronischer (Wilkens et al. 2001;

Michelakis 2002) bzw. Hypoxie-induzierter PAH (Zhao et al. 2001; Ghofrani et al. 2004b;

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2 LITERATURÜBERSICHT

Richalet 2004) nachgewiesen. Da die PDE-5 als Angriffspunkt von Sildenafil in der

systemischen Zirkulation kaum, in den glatten Muskeln der pulmonalen Gefäße aber stark

exprimiert wird, führt Sildenafil nicht zu systemischen Blutdruckabfällen, sondern weist eine

pulmonale Selaktivität auf (Weimann et al. 2000; Michelakis 2002; Michelakis et al. 2003;

Barnett und Machado 2006). Außerdem weist Sildenafil eine intrapulmonale Selektivität auf

(Ghofrani et al. 2004a; Ghofrani et al. 2004c). Diese wird erreicht, indem Sildenafil vermehrt

in solchen Lungenbezirken wirkt, die ausreichend ventiliert werden. Durch Ventilation und

die Anwesenheit von Sauerstoff wird vermehrt NO produziert (Ghofrani et al. 2004a). Eine

verstärkte Perfusion ventilierter Bereiche bewirkt eine verbesserte arterielle Oxygenierung.

Tierexperimentelle Studien konnten zeigen, dass eine orale Behandlung mit Sildenafil nicht

nur vasodilatativ wirkt, sondern auch die Neomuskularisierung sowohl in Hypoxie-, als auch

in Monocrotalin-Modellen der PAH in Ratten reduziert (Itoh 2003; Schermuly 2003; Sebkhi

2003) und die Mediaverdickung der Pulmonalarterien limitiert (Rondelet 2004). Hinweise auf

einen antiproliferativen Effekt von PDE-5-Inhibitoren gibt es auch an humanen

pulmonalarteriellen glatten Muskelzellen (Wharton et al. 2005; Wang et al. 2008a). Diese in

vitro Ergebnisse an humanen Zellen beantworten zwar nicht direkt die Frage, ob es durch eine

PDE-5-Inhibition möglich ist, das Gefäß-Remodeling in vivo zu beeinflussen, sie geben aber

einen Hinweis darauf, dass eine chronische PDE-5-Inhibition einen antiproliferativen Effekt

bei Patienten mit schwerer PAH haben kann (Wharton et al. 2005).

Nach Kenntnis der Autorin liegt bislang lediglich eine tierexperimentelle Studie zu

inhalativen Effekten von Sildenafil vor (Ichinose et al. 2001), auf die in der Diskussion näher

eingegangen wird.

2.3.2 Pulmonale Hypertonie bei Tieren

Im Gegensatz zur Humanmedizin, wo die pulmonale Hypertonie mit Faktoren wie

Fehlfunktionen des Endothels, Gefäßneubildungen und in-situ-Thrombosen in

Zusammenhang gebracht wird, ist diese Erkrankung bei Tieren laut Lehrbüchern am ehesten

als Folge von obstruktiven Atemwegserkrankungen oder Behinderungen des pulmonal-

venösen Blutflusses bekannt. Beispiele für auslösende Atemwegserkrankungen sind

chronische Bronchitiden, die besonders häufig bei Pferden (hier meist in Form einer chronisch

obstruktiven Bronchitis), Hunden und Katzen auftreten, sowie idiopathische Lungenfibrosen

und allergisch bedingte Bronchospasmen bei Rindern. Behinderungen des venösen

Blutflusses können bei Kleintieren im Zuge von Kardiopathien, erhöhten Druckverhältnissen

infolge kongenitaler Herzerkrankungen oder erhöhtem Widerstand in den Lungengefäßen,

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2 LITERATURÜBERSICHT

zum Beispiel durch Lungenembolien oder Herzwurminfektionen, entstehen. Durch die

Ungleichverteilung der Ventilation und erhebliche Ventilations-Perfusions-

Verteilungsstörungen kommt es zu einer arteriellen Hypoxämie. Diese führt zu einer

hypoxischen Vasokonstriktion in den schlecht belüfteten Lungenarealen und so schließlich

zur pulmonalen Hypertonie (Gros 2000; Hawkins 2010).

Die Therapie der pulmonalen Hypertonie bei Tieren besteht in der Identifikation und

Behandlung der zugrunde liegenden Krankheitsprozesse. Für Tiere, bei denen keine

Grunderkrankung identifiziert werden konnte oder bei denen konservative Maßnahmen zur

Verbesserung der intraarteriellen Druckverhältnisse fehlgeschlagen sind, ist ein direkter

Therapieansatz empfehlenswert. Das dabei am häufigsten eingesetzte Medikament bei

Hunden ist Sildenafil, z. B. als Präparat Viagra ® , Pfizer (Bach et al. 2006; Brown et al. 2010;

Hawkins 2010).

Bei Broilern ist das pulmonale hochdruck Syndrom auch als Aszitessyndrom bekannt.

Ursache ist ein erhöhter Blutfluss. Dieser wird bei den schnell wachsenden Fleischrassen

benötigt, um den für den erhöhten Metabolismus benötigten Sauerstoffbedarf decken zu

können. Um das Blut durch die Kapillargefäße in der Lunge transportieren zu können, wird

bei vermehrtem Fluss ein erhöhter Druck benötigt. So kommt es zum pulmonalen Hochdruck.

Die dadurch entstehende vermehrte Belastung des rechten Ventrikels führt sporadisch zu

Rechtsherzversagen und Aszites. Hühner haben eine dickere respiratorische Membran als

andere Vögel. Dabei ist die respiratorische Membran von Broilern noch mal dicker als die von

Hühnern der Rasse Leghorn. Dadurch ist der Übertritt von Sauerstoff ins Blut bei Broilern

erschwert. Neben genetischen Faktoren können eine Reihe weiterer Komponenten an der

Entstehung des Aszitessyndroms beteiligt sein. Dazu gehören unter anderem Kälte, Hitze,

bestimmte Nährstoffe oder Chemikalien. Andere Faktoren wie eine erhöhte Viskosität des

Blutes, ein erhöhte Rigidität der roten Blutzellen oder eine reduzierte vaskuläre Kapazität in

der Lunge verursachen pulmonalen Hochdruck und Aszites, indem sie den Fließwiderstand

des Blutes in den Lungen erhöhen. Die Inzidenz der Erkrankung kann gesenkt werden, indem

Umgebungstemperatur und Belüftung optimiert werden (Julian 2000; Baghbanzadeh und

Decuypere 2008).

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3 EIGENE UNTERSUCHUNGEN - 3.1 MATERIAL UND METHODEN

3 EIGENE UNTERSUCHUNGEN

3.1 MATERIAL UND METHODEN

3.1.1 Substanzen und Lösungen

3.1.1.1 DPPC

Die Fettsäureketten des Phospholipids 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DPPC,

Avanti Polar Lipids, Alabaster, USA) bestehen aus 16 Kohlenstoffatomen und besitzen keine

Doppelbindungen. DPPC (CAS-Nummer 63-89-8) hat folgende chemische Eigenschaften

(Anderson und Omri 2004; Khan et al. 2008, Herstellerangaben):

- Summenformel: C40H80NO8P

- Molekulargewicht: 734,039 g/mol

- Phasenübergangstemperatur: 41 °C

- Ladung: bei pH 7,4 ungeladen

Abb. 4: Chemische Eigenschaften und Strukturformel von DPPC

In der Lunge stellt DPPC ungefähr 70 – 80 % des natürlichen Surfactantpools dar (Myers et

al. 1993).

3.1.1.2 Cholesterol

Cholesterol (CH) wurde von Avanti Polar Lipids, Alabaster, USA, bezogen. Das Molekül mit

der CAS-Nummer 57-88-5 hat folgende chemische Eigenschaften (Vemuri und Rhodes 1995,

Herstellerangaben):

- Summenformel:

C27H46O

- Molekulargewicht:

386,654 g/mol

Abb. 5: Chemische Eigenschaften und Strukturformel von Cholesterol

- 30 -


3 EIGENE UNTERSUCHUNGEN - 3.1 MATERIAL UND METHODEN

Cholesterol ist ein Sterol, das oft zusätzlich zu den Phospholipiden in unterschiedlichen

Mengen zur Herstellung von Liposomen verwendet wird, um deren Membranstabilität zu

verbessern. Es reduziert die Permeabilität wasserlöslicher Moleküle durch die

Liposomenmembran (Demel und de Kruyff 1976; Sharma und Sharma 1997; Barenholz 2001;

Kraske und Mountcastle 2001) und verbessert die Stabilität der Membran in Gegenwart

biologischer Flüssigkeiten wie Blut oder Plasma (Gregoriadis und Davis 1979; Kirby et al.

1980; Damen et al. 1981). Cholesterol kommt auch natürlich in Zellen von Säugetieren vor,

wo es das am häufigsten vorkommende Sterol ist (Demel und de Kruyff 1976).

3.1.1.3 Rhodamin 6G

Rhodamin 6G (R6G, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Deutschland) ist ein

lipophiler Fluoreszenzfarbstoff, der bereits erfolgreich in Liposomen verkapselt werden

konnte (Moscho et al. 1996; Khan et al. 2008). R6G (CAS-Nummer 989-38-8) besitzt

folgende chemische Eigenschaften (Khan et al. 2008; Lahnstein et al. 2008):

-

Summenformel: C28H31CIN2O3

- Molekulargewicht: 479,02 g/mol

- pKs: 7,5

- Oktanol/ Wasser-Verteilungs-

koeffizient: log P = 2,69 ± 0,18

- λex: 528 nm

- λem: 551 nm

Abb. 6: Chemische Eigenschaften und Strukturformel von Rhodamin 6G

3.1.1.4 Sildenafil

Sildenafil ist ein potenter und selektiver Phosphodiesterase-5-Inhibitor (Galié et al. 2009), der

zur oralen Behandlung der erektilen Dysfunktion bei Männern eingesetzt wird (Boolell et al.

1996a; Boolell et al. 1996b). Seit 2005 ist Sildenafil unter dem Handelsnamen Revatio ® auch

zur Behandlung der pulmonal-arteriellen Hypertonie (PAH) zur Verbesserung der

Leistungsfähigkeit zugelassen, ursprünglich nur bei Patienten mit PAH der WHO-

Funktionsklasse III. Seit 2009 wurde die Indikation für die PAH der WHO-Funktionsklasse II

erweitert (Arzneimittelkommission der deutschen Ärzteschaft 2009; Ramani und Park 2010).

- 31 -


3 EIGENE UNTERSUCHUNGEN - 3.1 MATERIAL UND METHODEN

Die in dieser Arbeit verwendete Sildenafil Base (CAS-Nummer 139755-83-2) wurde von

zwei verschiedenen Herstellern bezogen (AK Scientific, Inc., USA und bioKEMIX, Hazel

Grove, Großbritannien). Die Substanz ist relativ hydrophob, wobei die Löslichkeit vom pH-

Wert abhängig ist und bei pH-Werten unter 6 und über 10 ansteigt (Al Omari et al. 2006;

Wang et al. 2008b). Weitere chemische Eigenschaften dieses weißen kristallinen Pulvers sind

nachstehend aufgeführt (Gobry et al. 2000; Melnikov et al. 2003, Herstellerangaben):

- Summenformel: C22H30N6O4S

- Dichte: 1,17 g/cm 3

- Molekulargewicht: 474,6 g/mol

- Oktanol/ Wasser-Verteilungs-

koeffizient: log P = 3,18 ± 0,01

Abb. 7: Chemische Eigenschaften und Strukturformel von Sildenafil

3.1.1.5 Elektrolytlösungen

Die Elektrolytlösungen wurden von Serag-Wiessner (Naila, Deutschland) hergestellt. Die

Lösung II N enthielt folgende Bestandteile: NaCl 120 mM, KCl 4,3 mM, KH2PO4 1,1 mM,

CaCl2 2,4 mM, MgCl2 1,3 mM, Glucose 13,32 mM und Hydroxyethylstärke 50g/l.

Die Lösung 1/3 enthielt CaCl2 2,4 mM, MgCl2 1,3 mM, KCl 4,3 mM, KH2PO4 1,1 mM, NaCl

125 mM und Glucose 13,32 mM.

Die Elektrolytlösung II N wurde für die Versuche zur Wiederfindung von Sildenafil

verwendet. Mit der Elektrolytlösung 1/3 wurden die Kaninchenlungen während der

Präparation perfundiert, bevor die Lösung in einem Perfusatwechsel durch die in den

Lungenversuchen verwendete Albumin-Lösung ersetzt wurde. Um bei den Versuchen und der

Isolation der Kaninchenlungen einen physiologischen pH-Wert aufrecht erhalten zu können,

war es nötig, die Lösungen zu puffern. Dafür wurden zu 975 ml der jeweiligen Lösung 23,5

ml Natriumbicarbonat (Natriumhydrogencarbonat 1 molar 8,4 %, Serag-Wiessner, Naila,

Deutschland) zugegeben.

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3 EIGENE UNTERSUCHUNGEN - 3.1 MATERIAL UND METHODEN

3.1.1.6 Albumin-Lösung

Die vierprozentige Albumin-Lösung wurde für die in vitro Freisetzungsversuche und die

Versuche mit der isolierten Kaninchenlunge benötigt. Zur Herstellung der Lösung für die

Lungenversuche wurden 16 g Albumin (Albumin Fraktion V, CAS-Nr. 90604-29-8, Carl

Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Deutschland) in 390 ml Elektrolytlösung 1/3 gegeben. Bis

sich das Albumin makroskopisch gelöst hatte, wurde die Flüssigkeit ca. 30 Minuten auf einem

Magnetrührer (IKA ® Model Big Squid, IKA ® -Werke GmbH & Co. KG, Staufen,

Deutschland) gerührt. Um ein vollständiges Lösen des Albumins zu gewährleisten, wurde

dieser Ansatz über Nacht bei 4 °C gelagert und erst am Folgetag im Versuch eingesetzt. Vor

Befüllen des Systems wurden der Albumin-Lösung noch 10 ml Natriumbicarbonat

zugegeben. Zudem wurde sie in einem beheizbaren Ultraschall-Bad (Bandelin Sonorex

Digitec DT 52 H, Badelin electronic, Berlin, Deutschland) 15 Minuten bei 35 °C vorgewärmt

und entgast.

Da für die in vitro Freisetzungsversuche weniger Flüssigkeit benötigt wurde als bei den

Lungenversuchen, wurden für einen kleineren Ansatz 2 g Albumin in 49 ml der

Elektrolytlösung 1/3 wie oben beschrieben gelöst und vor dem Versuch mit ca. 1 ml

Natriumbicarbonat auf einen pH-Wert von 7,4 titriert.

3.1.2 Vernebler

Bei den in dieser Arbeit verwendeten Verneblern handelte es sich um einen piezoelektrischen

Vernebler (Aeroneb ® Solo, Aerogen, Dangan, Galway, Irland), einen Düsenvernebler (Pari

LC Sprint ® Star, PARI GmbH, Starnberg, Deutschland) und einen MicroSprayer ® (Model IA-

1B, Penn-Century, Inc., Pennsylvania, USA).

3.1.2.1 Aeroneb ® Solo

Bei den Vibrating mesh Verneblern wird das Aerosol durch ein vibrierendes Netz oder eine

Platte mit zahlreichen Löchern generiert. Zu den Vibrating mesh Verneblern gehören unter

anderem der Aeroneb ® Pro der Firma Aerogen, der für den Einsatz während mechanischer

Beatmung konstruiert wurde, und der Aeroneb ® Solo, der auf dem gleichen Prinzip basiert,

aber laut Herstellerangaben für den Einpatientengebrauch konzipiert ist. Der Aeroneb ® Pro

besteht aus einem Vibrationselement und einer gewölbten Lochplatte. In der Platte befinden

sich ca. 1000 kegelförmige Löcher, deren weite Öffnungen der Flüssigkeit, die in ein

Reservoir über dieser Platte eingefüllt wird, zugewandt sind, und die sich zur Unterseite hin

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3 EIGENE UNTERSUCHUNGEN - 3.1 MATERIAL UND METHODEN

verjüngen. Bei Anlegen von elektrischer Spannung wird das keramische Vibrationselement

dazu angeregt, sich auszudehnen und wieder zusammenzuziehen, wodurch sich die gewölbte

Platte jeweils einige Mikrometer auf und ab bewegt. Durch diese Mikropumpenbewegung

wird die Flüssigkeit durch die Löcher extrudiert, wodurch das Aerosol entsteht (Dhand 2004).

3.1.2.2 Pari LC Sprint ® Star

Beim Pari LC Sprint ® Star handelt es sich um einen Düsenvernebler. Diese nutzen den

Venturi- bzw. Bernoullieffekt aus, um mithilfe von Druckluft ein Aerosol zu erzeugen

(Voshaar et al. 2001). Ein geringer Anteil des so generierten primären Aerosols besteht aus

Tröpfchen, die klein genug sind, um inhaliert werden zu können, und verlässt den Vernebler

direkt. Die verbleibenden großen Tropfen impaktieren an strategisch positionierten Blenden

oder an den Wänden der Verneblerkammer und werden wieder dem Flüssigkeitsreservoir

zugeführt (O'Callaghan und Barry 1997; Bridges und Taylor 1998).

3.1.2.3 MicroSprayer ®

Der MicroSprayer ® der Firma PennCentury basiert auf einer Sonde aus Edelstahl, an deren

Spitze sich eine Düse befindet, und wird hydraulisch durch eine Plastikspritze ausgelöst (s.

Abb. 8). Die Sonde kann tief in die Trachea geschoben werden, wodurch das Aerosol direkt in

die Lunge gelangt.

Abb. 8: Aufbau des MicroSprayers ®

- 34 -


3 EIGENE UNTERSUCHUNGEN - 3.1 MATERIAL UND METHODEN

3.1.3 Bestimmung der Aerosolpartikelgrößen

Die Größe der Aerosolpartikel wurde mittels eines Laserdiffraktometers (Sympatec,

Clausthal-Zellerfeld, Deutschland) bestimmt. Grundlage der Laserdiffraktometrie ist die

Beugung des Lichts, wobei je nach Form und Größe des Teilchens, an dem das Licht gebeugt

wird, unterschiedliche Beugungsbilder entstehen. Die Intensität des gebeugten Lichts wird

von einem Detektor erfasst und im Computer ausgewertet. Die Software ermöglicht dabei, je

nach Größe und Form der zu messenden Partikel, eine Auswertung nach der Fraunhofer- bzw.

der Mie-Theorie. Es können aber nur kugelförmige Teilchen unverfälscht analysiert werden,

denn nur diese ergeben ein radialsymmetrisches Beugungsbild (Müller und Schuhmann

1996).

Bei nicht sphärischen Partikeln wird deren Größe oft in Form von Äquivalentdurchmessern

angegeben, zum Beispiel auf Basis von gleichen Volumina, gleichen Massen oder gleichem

Luftwiderstand. Bei Aerosolen bietet sich hierfür der aerodynamische Durchmesser an, da er

sowohl die Partikeldichte als auch den Luftwiderstand berücksichtigt (Lippmann et al. 1980).

Der aerodynamische Durchmesser ist definiert als der Durchmesser einer Kugel mit der

Dichte 1 g/cm³, die in Luft genauso schnell fällt wie das beobachtete Teilchen (Yeh et al.

1976). Da Aerosole meistens Teilchen unterschiedlicher Größen enthalten, wird die

Größenverteilung durch den medianen aerodynamischen Massendurchmesser (MMAD)

angegeben (Groneberg et al. 2003). Der MMAD gibt den Partikeldurchmesser an, bei dem 50

% der Aerosolmasse in größeren und 50 % in kleineren Tröpfchen enthalten sind (Khilnani

und Banga 2008). Die Größenverteilung wird durch die geometrische Standardabweichumg

(GSD) angegeben (O'Callaghan und Barry 1997; Rubin 2010).

Zur Bestimmung der Aerosolpartikelgrößen des Aeroneb ® Solo und des Pari LC Sprint ® Star

wurden die Vernebler mit je 3 ml isotoner Kochsalzlösung oder Liposomensuspension gefüllt.

Die Vernebler wurden dann in ein Stativ eingespannt und so positioniert, dass sie sich in ca. 3

cm Abstand zum Laserstrahl befanden und die Aerosolwolke vom Laserstrahl mittig

durchquert wurde. Das Aerosol wurde von einem Staubsaugerrohr, das sich ca. 10 cm hinter

dem Laserstrahl befand, abgesaugt, um Verwirbelungen und Mehrfachmessungen der

Aerosolpartikel zu vermeiden. Bei allen Messungen wurde eine R2 Linse (Brennweite 50

mm; Messbereich 0,25 bis 87,5 µm) verwendet. Für jede Messung wurden sechs

Einzelmessungen durchgeführt. Für jede Einzelmessung wurden geräteintern während einer

Messzeit von fünf Sekunden 100 Messungen mit einer Zykluszeit von 50 Millisekunden

gemittelt.

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3 EIGENE UNTERSUCHUNGEN - 3.1 MATERIAL UND METHODEN

Um die Aerosolpartikelgrößen des MicroSprayers ® zu bestimmen, wurde die Spritze des

Verneblers mit 1 ml Aqua dest. befüllt. Zur Verneblung wurde die Spitze der Sonde ca. 3 cm

über den Laserstrahl gehalten. Da die Verneblungsdauer beim Microsprayer mit ca. zwei

Sekunden sehr kurz ist, wurde die Messzeit auf 0,5 Sekunden reduziert.

3.1.4 Verneblerleistung

Der Output der Vernebler wurde gravimetrisch bestimmt, indem die Vernebler jeweils vor

und nach der Verneblung gewogen wurden. Beim MicroSprayer ® wurden Spritze und Sonde

separat gewogen. Da nicht die ganze Flüssigkeit, die die Spritze verlassen hatte, als vernebelt

betrachtet werden konnte, weil immer ein kleiner Rest in der Sonde verblieb, wurde das in der

Sonde ermittelte Residuum vom Output der Spritze abgezogen.

Bei Verneblungen mit dem Aeroneb ® Solo wurde außerdem die Verneblungsdauer bis zur

vollständigen Verneblung des eingefüllten Volumens protokolliert. Bei Verneblungen mit

dem Pari LC Sprint ® Star wurde die Verneblung nach 15 Minuten gestoppt. Auf diese Weise

wurde sicher gestellt, dass bei der Verneblung von Liposomen ein ausreichender Rückstand

im Vernebler verblieb, aus dem Proben zur Charakterisierung der Liposomen entnommen

werden konnten.

3.1.5 Liposomen mit Rhodamin 6G

3.1.5.1 Herstellung der Liposomen

Es wurden Liposomen der Zusammensetzung DPPC : CH mit R6G nach vier verschiedenen

Methoden (A, B, C und D) hergestellt. Bei allen Methoden wurden das Phospholipid DPPC

und Cholesterol in einem molaren Verhältnis von 7 : 3 eingesetzt. Aus den

Molekulargewichten der eingesetzten Lipide und einem R6G-Gehalt von 0,03 % (w/v)

errechnet sich somit für einen Ansatz von 10 ml pro Charge und einem Gesamtlipidgehalt der

Liposomensuspension von 2 % (w/v) folgende Einwaage:

• DPPC 163,17 mg

• CH 36,83 mg

• R6G 3,00 mg

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3 EIGENE UNTERSUCHUNGEN - 3.1 MATERIAL UND METHODEN

3.1.5.1.1 Filmmethode

Die Methoden A, B und C basieren auf der Filmmethode. Bei dieser Methode wird ein dünner

Lipidfilm an der Wand eines Rundkolbens hergestellt. Nach Zugabe einer wässrigen Phase

und unter Zuführung mechanischer Energie bilden sich daraus spontan multilamellare Vesikel

(Lasic 1988; Lasch et al. 2002).

Die benötigten Lipidkomponenten wurden in einen 500 ml-Rundkolben eingewogen und in

40 ml eines organischen Lösungsmittelgemisches aus Chloroform und Methanol

(Volumenverhältnis 2 : 1) gelöst. Der Kolben wurde kurz geschwenkt, bis die Lipide

vollständig gelöst waren, und dann in einen Rotationsevaporator (Büchi Rotavapor R-114,

Büchi, Flawil, Schweiz) eingespannt und in ein auf 60 °C temperiertes Wasserbad (Büchi

Waterbath B-480, Büchi, Flawil, Schweiz) abgesenkt. Bei einer Rotationsgeschwindigkeit

von 120 Umdrehungen pro Minute wurde das Lösungsmittel verdampft. Dazu wurde an den

Rotationsevaporator eine Vakuumpumpe (Membran-Vakuumpumpe MD 1C, Vacuumbrand

GmbH + Co KG, Wertheim, Deutschland) angeschlossen und der Druck im Kolben alle zehn

Minuten schrittweise reduziert, sodass nach einer Stunde ein Vakuum hergestellt war. Der

Lipidfilm, der sich dabei an der Wand des Rundkolbens bildete, wurde eine weitere Stunde

unter Vakuum vollständig getrocknet. Im Anschluss wurde der Kolben abgenommen und der

Film wurde je nach Methode mit 10 ml der unterschiedlichen R6G-Lösungen hydriert, die

zuvor auf 60 °C temperiert worden waren.

Für Liposomen der Methode A wurde der Lipidfilm mit einer wässrigen R6G-Lösung

hydriert. Dafür wurden 3 mg R6G in 10 ml Aqua dest. gelöst.

Bei der Methode B wurde das R6G in Form einer ethanolischen Lösung zugegeben (López-

Pinto et al. 2005; Bendas und Tadros 2007; Dubey et al. 2007b). Zur Herstellung dieser

Lösung wurden 3 mg R6G in 10 ml eines Ethanol-Aqua dest.-Gemisches (30 % Ethanol (v/v))

gelöst.

Zur Herstellung der Liposomen nach Methode C wurde das R6G in den Lipidfilm

eingearbeitet, indem es zusammen mit den Lipiden in den Kolben eingewogen und im

Lösungsmittelgemisch gelöst wurde (Touitou et al. 2001; Ulrich 2002; López-Pinto et al.

2005; Dubey et al. 2007a; Bhalaria et al. 2009). Nachdem das Lösungsmittelgemisch

verdampft und der R6G-haltige Lipidfilm unter Vakuum getrocknet war, wurde er mit 10 ml

Aqua dest. rehydriert.

Nach Zugabe der jeweiligen R6G Lösung bzw. des Aqua dest. wurde der Kolben mit Parafilm

verschlossen und für eine weitere Stunde bei einer Wasserbadtemperatur von 60 °C und 90

Umdrehungen pro Minute in den Rotationsevaporator eingespannt. Danach wurde der Kolben

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3 EIGENE UNTERSUCHUNGEN - 3.1 MATERIAL UND METHODEN

abgenommen, fünf Minuten gevortext (Lab dancer S40, VWR International GmbH,

Darmstadt, Deutschland) und anschließend auf Eis gelagert.

3.1.5.1.2 Ethanolinjektions-Methode

Dieses Verfahren wurde angewendet, um Liposomen der Methode D herzustellen. Es handelt

sich dabei um eine etablierte Methode zur Herstellung von wirkstoffbeladenen Vesikeln, die

auch als Ethosomen bezeichnet werden (Dayan und Touitou 2000; Touitou et al. 2000;

Touitou et al. 2001; Paolino et al. 2005; Dubey et al. 2007a; Elsayed et al. 2007; Jain et al.

2007). Die Lipide und das R6G wurden in ein Glasgefäß eingewogen und in 3 ml Ethanol

gelöst. Nach Zugabe eines Magnetrührstäbchens wurde das Gefäß gut verschlossen, in ein auf

60 °C temperiertes Wasserbad auf einen beheizbaren Magnetrührer (Heidolph MR 3002,

Heidolph Instruments GmbH und Co KG, Schwabach, Deutschland) gestellt und bei 700

Umdrehungen pro Minute wenige Minuten gerührt, bis die Feststoffe vollständig gelöst

waren. Durch den Deckel des Gefäßes wurde dann eine Kanüle so weit eingestochen, bis sie

in die Flüssigkeit eintauchte. Eine 50 ml Spritze, die zuvor mit 7 ml Aqua dest. befüllt und in

einen Perfusor (Injectomat S, Fresenius AG, Bad Homburg, Deutschland) eingelegt worden

war, wurde über eine ebenfalls mit Aqua dest. befüllte Heidelberger Verlängerung mit der

Kanüle verbunden. Das Aqua dest. aus der Spritze wurde dann langsam mit einer

Flussgeschwindigkeit von 200 µl pro Minute der ethanolischen Lösung zugegeben, die dabei

weiterhin über den Magnetrührer gerührt wurde. Nachdem die 7 ml Aqua dest. auf diese

Weise vollständig zugegeben worden waren, wurde die Lösung weitere fünf Minuten gerührt

und dann auf Eis gelagert.

Abb. 9: Herstellung der Liposomen nach der Ethanolinjektions-Methode

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3 EIGENE UNTERSUCHUNGEN - 3.1 MATERIAL UND METHODEN

3.1.5.1.3 Extrusion

Um eine Reduktion der Lamellenzahl und somit eine Verkleinerung der Vesikel sowie eine

homogenere Größenverteilung zu erreichen, erfolgte die Extrusion der nach den

unterschiedlichen Methoden hergestellten Liposomen durch eine Polycarbonatmembran mit

400 nm Porengröße (Olson et al. 1979; Mayer et al. 1986; MacDonald et al. 1991). Der

Extruder (LiposoFast-Extruder, Avestin, Ottawa, Kanada) wurde im Wärmeschrank (Thermo

Scientific Heraeus Function Line, Typ UT 12, Thermo Electron LED GmbH, Langenselbold,

Deutschland) auf 70 °C vorgewärmt. Vor dem Einbau der Polycarbonatmembran in den

Extruder wurde sie 30 Minuten in Aqua dest. eingelegt. Dann wurde jeweils 1 ml der

Liposomensuspension blasenfrei in eine gasdichte Glasspritze aufgezogen, für fünf Minuten

mit dem Extruder im Wärmeschrank auf 70 °C temperiert und schließlich 21 mal durch die

Membran in eine gegenüberliegende Spritze gedrückt. Die extrudierten Liposomen wurden in

einem Falcon Tube gesammelt und bei 4 °C im Kühlschrank gelagert.

3.1.5.1.4 Zentrifugation

Nachdem die Liposomen über Nacht bei 4 °C im Kühlschrank gelagert worden waren,

wurden sie am darauf folgenden Tag zentrifugiert. Dieser Prozess diente der Entfernung von

nicht liposomal verkapseltem R6G (Lasch et al. 2002). Dazu wurden die Liposomen in

Eppendorfgefäße umgefüllt und mit einer Tischzentrifuge (Mikro 200 R, Hettich Zentrifugen,

Tuttlingen, Deutschland) vier mal 45 Minuten bei 4 °C und 15000 RPM zentrifugiert. Der

Überstand wurde jeweils abgenommen und das verbleibende Pellet mit einer entsprechenden

Menge Aqua dest. resuspendiert. Danach erfolgte die Lagerung der Liposomen bis zur

Charakterisierung und Verneblung wieder bei 4 °C im Kühlschrank.

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3 EIGENE UNTERSUCHUNGEN - 3.1 MATERIAL UND METHODEN

3.1.5.6 Charakterisierung

Um die Liposomensuspension zu charakterisieren, wurden Größe, Verkapselungseffizienz,

Verkapselungsrate und Verneblungsstabilität der Liposomen bei Verneblung mit dem

Aeroneb ® Solo untersucht.

3.1.5.6.1 Größenmessung

Die Größe der Liposomen (mittlerer Volumendurchmesser, VMD) sowie ihre

Partikelgrößenverteilung (geometrische Standardabweichung, GSD) wurden mit einem

Laserdiffraktometer (Sympatec, Clausthal-Zellerfeld, Deutschland) und der zugehörigen

Software untersucht. Es wurde eine R2 Linse (Brennweite 50 mm; Messbereich 0,25 bis 87,5

µm) verwendet. Die Messzeit betrug wie bei der Messung der Aerosolpartikelgrößen fünf

Sekunden bei einer Zykluszeit von 50 Millisekunden.

Für die Messungen wurde eine Glasküvette mit ca. 40 ml Aqua dest. befüllt und im

Laserstrahl platziert. Nach einer Referenzmessung wurden 100 µl der Liposomensuspension

in die Küvette pipettiert. Durch ein Magnetrührstäbchen in der Küvette, das sich mit 50 RPM

bewegte, wurde eine rasche Verteilung der Liposomen gewährleistet und ihr Sedimentieren

verhindert. Nachdem sich die Liposomen so nach wenigen Sekunden homogen in der Küvette

verteilt hatten, wurden pro Probe sechs Messungen durchgeführt, die von der zugehörigen

Software im Fraunhofer-Modus ausgewertet wurden.

3.1.5.6.2 Bestimmung von Verkapselungseffizienz und Verkapselungsrate

Bei der Herstellung der Liposomen wird nicht das gesamte eingesetzte R6G in die Liposomen

verkapselt. Ein Großteil des nicht verkapselten Farbstoffs wird bei der Zentrifugation entfernt.

Ein Rest verbleibt in der Liposomensuspension. Um die Verkapselungseffizienz und die

Verkapselungsrate zu bestimmen, wurden die Gesamtmenge sowie die Menge an liposomal

verkapseltem R6G in der Liposomensuspension mittels eines Fluoreszenzreaders (Synergy 2,

BioTek Instruments, Inc., Winooski, USA) bestimmt. Dafür wurde ein Filterpaar mit λex

530/25 nm und λem 600/40 nm verwendet.

Der Fluoreszenzreader wurde vor jeder Messung mit einer Eichreihe geeicht. Für die

Eichreihe wurden ein Nullwert und fünf R6G-Konzentrationen eingesetzt (100, 75, 50, 25 und

10 ng/ml). Da die zu messenden Proben aus neun Teilen Ethanol und einem Teil R6G in Aqua

dest. bestanden, wurden die Eichlösungen im gleichen Verhältnis hergestellt. Von jeder R6G-

Konzentration wurde 1 ml hergestellt. Dazu wurde 1 mg R6G in 10 ml Aqua dest. gelöst.

- 40 -


3 EIGENE UNTERSUCHUNGEN - 3.1 MATERIAL UND METHODEN

Diese Stammlösung der Konzentration 100 µg/ml wurde in Aqua dest. auf eine Konzentration

von 1 µg/ml verdünnt und dann zur Herstellung der Eichreihe verwendet. In

Eppendorfgefäßen wurden jeweils 900 µl Ethanol vorgelegt. Daraufhin wurden entsprechende

Volumina der R6G-Lösung zugegeben und mit Aqua dest. auf 1 ml aufgefüllt.

R6G-Konzentration (ng/ml) Ethanol (µl) R6G-Lösung 1 µg/ml (µl) Aqua dest. (µl)

ull 900 0 100

100 900 100 0

75 900 75 25

50 900 50 50

25 900 25 75

10 900 10 90

Tab. 1: Zusammensetzung der R6G-Eichreihe

Sowohl von der Eichreihe als auch von den Liposomenproben wurden von jeder Probe je 100

µl in Dreifachbestimmung auf eine 96-Well-Mikrotiterplatte (Costar Assay Plate, 96 Well,

Corning Incorporated, Corning, USA) pipettiert und nach der Messung automatisch gemittelt.

Zur Bestimmung des Gesamt-R6G-Gehalts in der Liposomensuspension wurden 100 µl der

Liposomensuspension in einem Eppendorfgefäß mit 900 µl Ethanol versetzt und für zehn

Minuten bei 15 Hertz auf eine Rüttelplatte (TopMix FB15024, Fisher Scientific, Schwerte,

Deutschland) gestellt, um eine Zerstörung der Liposomen und hierdurch die vollständige

Freisetzung des R6G zu erreichen.

Um das verkapselte R6G bestimmen zu können, wurden zuvor 200 µl der

Liposomensuspension mit der Tischzentrifuge bei 4 °C und 15000 RPM für 45 Minuten

zentrifugiert, der Überstand wurde abgenommen und das Pellet mit einer entsprechenden

Menge Aqua dest. resuspendiert. Dann wurden 100 µl des resuspendierten Pellets analog der

zur Bestimmung des Gesamtgehaltes beschriebenen Methode behandelt.

Aus den gemessenen Werten konnten die Verkapselungseffizienz (VE) und die

Verkapselungsrate (VR) in der Liposomenprobe berechnet werden.

Die VE gibt an, wie viel des zur Herstellung eingesetzten R6G in den Vesikeln enthalten ist

und berechnet sich nach folgender Formel:

verkapseltes

R6G

( mg / ml)

* 100

VE (%) =

zur Herstellung

eingesetztes

R6G

( 0,

3 mg / ml)

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3 EIGENE UNTERSUCHUNGEN - 3.1 MATERIAL UND METHODEN

Die VR gibt den Anteil an verkapseltem Farbstoff, bezogen auf den Gesamtfarbstoffgehalt in

der Liposomensuspension, an:

verkapseltes

R6G

( mg / ml)

* 100

VR (%) =

Gesamt−R6G−Gehalt

in der Liposomensuspension

3.1.5.6.3 Verneblungsstabilität

- 42 -

( mg / ml)

Die Stabilität der Liposomen gegenüber der Verneblung mit dem Aeroneb wurde untersucht,

indem 3 ml der Liposomensuspension mit dem Aeroneb ® Solo vernebelt wurden. Vor der

Verneblung wurden die Liposomensuspensionen mit Aqua dest. auf definierte R6G-

Konzentrationen von 5 oder 10 µg/ml verdünnt.

Die Messung der bei der Verneblung generierten Aerosolpartikel erfolgte wie in Kapitel 3.1.3

beschrieben. Der Rest der vernebelten Liposomensuspension wurde aufgefangen, indem der

Vernebler auf ein Falcon Tube aufgesetzt wurde, an dessen Wand sich das Aerosol

abscheiden konnte. Außerdem wurden Output und Verneblungsdauer erhoben.

Von den im Falcon Tube aufgefangenen Liposomen wurden Größe und Verkapselungsrate

wie in Kapitel 3.1.5.6.1 und 3.1.5.6.2 beschrieben bestimmt. Außerdem konnte durch

Messung des Gesamt-R6G-Gehalts die Wiederfindung nach der Verneblung unter

Zugrundelegung der folgenden Formel berechnet werden:

Wiederfindung

Gesamt−R6G

im aufgefangenen

Aerosol ( mg / ml)

* 100

(%) =

Gesamt−R6G

in der Liposomensuspension

vor Verneblung ( mg / ml)


3 EIGENE UNTERSUCHUNGEN - 3.1 MATERIAL UND METHODEN

3.1.6 Nachweis von Sildenafil mittels HPLC

Zum quantitativen Nachweis von Sildenafil wurden alle Proben nach der Entnahme bis zu

ihrer Messung in Eppendorf-Reaktionsgefäßen bei -20 °C gelagert. Die Sildenafil-

Bestimmung erfolgte in einer HPLC-Anlage (Agilent 1100, Agilent Technologies,

Waldbronn, Deutschland) durch UV-Detektion bei einer Detektionswellenlänge von 230 nm.

Mit einem Injektionsvolumen von 100 µl wurden die Proben durch einen automatischen

Probengeber (Smartline Autosampler 3900, Knauer, Berlin, Deutschland) in die Anlage, die

aus einer binären Pumpe und einem Dioden-Array-Detektor besteht, eingespritzt. Nach

Passage einer Vorsäule (LiChroCART ® -Kartusche 4*4 mm, LiChrospher ® RP-18e, 5 µm,

Merck, Darmstadt, Deutschland) zur Abtrennung von Schmutzpartikeln gelangten die Proben

zur analytischen Säule (LiChroCART ® 125*4 mm Säule, gefüllt mit LiChrospher ® 100, RP-

18e, 5 µm, Merck, Darmstadt, Deutschland). Die mobile Phase bestand aus einem

Phosphatpuffer (4,0826 g KH2PO4 in einem Liter Aqua dest.), der mit NaOH auf einen pH-

Wert von 6 titriert wurde und Acetonitril. Diese beiden Anteile wurden gefiltert, durch

Einleitung von Helium entgast und in einer Mischung aus 55 % Phosphatpuffer und 45 %

Acetonitril in die Anlage geleitet. Bei einer Betriebstemperatur von 40 °C und einer

Fließgeschwindigkeit von 0,5 ml/min lag die Retentionszeit von Sildenafil bei ca. neun

Minuten. Zur Messung und Auswertung der Proben wurde vor jeder Messung eine

Standardreihe mit unterschiedlichen Konzentrationen von Sildenafil angefertigt. Dazu wurde

Sildenafil in dem Lösungsmittel gelöst, in dem sich später auch die Proben befanden, und mit

mobiler Phase auf definierte Konzentrationen verdünnt.

3.1.7 Untersuchungen zur Wiederfindung von Sildenafil

In Versuchen der Arbeitsgruppe der Verfasserin war ein zeitabhängiger Verlust von Sildenafil

in einem Modellsystem der isolierten Kaninchenlunge aufgefallen. Da dieser Verlust auch in

dem kurzgeschlossenen System ohne Lunge auftrat, wurde angenommen, dass es zur

Adhäsion des Sildenafils an die Wände der Schläuche kam. Da für eine quantitative

Sildenafil-Analytik ein Verlust der Substanz ausgeschlossen werden musste, wurden in einer

Versuchsreihe die zur Aufbewahrung der Sildenafillösungen, der Sildenafil-

Liposomensuspensionen und der Proben verwendeten Gefäße untersucht. Um die

Wiederfindung der Substanz bei den Versuchen mit der isolierten Kaninchenlunge zu

gewährleisten, wurden Schläuche aus unterschiedlichen Materialien getestet, um anschließend

ein System aus einem geeigneten Schlauch herstellen zu können.

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3 EIGENE UNTERSUCHUNGEN - 3.1 MATERIAL UND METHODEN

3.1.7.1 Sildenafil in Eppendorf-Reaktionsgefäßen

Bei zwei Versuchen wurden je 1,5 mg Sildenafil (Base, AK Scientific, USA) in 10 ml Aqua

dest. gelöst. Für jeden Versuch wurden vier Eppendorf-Reagiergefäße mit je 1 ml dieser

Lösung gefüllt. Diese wurden unterschiedlich lange bei 37 °C im Wärmeschrank inkubiert.

Nach 0, 60, 180 und 300 Minuten wurde je ein Reagiergefäß pro Versuch entnommen. Es

wurden die Sildenafilgehalte in den eingesetzten Sildenafillösungen sowie in den zu

unterschiedlichen Zeitpunkten entnommenen Eppendorf-Gefäßen bestimmt. Die prozentuale

Sildenafil-Wiederfindung in den zu den definierten Zeitpunkten entnommenen Proben wurde

auf die Sildenafilgehalte in den eingesetzten Sildenafillösungen bezogen.

3.1.7.2 Sildenafil in Falcon Tubes

Die Nachweisbarkeit des Sildenafils (Base, AK Scientific, USA) in Falcon Tubes wurde

zusätzlich bei unterschiedlichen Temperaturen untersucht. Dazu wurde 1 mg Sildenafil in 10

ml Aqua dest. gelöst. Je 1 ml aus dieser Sildenafillösung der Konzentration 100 µg/ml wurde

in drei mit 30 ml gepufferter Elektrolytlösung (II N) gefüllte Falcon Tubes aus Polypropylen

(Blue Max ® Polypropylene Conical Tube, 50 ml, Becton Dickinson Labware) pipettiert. Je ein

Ansatz wurde bei 4 °C, 25 °C bzw. 37 °C über einen Zeitraum von fünf Stunden inkubiert (je

ein Versuch pro Temperatur). Nach 0, 10, 30, 60, 120, 180 und 300 Minuten wurden Proben

von je 1 ml aus jedem Gefäß entnommen. Es wurden die Sildenafilgehalte in der eingesetzten

Sildenafillösung sowie in den zu den genannten Zeitpunkten entnommenen Proben bestimmt.

Die Sildenafilkonzentration in der direkt nach Sildenafilzugabe und gründlichem

Durchmischen entnommenen Null-Probe entspricht bei der Berechnung der prozentualen

Wiederfindung einer Wiederfindung von 100 % im jeweiligen Falcon Tube.

3.1.7.3 Sildenafil in Glasgefäßen mit Schläuchen

Es wurden Schläuche aus den Materialien Teflon, Polyurethan, Polytetrafluorethylen (PTFE)

und C-FLEX ® getestet. Um nicht aus jedem getesteten Schlauchmaterial ein System bauen zu

müssen, wurden Proben der verschiedenen Schläuche in Glasgefäßen mit Sildenafillösung

inkubiert. Da die getesteten Schlauchstücke unterschiedlich lang waren und unterschiedliche

Durchmesser besaßen, musste das Verhältnis von eingesetzter Schlauchoberfläche zu

Volumen der Sildenafillösung vereinheitlicht werden. Die Länge der Schläuche wurde so

gewählt, dass alle Schlauchstücke eine Gesamtoberfläche von 90,8 cm 2 hatten. Dies entsprach

einem Zehntel der berechneten Innenfläche des für die Lungenversuche erforderlichen

- 44 -


3 EIGENE UNTERSUCHUNGEN - 3.1 MATERIAL UND METHODEN

Systems. Dabei musste beachtet werden, dass bei den hier beschriebenen Versuchen sowohl

die Innen- als auch die Außenfläche der aufgeschnittenen Schläuche mit der Sildenafillösung

in Kontakt kam. Daher berechnete sich die einzusetzende Schlauchlänge nach folgender

Formel (unter Vernachlässigung der Schnittflächen):

2

Oberfläche ( 90,

8 cm )

Schlauchlänge

( cm)

=

2 * π * ( d + d )

di = Innendurchmesser des Schlauches

da = Außendurchmesser des Schlauches

i

a

Teflon Polyurethan PTFE C-FLEX ®

Innendurchmesser (cm) 0,5 0,6 0,5 0,3

Außendurchmesser (cm) 0,6 1,0 0,7 0,7

Errechnete Schlauchlänge (cm) 13 18 24 29

Tab. 2: Berechnung der Schlauchlängen für die Versuche zur Sildenafil-Wiederfindung

Vom PTFE-Schlauch konnten nicht die errechneten 24 cm, sondern nur 14 cm eingesetzt

werden, da ausreichendes Schlauchmaterial nicht zur Verfügung stand.

Die Schläuche wurden der Länge nach aufgeschnitten und in Glasgefäßen mit 30 ml

Sildenafillösung inkubiert. Dies entsprach ebenfalls einem Zehntel des in den

Lungenversuchen eingesetzten Perfusatvolumens. Für die Sildenafillösung wurde 1 mg

Sildenafil (Base, AK Scientific, Inc., USA) in 1 ml Aqua dest. gelöst. Daraus wurden 40 µl in

200 ml gepufferte Elektrolytlösung (II N) pipettiert, um eine Konzentration von 200 ng/ml zu

erreichen. Aus dieser Lösung wurden je 30 ml in Glasgefäße gefüllt. Schließlich wurden die

aufgeschnittenen Schläuche zugegeben, die Gefäße wurden mit Parafilm verschlossen und auf

einem Schwenktisch (Nutating Mixer, VWR international, Löwen, Belgien) fünf Stunden in

einem Wärmeschrank (IR 1500, Flow Laboratories, Irvine, Großbritannien) bei 37 °C

inkubiert. Vor Zugabe der Schläuche sowie sofort nach Zugabe (0) und 60, 180 und 300

Minuten danach wurde aus jedem Gefäß je 1 ml Probe entnommen. Um einen Einfluss des

Glases auf die Sildenafilkonzentration auszuschließen, wurde außerdem ein Kontrollansatz

ohne Schläuche mitgeführt, aus dem nur zu Beginn und am Ende des Versuches eine Probe

entnommen wurde. Mit jedem Schlauchstück wurden drei Versuche durchgeführt. Die

- 45 -


3 EIGENE UNTERSUCHUNGEN - 3.1 MATERIAL UND METHODEN

prozentuale Wiederfindung des Sildenafils bezieht sich auf die vor Schlauchzugabe im

jeweiligen Gefäß gemessene Sildenafilkonzentration.

3.1.7.4 Clear C-FLEX ® System

Aus Clear C-FLEX ® - Schläuchen unterschiedlicher Durchmesser wurde ein System gebaut,

wie es später für die Versuche mit der isolierten Kaninchenlunge benötigt wurde. Die

Sildenafil-Wiederfindung in diesem System wurde sowohl mit der Sildenafil Base von AK

Scientific (n=4), als auch mit der Sildenafil Base von bioKEMIX (n=6), die später für die

Versuche verwendet wurde, untersucht. Dafür wurde 1 mg Sildenafil in 1 ml Aqua dest.

gelöst. Da das Sildenafil von bioKEMIX schlecht wasserlöslich war, musste das Aqua dest.

zuvor durch Zugabe von HCl auf einen pH-Wert von 2 titriert werden. Aus den so

hergestellten Sildenafillösungen wurden je 60 µl zu 300 ml gepufferter Elektrolytlösung (II

N) zugegeben, sodass sich wie bei den Versuchen mit den Schlauchstücken eine

Sildenafilkonzentration von 200 ng/ml ergab. Nach gründlichem Durchmischen wurde die

Lösung in das geschlossene System gefüllt, wo sie fünf Stunden zirkulierte, wobei das System

auf 40 °C temperiert wurde. Nach 0 (direkt nach Befüllen des Systems), 60, 180 und 300

Minuten wurden Proben von je einem ml aus dem System entnommen. Vor Einfüllen der

sildenafilhaltigen Elektrolytlösung ins System wurde bei jedem Versuch die darin enthaltene

Wirkstoffkonzentration gemessen. Diese entspricht in der Berechnung der prozentualen

Wiederfindung in den zu den definierten Zeitpunkten entnommenen Proben 100 %.

- 46 -


3 EIGENE UNTERSUCHUNGEN - 3.1 MATERIAL UND METHODEN

3.1.8 Liposomen mit Sildenafil

3.1.8.1 Herstellung der Liposomen

Die Liposomen wurden in Anlehnung an die Liposomen mit R6G, Methode C, nach der in

Kapitel 3.1.5.1.1 beschriebenen Filmmethode hergestellt. Dazu wurden DPPC und

Cholesterol in einem molaren Verhältnis von 8 : 2 sowie das Sildenafil (Base, bioKEMIX) in

einen Glasrundkolben eingewogen und in 32 ml eines Lösungsmittelgemisches aus

Chloroform und Methanol im Verhältnis 2 : 1 (v/v) gelöst. Aus den Molekulargewichten der

Lipide und einem Sildenafilgehalt von einem mg/ml errechnet sich somit für einen Ansatz

von 8 ml folgende Einwaage:

• DPPC 141,38 mg

• CH 18,62 mg

• Sildenafil 8,00 mg

Der Kolben wurde dann in den Rotationsevaporator eingespannt, wo bei einer

Wasserbadtemperatur von 60 °C über eine Stunde, während der der Druck schrittweise

reduziert wurde, das Lösungsmittelgemisch verdampft wurde. Der Lipidfilm mit dem

Sildenafil, der sich dabei an der Wand des Rundkolbens bildete, wurde eine weitere Stunde

unter Vakuum vollständig getrocknet. Schließlich wurde der Film mit 8 ml PBS (pH 7,4)

hydriert und nach Verschließen des Kolbens mit Parafilm eine weitere Stunde bei 60 °C

rotiert. Um ein vollständiges Ablösen des Films und eine homogenere Größenverteilung der

Liposomen zu erreichen, wurde der Kolben anschließend 15 Minuten unter leichter manueller

Rotation in ein Ultraschallbad, das ebenfalls auf 60 °C temperiert war, gehalten. Eine

Extrusion der Liposomen war nicht möglich, da bei dem Versuch, die Suspension mit der

Spritze durch die Membran des Extruders zu drücken, ein ungewöhnlich hoher Widerstand

auftrat. Die Liposomensuspension wurde in ein 15 ml Falcon Tube gefüllt und bei 4 °C im

Kühlschrank gelagert.

3.1.8.2 Verneblung mit Pari LC Sprint ® Star und Microsprayer

Die mit Sildenafil beladenen Liposomen wurden mit dem Pari LC Sprint ® Star und dem

MicroSprayer ® vernebelt.

Zur Verneblung mit dem Pari LC Sprint ® Star wurde der Vernebler mit 3 ml der

Liposomensuspension befüllt. Es wurden die Aerosolpartikelgrößen und der Output des

- 47 -


3 EIGENE UNTERSUCHUNGEN - 3.1 MATERIAL UND METHODEN

Verneblers nach 15 Minuten Verneblungsdauer bestimmt. Die Verneblungsdauer wurde auf

15 Minuten begrenzt, da sich so noch ausreichend Rückstand im Vernebler befand, der zur

Charakterisierung der darin enthaltenen Liposomen entnommen werden konnte. Nach der

Messung der Aerosolpartikelgrößen wurde das Aerosol aufgefangen, um die darin enthaltenen

Liposomen ebenfalls charakterisieren zu können. Da das Aerosol, das aus dem Vernebler

austrat, zu langsam war, um aufgefangen werden zu können, wurde auf die Austrittsöffnung

des Verneblers ein Aufsatz aufgesetzt. Dieser bestand aus einem abgesägten unteren Ende

eines 15 ml Falcon Tubes mit abgesägter Spitze. Durch diese Verkleinerung der

Austrittsöffnung wurde die Austrittsgeschwindigkeit des Aerosols erhöht, an der Wand eines

davor gehaltenen Eppendorf-Reaktionsgefäßes kam es zur Impaktion, und das Aerosol konnte

so aufgefangen werden.

Abb. 10: Auffangen des Aerosols aus dem Pari LC Sprint ® Star

Bei der Verneblung der Liposomen mit dem MicroSprayer ® wurde aufgrund des damit

verbundenen hohen Materialverbrauches auf eine Messung der Aerosolpartikelgrößen

verzichtet. Die Sonde des mit 1 ml der Liposomensuspension befüllten MicroSprayers ® wurde

in ein Eppendorf-Reaktionsgefäß gehalten, sodass das Aerosol darin aufgefangen werden

konnte. Es wurden der Output aus der Spritze sowie das nach der Verneblung in der Sonde

verbleibende Residuum gravimetrisch bestimmt.

- 48 -


3 EIGENE UNTERSUCHUNGEN - 3.1 MATERIAL UND METHODEN

3.1.8.3 Charakterisierung

Um die Liposomensuspension zu charakterisieren, wurden Größe, Verkapselungseffizienz,

Verkapselungsrate und Verneblungsstabilität der Liposomen bei Verneblung mit dem

MicroSprayer ® und dem Pari LC Sprint ® Star untersucht.

3.1.8.3.1 Größenmessung

Nach Zugabe von 30 µl der Liposomensuspension in die mit Aqua dest. befüllte Küvette

erfolgte die Messung des medianen Volumenduchmessers (VMD) und der zugehörigen

geometrischen Standardabweichung (GSD) der Liposomen wie in Kapitel 3.1.5.6.1

beschrieben. Die Messungen wurden nach der Herstellung, in den aufgefangenen Aerosolen

nach Verneblung mit dem Pari LC Sprint ® Star und dem MicroSprayer ® sowie in der aus dem

Rückstand des Pari LC Sprint ® Star entnommenen Liposomensuspension durchgeführt.

3.1.8.3.2 Bestimmung von Verkapselungseffizienz und Verkapselungsrate

Zur Bestimmung von Verkapselungseffizienz (VE) und Verkapselungsrate (VR) wurden die

Gesamt-Sildenafilkonzentrationen sowie das nicht liposomal verkapselte Sildenafil in den

Liposomensuspensionen nach der Herstellung, in den aufgefangenen Aerosolen nach

Verneblung mit dem Pari LC Sprint ® Star und dem MicroSprayer ® sowie in der aus dem

Rückstand des Pari LC Sprint ® Star entnommenen Liposomensuspension mittels HPLC

bestimmt.

Um den Gesamt-Sildenafilgehalt der Liposomensuspension bestimmen zu können, mussten

die Liposomen zuvor zerstört werden, sodass das liposomal verkapselte Sildenafil freigesetzt

wurde. Dazu wurden 100 µl der Liposomensuspension in einem Eppendorfgefäß mit 900 µl

Methanol versetzt und für zehn Minuten bei 15 Hertz auf eine Rüttelplatte gestellt.

Das freie Sildenafil wurde im Überstand nach Zentrifugation von 200 µl der Liposomen mit

der Tischzentrifuge bei 4 °C und 15000 RPM für 60 Minuten bestimmt. Zur Verbesserung der

Messbarkeit wurden 50 µl des Überstandes mit 450 µl Methanol verdünnt. Das verkapselte

Sildenafil wurde aus der Differenz zwischen dem Gesamtgehalt und dem freien Sildenafil

berechnet.

Aus den gemessenen Werten konnten die Verkapselungseffizienz (VE) und die

Verkapselungsrate (VR) in der Liposomenprobe berechnet werden.

- 49 -


3 EIGENE UNTERSUCHUNGEN - 3.1 MATERIAL UND METHODEN

Die Verkapselungseffizienz (VE) gibt an, wie viel des zur Herstellung eingesetzten

Sildenafils in den Vesikeln enthalten ist und berechnet sich nach folgender Formel:

VE (%) =

verkapseltes

Sildenafil ( mg / ml)

* 100

zur Herstellung

eingesetztes

Sildenafil ( 1 mg / ml)

Die Verkapselungsrate (VR) gibt den Anteil an verkapseltem Sildenafil, bezogen auf den

Gesamtsildenafilgehalt in der Liposomensuspension, an:

verkapseltes

Sildenafil ( mg / ml)

* 100

VR (%) =

Gesamtsildenafilgehalt

in der Liposomensuspension

3.1.8.3.3 Wiederfindung nach Verneblung

- 50 -

( mg / ml)

Die Sildenafilwiederfindung in den aufgefangenen Aerosolen bzw. in dem aus dem Pari LC

Sprint ® Star entnommenen Rückstand bezieht sich auf die Gesamtsildenafilgehalte der

Suspensionen. Dabei entspricht der nach der Herstellung gemessene Sildenafilgehalt 100 %

der jeweiligen Charge. Die Wiederfindung (WF) berechnet sich somit nach folgender Formel:

WF (%) =

Gesamtsildenafilgehalt

im Aerosol bzw.

Rückstand

( mg / ml)

* 100

Gesamtsildenafilgehalt

in der Liposomensuspension

nach Herstellung

( mg / ml)

3.1.8.4 In vitro Freisetzungsversuche

Die Sildenafil-Freisetzung aus den Liposomen wurde in vitro in vierprozentiger Albumin-

Lösung untersucht. Um Sink-Bedingungen zu erreichen, wurden Falcon-Tubes mit 14,4 ml

Albumin-Lösung befüllt, zu denen dann je 0,6 ml der Liposomensuspension zugegeben

wurden. Durch diese Verdünnung wird ein Konzentrationsgefälle erreicht, das eine

Freisetzung des Sildenafils aus den Liposomen über einen längeren Zeitraum ermöglicht. Die

Ansätze wurden im Wärmeschrank (IR 1500, Flow Laboratories, Irvine, Großbritannien) bei

37 °C auf einem Schwenktisch über fünf Stunden inkubiert. Sofort nach Zugabe der

Liposomen (Zeitpunkt 0) sowie nach 5, 10, 20, 30 und im weiteren Verlauf alle 30 Minuten

bis zum Ende des Versuches nach 300 Minuten wurden je 550 µl Proben entnommen, die

nach der Entnahme sofort auf Eis gelagert wurden. Um das freigesetzte Sildenafil bestimmen

zu können, wurden die in den Proben noch enthaltenen Liposomen in einer Tischzentrifuge


3 EIGENE UNTERSUCHUNGEN - 3.1 MATERIAL UND METHODEN

bei 4 °C und 15000 RPM für 60 Minuten abzentrifugiert. Aus jeder Probe wurden 500 µl

Überstand zur Bestimmung des Sildenafilgehalts mittels HPLC entnommen. Nachdem die

Proben bis zur Messung bei -20 °C gelagert worden waren, wurden sie direkt vor der

Messung wie in Kapitel 3.1.8.5.4 beschrieben behandelt.

Zusätzlich wurden zum Zeitpunkt 0 sowie nach 150 und 300 Minuten Proben zur Kontrolle

des Gesamtsildenafilgehaltes im Versuchsansatz entnommen. Dazu wurden 50 µl Probe

entnommen, die zur Zerstörung der Liposomen und vollständigen Freisetzung des Sildenafils

mit 450 µl Methanol versetzt und zehn Minuten auf die Rüttelplatte gestellt wurden.

Der prozentuale Anteil an freigesetztem Sildenafil bezieht sich auf den im jeweiligen in vitro-

Versuch gemessenen Gesamt-Sildenafilgehalt (Mittelwert aus den drei Messungen pro

Versuch zu verschiedenen Zeitpunkten).

3.1.8.5 Untersuchungen an der isolierten, ventilierten und blutfrei perfundierten

Kaninchenlunge

3.1.8.5.1 Das Modell

Die isolierte, ventilierte und blutfrei perfundierte Kaninchenlunge ist ein in der Arbeitsgruppe

bereits gut etabliertes Modell, das Untersuchungen von Pharmakokinetik und –dynamik

inhalativ verabreichter Farb- und Wirkstoffe ohne störende zentrale, humorale und

metabolische Einflüsse erlaubt (Seeger et al. 1994; Lahnstein et al. 2008; Beck-Broichsitter et

al. 2009; Lahnstein 2009; Beck-Broichsitter et al. 2010; Rüsch 2010). Da es bei früheren

Versuchen in der eigenen Arbeitsgruppe zu einem zeitabhängigen Verlust von Sildenafil in

einem Modellsystem, das für die Versuche mit der isolierten Kaninchenlunge verwendet

wurde, gekommen war, wurden zunächst verschiedene Schlauchmaterialien getestet (s.

Kapitel 3.1.7.3 und 3.1.7.4). Für die in der eigenen Arbeit durchgeführten Versuche mit

Sildenafil wurde das Perfusionssystem dann aus Clear C-FLEX ® -Schläuchen gebaut, da der

Wirkstoff in diesem System ohne Verluste nachweisbar war (s. Kapitel 3.2.3.4).

Aus zwei doppelwandigen Vorratsgefäßen, die gleichzeitig oder alternierend in den Kreislauf

eingeschaltet werden konnten, wurde das Perfusionsmedium durch eine Peristaltikpumpe

(Roller Pump BP 742, Fresenius, Bad Homburg, Deutschland) rezirkulierend durch das

System gepumpt. Dabei passierte es erst einen Pallfilter (Pall Cardioplegia Plus 0,2 µm, Pall

Biomedical Corp., Fajardo, USA) zum Schutz vor Embolien und dann eine Blasenfalle zur

Eliminierung evtl. noch vorhandener Luftblasen, bevor es über die Arteria pulmonalis in die

Lunge gelangte. Über einen in den linken Ventrikel eingenähten Ablauf verließ es das

- 51 -


3 EIGENE UNTERSUCHUNGEN - 3.1 MATERIAL UND METHODEN

Organmodell dann wieder und floss durch einen zur Probenentnahme zwischengeschalteten

Dreiwegehahn zurück in die Vorratsgefäße. Diese konnten, da sie doppelwandig waren, über

einen Wärmeregler (Thermomix BU, Braun, Melsungen, Deutschland) auf 40 °C temperiert

werden, ebenso wie die Kammer, in der die Lunge hing und eine Glasspirale, die das Perfusat

vor Eintritt in die Lunge passierte.

3.1.8.5.2 Präparation, Perfusion und Ventilation der Lunge

Das Perfusionssystem wurde für den Versuch vorbereitet, indem Gefäße und Schläuche erst

mit 500 ml Aqua dest, dann mit 500 ml isotoner Kochsalzlösung und schließlich mit 500 ml

gepufferter Elektrolytlösung (1/3) gespült wurden, wobei Luftblasen entfernt wurden. Danach

wurden beide Vorratsgefäße mit der Elektrolytlösung befüllt.

Nach Punktion einer Ohrvene von männlichen Kaninchen der Rasse New Zealand White mit

einem Gewicht von 2,5 - 3,2 kg wurde eine Allgemeinanästhesie intravenös durch ein

Gemisch aus Xylazin (Xylazin 2 %, Veva Tiergesundheit GmbH, Düsseldorf, Deutschland)

und Ketamin (Ketamin 10 %, bela-pharm GmbH & Co. KG, Vechta, Deutschland) im

Verhältnis 2 : 1 eingeleitet und während der Operation aufrecht erhalten. Eine

Antikoagulation wurde durch die intravenöse Gabe von 5000 I.E. Heparin (Heparin 25000

I.E., ratiopharm GmbH, Ulm, Deutschland) erzielt. Nach Erreichen der Bewusstlosigkeit des

Tieres erfolgte eine Fixation des Kaninchens auf dem Tisch in Rückenlage. Nach

prätrachealer subkutaner Applikation von 8 ml eines Lokalanästhetikums (Xylocain ® 1 %,

AstraZeneca GmbH, Wedel, Deutschland) wurde die Trachea frei präpariert, eröffnet und

intubiert. Nun konnten die Kaninchen über eine Beatmungspumpe (cat/ rabbit Ventilator,

Hugo Sachs Elektronik, March-Hugstetten, Deutschland) mit einer Frequenz von 30

Atemzügen pro Minute und einem Atemzugvolumen von 30 ml mit Raumluft beatmet

werden. Nach erfolgter Laparatomie ca. 1 cm caudal des Sternums wurde durch vorsichtige

Inzision des Zwerchfells ein Pneumothorax angelegt. Dadurch kollabierte die Lunge, sodass

das Diaphragma entlang der Rippen abgelöst und eine mediane Sternotomie durchgeführt

werden konnte. Die Thoraxhälften wurden gespreizt und seitlich fixiert, der Thymus wurde

stumpf abpräpariert und der Herzbeutel eröffnet. Nun wurde der rechte Ventrikel eröffnet, ein

flüssigkeitsgefüllter Perfusionskatheter wurde blasenfrei in die Pulmonalarterie vorgeschoben

und dort mit einer Ligatur fixiert. Zu diesem Zeitpunkt startete die Perfusion der Lunge mit

der auf 4 °C gekühlten gepufferten Elektrolytlösung (1/3) bei einem Fluss von 10 ml pro

Minute. Um einen Abfluss des Perfusats zu gewährleisten, wurde sofort im Anschluss die

Herzspitze vom Herz abgetrennt.

- 52 -


3 EIGENE UNTERSUCHUNGEN - 3.1 MATERIAL UND METHODEN

Mit Beginn der artifiziellen Perfusion begann die Beatmung mit einem Gasgemisch aus

Kohlendioxid (5,3 %), Sauerstoff (21 %) und Stickstoff (73,7 %). Nach erfolgter Ligatur der

Aorta konnten Trachea, Lunge und Herz zusammenhängend aus dem Brustkorb entnommen

werden. Schließlich wurden der rechte Ventrikel und die Papillarmuskeln im linken Ventrikel

entfernt, das linke Herzohr wurde abgebunden und ein Abfluss wurde mittels

Tabaksbeutelnaht in den linken Ventrikel eingenäht. Damit konnte der Perfusionskreislauf

geschlossen werden. Die Lungen wurden in einer auf 4 °C temperierten Kammer frei

aufgehängt, sodass über eine Wägezelle (Typ U1, Hottinger Baldwin Messtechnik,

Deutschland) mit angeschlossenem Messverstärker (Plugsys DBA 660, Hugo Sachs

Elektronik, March-Hugstetten, Deutschland) das Lungengewicht auf einem Schreiber

(Rikadenki R 50 Series, Rikadenki Elektronics, Freiburg, Deutschland) aufgezeichnet werden

konnte. Während die Temperatur der Perfusionsflüssigkeit und der Kammer auf 40 °C erhöht

wurde, erfolgte eine schrittweise Erhöhung der Perfusionsgeschwindigkeit auf 100 ml/min.

Der linksventrikuläre Druck (LVP) wurde auf 1,4 – 1,6 mmHg und der end-exspiratorische

Druck (PEEP) auf 1 cm Wassersäule eingestellt. Danach wurde ein Perfusatwechsel

durchgeführt, bei dem die bei der Präparation verwendete Elektrolytlösung durch

vorgewärmte, entgaste Albumin-Lösung ersetzt wurde. Zu Versuchsbeginn betrug das

Perfusatvolumen 300 ml. Pulmonalarterieller Druck (PAP) und LVP wurden während des

Versuches über zwei mit Perfusat gefüllte Katheter in den Perfusatschläuchen kurz vor der

Pulmonalarterie bzw. dem linken Ventrikel aufgenommen. Zusammen mit dem

Beatmungsdruck, der im exspiratorischen Schenkel des Beatmungssystems gemessen wurde,

wurden die Drucksignale durch elektromechanische Druckumwandler (Combitrans, B. Braun

Melsungen AG, Melsungen, Deutschland) in elektrische Signale umgewandelt und auf dem

angeschlossenen Computer aufgezeichnet. Der pH-Wert des Perfusats wurde während des

Versuches regelmäßig kontrolliert und lag bei 7,3 – 7,4.

Für die Versuche wurden nur solche Lungen verwendet, die ein gleichmäßiges weißes

Aussehen ohne Anzeichen von Hämostase oder Atelektasen aufwiesen und einen PAP und

LVP im normalen Bereich hatten. Auch eine Ödembildung, die sich durch eine

Gewichtszunahme der Lunge von mehr als 10 g über den Versuchszeitraum von fünf Stunden

zeigte, war ein Ausschlusskriterium.

3.1.8.5.3 Versuchsdurchführung

Vor dem Perfusatwechsel wurde der Pallfilter abgeklemmt und das Perfusat wurde während

des Versuches über einen Bypass geleitet. Für die Lungenversuche wurden je 1 ml freies

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3 EIGENE UNTERSUCHUNGEN - 3.1 MATERIAL UND METHODEN

Sildenafil (Base, bioKEMIX, 1 mg/ml, gelöst in Aqua dest bei pH 2; n=4) oder liposomal

verkapseltes Sildenafil (n=4) mit dem MicroSprayer ® vernebelt. Dessen Sonde war schon bei

der Präparation in den Trachealtubus integriert. Die Spitze der Sonde endete mit dem Tubus

ca. 1,5 cm vor der Bifurkation der Trachea.

Die Verneblung erfolgte während der Inspiration. Dazu wurde die Atemfrequenz kurzzeitig

auf fünf Atemzüge pro Minute reduziert. Vor der Verneblung wurde eine Perfusatprobe (Null-

Probe) entnommen. Der Output aus der MicroSprayer ® -Spritze wurde gravimetrisch

bestimmt. Die Sonde wurde nach der Applikation aus der Trachea entfernt.

Nach der Applikation wurden nach 5, 10, 20, 30 und im weiteren Versuchsverlauf alle 30

Minuten bis zum Ende des Versuches nach 300 Minuten je 1,1 ml Probe aus dem Perfusat

entnommen. Während den Experimenten kam es durch Probenentnahmen, Verdunstung und

Tropfenbildung zu einem Perfusatverlust. Da die im Perfusat gemessenen

Wirkstoffkonzentrationen somit falsch zu hoch waren, wurden die gemessenen Werte

rechnerisch durch folgende, in der Arbeitsgruppe der Verfasserin entwickelte Formel

korrigiert (Lahnstein 2009):

C

corr

C(

t)

* V p ( t)

+ ( V p ( 0)

−V

p ( t))

* C(

t)

/ 2 C(

t)

⎛ V p ( t)


( t)

= = * ⎜ + 1⎟

V ( 0)

2 ⎜ ⎟

p

⎝V

p ( 0)


Ccorr(t) = korrigierte Wirkstoffkonzentration im Perfusat zum Zeitpunkt (t)

C(t) = gemessene Wirkstoffkonzentration im Perfusat zum Zeitpunkt (t)

Vp(t) = Perfusatvolumen zum Zeitpunkt (t)

Vp(0) = Perfusatvolumen zum Zeitpunkt 0

Mithilfe dieser Formel konnte der Wirkstoffübertritt aus der Lunge ins Perfusat bestimmt

werden.

Um das nach Versuchsende in der Lunge verbleibende Sildenafil quantifizieren zu können,

wurden die Lungen lavagiert. Die Lavagen wurden zunächst mit drei mal 50 ml gepufferter

Elektrolytlösung durchgeführt. Um eine bessere Wiederfindung des schlecht wasserlöslichen

Wirkstoffs zu erzielen, wurden die Lungen anschließend noch mit 50 ml Methanol lavagiert.

Von den Elektrolyt-Lavagen wurden sofort nach ihrer Gewinnung aus jeder der drei pro

Versuch durchgeführten Lavagen je 2 ml entnommen, gepoolt und mit 6 ml Methanol

versetzt. Dies verbesserte die Messbarkeit der Substanz mittels HPLC. Alle Lavagen wurden

anschließend, wie auch die Proben, bis zur Messung bei -20 °C gelagert.

- 54 -


3 EIGENE UNTERSUCHUNGEN - 3.1 MATERIAL UND METHODEN

3.1.8.5.4 Aufbereitung der Proben und Lavagen

Um den Sildenafilgehalt in den Proben aus den in vitro Freisetzungsversuchen und den

Lungenversuchen mittels HPLC messen zu können, musste das Sildenafil zuvor aus den

Proben extrahiert werden. Dies geschah in Anlehnung an ein von Sheu et al. entwickeltes

Protokoll zur Messung von Sildenafilkonzentrationen in humanem Plasma (Sheu et al. 2003).

Dazu wurden 500 µl jeder Probe mit 50 µl des internen Standards Butylparaben (Butyl 4-

Hydroxybenzoat, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Deutschland) versetzt. Dieser

war in einer Konzentration von 20 µg/ml in Methanol gelöst. Zusätzlich wurden 50 µl

einmolare NaOH und 500 µl Methanol zugegeben. Anschließend wurden die Proben

gründlich gevortext. Die Methanol-Zugabe entfiel bei den Lavagen, da diese bereits

ausreichend Methanol enthielten. Nachdem den Proben in zwei Extraktionsschritten

insgesamt 3 ml Ethylacetat zugegeben und diese kurz durchmischt worden waren, wurden sie

kurz ruhen gelassen, um eine Phasentrennung zu erreichen. Dann wurde die organische Phase

entnommen, in ein neues Reagenzglas überführt und bei 40 °C unter Stickstoff vollständig

evaporiert. Das Residuum wurde in 500 µl mobiler Phase aufgenommen und gründlich

gevortext. Schließlich wurde die Probe in ein Eppendorf-Gefäß überführt und eine Minute bei

10000 RPM zentrifugiert. Der Sildenafilgehalt wurde im Überstand bestimmt.

Bei dieser relativ aufwändigen Probenaufarbeitung war davon auszugehen, dass es durch die

Eintrocknungs- und Extraktionsschritte zu einem Verlust von Sildenafil in den Proben kam.

Um diesen Verlust quantifizieren zu können, wurde sowohl den Proben als auch der

Standardreihe der interne Standard Butylparaben, der sich in den Proben ähnlich verhält wie

das zu messende Sildenafil, in definierter Menge zugegeben und mittels HPLC gemessen. Da

die ursprünglich in der Probe enthaltene Butylparabenmenge bekannt war, konnte durch den

Vergleich der Messergebnisse mit der erwarteten Menge die Wiederfindungsrate dieser

Substanz nach erfolgter Analyse bestimmt werden. Da die Butylparabenkonzentration durch

das Verfahren abnahm, wurde angenommen, dass sich die Sildenafilkonzentration in gleicher

Weise verändert hatte. Die Messergebnisse von Sildenafil wurden dann mit der

Wiederfindungsrate von Butylparaben korrigiert.

3.1.8.5.5 Berechnung der Stoffverteilung im Lungenmodell

Nach Bestimmung der Sildenafilgehalte in den Perfusatproben und den Lavagen wurde für

alle Versuche eine Gesamtbilanz erstellt. Die Sildenafilgehalte in den einzelnen

Kompartimenten wurden prozentual auf die jeweils deponierte Menge, die sich aus der

Sildenafilkonzentration der vernebelten Lösung bzw. Liposomensuspension und dem Output

- 55 -


3 EIGENE UNTERSUCHUNGEN - 3.1 MATERIAL UND METHODEN

ergab, bezogen. Zur Berechnung des prozentualen Anteils im Perfusat wurde die gemessene

Konzentration der letzten zwei Proben gemittelt und mit dem am Ende des Versuches noch

vorhandenen Perfusatvolumen verrechnet.

3.1.9 Statistische Auswertung

Die Ergebnisse wurden mit dem Test nach Grubbs auf Ausreißer untersucht.

Die statistische Auswertung der Ergebnisse erfolgte unter Verwendung des

Statistikprogramms SigmaSTAT ® Version 3.5 (Systat Software GmbH, Erkrath,

Deutschland).

Bei den nach unterschiedlichen Methoden hergestellten R6G-Liposomen wurden die

Verkapselungsraten mittels Varianzanalyse untereinander verglichen. Der Vergleich der

Partikelgrößen der Liposomen (VMD) wurde mittels Kruskall-Wallis-Test durchgeführt, da

durch die fehlende Varianzhomogenität eine der Voraussetzungen für die Varianzanalyse

nicht erfüllt war. Die Vergleiche von Verkapselungsraten der Liposomen vor und nach

Verneblung sowie Verneblungsdauer und Output von isotoner Kochsalzlösung und R6G-

Liposomen wurden mittels Student´s t-Test durchgeführt. Zum Vergleich des MMAD bei der

Verneblung von isotoner Kochsalzlösung und R6G-Liposomen sowie des VMD der

Liposomen vor und nach Verneblung wurde ein Mann-Whitney Rangsummentest

durchgeführt, da die Voraussetzungen für einen Student´s t-Test durch fehlende

Varianzhomogenität nicht erfüllt waren.

Im Falle der Sildenafil-Liposomen wurden die Verkapselungsraten und der VMD der

Liposomen nach MicroSprayer ® , im aufgefangenen Aerosol und im Rückstand des Pari LC ®

Sprint Star jeweils mittels Student´s t-Test mit den entsprechenden Werten nach Herstellung

verglichen. Auch für die Vergleiche des Output bei der Verneblung von Liposomen mit den

jeweiligen Werten von Aqua dest. (MicroSprayer ® ) bzw. isotoner Kochsalzlösung (Pari LC ®

Sprint Star) wurde dieser Test verwendet. Bei der Wiederfindung nach Verneblung war eine

Normalverteilung nicht gegeben, sodass die Ergebnisse mittels Mann-Whitney

Rangsummentest ausgewertet wurden.

Die Stoffverteilung im Lungenmodell sowie die AUC nach der Applikation der Liposomen

wurde jeweils mittels Student´s t-Test mit den jeweiligen Werten nach Applikation von

freiem Sildenafil vergleichen.

Zur Benennung der Signifikanzen wurde der jeweils berechnete p-Wert angegeben. In den

Abbildungen erfolgte die Darstellung der Signifikanzen entweder mit den entsprechenden p-

Werten oder mit * für p ≤ 0,05 bzw. n.s. für nicht signifikant (p > 0,05).

- 56 -


3.2 ERGEBNISSE

3 EIGENE UNTERSUCHUNGEN - 3.2 ERGEBNISSE

3.2.1 Charakterisierung der Vernebler

Im Rahmen der Verneblercharakterisierung wurden die Aerosolpartikelgrößen der von den in

dieser Arbeit verwendeten Verneblern bei der Verneblung von NaCl bzw. Aqua dest.

generierten Aerosole laserdiffraktometrisch bestimmt. Der Output wurde gravimetrisch

ermittelt.

Einen Überblick über die Ergebnisse der untersuchten Parameter bietet Tab. 3.

MMAD (µm) GSD Output (ml) Output (ml/min)

Aeroneb ® Solo (n=6) 4,71 ± 0,16 1,73 ± 0,08 2,85 ± 0,01 0,52 ± 0,02

Pari LC Sprint ® Star (n=4) 3,92 ± 0,04 1,92 ± 0,02 1,21 ± 0,02 0,08 ± 0,00

MicroSprayer ® (n=4) 20,1 ± 3,54 1,91 ± 0,08 0,87 ± 0,01 n.d.

Tab. 3: Ergebnisse (MW ± SD) der Verneblung von isotoner Kochsalzlösung (Aeroneb ® Solo

und Pari LC Sprint ® Star) bzw. Aqua dest. (MicroSprayer ® ). MMAD: Medianer

aerodynamischer Massendurchmesser; GSD: Geometrische Standardabweichung

3.2.1.1 Aerosolpartikelgrößen

Die Aerosolpartikelgrößen der von den Verneblern generierten Aerosole wurden mittels

Laserdiffraktometrie bestimmt. Die bei der Verneblung von isotoner Kochsalzlösung mit dem

Aeroneb ® Solo und dem Pari LC Sprint ® Star generierten Aerosole sind mit einem medianen

aerodynamischen Massendurchmesser (MMAD) von unter fünf µm klein genug, um in die

peripheren Lungenregionen gelangen zu können. Die bei vier Verneblungen von Aqua dest.

mit dem MicroSprayer ® generierten Aerosolpartikel sind mit einem MMAD von 20,1 ± 3,54

µm deutlich größer als die Aerosolpartikel der beiden anderen Vernebler (s. Tab. 3).

3.2.1.2 Output

Der Output der Vernebler (s. Tab. 3) wurde gravimetrisch bestimmt, indem die Vernebler

jeweils vor und nach der Verneblung gewogen wurden.

Bei der Verneblung von isotoner Kochsalzlösung mit dem Aeroneb ® Solo wurden von 3 ml,

die in den Vernebler eingefüllt worden waren, bei sechs Versuchen im Mittel 2,85 ± 0,01 ml

vernebelt. Der Vernebler benötigte dafür 5,54 ± 0,23 Minuten. Daraus berechnet sich ein

Output von 0,52 ± 0,02 ml/min.

- 57 -


3 EIGENE UNTERSUCHUNGEN - 3.2 ERGEBNISSE

Die Verneblung mit dem Pari LC Sprint ® Star wurde nach 15 Minuten beendet. In dieser Zeit

wurden bei vier Versuchen im Mittel 1,21 ± 0,02 ml der eingefüllten 3 ml Kochsalzlösung

vernebelt. Somit liegt sowohl der absolute Output, als auch der auf die Verneblungsdauer

bezogene Output mit 0,08 ± 0,00 ml deutlich niedriger als beim Aeroneb ® Solo.

Bei vier Verneblungen von je einem Milliliter Aqua dest. mit dem MicroSprayer ® lag der

Output aus der Spritze des Verneblers im Mittel bei 0,96 ± 0,00 ml. Da bei den Verneblungen

ein gravimetrisch bestimmtes Residuum von 0,09 ± 0,01 ml in der Sonde des Verneblers

verblieb, errechnete sich aus der Differenz ein effektiver Output von 0,87 ± 0,01 ml.

3.2.2 Liposomen mit Rhodamin 6G

Die mit dem Fluoreszenzfarbstoff Rhodamin 6G beladenen Liposomen wurden nach vier

unterschiedlichen Methoden hergestellt. Dabei wurden nach Methode A, B und C jeweils

zwei, nach Methode D eine Charge gefertigt und charakterisiert.

Außerdem wurde die Stabilität der Liposomen gegenüber der Verneblung mit dem Aeroneb ®

Solo untersucht. Dafür wurden je 3 ml der Liposomensuspension vernebelt. Das Aerosol

wurde zur Charakterisierung der darin enthaltenen Liposomen in einem Falcon Tube

aufgefangen.

Vor der Verneblung mit dem Aeroneb ® Solo wurden die Liposomensuspensionen auf

definierte R6G-Konzentrationen verdünnt. Die Verdünnungen wurden zur Kontrolle

analysiert. Die vor der Verneblung gemessenen R6G-Konzentrationen in den jeweiligen

Ansätzen zeigt Tab. 4:

Errechnete

Konzentration (µg/ml)

Gemessene R6G-

Konzentration (µg/ml)

vor Verneblung

Methode A B C D

10,0 5,0 10,0 5,0 5,0

9,88

9,66

5,31

4,80

- 58 -

10,13 5,13

Tab. 4: R6G-Konzentrationen in den zur Verneblung hergestellten Verdünnungen der nach

unterschiedlichen Methoden hergestellten Liposomensuspensionen

5,18

4,72

4,75

5,59


3 EIGENE UNTERSUCHUNGEN - 3.2 ERGEBNISSE

3.2.2.1 Charakterisierung der Liposomen nach Extrusion und Verneblung

3.2.2.1.1 Verkapselungseffizienz

Die Verkapselungseffizienz (VE) der nach den unterschiedlichen Methoden aus den gleichen

Ausgangssubstanzen hergestellten Liposomen wurde nach der Extrusion bestimmt und gibt

an, wie viel des zur Herstellung eingesetzten R6G in den Liposomen enthalten ist. Die

Ergebnisse sind in Tab. 5 dargestellt.

Methode A B C D

Chargennummer 1 2 1 2 1 2 1

VE (%) 2,92 7,02 3,20 7,09 6,95 7,85 3,80

- 7,97 3,10 7,06 - 7,95 3,70

MW 7,50 3,15 7,08 7,90 3,75

Tab. 5: Verkapselungseffizienzen (VE) der nach den unterschiedlichen Methoden

hergestellten, mit R6G beladenen Liposomen

Die Verkapselungseffizienzen (VE) der Liposomen lagen zwischen 2,92 % (Methode A) und

7,90 % (Methode C). Beim Vergleich der VE von zwei Chargen jeweils einer Methode fällt

auf, dass es bei den Methoden A und B deutliche Unterschiede zwischen den Chargen gibt,

während die VE bei den nach Methode C hergestellten Liposomen besser reproduzierbar

erschien.

3.2.2.1.2 Wiederfindung nach Verneblung

Durch die Messung des Gesamt-R6G-Gehalts in den aufgefangenen Liposomensuspensionen

konnte die Farbstoffwiederfindung nach der Verneblung berechnet werden. Die in Tab. 6

angegebene prozentuale Wiederfindung berechnet sich aus dem Gesamt-R6G-Gehalt im

aufgefangenen Aerosol, bezogen auf den in der Liposomensuspension vor Verneblung

enthaltenen, in Tab. 4 absolut angegebenen Gesamt-R6G-Gehalt.

- 59 -


3 EIGENE UNTERSUCHUNGEN - 3.2 ERGEBNISSE

Methode A B C D

Wiederfindung (%) 97,2

94,0

-

96,8

97,7

-

- 60 -

79,0

85,6

-

96,5

88,4

95,3

88,0

100,0

MW 95,6 97,3 82,3 93,4 94,0

Tab. 6: Prozentuale Farbstoffwiederfindung nach Verneblung der mit R6G beladenen

Liposomen mit dem Aeroneb ® Solo

Bei den Liposomen der Methode B, die vor der Verneblung auf eine R6G-Konzentration von

10 µg/ml verdünnt worden waren, konnten nach der Verneblung nur 82,3 % des Farbstoffs

wiedergefunden werden. Bei allen anderen vernebelten Liposomensuspensionen war die

Wiederfindung mit über 90 % des zur Verneblung eingesetzten Farbstoffs deutlich höher. Die

Liposomen verließen den Vernebler also nahezu vollständig.

3.2.2.1.3 Verkapselungsrate

Die Verkapselungsrate (VR) gibt den Anteil an verkapseltem Farbstoff, bezogen auf den

Gesamtfarbstoffgehalt in der Liposomensuspension, an. Die VR der Liposomensuspensionen

wurden nach der Extrusion sowie nach der Verneblung im aufgefangenen Aerosol bestimmt

und sind in Tab. 7 dargestellt.

Methode A B C D

VR (%) 99,0

MW ±

SD

n. Extr. n. Vern. n. Extr. n. Vern. n. Extr. n. Vern. n. Extr. n. Vern.

98,4

93,3

96,9 ±

3,1

-

96,7

100,0

98,4 ±

2,3

-

-

98,0

97,0

102,5

101,0

99,2 ±

2,9

98,8

93,6

97,1

96,0

96,4 ±

2,2

98,7

99,1

99,0

98,9 ±

0,2

-

94,1

92,8

94,0 ±

1,1

-

-

-

96,6

93,8

95,2 ±

2,0

-

-

93,8

91,0

92,4 ±

2,0

Tab. 7: Verkapselungsraten (VR) der nach unterschiedlichen Methoden hergestellten, mit

R6G beladenen Liposomen nach Herstellung und nach Verneblung

Die Verkapselungsraten nach Extrusion waren mit 95,2 % (Methode D) bis 99,2 (Methode

B) bei allen Liposomen ähnlich hoch (s. Abb. 11). Das bedeutet, dass fast der gesamte in der

Liposomensuspension enthaltene Farbstoff in liposomal verkapselter Form vorlag, während

-

-


3 EIGENE UNTERSUCHUNGEN - 3.2 ERGEBNISSE

nur ein geringer Anteil an freiem R6G enthalten war. Die Unterschiede zwischen den

verschiedenen Methoden waren statistisch nicht signifikant (p = 0,2).

Wie aus Abb. 11 weiterhin ersichtlich ist, waren die Verkapselungsraten auch nach der

Verneblung mit über 90 % bei allen Liposomenformulierungen ähnlich hoch wie nach der

Extrusion. Lediglich bei der Methode C war die VR nach der Verneblung mit 94,0 ± 1,1 %

signifikant niedriger als nach der Extrusion, wo sie 98,9 ± 0,2 % betrug (p = 0,002). Da aber

immer noch ein Großteil des Farbstoffs in den Liposomen enthalten war, ist dieser

Unterschied als nicht relevant anzusehen. Es kam durch die Verneblung also nicht zu einer

Freisetzung des Farbstoffs aus den Vesikeln.

Verkapselungsrate (%)

100

90

80

70

60

50

40

30

20

10

0

n.s n.s

.

p=0,002

A B C D

Herstellungsmethode

nach Extrusion nach Verneblung

Abb. 11: Verkapselungsraten (MW + SD) der Liposomen nach Extrusion und nach

Verneblung. n.s. = nicht signifikant

- 61 -

n.s


3 EIGENE UNTERSUCHUNGEN - 3.2 ERGEBNISSE

3.2.2.1.4 Medianer Volumendurchmesser

Die medianen Volumendurchmesser (VMD) der nach unterschiedlichen Methoden

hergestellten Liposomen wurden nach Extrusion und nach Verneblung im aufgefangenen

Aerosol bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tab. 8 dargestellt.

Methode A B C D

VMD (µm)

[GSD]

n. Extr. n. Vern. n. Extr. n. Vern. n. Extr. n. Vern. n. Extr. n. Vern.

0,66

[1,88]

0,53

[1,60]

-

-

0,50

[1,54]

0,53

[1,62]

-

-

0,79

[1,86]

0,70

[1,79]

-

-

- 62 -

0,65

[1,71]

0,65

[1,71]

-

-

0,62

[1,71]

0,59

[1,70]

-

-

0,61

[1,72]

0,59

[1,63]

0,60

[1,72]

0,71

[2,13]

-

-

-

-

0,73

[1,92]

0,72

[1,92]

MW VMD 0,60 0,52 0,75 0,65 0,61 0,60 - 0,73

Tab. 8: Medianer Volumendurchmesser (VMD) und geometrische Standardabweichung

(GSD) der mit R6G beladenen Liposomen nach Extrusion und nach Verneblung mit dem

Aeroneb ® Solo

Der mediane Volumendurchmesser (VMD) der Liposomen, die nach den Methoden A und B

hergestellt worden waren, war nach der Verneblung etwas kleiner als nach der Extrusion.

Diese Unterschiede stellten sich bei der statistischen Auswertung der Ergebnisse mittels

Mann-Whitney-Rangsummentest aber als statistisch nicht signifikant heraus. Der VMD der

nach den Methoden C und D hergestellten Liposomen änderte sich durch die Verneblung

nicht.

Aufgrund der guten Gesamtwiederfindung des Farbstoffs nach der Verneblung von ca. 82 –

97 %, der auch nach Verneblung sehr hohen Verkapselungsrate von 92 – 98 % und der nur

marginalen Größenveränderung der Vesikel durch die Verneblung kann davon ausgegangen

werden, dass die mit R6G beladenen Liposomen den Vernebler intakt verließen und somit

stabil gegenüber der Verneblung sind.

-

-


3 EIGENE UNTERSUCHUNGEN - 3.2 ERGEBNISSE

3.2.2.2 Vergleich der Verneblereigenschaften des Aeroneb ® Solo bei der Verneblung

von R6G-Liposomen und isotoner Kochsalzlösung

MMAD (µm)

[GSD]

Verneblungsdauer

(min)

Output (ml)

Methode aCl (n=6) A (n=2) B (n=4) C (n=3) D (n=2)

4,71 ± 0,16

[1,73 ± 0,08]

4,77 ± 0,26

(n.s.)

[1,67 ± 0,05]

5,54 ± 0,23 6,41 ± 0,13

(p=0,003)

2,85 ± 0,01 2,92 ± 0,02

(p=0,001)

- 63 -

4,36 ± 0,10

(p=0,02)

[1,7 ± 0,1]

6,73 ± 0,30

(p


MMAD (µm)

6

5,5

5

4,5

4

3,5

3

2,5

2

1,5

1

0,5

0

3 EIGENE UNTERSUCHUNGEN - 3.2 ERGEBNISSE

n.s

. p=0,02

NaCl A B C D

Herstellungsmethode

- 64 -

p=0,02

Abb. 12: Aerosolpartikelgrößen (MW + SD) der bei der Verneblung von NaCl und der nach

unterschiedlichen Methoden hergestellten Liposomen mit einem Aeroneb ® Solo generierten

Aerosole. MMAD: medianer aerodynamischer Massendurchmesser. Die Signifikanzangaben

beziehen sich auf den Vergleich der liposomalen Aerosolpartikel zu NaCl.

3.2.2.2.2 Verneblungsdauer

Wie in Abb. 13 gut erkennbar ist, lag die Verneblungsdauer von je 3 ml der

Liposomenformulierungen mit über 6 Minuten (s. Tab. 9) deutlich über der Verneblungsdauer

von 3 ml NaCl. Die Unterschiede zu NaCl waren bei allen Formulierungen statistisch

signifikant.

Verneblungsdauer (min)

8

7

6

5

4

3

2

1

0

NaCl A B C D

Herstellungsmethode

n.s.

p=0,003 p


3.2.2.2.3 Output

3 EIGENE UNTERSUCHUNGEN - 3.2 ERGEBNISSE

Der Output betrug bei sechs Verneblungen von NaCl im Mittel 2,85 ± 0,01 ml. Bei der

Verneblung von Liposomen der Methode A war er mit 2,92 ± 0,02 ml (Doppelmessung)

signifikant größer (p = 0,001). Bei Liposomen der anderen Methoden konnte kein

signifikanter Unterschied zu NaCl festgestellt werden (s. Tab. 9).

Aus der Verneblungsdauer und dem Output in Milliliter wurde der Output in Milliliter pro

Minute berechnet. Dieser betrug bei der Verneblung von NaCl bei sechs Messungen 0,52 ±

0,02 ml/min. Bei der Verneblung der Liposomenformulierungen lag er aufgrund der längeren

Verneblungsdauer bei allen Methoden mit 0,43 ml/min (Methoden A und B) bzw. 0,44

ml/min (Methoden C und D) signifikant niedriger.

Aufgrund des gleichbleibenden Outputs des Aeroneb ® Solo bei der Verneblung der

Liposomen kann davon ausgegangen werden, dass die mit R6G beladenen Liposomen bei

etwas verlängerter Verneblungsdauer (ca. 1 Minute bei 3 ml Befüllung) nahezu vollständig

vernebelt wurden.

3.2.3 Ergebnisse zur Wiederfindung von Sildenafil

In Versuchen der Arbeitsgruppe der Verfasserin war ein zeitabhängiger Verlust von Sildenafil

in einem Modellsystem, das für die Versuche mit der isolierten Kanichenlunge verwendet

wurde, aufgefallen. Um die Übertrittskinetiken von inhalativ appliziertem Sildenafil aus der

Lunge in das Perfusat bestimmen zu können, musste die Wiederfindung der Substanz im

System bei diesen Versuchen gewährleistet sein. Daher wurden Schläuche aus

unterschiedlichen Materialien getestet, um schließlich ein System aus geeigneten Schläuchen

bauen zu können.

Da für eine quantitative Sildenafil-Analytik ein Verlust der Substanz auch in den zur

Aufbewahrung der Sildenafillösungen, der Sildenafil-Liposomensuspensionen und der Proben

verwendeten Gefäße ausgeschlossen werden musste, wurden zuvor in einer Versuchsreihe

diese Behältnisse untersucht.

3.2.3.1 Sildenafil in Eppendorf-Reaktionsgefäßen

Für diese Wiederfindungsversuche wurden Sildenafillösungen der Konzentration 150 µg/ml

eingesetzt. Bei zwei Versuchen (V 1 und V 2) betrugen die gemessenen

Sildenafilkonzentrationen in den eingesetzten Lösungen vor Versuchsbeginn 143,0 µg/ml und

- 65 -


3 EIGENE UNTERSUCHUNGEN - 3.2 ERGEBNISSE

149,8 µg/ml. Die prozentuale Wiederfindung dieser Konzentrationen in Eppendorf-

Reaktionsgefäßen zu definierten Zeitpunkten nach Inkubation bei 37°C zeigt Tab. 10:

Wiederfindung (%)

Zeit (min)

0 60 180 300

V 1 102,1 102,1 104,9 104,2

V 2 100,1 102,1 100,8 90,8

Tab. 10: Prozentuale Wiederfindung von Sildenafil in Eppendorf-Reaktionsgefäßen nach

Inkubation bei 37 °C, bezogen auf die in der eingesetzten Lösung gemessene

Sildenafilkonzentration

Da das Sildenafil in den Gefäßen während des gesamten untersuchten Zeitraums nahezu

vollständig nachgewiesen werden konnte, erschienen die Gefäße zur Aufbewahrung der

Wirkstofflösungen geeignet.

3.2.3.2 Sildenafil in Falcon Tubes

Für die Versuche wurde eine Sildenafillösung der Konzentration 100 µg/ml hergestellt.

Gemessen wurde eine Sildenafilkonzentration von 104,64 µg/ml. Je ein Milliliter dieser

Lösung wurde in drei Falcon Tubes gegeben, die mit 30 ml gepufferter Elektrolytlösung

befüllten waren. Nach gründlichem Durchmischen lagen die in den sofort danach

entnommenen Null-Proben gemessenen Konzentrationen bei 3,3 µg/ml (4 °C-Ansatz) und 3,5

µg/ml (25 °C- und 37 °C-Ansatz). Die prozentuale Wiederfindung dieser

Sildenafilkonzentrationen in den Falcon Tubes zu definierten Zeitpunkten nach Inkubation

von je einem Tube bei 4 °C, 25 °C bzw. 37 °C zeigt Tab. 11:

Wiederfindung (%)

Zeit (min)

0 10 30 60 120 180 300

4 °C 100,00 100,91 103,03 100,30 101,52 101,52 100,61

25 °C 100,00 100,29 99,71 100,57 101,14 99,19 101,71

37 °C 100,00 99,43 101,99 99,72 100,00 100,00 101,14

Tab. 11: Prozentuale Wiederfindung von Sildenafil in Falcon Tubes bei verschiedenen

Temperaturen, bezogen auf die sofort nach Zugabe ins Gefäß gemessene

Sildenafilkonzentration

- 66 -


3 EIGENE UNTERSUCHUNGEN - 3.2 ERGEBNISSE

Der Wirkstoff konnte über den untersuchten Zeitraum von fünf Stunden sowohl in den

Eppendorf-Reaktionsgefäßen, als auch in den Falcon Tubes sehr gut reproduzierbar

nachgewiesen werden. Die Gefäße waren somit gut zur Aufbewahrung sildenafilhaltiger

Lösungen geeignet.

3.2.3.3 Sildenafil in Glasgefäßen mit Schläuchen

Die Wiederfindung von Sildenafil wurde nach Inkubation von Schläuchen aus den

Materialien Teflon, Polyurethan, Polytetrafluorethylen (PTFE) und C-FLEX ® getestet. Um

nicht aus jedem getesteten Schlauchmaterial ein System bauen zu müssen, wurden Proben der

verschiedenen Schläuche in Glasgefäßen mit Sildenafillösung inkubiert. Als Kontrolle diente

ein mit Sildenafillösung gefülltes Glas ohne Schlauch. Die Versuche wurden für jedes

Schlauchmaterial drei mal durchgeführt (V 1 bis V 3). Die vor Schlauchzugabe in den

Glasgefäßen gemessenen Sildenafilgehalte der gepufferten Elektrolytlösung, die rechnerisch

200 ng/ml betragen sollten, sind Tab. 12 zu entnehmen.

Sildenafil-

konzentration (ng/ml)

Kontrolle Teflon Polyurethan PTFE C-

- 67 -

FLEX®

V 1 180 177 187 176 181

V 2 163 155 162 163 168

V 3 195 197 201 193 198

Tab. 12: Sildenafilkonzentrationen der gepufferten Elektrolytlösung vor Schlauchzugabe

Die prozentuale Wiederfindung dieser Sildenafilkonzentrationen nach Zugabe von

Schlauchstücken aus unterschiedlichen Materialien während Inkubation bei 37 °C zeigt Tab.

13:

t

Teflon (%) Polyurethan (%) PTFE (%) C-FLEX ® (%)

(min) V 1 V 2 V 3 V 1 V 2 V 3 V 1 V 2 V 3 V 1 V 2 V 3

0 100,0 102,6 99,5 96,2 101,9 99,5 99,4 101,8 100,5 104,4 98,8 99,5

60 100,6 102,6 100,0 97,3 89,5 70,1 100,0 103,1 101,6 125,4 100,0 100,0

180 101,1 103,9 100,0 94,7 67,3 61,2 101,7 102,5 102,1 123,8 98,2 99,0

300 101,7 103,9 100,0 92,5 58,6 45,8 101,1 103,1 102,1 127,6 98,2 99,0

Tab. 13: Prozentuale Wiederfindung von Sildenafil bei Inkubation von Schlauchstücken aus

unterschiedlichen Materialien in Sildenafillösungen. Die prozentuale Wiederfindung bezieht

sich auf die vor Schlauchzugabe im jeweiligen Gefäß gemessene Sildenafilkonzentration.


3 EIGENE UNTERSUCHUNGEN - 3.2 ERGEBNISSE

Bei dem Kontrollansatz ohne Schlauch lag die Wiederfindung bei drei Versuchen nach 300

Minuten im Mittel bei 100,6 ± 1,5 %. Die Glasgefäße selbst verursachten also keinen

Sildenafilverlust.

In dem Versuchsansatz mit Teflon wurden bei allen drei Versuchen zu allen Zeitpunkten etwa

100 % des eingesetzten Sildenafils wiedergefunden. Am Ende des Versuchs nach 300

Minuten betrug die Wiederfindung im Mittel 101,9 ± 1,94 %.

Auch nach Inkubation von PTFE-Schlauchstücken in der Sildenafillösung konnten bei allen

drei Versuchen bei allen untersuchten Proben ca. 100 % des eingesetzten Sildenafils

wiedergefunden werden. Bei Versuchsende nach fünf Stunden lag die Wiederfindung im

Mittel bei 102,1 ± 1 %.

Mit Polyurethan konnte beim ersten Versuch eine relativ geringe Abnahme über die Zeit auf

92,5 % nach fünf Stunden beobachtet werden. Bei den beiden Folgeversuchen war der Verlust

deutlicher. Dabei konnten nach 300 Minuten nur noch 58,6 % bzw. 45,8 % des eingesetzten

Sildenafils nachgewiesen werden (s. Abb. 14).

Sildenafilwiederfindung mit

Polyurethan (%)

100

80

60

40

20

0

0 30 60 90 120 150 180 210 240 270 300

Zeit (min)

- 68 -

V1 V2 V3

Abb. 14: Prozentuale Wiederfindung von Sildenafil bei Inkubation von Schlauchstücken aus

Polyurethan in Sildenafillösung


3 EIGENE UNTERSUCHUNGEN - 3.2 ERGEBNISSE

In dem mit C-FLEX ® -Schlauch bestückten Ansatz lag die Wiederfindung beim ersten

Versuch nach 60 Minuten bei 125,4 %, nach 300 Minuten war diese weiter angestiegen auf

127,6 % (s. Abb. 15). Bei den beiden Folgeversuchen wurden über die gesamte

Versuchsdauer 98-100 % des eingesetzten Sildenafils wiedergefunden. Nach fünf Stunden lag

die Wiederfindung bei diesen beiden Versuchen im Mittel bei 98,6 ± 0,5 %.

Sildenafilwiederfindung mit C-

Flex (%)

140

120

100

80

60

40

20

0

0 30 60 90 120 150 180 210 240 270 300

Zeit (min)

- 69 -

V1 V2 V3

Abb. 15: Prozentuale Wiederfindung von Sildenafil bei Inkubation von Schlauchstücken aus

C-FLEX ® in Sildenafillösung.

Der Schlauch aus Polyurethan war aufgrund der schlechten Sildenafilwiederfindung nicht für

den Einsatz im Modellsystem geeignet. In Anwesenheit von Teflon- und PTFE-Schläuchen

war Sildenafil zwar ohne Verluste nachweisbar, die Materialien waren aber nicht flexibel

genug, um daraus ein System für die Versuche an der isolierten Kaninchenlunge bauen zu

können. Der C-FLEX ® -Schlauch war zwar, von den Auffälligkeiten beim ersten Versuch

abgesehen, aufgrund der Wiederfindung und der flexibilität gut geeignet, er war aber trüb,

was einen Einsatz im System ebenfalls ausschloss. Mit dem Clear C-FLEX ® Schlauch stand

eine transparente Alternative zu Verfügung, die daher in den folgenden Versuchen weiter

getestet wurde.


3.2.3.4 Clear C-FLEX ® System

3 EIGENE UNTERSUCHUNGEN - 3.2 ERGEBNISSE

Da davon ausgegangen wurde, dass mit dem Clear C-FLEX ® Schlauch die gleiche

Wiederfindungsrate wie mit dem undurchsichtigen C-FLEX ® -Schlauch erzielt werden konnte,

wurde auf Wiederfindungsversuche mit Stücken dieses transparenten Schlauches verzichtet.

Es wurde gleich ein System mit Clear C-FLEX ® gebaut, wie es für die Lungenversuche

benötigt wurde. Die Wiederfindung wurde anschließend mit in diesem System zirkulierender

Sildenafillösung untersucht.

Vor Befüllen des Schlauchsystems mit den Sildenafillösungen (Zeitpunkt -2 Minuten), die auf

eine errechnete Sildenafilkonzentration von 200 ng/ml verdünnt worden waren, wurde in den

Lösungen mit der Sildenafil Base von AK Scientific bei vier Versuchen im Mittel ein

Sildenafilgehalt von 220,8 ± 13,6 ng/ml gemessen, in den Lösungen mit der Sildenafil Base

von bioKEMIX waren es bei sechs Versuchen 217,8 ± 20,5 ng/ml.

Die prozentuale Wiederfindung dieser Sildenafilkonzentrationen in den im System

rezirkulierenden Lösungen zu definierten Zeitpunkten zeigt Tab. 14.

Wiederfindung (%)

Sildenafil AK Scientific (n=4)

Sildenafil bioKEMIX (n=6)

Zeit (min) -2 0 60 180 300

100,0

100,0

- 70 -

99,8 ± 0,9

98,2 ± 4,0

99,6 ± 0,7

98,2 ± 3,9

100,2 ± 0,8

99,6 ± 3,1

99,5 ± 0,7

99,3 ± 3,9

Tab. 14: Prozentuale Wiederfindung (MW ± SD) von Sildenafil bei Zirkulation der

Sildenafillösungen in einem Schlauchsystem aus Clear C-FLEX ® Schlauch. t = -2 min:

Sildenafilkonzentration in der Lösung vor Befüllen des Schlauchsystems

Es konnten von beiden Substanzen über die gesamte Versuchsdauer von fünf Stunden

annähernd 100 % der eingesetzten Sildenafilkonzentration wiedergefunden werden. Das aus

Clear C-FLEX ® Schlauch gebaute System war somit geeignet für die Versuche zur

Untersuchung der Übertrittskinetiken von pulmonal appliziertem Sildenafil aus der Lunge in

das Perfusat.


3 EIGENE UNTERSUCHUNGEN - 3.2 ERGEBNISSE

3.2.4 Liposomen mit Sildenafil

Bei den Versuchen zur liposomalen Verkapselung des Fluoreszenzfarbstoffs R6G hat sich

gezeigt, dass die Methode, den Farbstoff zusammen mit den Lipiden in den Glaskolben

einzuwiegen und im organischen Lösungsmittel zu lösen (Methode C) am besten geeignet ist,

das lipophile R6G in Liposomen zu verkapseln. Im Vergleich zu den anderen Methoden war

die Verkapselungseffizienz (VE) bei Methode C höher und vor allem besser reproduzierbar,

wohingegen die VE bei den anderen Methoden deutliche Schwankungen zwischen

verschiedenen Chargen zeigte. Da sich die nach Methode C hergestellten R6G-Liposomen

zudem weitgehend intakt und vollständig vernebeln ließen, wurde das direkte Einwiegen des

Wirkstoffs mit den Lipiden gewählt, um Liposomen mit Sildenafil herzustellen.

Es wurden fünf Chargen der mit Sildenafil beladenen Liposomen hergestellt und

charakterisiert. Außerdem wurde die Verneblerleistung des Düsenverneblers Pari LC Sprint ®

Star und des MicroSprayers ® bei Verneblung der Liposomen im Vergleich zur Verneblung

von Aqua dest. und NaCl untersucht. Eine Verneblung der Liposomen mit dem Aeroneb ®

Solo war nicht möglich (s. Kapitel 4.1.5).

3.2.4.1 Charakterisierung der Liposomen nach Herstellung und Verneblung

Die Ergebnisse der Charakterisierung der Liposomen nach Herstellung, nach Verneblung mit

dem MicroSprayer ® und dem Pari LC Sprint ® Star sowie im aus dem Pari LC Sprint ® Star

entnommenen Rückstand sind in Tab. 15 dargestellt.

Gesamt-Sildenafil

(mg/ml)

Verkapseltes

Sildenafil (mg/ml)

VMD (µm)

[GSD]

nach Herstellung nach MicroSprayer ® Pari ®

1,08 ± 0,05 1,07 ± 0,03

1,05 ± 0,06

3,08 ± 0,79

[1,84 ± 0,19]

- 71 -

(n.s.)

1,05 ± 0,03

(n.s.)

3,07 ± 0,85

(n.s.)

[1,96 ± 0,47]

Aerosol

1,15 ± 0,08

(n.s.)

1,13 ± 0,08

(n.s.)

2,54 ± 0,32

(n.s.)

[1,68 ± 0,12]

Pari ®

Rückstand

1,36 ± 0,17

(p = 0,008)

1,34 ± 0,17

(p = 0,008)

2,94 ± 0,95

(n.s.)

[1,83 ± 0,17]

Tab. 15: Charakterisierung der mit Sildenafil beladenen Liposomen (MW ± SD, n=5). VMD:

medianer Volumendurchmesser; GSD: geometrische Standardabweichung. Die p-Werte im

Vergleich zu den Daten nach Herstellung sind in runden Klammern angegeben.


3.2.4.1.1 Verkapselungseffizienz

3 EIGENE UNTERSUCHUNGEN - 3.2 ERGEBNISSE

Nach der Herstellung hatten die Liposomen zwischen 0,96 und 1,1 mg/ml Sildenafil

verkapselt. Somit lag die Verkapselungseffizienz (VE) der fünf Chargen im Mittel bei 105,3 ±

5,6 % der zur Herstellung eingesetzten Wirkstoffmenge von 1 mg/ml.

3.2.4.1.2 Wiederfindung nach Verneblung

Bezogen auf die Gesamt-Sildenafilkonzentrationen in den jeweiligen Suspensionen lag die

Wiederfindung nach der Verneblung mit dem MicroSprayer ® bei fünf Versuchen im Mittel

bei 99,4 ± 3,3 %. Im bei Verneblung der Liposomen mit dem Pari LC Sprint ® Star

aufgefangenen Aerosol war die Sildenafilkonzentration mit 107,2 ± 7,5 % der zur Verneblung

eingesetzten Konzentration zwar etwas höher, der Unterschied zu der nach Herstellung

gemessenen Sildenafilkonzentration war aber statistisch nicht signifikant. Wie in Abb. 16

deutlich zu erkennen ist, lag die Sildenafilkonzentration in der Liposomensuspension, die aus

dem Rückstand des Pari LC Sprint ® Star entnommen wurde, mit 127,1 ± 23,3 % signifikant

über der nach Herstellung gemessenen Konzentration (p = 0,008).

3.2.4.1.3 Verkapselungsrate

Die Verkapselungsrate (VR) der Sildenafil-Liposomen lag bei den fünf Chargen direkt nach

der Herstellung im Mittel bei 97,7 ± 0,5 %. Somit lag ein Großteil des in der

Liposomensuspension enthaltenen Sildenafils in liposomal verkapselter Form und nur ein

geringer Teil von < 3 % als freies Sildenafil vor. Nach Verneblung der Liposomen mit dem

MicroSprayer ® und dem Pari LC Sprint ® Star waren die Verkapselungsraten der Vesikel in

den aufgefangenen Aerosolen unverändert im Vergleich zur vor der Verneblung gemessenen

VR. Die VR der aus dem Rückstand des Pari LC Sprint ® Star entnommenen

Liposomensuspension lag mit 98,4 ± 0,2 % signifikant höher (p = 0,008) (s. Abb. 16).

- 72 -


Sildenafil (mg/ml)

1,6

1,4

1,2

1,0

0,8

0,6

0,4

0,2

0,0

3 EIGENE UNTERSUCHUNGEN - 3.2 ERGEBNISSE

Gesamtsildenafil

Verkapseltes Sildenafil

n.s n.s.

nach Herstellung n. Microsprayer n. Pari Pari Rückstand

- 73 -

n.s. n.s.

Abb. 16: Sildenafilkonzentrationen (MW + SD, n=5) der Liposomensuspensionen vor und

nach Verneblung mit dem MicroSprayer ® bzw. dem Pari LC Sprint ® Star. * p < 0,05 im

Vergleich zu den nach Herstellung gemessenen Werten; n.s. = nicht signifikant

Aus Abb. 16 wird deutlich, dass es durch die Verneblung der Liposomen mit dem

Düsenvernebler zu einer Aufkonzentrierung des Wirkstoffs im Verneblerrückstand kam. Die

Verneblung der Vesikel führte aber bei keinem der beiden untersuchten Vernebler zu einer

Freisetzung des verkapselten Wirkstoffs aus den Liposomen.

3.2.4.1.4 Medianer Volumendurchmesser

Nach der Herstellung betrug der mediane Volumendurchmesser (VMD) der Liposomen bei

den fünf Chargen im Mittel 3,08 ± 0,79 µm. Weder die Verneblung mit dem MicroSprayer ® ,

noch mit dem Pari LC Sprint ® Star bewirkten eine statistisch signifikante Änderung des

VMD der Vesikel.

*

*


3 EIGENE UNTERSUCHUNGEN - 3.2 ERGEBNISSE

3.2.4.2 Eigenschaften von MicroSprayer ® und Pari LC Sprint ® Star bei Verneblung

der Sildenafil-Liposomen im Vergleich zu Aqua dest./ aCl

MMAD (µm)

[GSD]

MicroSprayer ® Pari LC Sprint ® Star

Aqua dest.

(n=4)

20,14 ± 3,54

[1,91 ± 0,08]

Liposomen

- 74 -

(n=5)

n.d.

n.d.

aCl

(n=4)

3,92 ± 0,04

[1,92 ± 0,02]

Liposomen

(n=5)

3,53 ± 0,32

[1,98 ± 0,1]

Output (ml) 0,87 ± 0,007 0,9 ± 0,003 1,21 ± 0,02 1,15 ± 0,06

Tab. 16: Verneblereigenschaften (MW ± SD) von MicroSprayer ® und Pari LC Sprint ® Star.

MMAD: medianer aerodynamischer Massendurchmesser; GSD: geometrische

Standardabweichung

3.2.4.2.1 Aerosolpartikelgrößen Pari LC Sprint ® Star

Bei fünf Verneblungen der Sildenafil-Liposomen mit dem Pari LC Sprint ® Star wurde bei der

laserdiffraktometrischen Partikelgrößenmessung des Aerosols ein medianer aerodynamischer

Massendurchmesser (MMAD) von 3,53 ± 0,32 µm gemessen. Die Aerosolpartikel waren

somit signifikant kleiner als die bei vier Verneblungen von NaCl generierten Aerosolpartikel,

bei denen ein MMAD von 3,92 ± 0,04 µm gemessen worden war (p = 0,016).

3.2.4.2.2 Output von MicroSprayer ® und Pari LC Sprint ® Star

Der für den MicroSprayer ® in Tab. 16 angegebene Output berechnet sich aus der Differenz

zwischen dem gravimetrisch bestimmten Output aus der Spritze und dem nach der

Verneblung in der Sonde verbleibenden Residuum. Die Ergebnisse aus fünf

Liposomenverneblungen und vier Verneblungen von Aqua dest. sind in Tab. 17 dargestellt

Output Spritze (ml) Residuum Sonde (ml) Output (ml)

Aqua dest. (n=4) 0,96 ± 0,00 0,09 ± 0,01 0,87 ± 0,01

Liposomen (n=5) 0,96 ± 0,02 0,06 ± 0,01 0,90 ± 0,03

Tab. 17: Bestimmung des Outputs (MW ± SD) aus dem MicroSprayer ® bei der

Verneblung von Aqua dest. und Liposomen


3 EIGENE UNTERSUCHUNGEN - 3.2 ERGEBNISSE

Der bei fünf Verneblungen von Liposomen berechnete Output von 0,90 ± 0,03 ml

unterscheidet sich nicht signifikant von dem bei vier Verneblungen von Aqua dest.

errechneten Output (0,87 ± 0,01 ml).

Bei der Verneblung mit dem Pari LC Sprint ® Star konnte ebenfalls kein statistisch

signifikanter Unterschied zwischen dem Output von Liposomen und von NaCl festgestellt

werden. Somit ergab sich auch bei dem auf eine Verneblungsdauer von 15 Minuten

bezogenen Output, der für die Liposomen bei 0,077 ± 0,004 Milliliter pro Minute und für

NaCl bei 0,081 ± 0,002 Milliliter pro Minute lag, kein statistisch signifikanter Unterschied.

Zusammenfassend kann gesagt werden, dass die Sildenafil-Liposomen neben sehr hohen

Verkapselungseffizienzen und Verkapselungsraten eine gute Stabilität bei der Verneblung mit

dem MicroSprayer ® und dem Pari LC Sprint ® Star zeigten. Da sich VR und VMD auch durch

die Verneblung nicht signifikant änderten, kann angenommen werden, dass die Vesikel die

Vernebler intakt verlassen. Der Output der Vernebler, der sich bei Verneblung der Liposomen

nicht signifikant von dem bei Verneblung von Aqua dest. bzw. NaCl gemessenen Output

unterscheidet, zeigt, dass die Vesikel nahezu vollständig und effizient vernebelt werden

können.

- 75 -


3 EIGENE UNTERSUCHUNGEN - 3.2 ERGEBNISSE

3.2.4.3 Freisetzung aus den Sildenafil-Liposomen in vitro

Um die Sildenafil-Freisetzung aus den Liposomen in vitro zu untersuchen, wurden je 0,6 ml

der Liposomensuspension in 14,4 ml vierprozentiger Albumin-Lösung verdünnt und über fünf

Stunden bei 37 °C inkubiert. Dies wurde mit jeder der vier Liposomenchargen je einmal

durchgeführt.

3.2.4.3.1 Kontrolle Gesamtgehalt

Um die prozentuale Freisetzung des Wirkstoffs aus den Liposomen in den in vitro Versuchen

über die Zeit berechnen zu können, musste zuvor der in den Versuchen enthaltene

Gesamtsildenafilgehalt bestimmt werden. Die Gesamtsildenafilgehalte im Versuch wurden

nach 0, 150 und 300 Minuten gemessen und für jeden Versuch gemittelt (s. Tab. 18).

t (min) Charge 1 Charge 2 Charge 3 Charge 4 MW ± SD

0 n.d. 39,4 38,4 40,4 39,4 ± 1,0

150 38,6 39,5 41,8 40,1 40,0 ± 1,3

300 41,7 37,9 38,0 38,3 39,0 ± 1,8

MW ± SD 40,2 ± 2,2 38,9 ± 0,9 39,4 ± 2,1 39,6 ± 1,2

Tab. 18: Gesamtsildenafilgehalte (µg/ml) in den in vitro Freisetzungsversuchen

Über die Zeit betrachtet, blieben die Sildenafilgehalte in den Versuchen konstant. Sie lagen

für die vier Versuche zu Versuchsbeginn bei 39,4 µg/ml, nach 150 Minuten bei 40,0 µg/ml

und zum Versuchsende nach 300 Minuten bei 39,0 µg/ml. Somit konnte gezeigt werden, dass

während der Versuche kein Sildenafilverlust auftrat. Dies war Voraussetzung für die

Berechnung der prozentualen Freisetzung des Wirkstoffs aus den Liposomen über die Zeit.

- 76 -


3 EIGENE UNTERSUCHUNGEN - 3.2 ERGEBNISSE

3.2.4.3.2 Kinetik der Sildenafilfreisetzung aus den Liposomen

Um das freigesetzte Sildenafil in den in vitro Versuchen bestimmen zu können, wurden die

entnommenen Proben zentrifugiert, um die in den Proben enthaltenen Liposomen

abzutrennen. Das freie Sildenafil wurde anschließend im Überstand bestimmt. Die in diesen

Proben gemessenen Sildenafil-Konzentrationen wurden zur Berechnung der prozentualen

Sildenafil-Freisetzung auf den mittleren, im jeweiligen Versuch gemessenen Gesamt-

Sildenafilgehalt (s. Tab. 18) bezogen. Wie in Abb. 17 zu sehen ist, lagen bei den vier

Versuchen im Mittel zu Versuchsbeginn bereits 28,2 ± 3,7 % des gesamt enthaltenen

Sildenafils frei vor. Im weiteren Versuchsverlauf stieg die Konzentration an freiem Sildenafil

kontinuierlich an, bis nach 270 Minuten ein Plateau bei 62,5 ± 6,2 % erreicht wurde. Am

Ende des Versuches nach fünf Stunden lag die Freisetzung bei 62,1 ± 8 %.

freigesetztes Sildenafil (%)

100

90

80

70

60

50

40

30

20

10

0

0 30 60 90 120 150 180 210 240 270 300

Zeit (min)

Abb. 17.: In vitro aus den Liposomen freigesetztes Sildenafil in Prozent (MW ± SD, n=4; +

bei 150 min n=3), bezogen auf den gemessenen mittleren Gesamt-Sildenafilgehalt im

jeweiligen Versuch

+

- 77 -


3 EIGENE UNTERSUCHUNGEN - 3.2 ERGEBNISSE

3.2.4.4 Substanzübertritt von freiem und liposomal verkapseltem Sildenafil am Modell

der isolierten Kaninchenlunge

Durch die verzögerte Wirkstofffreisetzung aus den Liposomen in vitro war die Voraussetzung

für den Einsatz der Liposomen als Retardformulierung erfüllt, sodass diese am Modell der

isolierten Kaninchenlunge getestet wurden.

3.2.4.4.1 Deposition von Sildenafil in der Lunge nach MicroSprayer ® -Verneblung

Die Sildenafillösungen bzw. die mit Sildenafil beladenen Liposomen wurden während der

Inspiration mit dem MicroSprayer ® in die isolierte Kaninchenlunge vernebelt. Der Output aus

der Spritze des Verneblers wurde gravimetrisch bestimmt. Davon wurde das zuvor bei der

Verneblung von Aqua dest. bzw. Liposomen ermittelte, in der Sonde verbliebene Residuum

abgezogen.

3.2.4.4.1.1 Freies Sildenafil

Bei den vier Verneblungen von freiem Sildenafil mit dem MicroSprayer ® in die

Kaninchenlungen lag der Output aus der MicroSprayer ® -Spritze im Mittel bei 0,95 ± 0,01 ml.

Nach Abzug des vorab bei der Verneblercharakterisierung mit Aqua dest. ermittelten

Residuums in der Sonde, das 0,09 ± 0,01 ml betrug (s. Kapitel 3.2.1.2) ergab sich ein in der

Lunge deponierter Output von 0,86 ± 0,01 ml. Die Sildenafil-Konzentration der vernebelten

Lösungen betrugen im Mittel 1,1 ± 0,03 mg/ml. Somit wurden bei den Versuchen mit freiem

Sildenafil im Mittel 0,95 ± 0,02 mg Sildenafil in der Lunge deponiert.

3.2.4.4.1.2 Liposomal verkapseltes Sildenafil

Bei den vier Verneblungen der Sildenafil-Liposomen verließen im Mittel 0,97 ± 0,01 ml die

MicroSprayer ® -Spritze. Hier wurde als Residuum in der Sonde der bei der Charakterisierung

der Verneblereigenschaften bei Verneblung der Liposomen ermittelte Wert von 0,06 ± 0,01

ml zugrunde gelegt (s. Kapitel 3.2.4.2.2). Der errechnete, bei der Verneblung der Liposomen

in der Lunge deponierte Output lag somit bei 0,91 ± 0,01 ml. Die Gesamt-

Sildenafilkonzentration der vernebelten Liposomensuspensionen lag im Mittel bei 1,1 ± 0,02

mg/ml. Daraus ergibt sich eine in der Lunge deponierte Sildenafilmenge von 1,0 ± 0,02 mg.

- 78 -


3 EIGENE UNTERSUCHUNGEN - 3.2 ERGEBNISSE

3.2.4.4.2 Übertrittskinetiken von Sildenafil ins Perfusat

Die nach der Verneblung in den Perfusatproben gemessenen, mit der Korrekturformel

korrigierten Sildenafilkonzentrationen der je vier Versuche (V 1 bis V 4) mit freiem und

liposomal verkapseltem Sildenafil sind in Tab. 19 und Tab. 20 dargestellt.

Perfusatkonzentrationen (µg/ml)

t (min) V 1 V 2 V 3 V 4 MW SD

0 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

5 1,12 1,29 1,54 1,02 1,24 0,23

10 1,07 1,48 1,48 1,31 1,33 0,19

20 1,06 1,41 1,38 0,99 1,21 0,21

30 1,07 1,30 1,32 1,08 1,19 0,14

60 1,05 1,23 1,45 0,92 1,16 0,23

90 1,12 1,22 1,40 0,90 1,16 0,21

120 1,02 1,23 1,50 0,92 1,17 0,26

150 1,05 1,22 1,48 0,91 1,16 0,25

180 1,06 1,22 1,50 0,91 1,17 0,25

210 1,03 1,19 1,52 1,03 1,19 0,23

240 1,00 1,23 1,52 0,96 1,18 0,26

270 1,05 1,30 1,53 0,95 1,20 0,26

300 1,03 1,31 1,50 0,96 1,20 0,25

Tab. 19: Sildenafilkonzentrationen im Perfusat nach Verneblung von freiem Sildenafil in das

Modell der isolierten Kaninchenlunge

Perfusatkonzentrationen (µg/ml)

t (min) V 1 V 2 V 3 V 4 MW SD

0 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

5 1,43 1,03 0,88 1,03 1,09 0,24

10 1,45 0,87 0,75 0,87 0,98 0,31

20 1,43 0,88 0,68 0,88 0,97 0,33

30 1,47 0,99 0,61 1,00 1,02 0,35

60 1,31 1,05 0,74 1,05 1,04 0,23

90 1,29 1,19 0,67 1,19 1,08 0,28

120 1,21 1,21 0,67 1,21 1,07 0,27

150 1,16 1,22 0,67 1,22 1,07 0,27

180 1,18 1,23 0,71 1,23 1,09 0,25

210 1,18 1,30 0,75 1,30 1,13 0,26

240 1,17 1,27 0,76 1,27 1,12 0,25

270 1,09 1,34 0,79 1,34 1,14 0,26

300 1,10 1,29 0,80 1,29 1,12 0,23

Tab. 20: Sildenafilkonzentrationen im Perfusat nach Verneblung von liposomal verkapseltem

Sildenafil in das Modell der isolierten Kaninchenlunge

- 79 -


3 EIGENE UNTERSUCHUNGEN - 3.2 ERGEBNISSE

Da die bei der Veneblung von freiem und liposomal verkapseltem Sildenafil in der Lunge

deponierten Wirkstoffmengen mit 0,95 ± 0,02 mg bzw. 1,0 ± 0,02 mg trotz statistisch

signifikanten (p=0,01) Unterschieds in einer sehr ähnlichen Größenordnung liegen, wurden

die nach Übertritt des Sildenafils ins Perfusat erreichten Perfusatkonzentrationen direkt

miteinander verglichen (s. Abb. 18).

Die Konzentrations-Zeit-Kurve von liposomal verkapseltem Sildenafil liegt zwar insgesamt

etwas unterhalb der Kurve von freiem Sildenafil, die Kinetiken der beiden Kurven sind aber

ähnlich. In beiden Verläufen ist initial ein sehr schneller Anstieg der Sildenafilkonzentration

im Perfusat mit anschließender Plateaubildung zu sehen.

So wird zehn Minuten nach der Verneblung von freiem Sildenafil ein maximaler

Sildenafilgehalt von 1,33 ± 0,19 µg/ml im Perfusat erreicht. Danach fällt die Konzentration

wieder auf 1,16 ± 0,23 µg/ml nach 60 Minuten. Auf diesem Niveau stellt sich ein Plateau ein.

Bei Versuchsende nach fünf Stunden werden 1,20 ± 0,25 µg/ml Sildenafil im Perfusat

gemessen. Die AUC bei den Versuchen mit freiem Sildenafil beträgt 352,27 ± 68,15 (µg/ml)

* min.

Nach der Verneblung von liposomal verkapseltem Sildenafil wird bereits nach fünf Minuten

eine maximale Perfusatkonzentration von 1,09 ± 0,24 µg/ml gemessen. Danach bleibt die

Perfusatkonzentration über fünf Stunden relativ konstant bei ca. 1,0 bis 1,1 µg/ml. Am Ende

des Versuchs liegt sie bei 1,12 ± 0,23 µg/ml. Aus den Perfusatkonzentrationen der Versuche

mit liposomal verkapseltem Sildenafil berechnet sich eine AUC von 321,75 ± 72,19 (µg/ml) *

min. Der Unterschied zu der bei den Versuchen mit freiem Sildenafil errechneten AUC ist

statistisch nicht signifikant.

Gehalt an Sildenafil im

Perfusat (µg/ml)

1,6

1,4

1,2

1,0

0,8

0,6

0,4

0,2

0,0

0 30 60 90 120 150 180 210 240 270 300

Zeit (min)

- 80 -

Freies Sildenafil

Liposomen

Abb. 18: Vergleich der Übertrittskinetiken von freiem und liposomal verkapseltem Sildenafil

(je n=4) am Modell der isolierten Kaninchenlunge nach Verneblung mit dem MicroSprayer ® .

Freies Sildenafil: MW + SD; liposomales Sildenafil: MW – SD


3 EIGENE UNTERSUCHUNGEN - 3.2 ERGEBNISSE

3.2.4.4.3 Wiederfindung des in der Lunge deponierten Sildenafils

Die Verteilung des vernebelten Sildenafils in den unterschiedlichen Kompartimenten des

Modellsystems ist in Tab. 21 dargestellt

Freies Sildenafil Liposomen

µg % µg %

Deponiert 950,1 ± 18,3 100 % 999,4 ± 19,2 100 %

Perfusat 322,1 ± 78,3 33,8 ± 7,6 286,3 ± 64,8 28,6 ± 6,2

Lavage 91,1 ± 9,3 9,6 ± 0,8 85,4 ± 11,8 8,5 ± 1,1

Methanol-Lavage 118,2 ± 30,6 12,5 ± 3,4 101,3 ± 30,0 10,2 ± 3,1

Proben 17,9 ± 3,2 1,9 ± 0,3 15,3 ± 3,4 1,5 ± 0,3

Gesamt 549,3 ± 63,8 57,7 ± 5,6 488,2 ± 58,0 48,8 ± 5,3

Tab. 21: Verteilung des Sildenafils im Modell der isolierten Kaninchenlunge nach

Verneblung von freiem bzw. liposomal verkapseltem Sildenafil (MW ± SD, jeweils n=4)

Sowohl nach der Verneblung von freiem als auch von liposomal verkapseltem Sildenafil war

das Perfusat das Kompartiment mit der höchsten Wiederfindung (33,8 ± 7,6 bzw. 28,6 ± 6,2

% der jeweils deponierten Sildenafilmenge). Nachdem sich in den Lavagen in beiden Fällen

knapp 10 % des deponierten Sildenafils befanden, enthielten die danach gewonnenen

Methanol-Lavagen nochmals gut 10 %. In den Proben befand sich aufgrund des geringen

Volumens mit 1,5 – 2 % nur sehr wenig Sildenafil. Nach der Verneblung von freiem

Sildenafil konnten so ca. 42 % des Wirkstoffs nicht wiedergefunden werden, während es bei

den Versuchen mit den Sildenafil-Liposomen ca. 51 % waren. Dieser Unterschied ist aber,

ebenso wie die Unterschiede in den einzelnen Kompartimenten, statistisch nicht signifikant.

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4 DISKUSSION

4 DISKUSSION

4.1 KRITISCHE BETRACHTUNG DER METHODEN

4.1.1 Verwendung von DPPC und Cholesterol zur Herstellung der Liposomen

Bei einer Retardformulierung sollen verkapselte Wirkstoffe nicht schon während oder sofort

nach der Verabreichung freigesetzt werden. Bei der Verneblung von Liposomen und der

späteren Freisetzung der in ihnen enthaltenen Substanzen haben die Lipidzusammensetzung

(Ladung und Kettenlänge der Lipide) sowie der Cholesterolgehalt der Liposomen einen

starken Einfluss auf den Grad und den Zeitverlauf der Freisetzung verkapselter Wirkstoffe

(Abra et al. 1990; Niven und Schreier 1990; Fielding und Abra 1992).

Phospholipide erfahren bei einer für jedes Phospholipid charakteristischen Temperatur einen

Phasenübergang von der Gelphase in die flüssig-kristalline Phase (Kulkarni et al. 1995).

Diese Phasenübergangstemperatur (Tm) steigt mit zunehmender Fettsäurekettenlänge der

Lipide (Ulrich 2002). Die Tm der Lipide wiederum bestimmt die Stabilität der aus den Lipiden

hergestellten Liposomen in vitro und in vivo. Ein weites Spektrum von prinzipiell

verwendbaren Phospholipiden mit einer Reihe von Phasenübergangstemperaturen bietet,

alleine oder in Kombination mit Sterolen, eine hohe Variabilität der Membranfluidität. Die

Permeabilität der liposomalen Membran gegenüber verkapselten Substanzen, ihre Stabilität

sowie ihr Verhalten in vivo können über die Auswahl der Phospholipide bzw. Sterole

kontrolliert werden (Gregoriadis 1991; Anderson und Omri 2004). Bei Temperaturen

unterhalb der Tm liegen Vesikel in der stabilen Gelphase vor, wohingegen sie oberhalb dieser

Temperatur in den flüssigen Zustand übergehen (Kulkarni et al. 1995). Deshalb nimmt die

Barrierefunktion einer Lipidmembran in der Nähe der Tm schnell ab. Die Gel-artigen

Strukturen von Phospholipiden mit Phasenübergangstemperaturen oberhalb der

Körpertemperatur sind daher stabiler als solche mit kurzen oder ungesättigten Fettsäureketten

und daher niedriger Tm. Die Tm vom auch in den eigenen Untersuchungen verwendeten DPPC

liegt mit 41 – 42 °C (Lasic 1998; Ulrich 2002; Kleemann et al. 2007) über der

physiologischen Körpertemperatur. Zudem sind Liposomen aus DPPC stabiler gegenüber der

Verneblung als Vesikel aus Lipiden mit niedrigeren Phasenübergangstemperaturen (Bridges

und Taylor 1998). Allerdings kann es durch die Inkorporation von Cholesterol oder die

Verkapselung von Wirkstoffen in die Liposomen zu Veränderungen der Tm kommen (Tomita

et al. 1989; Darwis und Kellaway 2001; Jutila et al. 2001; Kleemann et al. 2007; Deniz et al.

2010). Da es sich bei dem in der eigenen Arbeit verwendeten Farbstoff Rhodamin 6G und

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4 DISKUSSION

dem Wirkstoff Sildenafil um lipophile Substanzen handelt, kann man davon ausgehen, dass

diese sich nach der Verkapselung in Liposomen bevorzugt in der Lipidmembran der Vesikel

befinden (Khan et al. 2008). Durch diese Inkorporation ist auch eine Veränderung der Tm sehr

wahrscheinlich. Diese wurde in der vorliegenden Arbeit nicht untersucht. Bei der

interessierenden Verneblungsstabilität und dem Verhalten der Vesikel im Modell der

isolierten Kaninchenlunge handelt es sich um komplexe Prozesse, die von mehreren Faktoren

abhängig sind. Einen wesentlichen Faktor stellt die Art des verwendeten Verneblers dar,

sodass das Verhalten der Liposomen auch mit Kenntnis der genauen Tm nicht hätte

vorhergesagt werden können.

Eine Stabilisierung der Membran wird durch eine Inkorporation von Cholesterol (CH)

erreicht. Wie in Kapitel 3.1.1.2 beschrieben, handelt es sich dabei um ein Sterol, das die

Permeabilität wasserlöslicher Moleküle durch die Liposomenmembran reduziert (Demel und

de Kruyff 1976; Sharma und Sharma 1997; Barenholz 2001; Kraske und Mountcastle 2001)

und die Stabilität der Membran in Gegenwart biologischer Flüssigkeiten wie Blut oder Plasma

stabilisiert (Gregoriadis und Davis 1979; Kirby et al. 1980; Damen et al. 1981). Cholesterol

kommt auch natürlich in Zellen von Säugetieren vor, wo es das am häufigsten vorkommende

Sterol ist (Demel und de Kruyff 1976). Bei der liposomalen Verkapselung von amphiphilen

oder lipophilen Substanzen kann ein höherer Cholesterolgehalt allerdings zu einer sinkenden

Verkapselungseffizienz führen, da die zu verkapselnde Substanz durch das Cholesterol aus

der Membran verdrängt wird (Moribe et al. 1999; Zhang et al. 2005; Yang et al. 2007; Zaru et

al. 2007; Deniz et al. 2010). Bei der Herstellung von Liposomen zur inhalativen Applikation

muss aber eine ausreichende Membranstabilität sichergestellt werden, da Liposomen durch

den Prozess der Verneblung einer nicht zu vernachlässigenden physikalischen Belastung

ausgesetzt werden und eine vorzeitige Freisetzung des Wirkstoffs bei der Verneblung den

Retardeffekt beeinträchtigen würde. Daher ist bei der Herstellung von Liposomen zur

inhalativen Applikation ein optimaler Cholesterolgehalt von entscheidender Bedeutung

(Leung 1996; Bridges und Taylor 1998; Abu-Dahab et al. 2001; Zaru et al. 2007).

In der eigenen Arbeit wurden Liposomen aus dem Phospholipid DPPC und dem Sterol

Cholesterol (CH) im Verhältnis von 7 : 3 (zur Verkapselung des Fluoreszenzfarbstoffs R6G)

bzw. 8 : 2 (zur Verkapselung des Wirkstoffs Sildenafil) hergestellt. Es konnte bereits gezeigt

werden, dass Liposomen aus DPPC und CH stabil gegenüber der Verneblung sind (Bridges

und Taylor 1998; Kleemann et al. 2007). Weiterhin haben sich Liposomen dieser

Zusammensetzung als geeignet für den Einsatz als Retardformulierung gezeigt, da die

Pharmakokinetik vernebelter Substanzen sowie deren Verweildauer in der Lunge durch ihre

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4 DISKUSSION

Verkapselung in Liposomen aus DPPC und CH sowohl ex vivo am Modell der isolierten

Kaninchenlunge als auch in vivo modifiziert werden konnte. So konnte Rüsch eine verzögerte

Freisetzung des hydrophilen Fluoreszenzfarbstoffs Carboxyfluorescein aus DPPC:CH-

Liposomen (DPPC:CH im Verhältnis 7 : 3) nach Verneblung der Liposomen am Modell der

isolierten, ventilierten und blutfrei perfundierten Kaninchenlunge zeigen (Rüsch 2010).

Taylor et al. konnten durch die Verkapselung von Cromoglycat in Liposomen (DPPC:CH im

Verhältnis 1 : 1) bei gesunden Freiwilligen, die die Substanz inhaliert hatten, eine verlängerte

Verweildauer und veränderte Pharmakokinetik des Wirkstoffs in den Lungen im Vergleich

zum freien Wirkstoff feststellen. Nach der Inhalation des liposomal verkapselten

Cromoglycats konnte der Wirkstoff noch nach 24 und 25 Stunden im Plasma der Probanden

festgestellt werden, während nach der Inhalation von freiem Cromoglycat ein deutlich höherer

anfänglicher Plasmapeak mit einer anschließenden raschen Abnahme der

Wirkstoffkonzentration beobachtet wurde, sodass das Cromoglycat nach 24 und 25 Stunden

nicht mehr im Plasma nachweisbar war (Taylor et al. 1989). Mit Liposomen aus DPPC und

CH, die mit 99m Tc markiert waren und die von Freiwilligen inhaliert wurden, konnten Weers

et al. nach 24 bzw. 48 Stunden noch 60,4 bzw. 38,3 % der ursprünglich deponierten

Radioktivität in der Lunge nachweisen (Weers et al. 2009).

Daher wurde davon ausgegangen, dass durch die selbst hergestellten Liposomen aus DPPC

und CH eine verzögerte Freisetzung des Wirkstoffs Sildenafil erzielt werden kann.

4.1.2 Verwendung von R6G zur Herstellung und Charakterisierung von

Liposomen

Ziel dieser Arbeit war es, eine liposomale Formulierung zu entwickeln, mit der Sildenafil

effizient verkapselt werden kann und die durch die Verneblung möglicht wenig Veränderung

hinsichtlich der Wirkstoffbeladung erfährt. Im Hinblick auf die spätere Verkapselung und

Verneblung von Sildenafil in Liposomen wurde der Fluoreszenzfarbstoff Rhodamin 6G

(R6G) als Modellsubstanz gewählt. Bei R6G handelt es sich um eine Substanz, die, ebenso

wie Sildenafil, lipophil ist (Khan et al. 2008; Lahnstein et al. 2008), aber durch

fluorimetrische Messungen deutlich einfacher nachweisbar ist. Außerdem konnte R6G bereits

erfolgreich in Liposomen verkapselt werden (Moscho et al. 1996; Khan et al. 2008). Da die

bislang verwendeten Liposomen nicht zur Verneblung eingesetzt wurden, sollte in der

eigenen Arbeit zunächst die Vernebelbarkeit der Vesikel untersucht werden.

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4 DISKUSSION

4.1.3 Methoden zur Herstellung der Liposomen mit R6G

In der eigenen Arbeit wurden vier unterschiedliche Methoden ausgewählt, um mit lipophilem

R6G, das als Modellsubstanz für Sildenafil diente, beladene Liposomen herzustellen. Durch

den Vergleich der Charakterisierungsergebnisse der nach diesen Methoden hergestellten

Vesikel sollte ein Verfahren zur optimalen Verkapselung des R6G in Liposomen gefunden

werden. Außerdem sollten die Liposomen bei der späteren Verneblung eine möglichst geringe

Menge des verkapselten Farbstoffes freisetzten.

Eine der gewählten Herstellungsmethoden ist die Filmmethode (in der vorliegenden Arbeit als

„Methode A“ bezeichnet). Dabei handelt es sich um eine etablierte, relativ einfache Methode

zur Herstellung multilamellarer Vesikel (MLV). MLV können aus verschiedenen

Phospholipiden hergestellt werden und eignen sich zur Verkapselung einer Vielzahl von

Substanzen. Ein großer Nachteil der so hergestellten Liposomen ist ihr geringer wässriger

Inhalt, bezogen auf den Lipidanteil, der eine geringe Verkapselungseffizienz hydrophiler

Substanzen bedingt (Szoka und Papahadjopoulos 1980). Wenn schlecht wasserlösliche Farb-

oder Wirkstoffe verkapselt werden sollen, ist bei dieser Methode das Erreichen ausreichender

Stoffkonzentrationen im wässrigen Kompartiment der Liposomen limitiert.

Durch den Einsatz von hydroethanolischen Lösungsmitteln kann die Löslichkeit lipophiler

Farb- oder Wirkstoffe verbessert werden. Daher wurde dieses Verfahren auch in der eigenen

Arbeit zur Verkapselung des lipophilen Farbstoffs R6G angewendet (in der vorliegenden

Arbeit als „Methode B“ bezeichnet). Die so gelösten Substanzen werden im wässrigen

Kompartiment der Vesikel eingeschlossen (López-Pinto et al. 2005). So konnten bereits

Liposomen mit Minoxidil (López-Pinto et al. 2005), Methotrexat (Dubey et al. 2007b) und

Salbutamol (Bendas und Tadros 2007) für die dermale Anwendung erfolgreich hergestellt

werden.

Eine weitere Möglichkeit (in der vorliegenden Arbeit als „Methode C“ bezeichnet) ist die

Zugabe der zu verkapselnden lipophilen Stoffe zu den Lipiden, die dann zusammen in einem

organischen Lösungsmittel gelöst werden (Szoka und Papahadjopoulos 1980). Dadurch sind

die Farb- bzw. Wirkstoffe schon im Lipidfilm enthalten und werden bei der Bildung von

Liposomen in deren Membran integriert (Lasic 1988; Touitou et al. 2001; Ulrich 2002;

López-Pinto et al. 2005; Dubey et al. 2007a; Bhalaria et al. 2009).

Bei der Ethanolinjektions-Methode (in der eigenen Arbeit als „Methode D“ bezeichnet)

schließlich handelt es sich um ein von Touitou et al. entwickeltes Verfahren zur Herstellung

von Ethosomen (Touitou et al. 2000), das inzwischen erfolgreich zur Verkapselung und somit

Verbesserung der dermalen Penetration von sowohl lipophilen als auch hydrophilen

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4 DISKUSSION

Substanzen wie Minoxidil und Testosteron (Touitou et al. 2000), Trihexyphenidyl (Dayan und

Touitou 2000), Fluoreszenzfarbstoffen (Touitou et al. 2001), Ammoniumglycyrrhizinat

(Paolino et al. 2005), Ketotifen (Elsayed et al. 2007), Melatonin (Dubey et al. 2007a) oder

Lamivudin (Jain et al. 2007) eingesetzt werden konnte. Lipophile Substanzen sind dabei

sowohl in den Lipidmembranen der mulitilamellaren Vesikel, als auch im ethanolhaltigen

Inneren zu finden (Touitou et al. 2000).

Die anschließende Extrusion der nach den oben beschriebenen Methoden selbst hergestellten,

mit R6G beladenen Liposomen wurde durchgeführt, um eine Reduktion der Vesikelgröße zu

erreichen. Große Vesikel können zwar effektiver hydrophile Substanzen verkapseln, sind aber

weniger stabil gegenüber der Verneblung. Durch eine Reduktion der Größe durch Extrusion

oder Ultraschall werden die Vesikel stabiler (Taylor et al. 1990; Niven et al. 1991; Taylor und

Newton 1992; Taylor und Elhissi 2006). Der Grund hierfür ist, dass bei der Passage durch den

Vernebler Scherkräfte auf die Liposomen wirken, die dazu führen, dass Liposomen und

Liposomenaggregate zerbrechen, was in einem Verlust der verkapselten Substanz (Bridges

und Taylor 1998) und einer signifikanten Reduktion ihrer mittleren Größe resultiert (Farr et

al. 1985; Taylor et al. 1990; Gilbert et al. 1988). Auf die Größenverteilung von kleinen

Liposomen (0,2 µm) hat die Verneblung hingegen kaum einen Einfluss (Schreier et al. 1993).

4.1.4 Herstellung von Liposomen mit Sildenafil

Durch die Versuche mit R6G hat sich gezeigt, dass die Methode, den Farbstoff zusammen mit

den Lipiden in den Glaskolben einzuwiegen und im organischen Lösungsmittel zu lösen

(„Methode C“), am besten geeignet ist, das lipophile R6G in Liposomen zu verkapseln. Die

mit dieser Methode erzielten Ergebnisse waren gut reproduzierbar, wohingegen die

Verkapselungseffizienzen bei den anderen Methoden deutliche Schwankungen zwischen

verschiedenen Chargen zeigten. Da sich die nach dieser Methode hergestellten R6G-

Liposomen zudem effizient und nahezu intakt vernebeln ließen (s. Kapitel 3.2.2.1.4 und

3.2.2.2.3), wurde diese Methode gewählt, um Liposomen mit Sildenafil herzustellen.

Die mit Sildenafil beladenen Liposomen wurden wie die Liposomen mit R6G aus DPPC und

Cholesterol (CH) im molaren Verhältnis von 7 : 3 hergestellt, die wässrige Phase bestand aus

Phosphatpuffer (PBS, pH 7,4). Bei dem Versuch, die Sildenafil-Liposomen zu extrudieren,

entstand ein so großer Widerstand im Extruder, dass es durch diesen Schritt zu einem

Sildenafilverlust von ca. 50 % kam. Auch bei einem Ansatz, bei dem als wässrige Phase

anstatt PBS Aqua dest. wie bei den R6G-Liposomen gewählt wurde, trat dieses Phänomen

auf. Deniz et al. hatten bereits bei Liposomen aus dem Phospholipid Distearyl

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4 DISKUSSION

Phosphatidylcholin (DSPC), die Celecoxib enthielten, beobachtet, dass die Vesikel sich mit

einem höheren Cholesterolgehalt (molares Verhältnis DSPC zu Cholesterol von 2 : 1) nicht

extrudieren ließen, während sich Liposomen mit weniger oder gar keinem Cholesterol gut

extrudieren ließen (Deniz et al. 2010). Daher wurde der Cholesterol-Gehalt der Sildenafil-

Liposomen zunächst von 30 auf 20 Molprozent reduziert. Aber auch die Liposomen mit

dieser Zusammensetzung konnten nicht extrudiert werden, ebenso wenig wie Liposomen ganz

ohne Cholesterol. Wahrscheinlich kam es, wie in Kapitel 4.2.3.3 ausführlicher diskutiert,

durch die Inkorporation des Sildenafils in die Liposomenmembran oder die Komplexbildung

von Sildenafil an der Oberfläche der Liposomen zu strukturellen Veränderungen der

Membran, die dazu führten, dass diese zu rigide wurde. Eine ausreichende Fluidität der

Lipidmembran, die zur Passage der Poren der Extruder-Membran vonnöten ist, war nicht

mehr gegeben. Es ist bekannt, dass hydrophobe Substanzen durch ihre direkte Interaktion mit

der Liposomenmembran die physikalischen Eigenschaften von Liposomen verändern können,

wenn sie in großen Mengen enthalten sind (Kulkarni et al. 1995). Diese Beobachtung wird

durch Ergebnisse aus mehreren Studien bestätigt, die zeigen konnten, dass bei der

Verkapselung von amphiphilen oder lipophilen Substanzen deren Inkorporation in die

Liposomenmembran einen stabilisierenden Effekt auf die Membran hat (Fatouros und

Antimisiaris 2001, 2002; Mohammed et al. 2004; Bhatia et al. 2004).

Für die eigenen Untersuchungen hatte dies zur Folge, dass im Hinblick auf die

Verneblungsstabilität und das Freisetzungsverhalten der Liposomen bei den weiteren Chargen

ein Cholesterolgehalt von 20 Molprozent beibehalten wurde. Da auf eine Extrusion verzichtet

werden musste, wurden die Liposomen nach der Herstellung mit Ultraschall behandelt. Dies

ist eine alternative Methode zur Größenreduktion (Sharma und Sharma 1997), die außerdem

zu einer vollständigen Ablösung des Lipidfilms vom Glaskolben und somit zu einer

verbesserten Verkapselungseffizienz führte. Allerdings waren die so behandelten Vesikel

noch deutlich größer (VMD 3,08 ± 0,79 µm) und wiesen eine weniger homogene

Größenverteilung auf (GSD 1,84 ± 0,19) als die extrudierten Liposomen mit R6G (VMD 0,61

µm; GSD 1,71) (s. Kapitel 3.2.4.1 und 3.2.2.1.4).

4.1.5 Verneblung der Liposomen mit verschiedenen Verneblern

Bei der Entwicklung einer liposomalen Depotformulierung zur pulmonalen Applikation gibt

es mindestens fünf wichtige Faktoren, die evaluiert werden müssen. Dazu gehören die

Partikelgröße, die Verkapselungseffizienz, die Freisetzungsgeschwindigkeit, die Stabilität und

die Wahl des Verneblers (Zeng et al. 1995). Neben einer effizienten Wirkstoffbeladung, die

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4 DISKUSSION

bei allen Liposomen eine Rolle spielt, müssen Liposomen, die zur inhalativen Therapie

eingesetzt werden sollen, auch eine ausreichende Stabilität gegenüber der Verneblung

aufweisen, da der Prozess der Verneblung einen merklichen Einfluss auf die Retention von

verkapselten Substanzen haben kann. Eine zu schnelle Freisetzung der Wirkstoffe aus den

Liposomen durch die Verneblung kann die Effektivität solch einer Formulierung, ob zur

kontrollierten systemischen Absorption oder zur Verlängerung der lokalen Wirkung

eingesetzt, reduzieren oder gar ganz aufheben. Wenn eine liposomale Formulierung zur

Inhalation als Aerosol verwendet werden soll, sollte also gezeigt werden, dass die

Wirkstofffreisetzung während der Verneblung minimal ist (Niven und Schreier 1990). Vor

allem, wenn amphiphile Substanzen in Liposomen verkapselt und diese dann vernebelt

werden sollen, ist die Verneblungsstabilität solcher Formulierungen nicht leicht

vorherzusagen, da es durch Interaktionen zwischen dem Wirkstoff und

Membrankomponenten der Liposomen zu Veränderungen der Rigidität und Integrität der

Vesikelmembran kommen kann (Zaru et al. 2007). Um eine Beschädigung der Vesikel zu

minimieren, müssen also einige Gesichtspunkte sowohl seitens der Formulierung, als auch

bezüglich des Verneblers beachtet werden (Taylor und Elhissi 2006; Zaru et al. 2007).

Die R6G-Liposomen wurden mit einem Vibrating mesh Vernebler, dem Aeroneb ® Solo,

venebelt. Diese Vernebler bieten einige Vorteile gegenüber Düsen- und Ultraschallverneblern,

die detailliert bei Dhand, 2004 beschrieben werden. So erzeugen sie Aerosole mit einem

ausgeprägten Feinpartikelanteil und sie bringen die Medikamente effizienter in den

Respirationstrakt als konventionelle Düsen- oder Ultraschallvernebler. Außerdem sind sie

tragbar, batteriebetrieben, relativ leise, können sowohl Lösungen als auch Suspensionen

effizient vernebeln und haben ein minimales Residualvolumen. Die Verneblungsdauer ist in

der Regel kürzer als bei konventionellen Verneblern. Einige Modelle sind atem-getriggert,

wodurch die Freisetzung von vernebeltem Wirkstoff in die Umgebung minimiert wird. Da der

Temperaturanstieg der Medikamentenlösung oder –suspension im Vergleich zu

Ultraschallverneblern minimal ist, können auch temperaturempfindliche Wirkstoffe wie

Proteine, Peptide oder Antibiotika vernebelt werden, ohne dass es zur Denaturierung bzw.

Reduktion der Aktivität kommt. Außerdem benötigt der Aeroneb zur Aerosolerzeugung keine

Druckluft. Die Scherspannung ist daher minimal und die Wirkstofffreisetzung durch

Beschädigung von Liposomen gering (Dhand 2004). Dies konnten auch Elhissi et al. zeigen,

die Liposomen mit einem Düsen- und verschiedenen Vibrating mesh Verneblern vernebelten.

Zwar kam es bei allen Verneblern zu einer Beschädigung der Liposomen und einem

signifikanten Verlust des verkapselten Salbutamolsulfats, dies war bei den Vibrating mesh

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4 DISKUSSION

Verneblern aber weniger stark ausgeprägt als bei den Düsenverneblern (Elhissi et al. 2006;

Elhissi et al. 2007). Auch Kleemann et al., die carboxyfluorescein- bzw. iloprosthaltige

Liposomen mit je einem Ultraschall-, Düsen- und Vibrating mesh Vernebler aerosolisierten,

konnten zeigen, dass die Verneblung mit dem Vibrating mesh Vernebler die Liposomen

weniger beschädigte als die beiden anderen Vernebler (Kleemann et al. 2007). Diese neue

Verneblergeneration ist somit gut zur effizienten Verneblung von Liposomen geeignet

(Dhand 2004; Elhissi et al. 2006; Kleemann et al. 2007). Allerdings wird die Leistung von

Vibrating mesh Verneblern stärker von Eigenschaften der zu vernebelnden Formulierung wie

Ionenstärke, Dichte, Oberflächenspannung und Viskosität beeinflusst, als dies bei

Düsenverneblern der Fall ist (Elhissi et al. 2006; Elhissi et al. 2007; Ghazanfari et al. 2007;

Zhang et al. 2007). Außerdem kann es auch bei der Verneblung von Liposomen mit Vibrating

mesh Verneblern, wie auch bei Düsen- und Ultraschallverneblern, zu einer Akkumulation der

Phospholipide im Vernebler kommen (Elhissi et al. 2006; Elhissi et al. 2007).

So bildeten sich bei einem ersten Versuch, die Sildenafil-Liposomen wie die R6G-Liposomen

mit dem Aeroneb ® Solo zu vernebeln, makroskopisch erkennbare Rückstände im Vernebler,

während das aufgefangene Aerosol deutlich klarer war als die eingefüllte

Liposomensuspension. Das aufgefangene Aerosol enthielt nur noch ca. 38 % der eingefüllten

Sildenafilkonzentration, im Verneblerrückstand konnten hingegen 371 % gemessen werden.

Daraus musste geschlossen werden, dass sich die Liposomen mit dem Aeroneb ® Solo nicht

vernebeln ließen. Dies stimmt mit der Beobachtung überein, dass sich die Liposomen kaum

extrudieren ließen, da die Verneblung mit einem Vibrating mesh Vernebler auf dem Prinzip

der Extrusion beruht (Dhand 2004). Durch die Inkorporation des Sildenafils in die

Liposomenmembran oder die Komplexbildung von Sildenafil mit den Lipiden an der

Liposomenoberfläche scheint die Membran der Vesikel so rigide geworden sein, dass die

Vesikel die Poren weder in der Polycarbonat-Membran des Extruders noch im Netz des

Verneblers passieren konnten. Daher wurden die Sildenafil-Liposomen zur Untersuchung der

Verneblungsstabilität mit dem Düsenvernebler Pari LC Sprint ® Star vernebelt.

Bei der Verneblung von Liposomen mit einem Düsenvernebler muss beachtet werden, dass

Scherkräfte vorhanden sind, die eine Beschädigung von Liposomen und ein Zerbrechen von

Liposomenaggregaten bewirken und so zur Freisetzung der verkapselten Substanz führen

können (Taylor et al. 1990; Niven et al. 1991; Taylor und Elhissi 2006). Auch die Impaktion

von Liposomen an den Blenden im Vernebler kann die Vesikel beschädigen und zur

Wirkstofffreisetzung führen (Dhand 2004). Dies ist bei der Verneblung von mit lipophilen

Substanzen beladenen Liposomen aber weniger kritisch, da die Substanzen mit der

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4 DISKUSSION

Lipidmembran assoziiert sind (Taylor et al. 1990; Taylor und Newton 1992; Taylor und Farr

1993). Daher führte die Verneblung der Sildenafil-Liposomen mit dem Düsenvernebler auch

nicht zu einer Freisetzung des Wirkstoffs aus den Vesikeln (s. Kapitel 4.2.3.1).

Der MicroSprayer ® wurde für die intratracheale Aerosolapplikation in die isolierte

Kaninchenlunge eingesetzt. Dadurch kam es innerhalb weniger Sekunden zur Deposition der

gesamten applizierten Sildenafilmenge. Dies erleichterte die Auswertung der Kinetikdaten, da

es bei einer Verneblung des Wirkstoffs zu einer Verzerrung der Ergebnisse durch den mehrere

Minuten andauernden Verneblungsprozess gekommen wäre. Die Applikation mit dem

MicroSprayer ® erfolgte während der Inspiration. Dabei wurde die Atemfrequenz von 30 auf 5

Atemzüge pro Minute reduziert. Durch die verlängerte Inspirationsphase mit herabgesetzter

Flussgeschwindigkeit sollte eine Deposition des Aerosols in den peripheren Lungenbezirken

erleichtert werden (Beck-Broichsitter et al. 2010). Untersuchungen der regionalen Verteilung

von mittels MicroSprayer ® in die Lungen von Rhesusaffen verbrachten Aerosolen bestätigten

eine periphere Lungendeposition von ca. 40 % mit annähernd gleichmäßiger Verteilung

zwischen rechter und linker Lunge. Dabei war diese Methode bezüglich der Lungendeposition

50 – 100 mal effektiver als die Verneblung mit konventionellen Verneblern (Beck et al.

2002). Durch die zuverlässige Applikation, verbunden mit der schnellen, einfachen

Handhabung, eignet sich der MicroSprayer ® gut zur experimentellen Behandlung von Mäusen

(Bivas-Benita et al. 2005) und Ratten (Suarez et al. 2001; Chandenier et al. 2009). Auch

Liposomen wurden schon mithilfe des MicroSprayers ® intratracheal in Ratten (Wijagkanalan

et al. 2008) und Mäuse (Kuronuma et al. 2009) appliziert.

In der Arbeitsgruppe der Verfasserin wurde der MicroSprayer ® bereits erfolgreich zur

Untersuchung von Salbutamol-beladenen Nanopartikeln am Modell der isolierten

Kaninchenlunge eingesetzt (Beck-Broichsitter et al. 2010).

4.1.6 Inhalative Applikation von Sildenafil

Der Phosphodiesterase (PDE)-5-Inhibitor Sildenafil wird zur oralen Behandlung der

pulmonalarteriellen Hypertonie (PAH) des Menschen eingesetzt (Barnett und Machado 2006).

Nach der Einnahme tritt ein maximaler Effekt nach 60 Minuten ein (Ghofrani et al. 2004c).

Die Halbwertszeit beträgt vier Stunden (Buckley et al. 2010). Da die Bioverfügbarkeit von

Sildenafil nach oraler Applikation nur bei ca. 41 % liegt (Nichols et al. 2002; Sheu et al.

2003), könnte durch pulmonale Applikation des Wirkstoffs eine Steigerung der Effizienz

erzielt werden. Außerdem weist Sildenafil zwar eine pulmonale Selektivität auf (Michelakis

2002; Michelakis et al. 2003; Barnett und Machado 2006). Aber Weimann et al. konnten bei

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4 DISKUSSION

Versuchen mit Schafen neben einer Senkung des pulmonalarteriellen Druckes (pulmonary

artery pressure, PAP), dessen Erhöhung zuvor durch ein Thromboxan-Analogon (U46619)

induziert worden war, bei höheren Sildenafildosen auch eine Senkung des systemischen

arteriellen Drucks (systemic artery pressure, SAP) beobachten (Weimann et al. 2000). Durch

die inhalative Verabreichung des PDE 5-Inhibitors sollen diese unerwünschten

Nebenwirkungen reduziert werden. So konnte in einer weiteren Studie ebenfalls bei Schafen

mit U46619-induzierter pulmonaler Hypertonie durch Inhalation von vernebeltem Sildenafil

eine selektive Senkung des PAP erzielt werden, ohne dass es zu systemischen

Nebenwirkungen wie Senkung des SAP, des systemischen Gefäßwiderstandes oder einer

Steigerung des Herzzeitvolumens kam. Außerdem wurden die Plasma-Sildenafilspiegel nach

dieser inhalativen Behandlung mit den von Weimann et al. nach oraler Behandlung

gemessenen Werten verglichen. Während bei oraler Applikation eine Sildenafildosis von 30

mg erforderlich war, um den PAP um 8 mmHg zu senken, wurden für den gleichen Effekt bei

Inhalation nur 25 mg des Wirkstoffs benötigt und nur zwei Drittel der nach enteraler

Applikation gemessenen Plasmakonzentration erreicht. Da nur der Anteil des Sildenafils, der

systemisch absorbiert wird, den systemischen Gefäßtonus beeinflusst, lässt diese

Untersuchung vermuten, dass vernebeltes Sildenafil im Vergleich zur enteralen Anwendung

eine verbesserte pulmonale Selektivität aufweist (Ichinose et al. 2001). Ein weiterer Vorteil ist

der schnelle Wirkungseintritt nach inhalativer Anwendung. Die Vasodilation begann

innerhalb von zwei Minuten nach Beginn der Verneblung. Ein Nachteil ist aber die kurze

Wirkdauer. Der PAP stieg bei den untersuchten Schafen dosisabhängig nach Beendigung der

Inhalation mit einer Halbwertszeit von 4,3 ± 0,7 Minuten (nach Beendigung der Verneblung

von 10 mg Sildenafil) bzw. 6,9 ± 1,2 Minuten (nach Beendigung der Verneblung von 30 mg

Sildenafil) wieder auf den Ausgangswert (Ichinose et al. 2001).

Daher sollte in dieser Arbeit versucht werden, durch die Verkapselung des PDE 5-Inhibitors

in Liposomen eine Retardformulierung mit verlängerter Wirkstofffreisetzung zur pulmonalen

Applikation zu entwickeln.

4.1.7 Das Modell der isolierten, ventilierten, perfundierten Kaninchenlunge

Das Modell der isolierten, perfundierten Lunge (IPL) wird schon seit langem zur

Untersuchung physiologischer, biochemischer und metabolischer Aspekte dieses komplexen

Organs verwendet (Seeger et al. 1994). In den frühen 1970er Jahren wurden dafür zuerst

Kaninchenlungen verwendet. Bald darauf wurde das System weiter entwickelt und verfeinert

- 91 -


4 DISKUSSION

für den Einsatz mit Ratten- und Meerschweinchenlungen modifiziert (Niemeier 1984). Dieses

Modell bietet folgende Vorteile (Seeger et al. 1994; Tronde et al. 2008):

- Die Untersuchungen werden an einem intakten Organ mit physiologischer Anordnung von

Zellen und extrazellulärer Matrix durchgeführt, wobei physiologische

Regulationsmechanismen wie Vasoreaktivität, Ventilations-Perfusions-Verhältnis,

Permeabilitätsbarrieren und Interaktionen zwischen verschiedenen Zelltypen aufrecht

erhalten bleiben, während systemische Absorption, Distribution, Metabolisierung und

Elimination ausgeschlossen werden. Daher konnte in der vorliegenden Arbeit der Übertritt

pulmonal applizierter Substanzen von der Lunge in das Perfusat direkt beobachtet werden.

- Der Einfluss plasmagetragener Mediatoren, Hormone und zirkulierender Blutzellen kann

leicht kontrolliert bzw. wie bei dem in der eigenen Arbeit verwendeten blutfrei

perfundierten Modell ganz eliminiert werden. Um die Löslichkeit des schlecht

wasserlöslichen Sildenafils im Perfusat zu verbessern, wurde dem Perfusat Albumin

zugesetzt. Dies vermittelt eine Löslichkeit durch die Bindung des Wirkstoffs an das

Protein. Somit wurde der Übertritt des lipophilen Sildenafils aus der Lunge in das Perfusat

erleichtert. Die Bindung einer lipophilen Substanz (Propranolol) an Albumin konnte schon

an isolierten Rattenlungen gezeigt werden. Bei Perfusion der Lunge mit dem Propanolol-

und Albumin-haltigen Perfusat verblieb der Betablocker im Gefäßsystem, während er bei

den mit Dextran-Perfusat perfundierten Lungen in den Lungen sequestriert wurde (Liu et

al. 2009).

- Ein weiterer Vorteil besteht in der Möglichkeit, hämodynamische Parameter sowie

Ventilation und Perfusion der Lunge kontrollieren zu können und relevante

physiologische Variablen wie Gefäßdruck, Membranpermeabilität, Flüssigkeitshaushalt

und Gasaustausch messen zu können. Dies geschah auch in der eigenen Arbeit, wo

linksventrikulärer und pulmonalarterieller Gefäßdruck, Beatmungsdruck und -volumen

sowie Gewicht der Lunge gemessen und zur Beurteilung der Viabilität der Lunge

herangezogen wurden.

- Eine Freisetzung von Mediatoren sowie metabolische Veränderungen können durch

Analysen des Puffermediums beobachtet werden. Dies geschah in der eigenen Arbeit

durch die Kontrolle des pH-Wertes des Perfusats.

- Im Vergleich zu in vivo Modellen wird im Modell der IPL die Applikation von Wirkstoffen

in die Lunge erleichtert, multiple Probenentnahmen aus dem Perfusat und ein Lavagieren

der Lungen sind leicht durchzuführen. Eine multiple Probenentnahme war in der eigenen

Arbeit wichtig, um den zeitlichen Verlauf des Wirkstoffübertritts von der Lunge in das

- 92 -


4 DISKUSSION

Perfusat verfolgen zu können. Auch das Lavagieren der Lungen am Ende der Versuche

wurde durchgeführt, um die Wiederfindung des Sildenafils in den einzelnen

Kompartimenten des Modellsystems berechnen zu können.

Nachteile bestehen in der Zusammensetzung des Organs aus unterschiedlichen Zelltypen, die

eine Zuordnung physiologischer oder biochemischer Ereignisse zu einem bestimmten Zelltyp

oder interzellulären Interaktionen verhindert. Außerdem können auch nach intensivem Spülen

der Gefäße Leukozyten am Endothelium haften bleiben und so im Gefäßbett verbleiben.

Weiterhin sind Langzeitstudien mit diesem Modell nicht möglich. Die Viabilität der Lungen

beträgt in der Regel maximal fünf Stunden. Daher wurde die Versuchsdauer in den eigenen

Untersuchen auf diesen Zeitraum beschränkt. Schließlich kann es durch die (neuronale)

Isolation und Perfusion der Lunge zu Veränderungen wie Aktivierung biochemischer und

metabolischer Stoffwechselwege kommen.

Wenn diese Punkte beachtet werden, können Informationen, die aus diesem Modell gewonnen

werden, Hinweise auf in vivo Bedingungen in diesem komplexen Organ geben. Somit nimmt

die perfundierte Lunge eine wichtige Position zwischen Zellkulturversuchen und

Untersuchungen an intakten Tieren ein.

Bei der Interpretation von an der isolierten Lunge erhobenen Ergebnissen muss aber beachtet

werden, dass es einige morphologische Unterschiede in der Lungenanatomie zwischen

verschiedenen Tierspezies und vor allem zwischen Tieren und dem Menschen gibt. In einer

Studie wurden Länge, Durchmesser und Verzweigungswinkel der ersten sechs

Teilungsgenerationen des Bronchialbaumes von Ratten, Hamstern, Hunden, Eseln und

Kaninchen mit denen von Menschen verglichen (Schlesinger und La McFadden 1981).

Andere Autoren verglichen die Bronchialbäume von Menschen, Hunden, Ratten und

Hamstern (Phillips und Kaye, SR 1995). Dabei zeigte sich, dass sich die Geometrie der

menschlichen Atemwege deutlich von jener der anderen Spezies unterscheidet, wobei der

menschliche Bronchialbaum am symmetrischsten in Bezug auf Durchmesser und

Verzweigungswinkel ist. Bei Esel und Kaninchen war eine monopodiale Verzweigung des

Bronchialbaumes zu erkennen. Dabei zieht von der Trachea aus je ein langer, gebogener Ast

zu den kaudalen Rändern der Lunge, der zur Peripherie hin immer dünner wird. Von diesen

beiden Luftwegen gehen lateral und ventral die Lappenbronchien ab, die sich dann weiter

aufteilten (Schlesinger und La McFadden 1981). Die Unterschiede zwischen der dichotomen

Aufzweigung einer menschlichen Lunge und der monopodialen Aufzweigung sind

schematisch in Abb. 19 dargestellt.

- 93 -


4 DISKUSSION

- 94 -

Abb. 19: Schematische Darstellung

der Aufzweigung des

Bronchialbaumes einer

menschlichen Lunge (A) und der

monopodialen Aufzweigung (Esel

oder Kaninchen) (B) (Schlesinger

und La McFadden 1981)

Die terminalen Bronchiolen von Kaninchen teilen sich schließlich dichotom auf in

respiratorische Bronchiolen, die dann weiter über Ductuli alveolares zu den Alveolen führen

(s. Abb. 20). Diese Aufzweigung unterscheidet sich wiederum von derjenigen des Menschen,

wo sich die respiratorischen Bronchiolen, die sowohl luftleitende als auch gasaustauschende

Funktion haben, sukzessiv immer weiter teilen und mit jeder Teilungsgeneration mehr

alveolarisiert werden (Murray 2010).

Abb. 20: Rasterelektronenmikroskopische

Aufnahme einer Kaninchenlunge, auf normales

Atemvolumen aufgebläht. Zu erkennen sind die

dichotome Aufzweigung einer terminalen

Bronchiole, teilweise alveolarisierte respiratorische

Bronchiolen, Ductuli alveolares und Alveolen

(Murray 2010)

Die tierartlichen Unterschiede im Verzweigungsmuster können sich unter anderem auf die

Deposition inhalierter Partikel auswirken und müssen daher bei der Interpretation von

Versuchsergebnissen beachtet werden. Für die Partikeldeposition sind vor allem die

Geometrie der Atemwege und der unter anderem davon abhängige Luftfluss verantwortlich.

Daher führt ein inhaliertes Aerosol bei verschiedenen Tieren zu unterschiedlichen

Depositionsmustern. Da der Aufbau des oberen Bronchialbaums von Hunden dem des


4 DISKUSSION

Menschen am ähnlichsten ist, halten Schlesinger et al. aufgrund dieser theoretischen

Überlegungen das Hundemodell für Depositionsstudien am besten geeignet (Schlesinger und

La McFadden 1981). Dagegen verglichen Lippmann et al. Ergebnisse aus Studien, die den

Einfluss der Partikelgrößen auf die totale bzw. regionale pulmonale Deposition inhalierter

Partikel bei Affen, Meerschweinchen, Kaninchen, Hunden und Eseln. Dazu gibt es bisher nur

wenige Daten. Basierend auf diesen Ergebnissen scheinen Kaninchenlungen im Hinblick auf

die bronchiale Deposition inhalierter Partikel dem Menschen ähnlicher zu sein als Hunde oder

Esel (Lippmann 2011). Eine Übertragung der Ergebnisse aus den eigenen Untersuchungen auf

den Menschen wird aber neben den tierartlichen Unterschieden auch durch die nicht

physiologische vertikale Position der Kaninchenlunge im Versuch und die Applikation der

Substanzen mit dem Microprayer ® erschwert. Um das Übertrittsverhalten von Sildenafil von

der Lunge in das Perfusat in Gegenwart von intaktem Lungegewebe zu beobachten, ist das

Modell aber aufgrund der oben genannten Vorteile gut geeignet.

Für die Perfusion der Lunge wurde ein rezirkulierendes System gewählt. Dies hat im

Vergleich zu einem offenen System die Vorteile, dass weniger Perfusatvolumen benötigt

wird, dass bei der Bestimmung von Übertrittskinetiken im Perfusat höhere Konzentrationen

der pulmonal applizierten Substanz erreicht werden und dass sich ähnlich wie in vivo ein

Gleichgewicht zwischen Medium und Gewebe einstellen kann (Rhoades 1984).

- 95 -


4 DISKUSSION

4.2 DISKUSSION DER ERGEBNISSE

4.2.1 Liposomen mit R6G

4.2.1.1 Charakterisierung der R6G-Liposomen nach Extrusion und nach Verneblung

In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass es mit allen vier untersuchten Methoden möglich

war, Liposomen mit R6G herzustellen.

Die Verkapselungseffizienzen (VE) lagen mit 2,9 % (Methode A) bis 7,9 % (Methode C)

ähnlich hoch bzw. etwas höher als die in der Arbeitsgruppe der Verfasserin bei der

Verkapselung von 6-Carboxyfluorescein (CF) und Salbutamol in Liposomen aus DPPC und

CH erreichten Verkapselungseffizienzen (s. Tab. 22).

Verkapselte Substanz Verkapselungseffizienz (%) Autor

Carboxyfluorescein (CF)

Iloprost, Phosphatpuffer pH 7,4 1,7 ± 0,5

Iloprost, Acetatpuffer pH 4,7 4,4 ± 0,3

Rhodamin

6G

Methode A 2,9 – 7,5

Methode B 3,2 – 7,1

Methode C 7,0 – 7,9

Methode D 3,75

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2,4 ± 0,2 Waschkowitz 2002

4,6 ± 0,3 Kleemann et al. 2007

1,75 ± 0,25 Rüsch 2010

Kleemann et al. 2007

Eigene Untersuchungen

Tab. 22: Verkapselungseffizienzen von DPPC : CH - Liposomen für CF, Iloprost und R6G

Die in der eigenen Arbeit für das R6G gemessenen höheren Verkapselungseffizienzen können

durch den lipophilen Charakter des Farbstoffs erklärt werden, der dadurch leichter in die

Lipidmembran der Liposomen aufgenommen werden konnte (Ulrich 2002).

Dies führt auch zu den bei allen R6G-haltigen Liposomensuspensionen zu hohen

Verkapselungsraten (VR) von ca. 95 bis 99 %. Somit liegt in der fertigen

Liposomensuspension nahezu das gesamte in der Suspension enthaltene R6G in den

Liposomen verkapselt vor und nur ein sehr geringer Anteil ist als freies R6G enthalten. Bei

den Liposomen der Methoden A, B und D veränderten sich die Verkapselungsraten durch die

Verneblung nicht signifikant. Bei Liposomen der Methode C war die VR nach der

Verneblung mit 93,97 ± 1,11 % signifikant niedriger als vor der Verneblung (98,93 ± 0,21

%). Der signifikante Unterschied kann dadurch erklärt werden, dass bei dieser Methode der


4 DISKUSSION

Farbstoff bei der Herstellung der Liposomen zusammen mit den Lipiden in den Glaskolben

eingewogen und im Lösungsmittelgemisch gelöst worden war. Dadurch befand er sich bei den

fertigen Liposomen wahrscheinlich weniger R6G im Kern der Vesikel, sondern vermehrt

außen in der Liposomenmembran. Somit war er weniger geschützt und wurde bei der

mechanischen Belastung der Membran durch die Verneblung vermehrt freigesetzt. Da aber

immer noch ein Großteil des Farbstoffs in den Liposomen enthalten war, erscheint dieser

Unterschied wenig relevant. Somit waren die R6G-Liposomen stabiler gegenüber der

Verneblung mit einem Vibrating mesh Vernebler als die mit CF oder Salbutamol beladenen

Vesikel, bei denen die VR von ca. 97 – 99 % vor der Verneblung auf ca. 70 % nach der

Verneblung fiel (Kleemann et al. 2007; Rüsch 2010).

Auch die Größe der R6G-Liposomen änderte sich durch die Verneblung kaum. Die Größen

der Vesikel nach der Verneblung unterschieden sich nicht signifikant von den jeweiligen

Werten vor der Verneblung.

4.2.1.2 Verneblereigenschaften bei der Verneblung der R6G-Liposomen

Bei der Betrachtung der Aerosolpartikelgrößen des Aeroneb ® Solo bei der Verneblung der

Liposomen fällt auf, dass die bei der Verneblung von Liposomen der Methode C generierten

Aerosolpartikel signifikant größer sind als die Aerosolpartikel der zum Vergleich vernebelten

Kochsalzlösung. Die Aerosolpartikelgrößen der anderen Liposomensuspensionen sind etwas

kleiner (Methode B) oder annähernd gleich groß wie die Aerosolpartikelgrößen von NaCl.

Diese Differenzen können durch Unterschiede der physikochemischen Eigenschaften der

vernebelten Suspensionen erklärt werden, da die Leistung von Vibrating mesh Verneblern

stärker von Eigenschaften der zu vernebelnden Formulierung beeinflusst wird, als dies zum

Beispiel bei Düsenverneblern der Fall ist (Elhissi et al. 2006; Elhissi et al. 2007). Von den von

Ghazanfari et al. untersuchten Eigenschaften (Viskosität, Oberflächenspannung und

Ionenkonzentration) haben vor allem die Viskosität und Oberflächenspannung einen

deutlichen Einfluss auf die Aerosolpartikelgrößen bei Verneblung mit Vibrating Mesh

Verneblern. Dabei sind sie umgekehrt proportional zum VMD der Vesikel (Ghazanfari et al.

2007). Daher könnte es sein, dass diese beiden Parameter bei Liposomen der Methode C

niedriger waren als bei NaCl und den anderen Liposomen, was in entsprechend größeren

Aerosolpartikeln resultierte. Bei der Verneblung von Ethanol produzierte der Vibrating Mesh

Vernebler Aerosolpartikel, die wahrscheinlich aufgrund der geringeren Oberflächenspannung

von Ethanol kleiner waren als die bei Verneblung der anderen Flüssigkeiten erzeugten

Aerosolpartikel (Ghazanfari et al. 2007). Dadurch kann erklärt werden, warum die Liposomen

- 97 -


4 DISKUSSION

der Methode B, die Ethanol enthielten, kleiner waren. Bei Liposomen der Methode D hatte

das enthaltene Ethanol wahrscheinlich durch ein Zusammenwirken von mehreren Faktoren,

die sich gegenseitig aufhoben, keinen Einfluss auf die Aerosolpartikelgröße, sodass diese sich

kaum von den bei der Verneblung von NaCl erzeugten Aerosolpartikeln unterschieden.

Trotz dieser Unterschiede ist aber allen bei der Verneblung der Liposomen erzeugten

Aerosolpartikeln gemein, dass sie mit einem MMAD von unter bzw. nur knapp über 5 µm

klein genug sind, um in die peripheren Lungenregionen gelangen zu können. Eine periphere

Deposition ist bei einer Partikelgröße von 3 – 5 µm maximal (Voshaar et al. 2001; Scheuch et

al. 2006).

Eine Beeinträchtigung der Verneblerleistung zeigt sich bei einem Vergleich von

Verneblungsdauer und Output pro Minute bei der Verneblung von Liposomen und

Kochsalzlösung. Zur Verneblung von jeweils 3 ml der Liposomensuspension benötigte der

Vernebler ca. 1 Minute, also fast 18 % länger als zur Verneblung der Kochsalzlösung. Bei

vergleichbarem absolutem Output errechnet sich daraus ein geringerer Output pro Minute.

Dies kann dadurch erklärt werden, dass die Kochsalzlösung die Poren des Verneblers leichter

passieren kann als die partikulären Liposomen.

Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass

- 90 bis 96 % des Farbstoffs nach der Verneblung wiedergefunden werden konnten,

- ein hoher Output bei der Verneblung der Liposomen erzielt wurde,

- die Verkapselungsrate der Liposomen auch nach der Verneblung bei deutlich über

90 % lag und

- es durch die Verneblung nur zu einer marginalen Größenänderung der Vesikel kam.

Daher kann davon ausgegangen werden, dass die Liposomen intakt und nahezu vollständig

vernebelt wurden.

Durch diese Versuche mit R6G hat sich gezeigt, dass alle untersuchten Herstellungsmethoden

geeignet sind, verneblungsstabile Liposomen herzustellen. Die Methode, den Farbstoff

zusammen mit den Lipiden in den Glaskolben einzuwiegen und im organischen

Lösungsmittel zu lösen („Methode C“) wurde zur Herstellung der Sildenafil-Liposomen

gewählt, da die Verkapselungseffizienz gut reproduzierbar war, während sie bei den anderen

Methoden deutliche Schwankungen aufwies.

- 98 -


4 DISKUSSION

4.2.2 Wiederfindung von Sildenafil und Auswahl eines geeigneten

Schlauchmaterials

Da in Versuchen der eigenen Arbeitsgruppe ein zeitabhängiger Verlust von Sildenafil in

einem Modellsystem, das für die Versuche mit der isolierten Kanichenlunge verwendet

wurde, aufgefallen war, wurden Schläuche aus unterschiedlichen Materialien getestet, um

schließlich ein System aus geeigneten Schläuchen zur Untersuchung der Übertrittskinetik von

Sildenafil in das Perfusat bauen zu können.

Zuvor wurden in einer Versuchsreihe die zur Aufbewahrung der Sildenafillösungen, der

Sildenafil-Liposomensuspensionen und der Proben verwendeten Gefäße untersucht, da für

eine quantitative Sildenafil-Analytik ein Verlust der Substanz auch in diesen Behältnissen

ausgeschlossen werden musste.

In den Eppendorf-Reaktionsgefäßen konnte das zugegebene Sildenafil auch nach fünf

Stunden nahezu komplett nachgewiesen werden. Auch in den bei unterschiedlichen

Temperaturen inkubierten Falcon Tubes wurde nach fünf Stunden kein Verlust der Substanz

nachgewiesen. Somit hat sich gezeigt, dass diese Gefäße geeignet waren zur Aufbewahrung

der Sildenafil-Lösungen, Liposomensuspensionen und Proben aus den Versuchen.

Obwohl alle untersuchten Schläuche laut Herstellerangaben chemisch beständig und für

Laborzwecke geeignet waren, zeigten sich teilweise deutliche Unterschiede in der

Sildenafilwiederfindung.

Bei der Inkubation von Schlauchstücken mit Sildenafil zeigte sich bei den Schläuchen aus

Teflon und PTFE über den gesamten Zeitraum von fünf Stunden eine Wiederfindung von ca.

100 %. Aufgrund dieser Ergebnisse wären diese Schläuche also für das Modellsystem

geeignet. Da das Material, aus dem ein System für die isolierte Kaninchenlunge gebaut

werden sollte, über eine gewisse Flexibilität verfügen mussten, kamen Teflon und PTFE nicht

infrage, da sie zu starr waren.

Im Falle des Polyurethan-Schlauches kam es bereits beim ersten Versuch zu einer Abnahme

der Sildenafil-Konzentration auf 92,5 % des eingesetzten Sildenafils nach fünf Stunden. Beim

zweiten Versuch konnten nach 300 Minuten nur noch 58,6, beim dritten Versuch sogar nur

noch 45,8 % des Sildenafils wiedergefunden werden. Es ist anzunehmen, dass es durch die

Versuche selbst oder durch das Waschen des Schlauchstückes nach dem Versuch mit heißem

Wasser zu einer Beschädigung der Schlauchoberfläche kam, sodass sich das Sildenafil in den

folgenden Versuchen vermehrt dort anlagern konnte. Daher war der Schlauch aus Polyurethan

nicht für einen Einsatz im Modellsystem geeignet.

- 99 -


4 DISKUSSION

Beim C-FLEX ® -Schlauch konnte beim ersten Versuch in den Proben nach 60, 180 und 300

Minuten ein Sildenafilgehalt von ca. 125 % gemessen werden. Da in der zu Versuchsbeginn

entnommenen Probe 104 % der eingesetzten Sildenafilmenge gemessen worden waren, kann

davon ausgegangen werden, dass es nicht schon beim Herstellen der Sildenafil-Lösung für

den Versuch zu Verdünnungsfehlern und somit einer höheren als der errechneten

Sildenafilkonzentration gekommen war. Da außerdem eine weitere Zugabe von Sildenafil in

den Ansatz während des Versuches, zum Beispiel durch eine Kontamination bei der

Probenentnahme, ausgeschlossen werden konnte, scheint es möglich, dass während des ersten

Versuchs ein Bestandteil des Schlauches herausgelöst wurde, der zur selben Retentionszeit

wie das Sildenafil bei der Messung mittels HPLC detektiert wurde und somit zu einer

scheinbaren Erhöhung der Sildenafilkonzentration führte. Diese Hypothese wird durch die

Beobachtung unterstützt, dass bei den beiden Folgeversuchen, nachdem der Schlauch nach

dem ersten Versuch gründlich gewaschen worden war, dieses Phänomen nicht mehr auftrat

und in beiden Versuchen über die gesamte Versuchsdauer annähernd 100 % des eingesetzten

Sildenafils detektiert werden konnten. Dieser Schlauch war also ausreichend stabil gegenüber

Sildenafil und außerdem flexibel genug, um ein System daraus bauen zu können. Nachteilig

war allerdings, dass er milchig-trüb war. Dies hätte bei einem System aus diesem Schlauch zu

Problemen geführt, da das Perfusionssystem vor Integration der Lunge luftblasenfrei gespült

werden muss, um Luftembolien in der Lunge zu verhindern. Die trübe Färbung des

Schlauches hätte ein Erkennen und Entfernen eventuell enthaltener Luftblasen erschwert oder

verhindert. Da mit dem Clear C-FLEX ® Schlauch eine transparente Alternative zur

Verfügung stand, wurde dieser Schlauch gewählt, um daraus ein System zu bauen, das vor

dem ersten Versuch sowie nach jedem Versuch gespült wurde.

Um nachzuweisen, dass der Clear C-FLEX ® Schlauch genauso geeignet ist wie der Schlauch

aus C-FLEX ® , und um einen Einfluss anderer im System enthaltener Teile, wie

Verbindungsstücke oder Dreiwegehähne, auszuschließen, wurde die Wiederfindung in einem

aus Clear C-FLEX ® Schläuchen unterschiedlicher Durchmesser gebauten System sowohl mit

der in den oben aufgeführten Versuchen verwendeten Sildenafil-Base von AK scientific, als

auch mit der später für die Versuche verwendeten Base von bioKEMIX untersucht. Da für

beide Substanzen eine Wiederfindung von annähernd 100 % über die gesamte Versuchsdauer

erreicht werden konnte, wurde dieses Modellsystem für die folgenden Untersuchungen von

Übertrittskinetiken inhalativ applizierter Sildenafil-Lösungen bzw. Liposomensuspensionen

am Modell der isolierten Kaninchenlunge eingesetzt.

- 100 -


4.2.3 Liposomen mit Sildenafil

4 DISKUSSION

4.2.3.1 Charakterisierung der Liposomen vor und nach Verneblung

Die Verkapselungseffizienz (VE) der Sildenafil-Liposomen lag bei 105,3 ± 5,6 %. Das

bedeutet, dass das gesamte bei der Herstellung eingesetzte Sildenafil in der

Liposomensuspension enthalten war. Dass die VE deutlich über der bei den R6G-Liposomen

gemessenen VE lag, kann zum einen durch die etwas veränderte Herstellungmethode erklärt

werden. Durch die zusätzliche Behandlung des Kolbens mittels Ultraschallbad kam es bei den

Sildenafil-Liposomen zu einem nahezu vollständigen Ablösen des Lipidfilms von der

Innenwand des Kolbens, wohingegen bei den R6G-Liposomen noch Reste von Lipiden und

Farbstoff am Kolben haften geblieben sein könnten, die auch die Schwankungen der VE

zwischen den einzelnen Chargen der R6G-Liposomen erklären würden. Ein weiterer Grund

ist wahrscheinlich die Struktur des Sildenafil-Moleküls, das lipophiler als R6G ist, was am

höheren Oktanol/ Wasser-Verteilungskoeffizienten abgelesen werden kann. Dadurch kam es

zu einer nahezu vollständigen Assoziation der Substanz mit der Lipidmembran der

Liposomen, während in der wässrigen Umgebung der Vesikel nur sehr geringe

Konzentrationen des schlecht wasserlöslichen Wirkstoffs gemessen wurden.

Verkapselungseffizienzen von 94 – 100 % konnten auch für das schlecht wasserlösliche

Paclitaxel erzielt werden (Zhang et al. 2005). Durch die starke Lipidbindung und schlechte

Wasserlöslichkeit des Sildenafils kann auch die hohe Verkapselungsrate (VR) von ca. 98 %

direkt nach der Herstellung erklärt werden, die ein Zentrifugieren der Suspension zur

Abtrennung von freiem Sildenafil überflüssig machte. Da die Sildenafil-Liposomen nicht

extrudiert werden konnten (s. Kapitel 4.1.4), lag der mediane Volumendurchmesser (VMD)

der Vesikel mit ca. 3,1 µm deutlich über dem VMD der R6G-Liposomen (ca. 0,6 µm). Da mit

Düsenverneblern auch eine Verneblung von relativ großen Partikeln möglich ist (Bridges und

Taylor 1998) und die Deposition von liposomalen Aerosolen weniger von der Größe der

Liposomen, sondern im Wesentlichen von der Größe der Aerosoltröpfchen bestimmt wird

(Farr et al. 1985; Taylor und Newton 1992; Schreier et al. 1993), schließt der große VMD

eine pulmonale Applikation der Liposomen nicht aus. Es gibt sogar Hinweise darauf, dass die

Verweildauer von nicht extrudierten Liposomen (mittlere Partikelgröße 3,9 µm) in

Rattenlungen nach intratrachealer Instillation länger ist als die von kleineren, extrudierten

Vesikeln (mittlere Partikelgröße 0,27 µm) der gleichen Lipidzusammensetzung. Die

unextrudierte Formulierung hatte eine Halbwertszeit von 14,5 Stunden, bei der extrudierten

Formulierung waren es nur 5,4 Stunden. Dadurch konnte die Verweildauer des in den

Liposomen enthaltenen Terbutalins durch die unextrudierten Liposomen effektiver verlängert

- 101 -


4 DISKUSSION

werden. Dieser Effekt kann durch die reduzierte Lamellenanzahl und somit erhöhte

Permeabilität in den extrudierten Liposomen erklärt werden (Fielding und Abra 1992).

Nach der Verneblung der Liposomen mit dem MicroSprayer ® konnten über 99 % der

eingesetzten Sildenafilkonzentration wiedergefunden werden. Da sich durch die Verneblung

auch keine signifikanten Unterschiede hinsichtlich der untersuchten Parameter VR und VMD

zeigten, konnte davon ausgegangen werden, dass die Liposomen den Vernebler nahezu

vollständig und intakt verlassen und es nicht zu einer Freisetzung der verkapselten Substanz

durch die Verneblung kommt. Dies war eine Voraussetzung für den Einsatz der Liposomen

und die Wahl des Verneblers für die Versuche an der isolierten Kaninchenlunge.

Bei der Verneblung der Liposomen mit dem Pari LC Sprint ® Star konnte ein Anstieg der

Sildenafilkonzentration im Aerosol und im Verneblerrückstand beobachtet werden. Im

Aerosol war dieser mit einer Wiederfindung von ca. 107 % des eingesetzten Sildenafils nicht

sehr stark ausgeprägt. In der Liposomensuspension, die nach einer Verneblungsdauer von 15

Minuten aus dem Rückstand im Vernebler entnommen worden war, kam es aber zu einer

deutlichen Aufkonzentrierung des Wirkstoffs, so dass dort ca. 27 % mehr Sildenafil

wiedergefunden werden konnte, als in Form der Liposomensuspension in den Vernebler

eingefüllt worden war. Diese Aufkonzentrierung kommt durch ein Verdunsten von Flüssigkeit

während der Verneblung zustande. Der Aerosol-Output eines Düsenverneblers enthält

aerosolisierte Tropfen und Lösungsmitteldampf, der die durchfließende Luft sättigt. Dadurch

steigt die Konzentration der Lösung im Vernebler kontinuierlich, während ihre Temperatur

abnimmt (Wood et al. 1986; O'Callaghan und Barry 1997; Bridges und Taylor 1998). Bei der

Verneblung von Liposomen trägt außerdem eine Retention von großen Liposomen oder

Liposomenaggregaten im Vernebler, die zu einer Akkumulation von Phospholipiden führt,

zur Aufkonzentrierung bei (Bridges und Taylor 1998; Elhissi et al. 2006). Die geringe, nicht

signifikante Reduktion des VMD der Vesikel von ca. 3,1 µm nach der Herstellung auf ca. 2,5

µm im Aerosol kann durch die Scherkräfte erklärt werden, die bei der Passage der Liposomen

durch die Düse des Verneblers auf die Vesikel wirken. Dadurch zerbrechen Liposomen und

Liposomenaggregate, was in einer Reduktion ihrer mittleren Größe resultiert. Liposomen, die

danach noch zu groß sind, um den Vernebler mit dem primären Aerosol zu verlassen,

reassoziieren und gelangen wieder in das Verneblerreservoir. Auf diese Weise werden sie so

lange recycelt, bis sie klein genug sind, um den Vernebler über das sekundäre Aerosol

verlassen zu können (Farr et al. 1985; Gilbert et al. 1988; Taylor et al. 1990; Bridges und

Taylor 1998). Daher ist der VMD der im Rückstand enthaltenen Vesikel mit 2,9 µm auch

etwas kleiner als vor der Verneblung.

- 102 -


4 DISKUSSION

Bei den Sildenafil-Liposomen führte die Verneblung allerdings nicht zu einer Freisetzung der

verkapselten Substanz aus den Vesikeln. Die Verkapselungsrate (VR) der Sildenafil-

Liposomen wurde kaum beeinflusst, sie stieg sogar leicht an. Der geringe Anstieg der VR im

Aerosol war nicht signifikant. Der Anstieg im Rückstand von 97,7 ± 0,5 % auf 98,4 ± 0,2 %

war statistisch signifikant, was aber in dieser Größenordung als nicht relevant betrachtet

werden kann. Dies ist mit der Lipophilität des Sildenafils zu erklären. Da hydrophobe

Substanzen mit der Lipidmembran assoziiert sind, ist ein Zerbrechen der Liposomen während

der Verneblung weniger kritisch als bei verkapselten hydrophilen Substanzen (Taylor et al.

1990; Taylor und Newton 1992). Daher zeigten die mit dem lipophilen Sildenafil beladenen

Liposomen trotz ihrer Größe bei der Nutzung des Düsenverneblers eine ausreichende

Verneblungsstabilität. Somit wirkte es sich nicht negativ auf das Freisetzungsverhalten der

Vesikel während der Verneblung aus, dass die Extrusion nicht durchgeführt werden konnte.

4.2.3.2 Verneblereigenschaften bei der Verneblung der Sildenafil-Liposomen

Die bei der Verneblung der Sildenafil-Liposomen mit dem Pari LC Sprint ® Star generierten

Aerosolpartikel waren mit einem mittleren aerodynamischen Durchmesser (MMAD) von ca.

3,5 µm signifikant kleiner als die bei der Verneblung von Kochsalzlösung generierten

Aerosolpartikel, bei denen ein MMAD von ca. 3,9 µm gemessen wurde. Mit diesen

Aerosolpartikelgrößen waren die Partikel ebenso wie die mit dem Aeroneb ® Solo bei der

Verneblung der R6G-Liposomen generierten Aerosole gut zur peripheren Deposition in der

Lunge geeignet (Voshaar et al. 2001; Scheuch et al. 2006).

Bei dem Vergleich des Outputs ergaben sich im Gegensatz zur Verneblung der R6G-

Liposomen mit dem Aeroneb ® Solo weder für den absoluten Output in ml, noch für den bei

einer Verneblungsdauer von 15 Minuten errechneten Output in ml pro Minute signifikante

Unterschiede bei der Verneblung der Sildenafil-Liposomen und isotoner Kochsalzlösung.

Bridges et al. untersuchten den Einfluss der Lipidkonzentration bei der Verneblung von

Liposomensuspensionen mit Düsenverneblern. Bei einem Pari LC-Vernebler führte eine

Steigerung der Lipidkonzentration von 5 mg/ml auf 80 mg/ml zu einer Reduktion des Outputs

um 10 bis 37 %, abhängig von der Größe der vernebelten Liposomen (Bridges und Taylor

2000). Wahrscheinlich gab es in der eigenen Arbeit keine signifikanten Unterschiede

zwischen dem Output der Kochsalzlösung und dem der Liposomen, weil die vernebelte

Liposomensuspension mit einer Lipidkonzentration von 20 mg/ml noch zu niedrig war, um

einen signifikanten Einfluss auf den Output zu besitzen.

- 103 -


4 DISKUSSION

Zusammen mit den oben genannten Ergebnissen der im Aerosol gemessenen Sildenafil-

Konzentration und VR der aufgefangenen Liposomen (s. Kapitel 4.2.3.1) zeigt dies, dass die

Liposomen mit dem Düsenvernebler effizient vernebelt werden können.

Bei der Verneblung von 1 ml der Sildenafil-Liposomen mit dem MicroSprayer ® betrug der

Output ca. 0,9 ml und unterschied sich somit nicht signifikant von dem bei der Verneblung

von Aqua dest. gemessenen Output. Dadurch konnte gezeigt werden, dass sich die

Liposomensuspension komplett vernebeln lässt und es nicht zu Rückständen, zum Beispiel

durch Verstopfen der Düse an der Spitze der Sonde durch die Liposomen kommt. Auf eine

Messung der Aerosolpartikelgrößen bei der Verneblung der Liposomen wurde verzichtet, da

dies einen sehr großen Materialverbrauch bedeutet hätte. Nach Kenntnis der Autorin wurden

derartige Messungen bereits mit Nanopartikeln durchgeführt. Dabei lagen bei der

Untersuchung der Aerosolpartikel bei der Verneblung von isotoner Kochsalzlösung,

Salbutamol-Lösung und zwei unterschiedlichen Nanopartikel-Suspensionen mit dem

MicroSprayer ® die Partikelgrößen alle in einem Bereich von 27 bis 32 µm mit einer GSD von

1,9 bis 2,2 (Beck-Broichsitter et al. 2010). Unterschiede waren bei diesem Vernebler, in dem

die zu vernebelnde Lösung durch mechanischen Druck eine Düse passiert, auch für

Liposomen nicht zu erwarten. Auch die Verneblungsdauer, die mit ca. 2 Sekunden sowohl bei

Aqua dest. als auch bei den Liposomen sehr kurz war, wurde nicht genauer bestimmt.

Bei den Versuchen mit der isolierten Kaninchenlunge wurde der Output aus der

MicroSprayer ® -Spritze gravimetrisch bestimmt. Die Sonde wurde zwar nach der Applikation

aus der Trachea entfernt, bei einer gravimetrischen Bestimmung des Residuums in der Sonde

wäre es aber zu Fehlern durch anhaftende Blut- und Gewebereste gekommen. Daher wurde

vom Spritzenoutput das zuvor bei der Verneblung von Aqua dest. bzw. Liposomen ermittelte

Residuum abgezogen.

4.2.3.3 In vitro Freisetzungsversuche

Um die Sildenafil-Freisetzung aus den Liposomen in vitro zu untersuchen, wurden je 0,6 ml

der Liposomensuspension in 14,4 ml vierprozentiger Albumin-Lösung über fünf Stunden bei

37 °C inkubiert. Dies wurde mit jeder der vier Liposomenchargen je einmal durchgeführt. Das

freigesetzte Sildenafil wurde nach Zentrifugation der aus den Ansätzen entnommenen Proben

im Überstand bestimmt.

Um die prozentuale Freisetzung des Wirkstoffs aus den Liposomen in den in vitro Versuchen

über die Zeit berechnen zu können, musste zuvor der in den Versuchen enthaltene

Gesamtsildenafilgehalt bestimmt werden. Die Gesamtsildenafilgehalte im Versuch wurden

- 104 -


4 DISKUSSION

nach 0, 150 und 300 Minuten gemessen und für jeden Versuch gemittelt. Dabei konnten über

die gesamte Versuchsdauer von fünf Stunden ca. 90 % der aus den Gesamt-Sildenafilgehalten

der Liposomenchargen errechneten Sildenafilkonzentration gefunden werden. Dass nicht das

gesamte eingesetzte Sildenafil wiedergefunden werden konnte, kann an

Pipettierungenauigkeiten bei der Zugabe der Liposomen in den Albumin-Ansatz oder beim

Verdünnen der Proben mit Methanol liegen. Für die Auswertung der Versuche erschien es

aber nicht relevant, da für die Bestimmung der Kinetik der prozentuale Anteil an

freigesetztem Sildenafil berechnet wurde. Dafür war es wichtig, dass die Gesamt-

Sildenafilkonzentration sich während des Versuches nicht änderte. Durch die drei im Laufe

des Versuches entnommenen Proben zur Bestimmung des Gesamt-Sildenafilkonzentration

konnte gezeigt werden, dass diese konstant blieb.

Bei der Auswertung der Kinetik fällt auf, dass schon zu Versuchsbeginn 30 % des Sildenafils

in Form von freiem Sildenafil vorliegen. Dies kann daran liegen, dass ein Teil des liposomal

verkapselten Wirkstoffs nicht fest in die Lipidmembran der Vesikel integriert war, sondern

Komplexe mit den Kopfgruppen der Lipide an der Oberfläche der Liposomen gebildet hat.

Solche Komplexe entstehen, wenn Liposomen mit lipophilen Wirkstoffen hergestellt werden

und überschüssige, nicht verkapselte lipophile Moleküle sich nicht im umgebenden wässrigen

Medium bzw. Puffer lösen können (Szoka und Papahadjopoulos 1980). Diese Hypothese wird

von Ergebnissen einer Arbeitsgruppe unterstützt, die Beclomethason, ein unlösliches

Glukokortikoid, in Liposomen verkapselt haben. Da es bei der Extrusion dieser Liposomen zu

einer Freisetzung von Beclomethason kam nahmen die Forscher an, dass der Wirkstoff nicht

in den Liposomen enthalten, sondern äußerlich an die Membran gebunden war und sich diese

Bindung bei der Passage der Liposomen durch die Membranporen des Extruders löste

(Darwis und Kellaway 2001). Übertragen auf die eigenen Ergebnisse mit Sildenafil-

Liposomen kann daher davon ausgegangen werden, dass bei der Aufbewahrung der

Liposomen in konzentrierter Form die Bindung von Sildenafil an die Vesikelmembran stabil

blieb, da sich der lipophile Wirkstoff nicht in ausreichender Menge in der wässrigen

Umgebung lösen konnte. Es ist anzunehmen, dass bei der Inkubation der Liposomen im

Freisetzungsmedium durch die Verdünnung und das zugesetzte Albumin das nur

oberflächlich gebundene Sildenafil schnell die Liposomenmembran verließ und sich an das

Albumin binden konnte. In ähnlicher Weise konnte eine Bindung des lipophilen Amins

Propranolol an Albumin schon bei Versuchen mit isolierten Rattenlungen beobachtet werden

(Liu et al. 2009).

- 105 -


4 DISKUSSION

Außerdem kann durch die Inkorporation von Cholesterol und Sildenafil in die DPPC-Vesikel

deren Phasenübergangstemperatur herabgesetzt worden sein, sodass es schon bei 37 – 38 °C

zu einer signifikanten Freisetzung kommen konnte (s. Kapitel 4.1.1).

Im Versuchsverlauf ist ein weiterer Anstieg der Konzentration an freiem Sildenafil auf gut 60

% der enthaltenen Wirkstoffkonzentration zu beobachten. Dieser Anstieg kann dadurch

erklärt werden, dass es sich bei den Liposomen aufgrund ihrer Größe wahrscheinlich um

multilamellare Vesikel gehandelt hat (Vemuri und Rhodes 1995). Das heißt, dass nach

Zugabe der Vesikel in die Albumin-Lösung erst nur das in der äußeren Lipidschicht

enthaltene Sildenafil freigesetzt wurde, während die inneren Schichten weiterhin geschützt

waren. Eine Diffusion des in den inneren Membranen integrierten Sildenafils würde durch die

zwischen den Schichten befindlichen Wassermoleküle verzögert. Mit dieser Hypothese wurde

schon von Fielding et al. erklärt, warum große, nicht extrudierte Liposomen besser als kleine

Liposomen geeignet sind, die Verweildauer von liposomal verkapseltem, intratracheal

instilliertem Terbutalin in der Lunge von Meerschweinchen zu verlängern (Fielding und Abra

1992).

Nach 270 Minuten wird ein Plateau erreicht. Eine vollständige Freisetzung des Sildenafils

wird wahrscheinlich durch eine weiterhin bestehende Bindung des lipophilen Wirkstoffs an

die vesikulären Lipide verhindert. Durch diese verzögerte Wirkstofffreisetzung aus den

Liposomen über einen Zeitraum von 4,5 Stunden in vitro war die Voraussetzung für den

Einsatz der Liposomen als Retardformulierung erfüllt, sodass diese weiter am Modell der

isolierten Kaninchenlunge getestet wurden.

4.2.3.4 Substanzübertritt am Modell der isolierten Kaninchenlunge

Bei den Versuchen mit freiem Sildenafil zeigte sich ein sehr schneller Anstieg der

Wirkstoffkonzentration im Perfusat mit einem Peak nach zehn Minuten und anschließend

wieder eine leichte Abnahme. Dass Pharmazeutika nach tiefer Inhalation und Deposition in

den peripheren Lungenregionen schnell absorbiert werden können, liegt an der großen

Oberfläche der Lunge (beim Menschen 80 – 140 m²), ihrer guten Vaskularisation, dem

dünnen Alveolarepithel (dieses ist in den meisten Regionen der Lunge nur 0,1 – 0,2 µm dick)

und ihrer großen Kapazität für Flüssigkeitsaustausch (Scheuch et al. 2006). Dabei kann die

Lunge eine ganze Reihe verschiedener Substanzen wie Wasser, Elektrolyte, Lipide, Zucker,

Proteine und Peptide absorbieren. Dazu stehen verschiedene Absorptionsmechanismen zur

Verfügung, wie para- und transzelluläre Diffusion, aktiver und passiver Transport über

Ionenkanäle oder vesikelvermittelte Transzytose, die zum Teil rezeptorvermittelt abläuft (von

- 106 -


4 DISKUSSION

Wichert und Seifart 2005). Wie schnell und über welchen Mechanismus Moleküle absorbiert

werden, hängt von dem Ort ihrer Deposition sowie ihren physikochemischen Eigenschaften

wie ihrem Molekulargewicht, ihrem Oktanol/ Wasser-Verteilungskoeffizienten, ihrer Ladung,

ihrer Löslichkeit und ihrer chemischen und enzymatischen Stabilität ab (Tronde et al. 2008).

Kleine hydrophile Stoffe werden vor allem über parazellulären Transport über mehrere

Minuten absorbiert. Kleine lipidlösliche Substanzen werden schnell (innerhalb weniger

Sekunden bis Minuten) durch transzellulären Transport absorbiert. Dabei werden sie in die

Lipiddoppelmembran, die die Zellen umgibt, integriert und wandern darin von der apikalen

zur basolateralen Zellseite (Patton et al. 2004; Patton und Byron 2007).

Über diesen Mechanismus könnte das lipophile Sildenafil sehr schnell in das Perfusat

übergetreten sein. Bereits zehn Minuten nach der Verneblung konnte im Perfusat eine

Sildenafilkonzentration von 1,33 µg/ml gemessen werden. Dies entspricht ca. 42 % des

verabreichten Sildenafils. Die anschließende leichte Abnahme der Sildenafilkonzentration im

Perfusat auf ca. 1,16 µg/ml (ca. 37 % der deponierten Menge) kann durch eine Redistribution

der lipophilen Substanz aus dem wässrigen Perfusat zurück in die Lunge erklärt werden, wo

es in den Zellen akkumulierte und im Lungengewebe verblieb. Ein ähnliches Verhalten wurde

bereits für die ähnlich lipophile Substanz Propranolol (Oktanol/ Wasser-

Verteilungskoeffizient log P = 3,0) beschrieben. Nachdem die Substanz intratracheal über

einen Katheter in isolierte Rattenlungen appliziert worden war, konnte ein schneller Übertritt

in das albuminhaltige Perfusat beobachtet werden. Bereits nach fünf Minuten wurde dort eine

Peak-Konzentration von 21 % der applizierten Dosis gemessen. Danach nahm die

Perfusatkonzentration wieder ab und erreichte nach 40 Minuten ein Plateau (9 % der

applizierten Dosis), das bis zum Ende des Versuches nach 120 Minuten konstant blieb. Dieses

Verhalten wurde mit einer Bindung der Substanz an das Lungengewebe erklärt (Tronde et al.

2003).

Eine weitere Erklärung für die Abnahme der Sildenafilkonzentration im Perfusat wäre ein

Metabolismus der Substanz in der Lunge. Sildenafil wird über Cytochrom P450-Enzyme

metabolisiert (Hyland et al. 2001). Diese Enzyme werden auch in der Lunge exprimiert

(Anttila et al. 1997). Die Hauptrolle im Metabolismus von Sildenafil kommt dem Enzym-Typ

CYP3A4 zu (Warrington et al. 2000). Die Expression dieses Enzyms in humanen Lungen

unterliegt beträchtlichen interindividuellen Unterschieden und wurde nur bei 20 % der

untersuchten Individuen nachgewiesen (Anttila et al. 1997). Nach Kenntnis der Autorin liegen

keine Daten zum Vorkommen der Cytochrom P450-Enzyme in Lungen von Kaninchen vor.

- 107 -


4 DISKUSSION

Daher ist ein Metabolismus von Sildenafil in der Kaninchenlunge während des Versuchs

möglich, kann aber nicht genau quantifiziert werden.

Von der rechnerisch ermittelten, in der Lunge deponierten Sildenafilmenge konnten in den

eigenen Versuchen insgesamt ca. 56 % wiedergefunden werden. Dies ist deutlich weniger als

nach Verneblung des hydrophilen Fluoreszenzfarbstoffs 6-Carboxyfluoreszein (CF), wo eine

Wiederfindung von 75 % erzielt werden konnte (Lahnstein et al. 2008). Auch nach

Verneblung des lipophilen Farbstoffs Rhodamin 6G (R6G) konnten vor allem durch die

Lavagen insgesamt 85,7 ± 9,2 % wiedergefunden werden (Lahnstein et al. 2008). Für die

eigenen Versuche bedeutet dies, dass ca. 44 % des deponierten Sildenafils in der Lunge und

somit am Wirkort verblieben, wo der Wirkstoff wahrscheinlich nicht frei in der Lunge vorlag,

sondern fest in das Lungengewebe integriert war.

Ein direkter Vergleich der Übertrittskinetiken von freiem und liposomal verkapseltem

Sildenafil nach Verneblung mit dem MicroSprayer ® in das Modell der isolierten

Kaninchenlunge ist möglich, da die in der Lunge deponierten Sildenafilmengen mit 0,95 ±

0,02 mg bzw. 1,0 ± 0,02 mg trotz statistisch signifikanten (p=0,01) Unterschieds in einer sehr

ähnlichen Größenordnung liegen. Dabei zeigte sich für das liposomal verkapselte Sildenafil

anfangs eine ähnliche Übertrittskinetik wie für den freien Wirkstoff. Fünf Minuten nach der

Applikation wird im Perfusat eine Konzentration von 1,09 µg/ml (ca. 32 % der deponierten

Wirkstoffmenge) erreicht. Im Versuchsverlauf zeigt die Perfusatkonzentration ein Plateau bei

ca. 1,1 µg/ml bis zum Ende des Versuches. Der schnelle Anstieg kann zum einen daran

liegen, dass, wie schon in Kapitel 4.2.3.3 diskutiert, ein Teil des liposomalen Sildenafils nicht

fest in die Membran integriert wurde. Wenn es nur oberflächliche Komplexe mit den Lipiden

gebildet hat, könnte es bei Kontakt mit dem Lungengewebe schnell freigesetzt worden sein

und wie das freie Sildenafil schnell ins Perfusat übertreten, wo es sich an das Albumin band.

Diese Beobachtung stimmt mit den Ergebnissen der in vitro-Freisetzungsversuche überein,

wo schon zu Versuchsbeginn ca. 30 % der enthaltenen Wirkstoffmenge in freier Form

vorlagen. Wenn davon ausgegangen wird, dass wirklich ca. 30 % des liposomalen Sildenafils

nicht fest verkapselt waren und daher schnell ins Perfusat übertreten konnten, reicht dies aber

noch nicht aus, um eine Perfusatkonzentration zu erreichen, die bei ca. 75 % der nach der

Verneblung von freiem Sildenafil erreichten Wirkstoffkonzentration liegt. Es muss auch zu

einer raschen Freisetzung der in die Liposomen integrierten Moleküle gekommen sein.

Verkapselte Substanzen sollten vom Phospholipid-Bilayer eingeschlossen bleiben und

langsam durch die Membran diffundieren (Vemuri und Rhodes 1995). Inhalierte Liposomen

kommen aber nach Deposition in der Lunge schnell in Kontakt mit

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4 DISKUSSION

Bronchoalveolarflüssigkeit, die neben Surfactantproteinen auch Serumkomponenten wie

Albumin und Immunglobuline enthält, welche die Stabilität der Liposomen beeinflussen

können (Shek et al. 1994). So wurde bei Inkubation von amikacinhaltigen Liposomen mit

Lavageflüssigkeit in vitro eine rasche Freisetzung der verkapselten Substanzen aus den

Liposomen festgestellt (Wichert et al. 1992). In der Lunge in vivo bzw. ex vivo kann es zu

einem Abbau der Vesikel in den Alveolen oder in Alveolarmakrophagen, Fusion der

Liposomen mit Epithelzellen oder Fusion und Austausch von Phospholipiden zwischen

Liposomen und Surfactant kommen. Dies kann eine durch Diffusion von Substanzen durch

die Liposomenmembran bedingte Wirkstofffreisetzung verstärken. Die freigesetzten

Substanzen können schnell aus der Lunge übertreten und einen raschen Anstieg des

Plasmalevels bewirken (Taylor und Newton 1992). Bei der Verneblung des liposomal

verkapselten hydrophilen Fluoreszenzfarbstoffs 6-CF in die isolierte Kaninchenlunge konnte

ein langsamerer Anstieg der Farbstoffkonzentration im Plasma, verglichen mit der Kinetik

nach der Verneblung des freien Farbstoffs, erzielt werden (Rüsch 2010). Für den Farbstoff,

der sich dabei ausschließlich im wässrigen Kern der Liposomen befand, stellt die

Lipidmembran eine deutliche Barriere dar, die eine schnelle Diffusion der hydrophilen

Substanz verhinderte (Elsayed et al. 2007; Khan et al. 2008). Das lipophile Sildenafil befand

sich im Gegensatz dazu in der Liposomenmembran und konnte somit schnell von dort über

das Lungengewebe ins Perfusat übertreten.

Da hydrophobe Substanzen problemlos von den Kohlenwasserstoffketten des Bilayers

aufgenommen werden, werden Liposomen intuitiv als exzellente Träger für lipophile

Substanzen betrachtet. Es hat sich aber gezeigt, dass sich hydrophobe Stoffe innerhalb

weniger Minuten von ihren Trägern loslösen und sich über Austauschmechanismen ein

Gleichgewicht zwischen allen lipidartigen Strukturen in der Umgebung einstellt (Ulrich

2002). Wahrscheinlich verhindert dieses Verhalten eine verzögerte Freisetzung des Wirkstoffs

aus den selbst hergestellten Liposomen. Da das in den eigenen Versuchen verwendete

Perfusat Albumin enthielt, konnte das Sildenafil auch durch Bindung an dieses Protein ins

Perfusat übertreten.

Die Wiederfindung bei den Liposomenversuchen im Vergleich zu den Versuchen mit freiem

Sildenafil war etwas geringer. Die Unterschiede waren aber in allen untersuchten

Kompartimenten (Perfusat, Lavagen, Methanol-Lavagen und Proben) nicht statistisch

signifikant. Auch hier kann also davon ausgegangen werden, dass das Sildenafil zum Teil ins

Lungengewebe aufgenommen wurde und nicht wiedergewonnen werden konnte.

- 109 -


4 DISKUSSION

Da durch die Liposomen keine Verzögerung des Übertritts von Sildenafil aus der Lunge in

das Perfusat erreicht werden konnte, ist die in der eigenen Arbeit untersuchte Formulierung

nicht als Retardformulierung zur inhalativen Verabreichung des PDE-Inhibitors geeignet.

Eine bessere Verkapselung könnte eventuell erzielt werden, indem weniger Sildenafil zur

Herstellung der Liposomen eingesetzt wird und somit der Anteil an nicht verkapseltem

Wirkstoff reduziert wird. Weiterhin könnte nicht verkapseltes Sildenafil entfernt werden,

indem die Liposomen nach der Herstellung in Albumin-Lösung inkubiert und anschließend

abzentrifugiert werden. An die Liposomenmembran angelagertes Sildenafil würde dabei in

die Albumin-Lösung übertreten. Bei einer Messung des Sildenafil-Gehaltes in den

abzentrifugierten Liposomen würde dann nur der verkapselte Wirkstoff gemessen.

Um die Stabilität der Liposomen in der Lunge zu verbessern, könnten Formulierungen mit

anderen Phospholipiden untersucht werden. Eine weitere Stabilisierung könnte durch eine

Schutzschicht, zum Beispiel aus Polyethylenglykol, erzielt werden.

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5 ZUSAMMENFASSUNG

5 ZUSAMMENFASSUNG

Die pulmonale arterielle Hypertonie (PAH) des Menschen ist eine chronische Erkrankung, die

nicht geheilt werden kann (Olschewski et al. 2007; Chin und Rubin 2008; Galié et al. 2009).

Sildenafil ist seit 2005 unter dem Handelsnamen Revatio ® (Pfizer) zur oralen Behandlung der

PAH zur Verbesserung der Leistungsfähigkeit zugelassen (Arzneimittelkommission der

deutschen Ärzteschaft 2009; Ramani und Park 2010). Nachteile der oralen Behandlung sind

die mäßige Bioverfügbarkeit des Wirkstoffs (Nichols et al. 2002; Sheu et al. 2003) und der

verzögerte maximale Wirkeffekt, der erst 60 Minuten nach der Einnahme eintritt (Ghofrani et

al. 2004c). Zudem konnte trotz der pulmonalen Selektivität des Wirkstoffs (Michelakis 2002;

Michelakis et al. 2003; Barnett und Machado 2006) bei Versuchen mit Schafen bei höheren

Dosen auch eine Senkung des systemischen arteriellen Druckes beobachtet werden (Weimann

et al. 2000). Daraus ergibt sich die Überlegung, den Wirkstoff durch Inhalation direkt in die

Lunge zu verbringen. Dadurch können hohe lokale Wirkstoffkonzentrationen bei minimalen

systemischen Nebeneffekten erreicht werden. Außerdem wird durch die Inhalation ein

schneller Wirkungseintritt erzielt (Le Brun et al. 2000; Khilnani und Banga 2008). Bei

Schafen mit induzierter pulmonaler Hypertonie konnte durch die Inhalation von vernebeltem

Sildenafil eine noch während der Inhalation eintretende selektive Senkung des

pulmonalarteriellen Druckes (pulmonary artery pressure, PAP) erzielt werden, ohne dass es zu

systemischen Nebenwirkungen kam. Ein Nachteil war aber die kurze Wirkdauer: der PAP

stieg nach Beendigung der Inhalation innerhalb weniger Minuten wieder auf den

Ausgangswert (Ichinose et al. 2001).

Ziel dieser Arbeit war es daher, eine liposomale Formulierung des lipophilen PDE 5-

Inhibitors Sildenafil herzustellen und diese hinsichtlich ihrer Eignung als Controlled Release-

Formulierung zur pulmonalen Applikation zu untersuchen.

Vorbereitend wurden Liposomen mit dem lipophilen Fluoreszenzfarbstoff Rhodamin 6G als

Modellsubstanz nach vier verschiedenen Methoden hergestellt. Die Verkapselungseffizienzen

(VE) lagen bei ca. 3,8 bis 7,6 %. Die Verkapselungsraten (VR) unterschieden sich mit ca. 95

bis 99 % kaum voneinander, ebenso wie die medianen Volumendurchmesser (VMD), die bei

ca. 0,6 bis 0,8 µm lagen. Durch die Verneblung mit dem Vibrating Mesh-Vernebler Aeroneb ®

Solo veränderten sich die Charakteristika der Vesikel kaum. Aus der Farbstoffwiederfindung

nach Aerosolisierung von ca. 90 bis 96 % konnte geschlossen werden, dass die Vesikel

nahezu intakt und vollständig vernebelt werden konnten.

- 111 -


5 ZUSAMMENFASSUNG

Mit der Herstellungsmethode, bei der der Farbstoff direkt in den Lipidfilm eingearbeitet

wurde, war die VE am besten reproduzierbar. Diese Methode wurde daher gewählt und weiter

optimiert, um damit Liposomen mit Sildenafil herzustellen. Diese wurden bezüglich ihrer

Verkapselungseigenschaften und Größenverteilung charakterisiert. Die VE lag bei ca. 105 %

und die VR bei ca. 98 %. Da die Vesikel nicht extrudiert werden konnten, lag der VMD mit

ca. 3 µm deutlich über dem der Rhodamin 6G-Liposomen. Da sich die Sildenafil-Liposomen

aus methodischen Gründen nicht mit dem Aeroneb ® Solo vernebeln ließen, wurde die

Verneblungsstabilität mit dem Düsenvernebler Pari LC Sprint ® Star untersucht. Dabei

änderten sich VR und VMD der Vesikel kaum. Die Wiederfindung des Wirkstoffs lag

aufgrund der verneblerspezifischen Aufkonzentrierung durch Verdunstung bei ca. 107 % im

aufgefangenen Aerosol und ca. 127 % im Verneblerrückstand. Der mittlere aerodynamische

Massendurchmesser des mit dem Düsenvernebler generierten Aerosols lag bei ca. 3,5 µm.

Auch diese Liposomen waren somit stabil gegenüber der Verneblung und das Aerosol schien

gut für eine Deposition in peripheren Lungenregionen geeignet.

Bei in vitro Freisetzungsversuchen fiel auf, dass bereits zu Beginn der Versuche knapp 30 %

des liposomal eingesetzten Sildenafils als freies Sildenafil vorlag. Im weiteren

Versuchsverlauf kam es zu einem langsamen Anstieg des freien Sildenafils auf gut 60 % nach

270 Minuten.

Durch diese verzögerte Freisetzung erschienen die Liposomen geeignet, um im Modell der

isolierten, ventilierten und perfundierten Kaninchenlunge getestet zu werden. Dafür wurden

die Übertrittskinetiken von freiem und liposomal verkapseltem Sildenafil verglichen. Bei den

Versuchen mit freiem Sildenafil trat der Wirkstoff erwartungsgemäß sehr schnell in das

Perfusat über, sodass bereits nach zehn Minuten eine maximale Konzentration von 1,33 µg/ml

(ca. 42 % der deponierten Menge) erreicht wurde. Danach blieb die Konzentration relativ

konstant bis zum Versuchsende nach fünf Stunden. Die Konzentrations-Zeit-Kurve von

liposomal verkapseltem Sildenafil lag insgesamt etwas unterhalb der Kurve von freiem

Sildenafil, die Kinetiken der beiden Kurven waren aber ähnlich. Bereits nach fünf Minuten

wurde eine Konzentration von 1,09 µg/ml (ca. 32 % der deponierten Menge) erreicht, die bis

zum Ende des Versuches relativ konstant bei 1,1 µg/ml blieb. Die AUC der Versuche mit

liposomalem Sildenafil unterschied sich nicht signifikant von der AUC der Versuche mit

freiem Wirkstoff. In der Lunge muss es also zu einer schnellen Freisetzung des Wirkstoffs aus

den Vesikeln gekommen sein, weshalb diese sich trotz der vielversprechenden in vitro-

Vorversuche nicht als Retardformulierung zur inhalativen Applikation von Sildenafil eignen.

- 112 -


6 SUMMARY

6 SUMMARY

Human Pulmonary arterial hypertension (PAH) is a chronic disease without cure (Olschewski

et al. 2007; Chin und Rubin 2008; Galié et al. 2009). Sildenafil (Revatio ® ; Pfizer) was

approved in 2005 for the oral treatment of PAH with the aim of strengthening the patients´

physical endurance (Arzneimittelkommission der deutschen Ärzteschaft 2009; Ramani und

Park 2010). Drawbacks of an oral treatment are the rather poor bioavailability of the agent

(Nichols et al. 2002; Sheu et al. 2003) and the delay of 60 minutes after intake until its

maximum effect unfolds (Ghofrani et al. 2004c). Furthermore, despite the agent´s pulmonary

selectivity (Michelakis 2002; Michelakis et al. 2003; Barnett und Machado 2006), a decrease

in systemic artery pressure was observed in trials with sheep, when high doses were

administered (Weimann et al. 2000). This led to the conclusion that the drug should rather be

directly conveyed into the lung by means of inhalation. As a result, a high local drug

concentration can be achieved with concurrent reduction of systemic side effects. Also, the

inhalation ensures a rapid onset of effects (Le Brun et al. 2000; Khilnani und Banga 2008).

The inhalation of aerosolized Sildenafil caused a selective decrease of pulmonary artery

pressure (PAP) in sheep with induced pulmonary hypertension during inhalation without the

occurence of systemic side effects. However, the treatment´s effect was very short: the PAP

rose back to its initial level a few minutes after the inhalation had ceased (Ichinose et al.

2001).

The aim of this study therefore was to produce a liposomal carrier of the lipophilic PDE 5-

inhibitor Sildenafil and to analyse this formulation with regard to its aptitude as a controlled

release formulation for pulmonary application.

In first experiments, liposomes with a model substance, the lipophilic fluorescence dye

rhodamine 6G, were prepared using four different production processes. The encapsulation

efficiencies amounted to 3.8 to 7.6 %. Both, the encapsulation rates (approximately 95 – 99

%) and the volume mean diameters (VMD of 0.6 to 0.8 µm) varied only slightly. The

nebulization of the liposomes, for wich a vibrating mesh-nebulizer (Aeroneb ® Solo, Aerogen,

Dangan, Galway, Ireland) was used, had hardly any effect on the characteristics of the

vesicles. The recovery of the fluorescent dye after aerosolization, which was 90 – 96 %,

indicates that the vesicles were aerosolized nearly intact and complete.

The most appropriate method for producing liposomes with a reproducible encapsulation

efficiency proved to be the direct application of the fluorecscent dye into the lipid film.

Consequently, this method was chosen and further improved for preparing Sildenafil

- 113 -


6 SUMMARY

containing liposomes. These were characterised in terms of their encapsulation properties and

size distribution. An encapsulation efficiency of about 105 % and an encapsulation rate of 98

% was determined. Since the extrusion of these liposomes proved impossible, the VMD of 3

µm considerably exceeded that of the Rhodamine 6G-liposomes. The stability towards

nebulization was tested by means of a jet nebulizer (Pari LC Sprint ® Star, PARI GmbH,

Starnberg, Germany), because technical reasons prevented the nebulization of the sildenafil

liposomes with the Aeroneb ® Solo. In the process, the encapsulation rate and VMD of the

vesicles were only slightly altered. The recovery of the drug attained a level of approximately

107 % in the collected aerosol and approximately 127 % in the residue of the nebulizer. The

increase in drug concentration was due to the solvent evaporation specific to the nebulizer.

The mass median aerodynamic diameter of the aerosol produced by the jet nebulizer was

approximately 3.5 µm. These liposomes, too, were therefore proved to be stable during

nebulization and the aerosol seemed to be well suited for deposition in periphery lung regions.

During in vitro drug release, it was established that even at the beginning of the experiment,

nearly 30 % of free Sildenafil was detected, indicating that the substance was no longer

incorparated in the liposomes. In the course of the experiments, a slow further increase of the

free Sildenafil to 60 % of the incorporated substance ensued after 270 minutes.

As a consequence of this controlled release, the liposomes seemed to be suited for being

tested in the isolated, ventilated and perfused rabbit lung. The absorption kinetics of free and

liposomally encapsulated Sildenafil were compared. As expected, in experiments with free

Sildenafil the drug was rapidly absorbed into the perfusion fluid. As early as ten minutes into

the experiment, a maximum concentration of 1.33 µg/ml (approximately 42 % of the

deposited amount) was reached. Afterwards, the concentration remained relatively constant

until the end of the experiment after five hours. The concentration over time curve for the

liposomally encapsulated Sildenafil ran below the curve for free Sildenafil, but the kinetics of

the curves were similar. After five minutes already, a concentration of 1.09 µg/ml

(approximately 32 % of the liposomally deposited amount) was reached. A steady-state was

established at 1.1 µg/ml, which lasted up to the end of the experiment. The AUC of the

experiments with liposomally encapsulated Sildenafil did not differ significantly from the

AUC of the experiments with the free drug. It therefore has to be assumed that in the lung the

drug was rapidly set free from the vesicles. In conclusion, despite the promising preliminary

tests in vitro, these liposomes were not suited as a controlled release formulation for Sildenafil

inhalation.

- 114 -


7 LITERATURVERZEICHNIS

7 LITERATURVERZEICHNIS

• Abra, R.; Mihalko, P.J.; Schreier, H. (1990): The effect of lipid composition upon the

encapsulation and in vitro leakage of metaproterenol sulfate from 0.2µm diameter, extruded,

multilamellar liposomes. J. Controlled Release 14 (1), S. 71–78.

• Abu-Dahab, R.; Schafer, U.F.; Lehr, C.M. (2001): Lectin-functionalized liposomes for

pulmonary drug delivery: effect of nebulization on stability and bioadhesion. Eur. J. Pharm.

Sci. 14 (1), S. 37–46.

• Agarwal, R.; Gomberg-Maitland, M. (2011): Current therapeutics and practical

management strategies for pulmonary arterial hypertension. Am. Heart J. 162 (2), S. 201–

213.

• Al Omari, M.M.; Zughul, M.B.; Davies, J.E.D.; Badwan, A.A. (2006):

Sildenafil/cyclodextrin complexation: stability constants, thermodynamics, and guest-host

interactions probed by 1H NMR and molecular modeling studies. J. Pharm. Biomed. Anal.

41 (3), S. 857–865.

• Anderson, D.; Kollias-Baker, C.; Colahan, P.; Keene, R.O.; Lynn, R.C.; Hepler, D.I. (2005):

Urinary and serum concentrations of diclofenac after topical application to horses. Vet Ther.

6 (1), S. 57–66.

• Anderson, M.; Omri, A. (2004): The effect of different lipid components on the in vitro

stability and release kinetics of liposome formulations. Drug Deliv. 11 (1), S. 33–39.

• Anttila, S.; Hukkanen, J.; Hakkola, J.; Stjernvall, T.; Beaune, P.; Edwards, R.J. et al. (1997):

Expression and localization of CYP3A4 and CYP3A5 in human lung. Am. J. Respir. Cell

Mol. Biol 16 (3), S. 242–249.

• Arzneimittelkommission der deutschen Ärzteschaft (2009): Revatio® (Sildenafil).

Arzneimittelkommission der deutschen Ärzteschaft. Online verfügbar unter

http://www.akdae.de/Arzneimitteltherapie/NA/Archiv/2009008-Revatio.pdf, zuletzt

aktualisiert am 26.10.2009.

• Bach, J.F.; Rozanski, E.A.; MacGregor, J.; Betkowski, J.M.; Rush, J.E. (2006):

Retrospective evaluation of sildenafil citrate as a therapy for pulmonary hypertension in

dogs. J. Vet. Intern. Med 20 (5), S. 1132–1135.

• Badesch, D.B.; Abman, S.H.; Simonneau, G.; Rubin, L.J.; McLaughlin, V.V. (2007):

Medical therapy for pulmonary arterial hypertension: updated ACCP evidence-based

clinical practice guidelines. Chest 131 (6), S. 1917–1928.

• Baghbanzadeh, A.; Decuypere, E. (2008): Ascites syndrome in broilers: physiological and

nutritional perspectives. Avian Pathol. 37 (2), S. 117–126.

• Bangham, A.D. (1993): Liposomes: the Babraham connection. Chem. Phys. Lipids 64 (1-3),

S. 275–285.

• Bangham, A.D.; Standish MM; Watkins JC (1965): Diffusion of univalent ions across the

lamellae of swollen phospholipids. J. Mol. Biol. 13 (1), S. 238–252.

• Barenholz, Y. (2001): Liposome application: problems and prospects. Curr. Opin. Colloid

Interface Sci. 6, S. 66–77.

• Barker, S.; Taylor, K.; Short, M. (1994): The deposition and clearance of liposome

entrapped 99mTc-DTPA in the human respiratory tract. Int. J. Pharm. 102 (1-3), S. 159–

165.

- 115 -


7 LITERATURVERZEICHNIS

• Barnett, C.F.; Machado, R.F. (2006): Sildenafil in the treatment of pulmonary hypertension.

Vasc. Health Risk Manag. 2 (4), S. 411–422.

• Baş, L.A.; Simşek, A.; Corlu, M.; Yazar, E.; Elmas, M.; Değim, Z.G. (2002): Determination

of intracellular concentrations of free and two types of liposome-encapsulated enrofloxacin

in anatolian shepherd dog monocytes. J. Vet. Med. B Infect. Dis. Vet. Public Health 49 (6),

S. 289–293.

• Beck, S.E.; Laube, B.L.; Barberena, C.I.; Fischer, A.C.; Adams, R.J.; Chesnut, K. et al.

(2002): Deposition and expression of aerosolized rAAV vectors in the lungs of Rhesus

macaques. Mol. Ther. 6 (4), S. 546–554.

• Beck-Broichsitter, M.; Gauss, J.; Gessler, T.; Seeger, W.; Kissel, T.; Schmehl, T. (2010):

Pulmonary targeting with biodegradable salbutamol-loaded nanoparticles. J. Aerosol Med.

Pulm. Drug Deliv. 23 (1), S. 47–57.

• Beck-Broichsitter, M.; Gauss, J.; Packhaeuser, C.; Lahnstein, K.; Schmehl, T.; Seeger, W. et

al. (2009): Pulmonary drug delivery with aerosolizable nanoparticles in an ex vivo lung

model. Int. J. Pharm. 367 (1-2), S. 169–178.

• Bendas, E.R.; Tadros, M.I. (2007): Enhanced transdermal delivery of salbutamol sulfate via

ethosomes. AAPS PharmSciTech 8 (4), S. 213–220.

• Bhalaria, M.K.; Naik, S.; Misra, A.N. (2009): Ethosomes: a novel delivery system for

antifungal drugs in the treatment of topical fungal diseases. Indian J. Exp. Biol. 47 (5), S.

368–375.

• Bhatia, A.; Kumar, R.; Katare, O. (2004): Tamoxifen in topical liposomes: development,

characterization and in-vitro evaluation. J. Pharm. Pharm. Sci. 7 (2), S. 252–259.

• Bivas-Benita, M.; Zwier, R.; Junginger, H.E.; Borchard, G. (2005): Non-invasive

pulmonary aerosol delivery in mice by the endotracheal route. Eur. J. Pharm. Biopharm. 61

(3), S. 214–218.

• Black, S.M.; Sanchez, L.S.; Mata-Greenwood, E.; Bekker, J.M.; Steinhorn, R.H.; Fineman,

J.R. (2001): sGC and PDE5 are elevated in lambs with increased pulmonary blood flow and

pulmonary hypertension. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 281 (5), S. L1051-7.

• Boolell, M.; Allen, M.J.; Ballard, S.A.; Gepi-Attee, S.; Muirhead, G.J.; Naylor, A.M. et al.

(1996a): Sildenafil: an orally active type 5 cyclic GMP-specific phosphodiesterase inhibitor

for the treatment of penile erectile dysfunction. Int. J. Impot. Res. 8 (2), S. 47–52.

• Boolell, M.; Gepi-Attee, S.; Gingell, J.C.; Allen, M.J. (1996b): Sildenafil, a novel effective

oral therapy for male erectile dysfunction. Br. J. Urol. 78 (2), S. 257–261.

• Borok, Z.; Buhl, R.; Grimes, G.J.; Bokser, A.D.; Hubbard, R.C.; Holroyd, K.J. et al. (1991):

Effect of glutathione aerosol on oxidant-antioxidant imbalance in idiopathic pulmonary

fibrosis. Lancet 338 (8761), S. 215–216.

• Bridges, P.A.; Taylor, K.M. (1998): Nebulisers for the generation of liposomal aerosols. Int.

J. Pharm. 173 (1-2), S. 117–125.

• Bridges, P.A.; Taylor, K.M. (2000): An investigation of some of the factors influencing the

jet nebulisation of liposomes. Int. J. Pharm. 204 (1-2), S. 69–79.

• Brown, A.J.; Davison, E.; Sleeper, M.M. (2010): Clinical efficacy of sildenafil in treatment

of pulmonary arterial hypertension in dogs. J. Vet. Intern. Med. 24 (4), S. 850–854.

- 116 -


7 LITERATURVERZEICHNIS

• Buckley, M.S.; Feldman, J.; Wicks, L.; Staib, R. (2010): Phosphodiesterase-5 inhibitors in

management of pulmonary hypertension: Safety, tolerability, and efficacy. Drug Healthc.

Patient Saf. (2), S. 151.

• Buhl, R.; Vogelmeier, C. (1994): Therapie von Lungenkrankheiten mit Antioxidantien.

Pneumologie 48 (2), S. 50–56.

• Caldwell, F.J.; Mueller, P.O.E.; Lynn, R.C.; Budsberg, S.C. (2004): Effect of topical

application of diclofenac liposomal suspension on experimentally induced subcutaneous

inflammation in horses. Am. J. Vet. Res. 65 (3), S. 271–276.

• Chandenier, J.; Bernard, S.; Montharu, J.; Bailly, E.; Fetissof, F.; Monte, M. de et al.

(2009): The utility of a nebulised intra-tracheal rat model of invasive pulmonary

aspergillosis. Mycoses 52 (3), S. 239–245.

• Chin, K.M.; Rubin, L.J. (2008): Pulmonary Arterial Hypertension. J. Am. Coll. Cardiol. 51

(16), S. 1527–1538.

• D'Alonzo, G.E.; Barst, R.J.; Ayres, S.M.; Bergofsky, E.H.; Brundage, B.H.; Detre, K.M. et

al. (1991): Survival in patients with primary pulmonary hypertension. Results from a

national prospective registry. Ann. Intern. Med 115 (5), S. 343–349.

• Damen, J.; Regts, J.; Scherphof, G. (1981): Transfer and exchange of phospholipid between

small unilamellar liposomes and rat plasma high density lipoproteins. Dependence on

cholesterol content and phospholipid composition. Biochim. Biophys. Acta 665 (3), S. 538–

545.

• Darwis, Y.; Kellaway, I.W. (2001): Nebulisation of rehydrated freeze-dried beclomethasone

dipropionate liposomes. Int. J. Pharm. 215 (1-2), S. 113–121.

• Dayan, N.; Touitou, E. (2000): Carriers for skin delivery of trihexyphenidyl HCl: ethosomes

vs. liposomes. Biomaterials 21 (18), S. 1879–1885.

• Degim, Z.; Degim, T.; Bas, L.; Elmas, M. (2002): The use of liposomal enrofloxacin for

intracellular infections in Kangal dogs and visualization of phagocytosis of liposomes. J.

Biomed. Mater. Res. 61 (2), S. 246–251.

• Demaeyer, P.; Akodad, E.M.; Gravet, E.; Schietecat, P.; van Vooren, J.P.; Drowart, A. et al.

(1993): Disposition of liposomal gentamicin following intrabronchial administration in

rabbits. J. Microencapsulation 10 (1), S. 77–88.

• Demel, R.A.; Kruyff, B. de (1976): The function of sterols in membranes. Biochim.

Biophys. Acta 457 (2), S. 109–132.

• Deniz, A.; Sade A; Severcan, F.; Keskin, D.; Tezcaner, A.; Banerjee, S. (2010): Celecoxibloaded

liposomes: effect of cholesterol on encapsulation and in vitro release characteristics.

Biosci. Rep. 30 (5), S. 365–373.

• Dhand, R. (2004): New frontiers in aerosol delivery during mechanical ventilation. Respir.

Care 49 (6), S. 666–677.

• Dissanayake, D.; Wijewardana, T.; Gunawardena, G.; Poxton, I. (2010): Potential use of a

liposome-encapsulated mixture of lipopolysaccharide core types (R1, R2, R3 and R4) of

Escherichia coli in controlling colisepticaemia in chickens. J. Med. Microbiol. 59 (Pt 1), S.

100–107.

• Dubey, V.; Mishra, D.; Jain, N. (2007a): Melatonin loaded ethanolic liposomes:

Physicochemical characterization and enhanced transdermal delivery. Eur. J.

Pharm.Biopharm. 67 (2), S. 398–405.

- 117 -


7 LITERATURVERZEICHNIS

• Dubey, V.; Mishra, D.; Dutta, T.; Nahar, M.; Saraf, D.K.; Jain, N.K. (2007b): Dermal and

transdermal delivery of an anti-psoriatic agent via ethanolic liposomes. J. Controlled

Release 123 (2), S. 148–154.

• Elhissi, A.M.; Faizi, M.; Naji, W.F.; Gill, H.S.; Taylor, K.M. (2007): Physical stability and

aerosol properties of liposomes delivered using an air-jet nebulizer and a novel micropump

device with large mesh apertures. Int. J. Pharm. 334 (1-2), S. 62–70.

• Elhissi, A.M.A.; Karnam, K.K.; Danesh-Azari, M.-R.; Gill, H.S.; Taylor, K.M.G. (2006):

Formulations generated from ethanol-based proliposomes for delivery via medical

nebulizers. J. Pharm. Pharmacol. 58 (7), S. 887–894.

• Elsayed, M.M.; Abdallah, O.Y.; Naggar, V.F.; Khalafallah, N.M. (2007): Deformable

liposomes and ethosomes as carriers for skin delivery of ketotifen. Pharmazie 62 (2), S.

133–137.

• Falagas, M.E.; Michalopoulos, A.; Metaxas, E.I. (2010): Pulmonary drug delivery systems

for antimicrobial agents: facts and myths. Int. J. Antimicrob. Agents 35 (2), S. 101–106.

• Fan, Y.; Wang, D.; Hu, Y.; Liu, J.; Han, G.; Zhao, X. et al. (2012): Liposome and

epimedium polysaccharide-propolis flavone can synergistically enhance immune effect of

vaccine. Int. J. Biol. Macromol. 50 (1), S. 125–130.

• Farr, S.; Kellaway, I.; Parry-Jones, D.; Woolfrey, S. (1985): 99m-Technetium as a marker

of liposomal deposition and clearance in the human lung. Int. J. Pharm. 26 (3), S. 303–316.

• Fatouros, D.G.; Antimisiaris, S.G. (2001): Physicochemical properties of liposomes

incorporating hydrochlorothiazide and chlorothiazide. J. Drug Target. 9 (1), S. 61–74.

• Fatouros, D.G.; Antimisiaris, S.G. (2002): Effect of amphiphilic drugs on the stability and

zeta-potential of their liposome formulations: a study with prednisolone, diazepam, and

griseofulvin. J. Colloid Interface Sci. 251 (2), S. 271–277.

• Fey, K. (2006): Nichtinfektiöse Krankheiten der tiefen Atemwege und der Lunge.

Chronisch obstruktive Bronchi(oli)tis. In: Olof Dietz (Hg.): Handbuch Pferdepraxis. 131

Tabellen : 18 Übersichten. 3. Aufl. Stuttgart: Enke, S. 332.

• Fielding, R.M.; Abra, R.M. (1992): Factors Affecting the Release Rate of Terbutaline from

Liposome Formulations After Intratracheal Instillation in the Guinea Pig. Pharm. Res. 09

(2), S. 220–223.

• Fransson, B.A.; Peck, K.E.; Smith, J.K.; Anthony, J.A.; Mealey, K.L. (2002): Transdermal

absorption of a liposome-encapsulated formulation of lidocaine following topical

administration in cats. Am. J. Vet. Res. 63 (9), S. 1309–1312.

• Frisbie, D.D.; McIlwraith, C.W.; Kawcak, C.E.; Werpy, N.M.; Pearce, G.L. (2009):

Evaluation of topically administered diclofenac liposomal cream for treatment of horses

with experimentally induced osteoarthritis. Am. J. Vet. Res 70 (2), S. 210–215.

• Fukumoto, Y.; Shimokawa, H. (2011): Recent progress in the management of pulmonary

hypertension. Circ. J. 75 (8), S. 1801–1810.

• Galié, N.; Hoeper, M.M.; Humbert, M.; Torbicki, A.; Vachiery, J.-L.; Barbera, J.A. et al.

(2009): Guidelines for the diagnosis and treatment of pulmonary hypertension: The Task

Force for the Diagnosis and Treatment of Pulmonary Hypertension of the European Society

of Cardiology (ESC) and the European Respiratory Society (ERS), endorsed by the

International Society of Heart and Lung Transplantation (ISHLT). Eur. Heart J. 30 (20), S.

2493–2537.

- 118 -


7 LITERATURVERZEICHNIS

• Ghazanfari, T.; Am Elhissi; Ding, Z.; Taylor, K.M. (2007): The influence of fluid

physicochemical properties on vibrating-mesh nebulization. Int. J. Pharm. 339 (1-2), S.

103–111.

• Ghofrani, H.; Pepke-Zaba, J.; Barbera, J.; Channick, R.; Keogh, A.; Gomez-Sanchez, M. et

al. (2004a): Nitric oxide pathway and phosphodiesterase inhibitors in pulmonary arterial

hypertension. J. Am. Coll. Cardiol. 43 (12 Suppl. S), S. 68S-72S.

• Ghofrani, H.A.; Reichenberger, F.; Kohstall, M.G.; Mrosek, E.H.; Seeger, T.; Olschewski,

H. et al. (2004b): Sildenafil increased exercise capacity during hypoxia at low altitudes and

at Mount Everest base camp: a randomized, double-blind, placebo-controlled crossover

trial. Ann. Intern. Med 141 (3), S. 169–177.

• Ghofrani, H.A.; Voswinckel, R.; Reichenberger, F.; Olschewski, H.; Haredza, P.; Karadaş,

B. et al. (2004c): Differences in hemodynamic and oxygenation responses to three different

phosphodiesterase-5 inhibitors in patients with pulmonary arterial hypertension. J. Amer.

College Cardiology 44 (7), S. 1488–1496.

• Gilbert, B.E.; Six, H.R.; Wilson, S.Z.; Wyde, P.R.; Knight, V. (1988): Small particle

aerosols of enviroxime-containing liposomes. Antiviral Res. 9 (6), S. 355–365.

• Gobry, V.; Bouchard, G.; Carrupt, P.-A.; Testa, B.; Girault, H.H. (2000): Physicochemical

Characterization of Sildenafil: Ionization, Lipophilicity Behavior, and Ionic-Partition

Diagram Studied by Two-Phase Titration and Electrochemistry. HeIv. Chim. Acta 83 (7), S.

1465–1474.

• Gonda, I. (2000): The ascent of pulmonary drug delivery. J. Pharm. Sci. 89 (7), S. 940–945.

• Gonzalez-Rothi, R.J.; Straub, L.; Cacace, J.L.; Schreier, H. (1991): Liposomes and

pulmonary alveolar macrophages: functional and morphologic interactions. Exp. Lung Res.

17 (4), S. 687–705.

• Goyal, P.; Goyal, K.; Vijaya Kumar, S.G.; Singh, A.; Katare, O.P.; Mishra, D.N. (2005):

Liposomal drug delivery systems--clinical applications. Acta Pharm. 55 (1), S. 1–25.

• Gregoriadis, G. (1976): The carrier potential of liposomes in biology and medicine (second

of two parts). . Engl. J. Med. 295 (14), S. 765–770.

• Gregoriadis, G. (1991): Overview of liposomes. J. Antimicrob. Chemother. 28 (Suppl. B),

S. 39–48.

• Gregoriadis, G. (2008): Liposome research in drug delivery: the early days. J. Drug Target.

16 (7), S. 520–524.

• Gregoriadis, G.; Davis, C. (1979): Stability of liposomes in vivo and in vitro is promoted by

their cholesterol content and the presence of blood cells. Biochem. Biophys. Res. Commun.

89 (4), S. 1287–1293.

• Groneberg, D.A.; Witt, C.; Wagner, U.; Chung, K.F.; Fischer, A. (2003): Fundamentals of

pulmonary drug delivery. Respir. Med. 97 (4), S. 382–387.

• Gros, G. (2000): Atmung. Vergleichende Pathophysiologie der Lungenfunktion der

Haustiere. Obstruktive Lungenerkrankungen. In: W.v Engelhardt und G. Breves (Hg.):

Physiologie der Haustiere. Stuttgart: Enke, S. 245–246.

• Grossman, J. (1994): The evolution of inhaler technology. J. Asthma 31 (1), S. 55–64.

• Hassoun, P.M.; Mouthon, L.; Barberà, J.A.; Eddahibi, S.; Flores, S.C.; Grimminger, F. et al.

(2009): Inflammation, Growth Factors, and Pulmonary Vascular Remodeling. J. Am. Coll.

Cardiol. 54 (1), S. S10.

- 119 -


7 LITERATURVERZEICHNIS

• Hawkins, E.C.: Erkrankungen der Atemwege. Pulmonale Hypertonie. In: Richard W.

Nelson und C. Guillermo Couto (Hg.): Innere Medizin der Kleintiere, 2. Auflage, 2010, S.

335–336.

• Hawkins, E.C.: Erkrankungen der Atemwege. Erkrankungen von Trachea und Bronchien.

In: Richard W. Nelson und C. Guillermo Couto (Hg.): Innere Medizin der Kleintiere, 2.

Auflage, 2010, S. 312–314.

• Hawkins, E.C.: Erkrankungen der Lungenparenchyms und der Lungengefäße. Bakterielle

Pneumonie. In: Richard W. Nelson und C. Guillermo Couto (Hg.): Innere Medizin der

Kleintiere, 2. Auflage, 2010, S. 324–325.

• Huang, Y.Y.; Wang, C.H. (2006): Pulmonary delivery of insulin by liposomal carriers. J

Control Release 113 (1), S. 9–14.

• Humbert, M.; Morrell, N.W.; Archer, S.L.; Stenmark, K.R.; MacLean, M.R.; Lang, I.M. et

al. (2004): Cellular and molecular pathobiology of pulmonary arterial hypertension. J. Am

Coll. Cardiol. 43 (12), S. S13.

• Hyland, R.; Roe, E.G.H.; Jones, B.C.; Smith, D.A. (2001): Identification of the cytochrome

P450 enzymes involved in the N-demethylation of sildenafil. Br. J. Clin. Pharmacol. 51 (3),

S. 239–248.

• Ichinose, F.; Erana-Garcia, J.; Hromi, J.; Raveh, Y.; Jones, R.; Krim, L. et al. (2001):

Nebulized sildenafil is a selective pulmonary vasodilator in lambs with acute pulmonary

hypertension. Crit. Care Med. 29 (5), S. 1000–1005.

• Itoh, T. (2003): A Combination of Oral Sildenafil and Beraprost Ameliorates Pulmonary

Hypertension in Rats. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 169 (1), S. 34–38.

• Jain, S.; Tiwary, A.K.; Sapra, B.; Jain, N.K. (2007): Formulation and evaluation of

ethosomes for transdermal delivery of lamivudine. AAPS PharmSciTech 8 (4), S. E111.

• Julian, R.J. (2000): Physiological, management and environmental triggers of the ascites

syndrome: a review. Avian Pathol. 29 (6), S. 519–527.

• Juliano, R.L.; McCullough, H.N. (1980): Controlled delivery of an antitumor drug:

localized action of liposome encapsulated cytosine arabinoside administered via the

respiratory system. J. Pharmacol. Exp. Ther. 214 (2), S. 381–387.

• Juliano, R.L.; Stamp, D. (1975): The effect of particle size and charge on the clearance rates

of liposomes and liposome encapsulated drugs. Biochem. Biophys. Res. Commun. 63 (3), S.

651–658.

• Jutila, A.; Soderlund, T.; Pakkanen, A.L.; Huttunen, M.; Kinnunen, P.K. (2001):

Comparison of the effects of clozapine, chlorpromazine, and haloperidol on membrane

lateral heterogeneity. Chem. Phys. Lipids 112 (2), S. 151–163.

• Kass, D.; Takimoto, E.; Nagayama, T.; Champion, H. (2007): Phosphodiesterase regulation

of nitric oxide signaling. Cardiovasc. Res. 75 (2), S. 303–314.

• Kellaway, I.W.; Farr, S.J. (1990): Liposomes as drug delivery systems to the lung. Adv.

Drug Deliv. Reviews 5 (1-2), S. 149–161.

• Khan; Rezler, E.M.; Lauer-Fields, J.; Fields, G.B. (2008): Effects of drug hydrophobicity on

liposomal stability. Chem. Biol. Drug Des. 71 (1), S. 3–7.

• Khilnani, G.; Banga A. (2008): Aerosol Therapy. Indian J. Chest Dis. Allied Sci. (50), S.

209–219.

- 120 -


7 LITERATURVERZEICHNIS

• Kirby, C.; Clarke, J.; Gregoriadis, G. (1980): Effect of the cholesterol content of small

unilamellar liposomes on their stability in vivo and in vitro. Biochem. J. 186 (2), S. 591–

598.

• Kleemann, E.; Schmehl, T.; Gessler, T.; Bakowsky, U.; Kissel, T.; Seeger, W. (2007):

Iloprost-containing liposomes for aerosol application in pulmonary arterial hypertension:

formulation aspects and stability. Pharm. Res. 24 (2), S. 277–287.

• Kleiter, M.; Tichy, A.; Willmann, M.; Pagitz, M.; Wolfesberger, B. (2010): Concomitant

liposomal doxorubicin and daily palliative radiotherapy in advanced feline soft tissue

sarcomas. Vet. Radiol. Ultrasound 51 (3), S. 349–355.

• Klepser, M. (2004): Role of nebulized antibiotics for the treatment of respiratory infections.

Curr. Opin. Infect. Dis. 17 (2), S. 109–112.

• Kraske, W.V.; Mountcastle, D.B. (2001): Effects of cholesterol and temperature on the

permeability of dimyristoylphosphatidylcholine bilayers near the chain melting phase

transition. Biochim. Biophys. Acta 1514 (2), S. 159–164.

• Kulkarni, S.B.; Betageri, G.V.; Singh, M. (1995): Factors affecting microencapsulation of

drugs in liposomes. J. Microencapsul. 12 (3), S. 229–246.

• Kuronuma, K.; Mitsuzawa, H.; Takeda, K.; Nishitani, C.; Chan, E.D.; Kuroki, Y. et al.

(2009): Anionic Pulmonary Surfactant Phospholipids Inhibit Inflammatory Responses from

Alveolar Macrophages and U937 Cells by Binding the Lipopolysaccharide-interacting

Proteins CD14 and MD-2. J. Biol. Chem. 284 (38), S. 25488–25500.

• Lahnstein, K.; Schmehl, T.; Rusch, U.; Rieger, M.; Seeger, W.; Gessler, T. (2008):

Pulmonary absorption of aerosolized fluorescent markers in the isolated rabbit lung. Int. J.

Pharm. 351 (1-2), S. 158–164.

• Lahnstein, Kerstin (2009): Charakterisierung verschiedener Verneblersysteme und

Untersuchung der Übertrittskinetiken von inhalativ verabreichten Fluoreszenzfarbstoffen

sowie von Salbutamol am Modell der isolierten Kaninchenlunge. 1. Aufl. Giessen: VVB

Laufersweiler.

• Lambros, M.P.; Bourne, D.W.; Abbas, S.A.; Johnson, D.L. (1997): Disposition of

aerosolized liposomal amphotericin B. J. Pharm. Sci. 86 (9), S. 1066–1069.

• Lasch J.; Weissig, V.; Brandl, M. (2002): General methods. Preparation of liposomes.

Preparation methods. In: Vladimir Petrovitch Tortchiline und Volkmar Weissig (Hg.):

Liposomes. 2. Aufl. Oxford ; New York: Oxford University Press, S. 4–23.

• Lasic, D.D. (1988): The mechanism of vesicle formation. Biochem. J. 256 (1), S. 1–11.

• Lasic, D.D. (1998): Novel applications of liposomes. Trends Biotechnol. 16 (7), S. 307–

321.

• Laube, B.L. (2005): The expanding role of aerosols in systemic drug delivery, gene therapy,

and vaccination. Respir. Care 50 (9), S. 1161–1176.

• Lavorini, F.; Fontana, G.A. (2009): Targeting drugs to the airways: The role of spacer

devices. Expert Opin. Drug Deliv. 6 (1), S. 91–102.

• Le Brun, P.P.; Boer, A.H. de; Heijerman, H.G.; Frijlink, H.W. (2000): A review of the

technical aspects of drug nebulization. Pharm. World Sci. 22 (3), S. 75–81.

• Leung, K. (1996): The stability of liposomes to ultrasonic nebulisation. Int. J. Pharm. 145

(1-2), S. 95–102.

- 121 -


7 LITERATURVERZEICHNIS

• Levine, D.G.; Epstein, K.L.; Neelis, D.A.; Ross, M.W. (2009): Effect of topical application

of 1% diclofenac sodium liposomal cream on inflammation in healthy horses undergoing

intravenous regional limb perfusion with amikacin sulfate. Am. J. Vet. Res 70 (11), S. 1323–

1325.

• Lian, T.; Ho, R.J. (2001): Trends and developments in liposome drug delivery systems. J.

Pharm. Sci. 90 (6), S. 667–680.

• Lippmann, M. (2011): Regional Deposition of Particles in the Human Respiratory Tract.

Comprehensive Physiology, S. 213–232.

• Lippmann, M.; Yeates, D.B.; Albert, R.E. (1980): Deposition, retention, and clearance of

inhaled particles. Br. J. Ind. Med. 37 (4), S. 337–362.

• Liu, S.; Guo, D.; Guo, Y.; Zhou, W. (2011): Preparation and pharmacokinetics of ceftiofur

sodium liposomes in cows. J. Vet. Pharmacol. Ther 34 (1), S. 35–41.

• Liu, X.; Wang, J.Y.; Khlentzos, A.M.; Fontaine, F.; Nikolovski, J.; Goh, L.-A.; Roberts,

M.S. (2009): Influence of perfusate composition on drug disposition in the in-situ perfused

rat lung. Int. J. Pharm. 382 (1-2), S. 192–197.

• López-Pinto, J.; González-Rodríguez, M.; Rabasco, A. (2005): Effect of cholesterol and

ethanol on dermal delivery from DPPC liposomes. Int. J. Pharm. 298 (1), S. 1–12.

• Lynn, R.C.; Hepler, D.I.; Kelch, W.J.; Bertone, J.J.; Smith, B.L.; Vatistas, N.J. (2004):

Double-blinded placebo-controlled clinical field trial to evaluate the safety and efficacy of

topically applied 1% diclofenac liposomal cream for the relief of lameness in horses. Vet.

Ther. 5 (2), S. 128–138.

• MacDonald, R.C.; MacDonald, R.I.; Menco, B.P.; Takeshita, K.; Subbarao, N.K.; Hu, L.R.

(1991): Small-volume extrusion apparatus for preparation of large, unilamellar vesicles.

Biochim. Biophys. Acta. 1061 (2), S. 297–303.

• MacLean, M.R.; Johnston, E.D.; Mcculloch, K.M.; Pooley, L.; Houslay, M.D.; Sweeney, G.

(1997): Phosphodiesterase isoforms in the pulmonary arterial circulation of the rat: changes

in pulmonary hypertension. J. Pharmacol. Exp. Ther. 283 (2), S. 619–624.

• Mansour, H.M.; Rhee, Y.S.; Wu, X. (2009): Nanomedicine in pulmonary delivery. Int. J.

anomedicine 4, S. 299–319.

• Marr, A.K.; Kurzman, I.D.; Vail, D.M. (2004): Preclinical evaluation of a liposomeencapsulated

formulation of cisplatin in clinically normal dogs. Am. J. Vet. Res 65 (11), S.

1474–1478.

• Mayer, L.D.; Hope, M.J.; Cullis, P.R. (1986): Vesicles of variable sizes produced by a rapid

extrusion procedure. Biochim. Biophys. Acta 858 (1), S. 161–168.

• McCalden, T.A. (1990): Particulate systems for drug delivery to the lung. Adv. Drug Deliv.

Rev. 5 (3), S. 253–263.

• McCalden, T.A.; Radhakrishnan, R. (1991): A comparative study of the bronchodilator

effect and duration of action of liposome encapsulated beta-2 adrenergic agonists in the

guinea-pig. Pulm. Pharmacol. 4 (3), S. 140–145.

• McCalden, T.A.; Abra, R.M.; Mihalko, P.J. (1989): Bronchodilator Efficacy of Liposome

Formulations of Metaproterenol Sulfate in the Anesthetized Guinea Pig. J. Liposome Res. 1

(2), S. 211–222.

• McLaughlin, V.V. (2002): Survival in Primary Pulmonary Hypertension: The Impact of

Epoprostenol Therapy. Circulation 106 (12), S. 1477–1482.

- 122 -


7 LITERATURVERZEICHNIS

• McLaughlin, V.V.; Oudiz, R.J.; Frost, A.; Tapson, V.F.; Murali, S.; Channick, R.N. et al.

(2006): Randomized Study of Adding Inhaled Iloprost to Existing Bosentan in Pulmonary

Arterial Hypertension. Am. J. Resp. Crit. Care Med. 174 (11), S. 1257–1263.

• Meisner, D.; Pringle, J.; Mezei, M. (1989): Liposomal pulmonary drug delivery I. In vivo

disposition of atropine base in solution and liposomal form following endotracheal

instillation to the rabbit lung. J. Microencapsul. 6 (3), S. 379–387.

• Melnikov, P.; Corbi, P.; Cuin, A.; Cavicchioli, M.; Guimaraes, W. (2003): Physicochemical

properties of sildenafil citrate (Viagra) and sildenafil base. J. Pharm. Sci. 92 (10), S. 2140–

2143.

• Michelakis, E. (2002): Oral Sildenafil Is an Effective and Specific Pulmonary Vasodilator in

Patients With Pulmonary Arterial Hypertension: Comparison With Inhaled Nitric Oxide.

Circulation 105 (20), S. 2398–2403.

• Michelakis, E.D.; Tymchak, W.; Noga, M.; Webster, L.; Wu, X.-C.; Lien, D. et al. (2003):

Long-term treatment with oral sildenafil is safe and improves functional capacity and

hemodynamics in patients with pulmonary arterial hypertension. Circulation 108 (17), S.

2066–2069.

• Mohammed, A.R.; Weston, N.; Coombes, A.G.; Fitzgerald, M.; Perrie, Y. (2004):

Liposome formulation of poorly water soluble drugs: optimisation of drug loading and

ESEM analysis of stability. Int. J. Pharm. 285 (1-2), S. 23–34.

• Moribe, K.; Maruyama, K.; Iwatsuru, M. (1999): Encapsulation characteristics of nystatin in

liposomes: effects of cholesterol and polyethylene glycol derivatives. Int. J. Pharm. 188 (2),

S. 193–202.

• Moscho, A.; Orwar, O.; Chiu, D.T.; Modi, B.P.; Zare, R.N. (1996): Rapid preparation of

giant unilamellar vesicles. Proc. atl. Acad. Sci. U S A 93 (21), S. 11443–11447.

• Müller, R.H.; Mäder, K.; Gohla, S. (2000): Solid lipid nanoparticles (SLN) for controlled

drug delivery - a review of the state of the art. Eur. J. Pharm. Biopharm. 50 (1), S. 161–177.

• Müller, Rainer H.; Schuhmann, Raimund (1996): Teilchengrössenmessung in der

Laborpraxis. Kurzes Lehrbuch mit Einführung in die Theorie:

Photonenkorrelationsspektroskopie (PCS) - Laserdiffraktometrie (LD) - Coulter-

Messprinzip (CM) und Messbeispielen aus dem Schwerpunktbereich der

Koaleszenzuntersuchungen: - Turbidimetrie vs. Coulter-Counter-Assay ; erstellt anlässlich:

Colloidal drug carriers (cdc), 3rd expert meeting, Workshop "Particle Sizing", 29-31 May

1997, Berlin ; mit 21 Tabellen. Unter Mitarbeit von Kai Thode. Stuttgart: Wiss. Verl.-Ges.

• Murray, F.; MacLean, M.R.; Pyne, N.J. (2002): Increased expression of the cGMP-inhibited

cAMP-specific (PDE3) and cGMP binding cGMP-specific (PDE5) phosphodiesterases in

models of pulmonary hypertension. Br. J. Pharmacol. 137 (8), S. 1187–1194.

• Murray, J.F. (2010): The structure and function of the lung. Int. J. Tuberc. Lung. Dis. 14 (4),

S. 391–396.

• Myers, M.A.; Thomas, D.A.; Straub, L.; Soucy, D.W.; Niven, R.W.; Kaltenbach, M. et al.

(1993): Pulmonary effects of chronic exposure to liposome aerosols in mice. Exp. Lung.

Res. 19 (1), S. 1–19.

• Nichols, D.J.; Muirhead, G.J.; Harness, J.A. (2002): Pharmacokinetics of sildenafil after

single oral doses in healthy male subjects: absolute bioavailability, food effects and dose

proportionality. Br. J. Clin. Pharmacol. 53 (Suppl. 1), S. 5S-12S.

• Niemeier, R.W. (1984): The isolated perfused lung. Environ. Health Perspect. 56, S. 35–41.

- 123 -


7 LITERATURVERZEICHNIS

• Niven, R.W.; Schreier, H. (1990): Nebulization of Liposomes. I. Effects of Lipid

Composition. Pharm. Res. 07 (11), S. 1127–1133.

• Niven, R.W.; Speer, M.; Schreier, H. (1991): Nebulization of Liposomes. II. The Effects of

Size and Modeling of Solute Release Profiles. Pharm. Res. 08 (2), S. 217–221.

• O'Callaghan, C.; Barry, P.W. (1997): The science of nebulised drug delivery. Thorax 52

(Suppl. 2), S. S31.

• Olschewski, H.; Ghofrani, H.A.; Schmehl, T.; Winkler, J.; Wilkens, H.; Hoper, M.M. et al.

(2000): Inhaled iloprost to treat severe pulmonary hypertension. An uncontrolled trial.

German PPH Study Group. Ann. Intern. Med. 132 (6), S. 435–443.

• Olschewski, H.; Hoeper, M.M.; Borst, M.M.; Ewert, R.; Grünig, E.; Kleber, F.-X. et al.

(2007): Diagnostik und Therapie der chronischen pulmonalen Hypertonie. Clin. Res.

Cardiol. 96 (5), S. 301–330.

• Olschewski, H.; Rose, F.; Grunig, E.; Ghofrani, H.A.; Walmrath, D.; Schulz, R. et al.

(2001): Cellular pathophysiology and therapy of pulmonary hypertension. J. Lab. Clin.

Med. 138 (6), S. 367–377.

• Olson, F.; Hunt, C.A.; Szoka, F.C.; Vail, W.J.; Papahadjopoulos, D. (1979): Preparation of

liposomes of defined size distribution by extrusion through polycarbonate membranes.

Biochim. Biophys. Acta 557 (1), S. 9–23.

• Paolino, D.; Lucania, G.; Mardente, D.; Alhaique, F.; Fresta, M. (2005): Ethosomes for skin

delivery of ammonium glycyrrhizinate: in vitro percutaneous permeation through human

skin and in vivo anti-inflammatory activity on human volunteers. J. Control. Release 106

(1-2), S. 99–110.

• Parthasarathy, R.; Gilbert, B.; Mehta, K. (1999): Aerosol delivery of liposomal all-transretinoic

acid to the lungs. Cancer Chemother. Pharmacol. 43 (4), S. 277–283.

• Patton, J.S.; Byron, P.R. (2007): Inhaling medicines: delivering drugs to the body through

the lungs. at Rev Drug Discov 6 (1), S. 67–74.

• Patton, J.S.; Fishburn, C.S.; Weers, J.G. (2004): The lungs as a portal of entry for systemic

drug delivery. Pro.c Am. Thorac. Soc. 1 (4), S. 338–344.

• Phillips, C.G.; Kaye, SR (1995): Diameter-based analysis of the branching geometry of four

mammalian bronchial trees. Respir. Physiol. 102 (2-3), S. 303–316.

• Poelma, D.L.; Zimmermann, L.J.; Scholten, H.H.; Lachmann, B.; van, I. (2002): In vivo and

in vitro uptake of surfactant lipids by alveolar type II cells and macrophages. Am. J. Physiol.

Lung Cell Mol. Physiol. 283 (3), S. L648-54.

• Prousky, J. (2008): The treatment of pulmonary diseases and respiratory-related conditions

with inhaled (nebulized or aerosolized) glutathione. Evid. Based Complement Alternat. Med.

5 (1), S. 27–35.

• Ramani, G.V.; Park, M.H. (2010): Update on the clinical utility of sildenafil in the treatment

of pulmonary arterial hypertension. Drug Des. Devel. Ther. 4, S. 61–70.

• Rhoades, R.A. (1984): Isolated perfused lung preparation for studying altered gaseous

environments. Environ. Health Perspect. 56, S. 43–50.

• Richalet, J.-P. (2004): Sildenafil Inhibits Altitude-induced Hypoxemia and Pulmonary

Hypertension. Am. J. Resp. Crit. Care Med. 171 (3), S. 275–281.

• Rondelet, B. (2004): Signaling Molecules in Overcirculation-Induced Pulmonary

Hypertension in Piglets: Effects of Sildenafil Therapy. Circulation 110 (15), S. 2220–2225.

- 124 -


7 LITERATURVERZEICHNIS

• Rubin, B. (2010): Air and soul: the science and application of aerosol therapy. Respir. Care

55 (7), S. 911–921.

• Rüsch, Ute (2010): Herstellung und Anwendung von liposomalen Carriersystemen für die

inhalative Applikation von Iloprost. 1. Aufl. Giessen: VVB Laufersweiler.

• Saari, M.; Vidgren, M.T.; Koskinen, M.O.; Turjanmaa, V.M.; Nieminen, M.M. (1999):

Pulmonary distribution and clearance of two beclomethasone liposome formulations in

healthy volunteers. Int. J. Pharm. 181 (1), S. 1–9.

• Salama, R.; Traini, D.; Chan, H.-K.; Young, P.M. (2009): Recent Advances in Controlled

Release Pulmonary Therapy. Curr. drug deliv. 6 (4), S. 404–414.

• Schermuly, R.T. (2003): Chronic Sildenafil Treatment Inhibits Monocrotaline-induced

Pulmonary Hypertension in Rats. Am. J. Resp. Crit. Care Med. 169 (1), S. 39–45.

• Scheuch, G.; Kohlhaeufl, M.J.; Brand, P.; Siekmeier, R. (2006): Clinical perspectives on

pulmonary systemic and macromolecular delivery. Adv. Drug Deliv. Rev. 58 (9-10), S. 996–

1008.

• Schlesinger, R.B.; La McFadden (1981): Comparative morphometry of the upper bronchial

tree in six mammalian species. Anat. Rec. 199 (1), S. 99–108.

• Schreier, H. (1994): Pulmonary Delivery of Liposomal Drugs. J. Liposome Res. 4 (1), S.

229–238.

• Schreier, H.; Gonzalez-Rothi, R.J.; Stecenko, A.a. (1993): Pulmonary delivery of

liposomes. J. controlled release 24, S. 209–223.

• Schreier, H.; McNicol, K.J.; Ausborn Michael; Soucy David M.; Derendorf Hartmut;

Stecenko Arlene a; Gonzalez-Rothi Ricardo J (1992): Pulmonary delivery of amikacin

liposomes and acute liposome toxicity in the sheep. Int. J. Pharm. 87, S. 183–193.

• Sebkhi, A. (2003): Phosphodiesterase Type 5 as a Target for the Treatment of Hypoxia-

Induced Pulmonary Hypertension. Circulation 107 (25), S. 3230–3235.

• Seeger, W.; Walmrath, D.; Grimminger, F.; Rosseau, S.; Schutte, H.; Kramer, H.J. et al.

(1994): Adult respiratory distress syndrome: model systems using isolated perfused rabbit

lungs. Methods Enzymol. 233, S. 549–584.

• Sessa, G.; Weissmann, G. (1968): Phospholipid spherules (liposomes) as a model for

biological membranes. J. Lipid Res. 9 (3), S. 310–318.

• Sharma, A.; Sharma, U.S. (1997): Liposomes in drug delivery: Progress and limitations. Int.

J. Pharm. 154 (2), S. 123–140.

• Shek, P.N.; Suntres, Z.E.; Brooks, J.I. (1994): Liposomes in pulmonary applications:

physicochemical considerations, pulmonary distribution and antioxidant delivery. J. Drug

Target 2 (5), S. 431–442.

• Sheu, M.-T.; Wu, A.-B.; Yeh, G.-C.; Hsia, A.; Ho, H.-O. (2003): Development of a liquid

chromatographic method for bioanalytical applications with sildenafil. J. Chromatogr. B

Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 791 (1-2), S. 255–262.

• Simonneau, G.; Robbins, I.M.; Beghetti, M.; Channick, R.N.; Delcroix, M.; Denton, C.P. et

al. (2009): Updated Clinical Classification of Pulmonary Hypertension. J. Am. Coll.

Cardiol. 54 (1), S. S43.

• Sladky, K.K.; Krugner-Higby, L.; Meek-Walker, E.; Heath, T.D.; Paul-Murphy, J. (2006):

Serum concentrations and analgesic effects of liposome-encapsulated and standard

butorphanol tartrate in parrots. Am. J. Vet. Res 67 (5), S. 775–781.

- 125 -


7 LITERATURVERZEICHNIS

• Smith, L.J.; KuKanich, B.; Hogan, B.K.; Brown, C.; Heath, T.D.; Krugner-Higby, L.A.

(2008): Pharmacokinetics of a controlled-release liposome-encapsulated hydromorphone

administered to healthy dogs. J. Vet. Pharmacol. Ther 31 (5), S. 415–422.

• Stamm, J.A.; Risbano, M.G.; Mathier, M.A. (2011): Overview of current therapeutic

approaches for pulmonary hypertension. Pulm. Circ. 1 (2), S. 138–159.

• Suarez, S.; Garcia-Contreras, L.; Sarubbi, D.; Flanders, E.; O'Toole, D.; Smart, J.; Hickey,

A.J. (2001): Facilitation of pulmonary insulin absorption by H-MAP: pharmacokinetics and

pharmacodynamics in rats. Pharm. Res 18 (12), S. 1677–1684.

• Szoka, F.; Papahadjopoulos, D. (1980): Comparative properties and methods of preparation

of lipid vesicles (liposomes). Annu. Rev. Biophys. Bioeng 9, S. 467–508.

• Tan, S.; Hung, O.; Whynot, S.; Mezei, M. (1996): Sustained tissue drug concentrations

following inhalation of liposome-encapsulated fentanyl in rabbits. Drug Deliv. 3 (4), S.

251–254.

• Taylor, K.; Elhissi, A. (2006): Preparation of Liposomes for Pulmonary Delivery Using

Medical Nebulizers. In: Liposome Technology, Third Edition, Volume I: Liposome

Preparation and Related Techniques, S. 67–84.

• Taylor, K.; Taylor, G.; Kellaway, I.; Stevens, J. (1990): The stability of liposomes to

nebulisation. Int. J. Pharm. 58, S. 57–61.

• Taylor, K.M.; Farr, S.J. (1993): Liposomes for Drug Delivery to the Respiratory Tract.

Drug Dev. Ind. Pharm. 19 (1-2), S. 123–142.

• Taylor, K.M.; Newton, J.M. (1992): Liposomes for controlled delivery of drugs to the lung.

Thorax 47 (4), S. 257–259.

• Taylor, K.M.; Taylor, G.; Kellaway, I.W.; Stevens, J. (1989): The influence of liposomal

encapsulation on sodium cromoglycate pharmacokinetics in man. Pharm. Res. 6 (7), S.

633–636.

• Thomas, D.A.; Myers, M.A.; Wichert, B.; Schreier, H.; Gonzalez-Rothi, R.J. (1991): Acute

effects of liposome aerosol inhalation on pulmonary function in healthy human volunteers.

Chest 99 (5), S. 1268–1270.

• Tomita, T.; Watanabe, M.; Takahashi, T.; Kumai, K.; Tadakuma, T.; Yasuda, T. (1989):

Temperature-sensitive release of adriamycin, an amphiphilic antitumor agent, from

dipalmitoylphosphatidylcholine-cholesterol liposomes. Biochim. Biophys. Acta 978 (2), S.

185–190.

• Torchilin, V.P. (2005): Recent advances with liposomes as pharmaceutical carriers. at.

Rev. Drug Discov. 4 (2), S. 145–160.

• Touitou, E.; Dayan, N.; Bergelson, L.; Godin, B.; Eliaz, M. (2000): Ethosomes — novel

vesicular carriers for enhanced delivery: characterization and skin penetration properties. J.

Controlled Release 65 (3), S. 403–418.

• Touitou, E.; Godin, B.; Dayan, N.; Weiss, C.; Piliponsky, A.; Levi-Schaffer, F. (2001):

Intracellular delivery mediated by an ethosomal carrier. Biomaterials 22 (22), S. 3053–

3059.

• Traini, D.; Young, P. (2009): Delivery of antibiotics to the respiratory tract: an update.

Expert Opin. Drug Deliv. 6 (9), S. 897–905.

- 126 -


7 LITERATURVERZEICHNIS

• Tronde, A.; Bosquillon, C.; Forbes, B. (2008): The Isolated Perfused Lung for Drug

Absorption Studies. In: Carsten Ehrhardt und Kwang-Jin Kim (Hg.): Biotechnology:

Pharmaceutical Aspects. Boston, MA: Springer US (VII), S. 135–163.

• Tronde, A.; Nordén, B.; Jeppsson, A.-B.; Brunmark, P.; Nilsson, E.; Lennernäs, H.;

Bengtsson, U.H. (2003): Drug absorption from the isolated perfused rat lung--correlations

with drug physicochemical properties and epithelial permeability. J. Drug Target. 11 (1), S.

61–74.

• Ulrich, A.S. (2002): Biophysical aspects of using liposomes as delivery vehicles. Biosci.

Rep. 22 (2), S. 129–150.

• Underwood, C.; van Eps, A.W.; Ross, M.W.; Laverman, P.; van Bloois, L.; Storm, G.;

Schaer, T.P. (2011): Intravenous technetium-99m labelled PEG-liposomes in horses: A

safety and biodistribution study. Equine Vet. J. 44 (2), S.196-202.

• Vail, D.M.; MacEwen, E.G.; Kurzman, I.D.; Dubielzig, R.R.; Helfand, S.C.; Kisseberth,

W.C. et al. (1995): Liposome-encapsulated muramyl tripeptide phosphatidylethanolamine

adjuvant immunotherapy for splenic hemangiosarcoma in the dog: a randomized multiinstitutional

clinical trial. Clin. Cancer Res. 1 (10), S. 1165–1170.

• Vemuri, S.; Rhodes, C.T. (1995): Preparation and characterization of liposomes as

therapeutic delivery systems: a review. Pharm. Acta Helv. 70 (2), S. 95–111.

• Voshaar, T.; App, E.M.; Berdel, D.; Buhl, R.; Fischer, J.; Gessler, T. et al. (2001):

Recommendations for the Choice of Inhalatory Systems for Drug Prescription. Pneumologie

55 (12), S. 579–586.

• Waldrep, J.C.; Knight, C.M.; Black, M.B.; Gilbert, B.E.; Knight, V.; Eschenbacher, W.;

Scherer, P.W. (1997): Pulmonary Delivery of Beclomethasone Liposome Aerosol in

Volunteers: Tolerance and Safety. Chest 111 (2), S. 316–323.

• Wang, C.; Wang, J.; Zhao, L.; Wang, Y.; Liu, J.; Shi, L.; Xu, M. (2008a): Sildenafil inhibits

human pulmonary artery smooth muscle cell proliferation by decreasing capacitative Ca2+

entry. J. Pharmacol. Sci. 108 (1), S. 71–78.

• Wang, Y.; Chow, M.S.; Zuo, Z. (2008b): Mechanistic analysis of pH-dependent solubility

and trans-membrane permeability of amphoteric compounds: Application to sildenafil. Int.

J. Pharm. 352 (1-2), S. 217–224.

• Warrington, J.S.; Shader, R.I.; Moltke, L.L. von; Greenblatt, D.J. (2000): In vitro

biotransformation of sildenafil (Viagra): identification of human cytochromes and potential

drug interactions. Drug Metab. Dispos. 28 (4), S. 392–397.

• Waschkowitz, Esther (2002): Darstellung und Charakterisierung einer liposomalen

Depotform zum inhalativen pulmonalen Applikation. 1. Aufl. Wettenberg: VVB

Laufersweiler.

• Weers, J.; Metzheiser, B.; Taylor, G.; Warren, S.; Meers, P.; Perkins, W.R. (2009): A

Gamma Scintigraphy Study to Investigate Lung Deposition and Clearance of Inhaled

Amikacin-Loaded Liposomes in Healthy Male Volunteers. J. Aerosol Med. Pulm. Drug

Deliv. 22 (2), S. 131–138.

• Weimann, J.; Ullrich, R.; Hromi, J.; Fujino, Y.; Clark, M.W.; Bloch, K.D.; Zapol, W.M.

(2000): Sildenafil is a pulmonary vasodilator in awake lambs with acute pulmonary

hypertension. Anesthesiology 92 (6), S. 1702–1712.

- 127 -


7 LITERATURVERZEICHNIS

• Wharton, J.; Strange, J.W.; Moller, G.M.; Growcott, E.J.; Ren, X.; Franklyn, A.P. et al.

(2005): Antiproliferative effects of phosphodiesterase type 5 inhibition in human pulmonary

artery cells. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 172 (1), S. 105–113.

• Wichert, B.V.; Gonzalez-Rothi, R.J.; Straub, L.E.; Wichert, B.M.; Schreier, H. (1992):

Amikacin liposomes: characterization, aerosolization, and in vitro activity against

Mycobacterium avium-intracellulare in alveolar macrophages. Int. J. Pharm. 78 (1-3), S.

227–235.

• Wichert, P. von; Seifart, C. (2005): The lung, an organ for absorption? Respiration 72 (5),

S. 552–558.

• Wijagkanalan, W.; Higuchi, Y.; Kawakami, S.; Teshima, M.; Sasaki, H.; Hashida, M.

(2008): Enhanced anti-inflammation of inhaled dexamethasone palmitate using

mannosylated liposomes in an endotoxin-induced lung inflammation model. Mol.

Pharmacol. 74 (5), S. 1183–1192.

• Wilkens, H.; Guth, A.; König, J.; Forestier, N.; Cremers, B.; Hennen, B. et al. (2001): Effect

of inhaled iloprost plus oral sildenafil in patients with primary pulmonary hypertension.

Circulation 104 (11), S. 1218–1222.

• Wood, J.A.; Wilson, R.S.; Bray, C. (1986): Changes in salbutamol concentration in the

reservoir solution of a jet nebulizer. Br. J. Dis. Chest 80 (2), S. 164–169.

• Woolfrey, S.G.; Taylor, G.; Kellaway, I.W.; Smith, A. (1988): Pulmonary absorption of

liposome-encapsulated 6-Carboxyfluorescein. J. controlled release 5, S. 203–209.

• Wyde, P.R.; Six, H.R.; Wilson, S.Z.; Gilbert, B.E.; Knight, V. (1988): Activity against

rhinoviruses, toxicity, and delivery in aerosol of enviroxime in liposomes. Antimicrob.

Agents Chemother. 32 (6), S. 890–895.

• Yang, T.; Cui, F.-D.; Choi, M.-K.; Lin, H.; Chung, S.-J.; Shim, C.-K.; Kim, D.-D. (2007):

Liposome formulation of paclitaxel with enhanced solubility and stability. Drug Deliv. 14

(5), S. 301–308.

• Yazar, E.; Bas, A.; Birdane, Y.; Yapar, K.; Tras, B. (2006): Determination of intracellular

(neutrophil and monocyte) concentrations of free and liposome encapsulated ampicillin in

sheep. Veterinari Medicina 51 (2), S. 51–54.

• Yeh, H.C.; Phalen, R.F.; Raabe, O.G. (1976): Factors influencing the deposition of inhaled

particles. Environ. Health Perspec. 15, S. 147–156.

• Zaru, M.; Mourtas, S.; Klepetsanis, P.; Am Fadda; Antimisiaris, S.G. (2007): Liposomes for

drug delivery to the lungs by nebulization. Eur. J. Pharm. Biopharm. 67 (3), S. 655–666.

• Zeng, X.M.; Martin, G.P.; Marriott, C. (1995): The controlled delivery of drugs to the lung.

Int. J. Pharm. 124 (2), S. 149–164.

• Zhang, G.; David, A.; Wiedmann, T.S. (2007): Performance of the vibrating membrane

aerosol generation device: Aeroneb Micropump Nebulizer. J. Aerosol Med. 20 (4), S. 408–

416.

• Zhang, J.A.; Anyarambhatla, G.; Ma, L.; Ugwu, S.; Xuan, T.; Sardone, T.; Ahmad, I.

(2005): Development and characterization of a novel Cremophor® EL free liposome-based

paclitaxel (LEP-ETU) formulation. Eur. J. Pharm. Biopharm. 59 (1), S. 177–187.

• Zhao, L.; Mason, N.A.; Morrell, N.W.; Kojonazarov, B.; Sadykov, A.; Maripov, A. et al.

(2001): Sildenafil Inhibits Hypoxia-Induced Pulmonary Hypertension. Circulation 104 (4),

S. 424–428.

- 128 -


7 LITERATURVERZEICHNIS

• Zhao, X.; Fan, Y.; Wang, D.; Hu, Y.; Guo, L.; Ruan, S. et al. (2011): Immunological

adjuvant efficacy of glycyrrhetinic acid liposome against Newcastle disease vaccine.

Vaccine 29 (52), S. 9611–9617.

- 129 -


8 ANHANG

8.1 Abkürzungen

Abb. Abbildung

AMP Adenosinmonophosphat

8 ANHANG

ANOVA Analysis of Variance (Varianzanalyse)

Aqua dest. destilliertes Wasser

ATRA All-trans-retinoic acid (all-trans-Retinsäure)

BAL bronchoalveoläre Lavage

bzw. beziehungsweise

C Kohlenstoff

Ca ++ Calcium

ca. cirka

CaCl2 Calciumchlorid

cAMP cyclisches Adenosinmonophosphat

CAS Chemical Abstracts Service

CF 5(6)-Carboxyfluorescein

cGMP cyclisches Guanosinmonophosphat

CH Cholesterol

Cl - Chlor

COB chronisch obstruktive Bronchitis

COPD chronic obstructive pulmonary disease (chronisch obstruktive

Lungenerkrankung)

Ccorr(t) korrigierte Wirkstoffkonzentration im Perfusat zum Zeitpunkt (t)

C(t) gemessene Wirkstoffkonzentration im Perfusat zum Zeitpunkt (t)

da

di

Außendurchmesser

Innendurchmesser

DLPC 1,2-Dilauroyl-sn-glycero-3-phosphocholin

DPPC 1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholin

DSPC 1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholin

DTPA Diethylentriaminpentaessigsäure

GMP Guanosinmonophosphat

GSD Geometric standard deviation (Geometrische Standardabweichung)

GTP Guanosintriphosphat

- 130 -


H Wasserstoff

8 ANHANG

HPLC high performance liquid chromatography

(Hochleistungsflüssigkeitschromatographie)

HRLD High Resolution Laser Diffraction

IgG Immunglobulin G

IgM Immunglobulin M

IPL isolierte, perfundierte Lunge

K + Kalium

KCl Kaliumchlorid

KH2PO4

λem

λex

Kaliumdihydrogenphosphat

Emissionswellenlänge

Anregungswellenlänge

logP dekadischer Logarithmus des Oktanol/ Wasser-Verteilungskoeffizienten

LPS Lipopolysaccharide

LVP left ventricular pressure (linksventrikulärer Druck)

MDI metered dose inhaler (Dosieraerosole)

MgCl Magnesiumchlorid

MLV multilamellare Vesikel

mM millimolar

MMAD Mass median aerodynamic diameter (medianer aerodynamischer

Massendurchmesser)

MPS Metaproterenol-Sulfat

MW Mittelwert

n Anzahl

N Stickstoff

Na + Natrium

NaCl Natriumchlorid (Kochsalz)

NaOH Natriumhydroxid (Natronlauge)

n.d. nicht durchgeführt

NO Stickstoffmonoxid

NOS NO-Synthase

n.s. nicht signifikant

NSAID non steroidal anti inflammatory drug (nichtsteroidales

Antiphlogistikum)

- 131 -


O Sauerstoff

P Phosphor

8 ANHANG

paCO2 arterieller Kohlendioxidpartialdruck

PAH pulmonale arterielle Hypertonie

PAP pulmonary artery pressure (pulmonalarterieller Druck)

PBS phosphate buffered saline (phosphatgepufferte Salzlösung)

PDE Phosphodiesterase

PEEP Positive endexpiratory pressure (positiver endexspiratorischer Druck)

PEG Polyethylenglycol

pH negativer dekadischer Logarithmus der Wasserstoffionen-Aktivität

PH pulmonale Hypertonie

PKA Proteinkinase A

PKG Proteinkinase G

pKs Säuredissoziationskonstante

paO2 arterieller Sauerstoffpartialdruck

RPM Rounds per minute (Umdrehungen pro Minute)

R6G Rhodamin 6G

S Schwefel

SAP systemic artery pressure (systemischer arterieller Druck)

SD Standard deviation (Standardabweichung)

99m TC

99m Technetium-Pertechnetat

Tm Phasenübergangstemperatur

UV ultraviolette Strahlung

V Versuch

v. Chr. vor Christus

VE Verkapselungseffizienz

VMD Volume mean diameter (medianer Volumendurchmesser)

Vp(t) Perfusatvolumen zum Zeitpunkt (t)

Vp(0) Perfusatvolumen zum Zeitpunkt 0

VR Verkapselungsrate

v/v (%) Volumenprozent

WHO World Health Organization (Weltgesundheitsorganisation)

w/v (%) Massenprozent

- 132 -


8.2 Abbildungsverzeichnis

8 ANHANG

Abb. 1 Schematischer Aufbau eines Phospholipids (modifiziert aus Vemuri und

Rhodes 1995)

Abb. 2 Modellhafte Darstellung der Verkapselung einiger Substanzen in

unterschiedlichen Kompartimenten eines unilamellaren Liposoms sowie

verschiedener Möglichkeiten der Oberflächenmodifikation. PEG:

Polyethylenglykol

Abb. 3 Schematische Darstellung der vasodilatativen und antiproliferativen Effekte

von Sildenafil (modifiziert und kombiniert aus Barnett und Machado 2006

und Ghofrani et al. 2004a)

AMP: Adenosinmonophosphat

Ca ++ : Calcium

cAMP: cyclisches Adenosinmonophosphat

cGMP: cyclisches Guanosinmonophosphat

GMP: Guanosinmonophosphat

GTP: Guanosintriphosphat

K + : Kalium

NO: Stickstoffmonoxid

NOS: NO-Synthase

O2: Sauerstoff

PDE: Phosphodiesterase

PKA: Proteinkinase A

PKG: Proteinkinase G

- 133 -

S. 7

S. 10

S. 27

Abb. 4 Chemische Eigenschaften und Strukturformel von DPPC S. 30

Abb. 5 Chemische Eigenschaften und Strukturformel von Cholesterol S. 30

Abb. 6 Chemische Eigenschaften und Strukturformel von Rhodamin 6G S. 31

Abb. 7 Chemische Eigenschaften und Strukturformel von Sildenafil S. 32

Abb. 8 Aufbau des MicroSprayers ® S. 34

Abb. 9 Herstellung der Liposomen nach der Ethanolinjektions-Methode S. 38

Abb. 10 Auffangen des Aerosols aus dem Pari LC Sprint ® Star S. 48

Abb. 11 Verkapselungsraten (MW + SD) der Liposomen nach Extrusion und nach

Verneblung. n.s. = nicht signifikant

S. 61


8 ANHANG

Abb. 12 Aerosolpartikelgrößen (MW + SD) der bei der Verneblung von NaCl und

der nach unterschiedlichen Methoden hergestellten Liposomen mit einem

Aeroneb ® Solo generierten Aerosole. MMAD: medianer aerodynamischer

Massendurchmesser. Die Signifikanzangaben beziehen sich auf den

Vergleich der liposomalen Aerosolpartikel zu NaCl

Abb. 13 Verneblungsdauer bei der Verneblung von NaCl und mit R6G beladenen

Liposomen mit dem Aeroneb ® Solo. Die Signifikanzangaben beziehen sich

auf den Vergleich der jeweiligen Liposomen zu NaCl.

Abb. 14 prozentuale Wiederfindung von Sildenafil bei Inkubation von

Schlauchstücken aus Polyurethan in Sildenafillösung

Abb. 15 prozentuale Wiederfindung von Sildenafil bei Inkubation von

Schlauchstücken aus C-FLEX ® in Sildenafillösung

Abb. 16 Sildenafilkonzentrationen (MW + SD, n=5) der Liposomensuspensionen

vor und nach Verneblung mit dem MicroSprayer ® bzw. dem Pari LC

Sprint ® Star. * p < 0,05 im Vergleich zu den nach Herstellung gemessenen

Werten; n.s. = nicht signifikant

Abb. 17 In vitro aus den Liposomen freigesetztes Sildenafil in Prozent (MW ± SD,

n=4; + bei 150 min n=3), bezogen auf den gemessenen mittleren Gesamt-

Sildenafilgehalt im jeweiligen Versuch

Abb. 18 Vergleich der Übertrittskinetiken von freiem und liposomal Sildenafil (je

n=4) am Modell der isolierten Kaninchenlunge nach Verneblung mit dem

MicroSprayer ® . Freies Sildenafil: MW + SD; liposomales Sildenafil: MW –

SD

Abb. 19 Schematische Darstellung der Aufzweigung des Bronchialbaumes einer

menschlichen Lunge (A) und der monopodialen Aufzweigung (Esel oder

Kaninchen) (B) (Schlesinger und La McFadden 1981)

Abb. 20 Rasterelektronenmikroskopische Aufnahme einer Kaninchenlunge, auf

normales Atemvolumen aufgebläht. Zu erkennen sind die dichotome

Aufzweigung einer terminalen Bronchiole, teilweise alveolarisierte

respiratorische Bronchiolen, Ductuli alveolares und Alveolen (Murray

2010)

- 134 -

S. 64

S. 64

S. 69

S. 68

S. 73

S. 77

S. 80

S. 94

S. 94


8.3 Tabellenverzeichnis

8 ANHANG

Tab. 1 Zusammensetzung der R6G-Eichreihe S. 41

Tab. 2 Berechnung der Schlauchlängen für die Versuche zur Sildenafil-

Wiederfindung

Tab. 3 Ergebnisse (MW ± SD) der Verneblung von isotoner Kochsalzlösung

(Aeroneb ® Solo und Pari LC Sprint ® Star) bzw. Aqua dest.

(MicroSprayer ® ). MMAD: Medianer aerodynamischer Massendurchmesser;

GSD: Geometrische Standardabweichung

Tab. 4 R6G-Konzentrationen in den zur Verneblung hergestellten Verdünnungen

der nach unterschiedlichen Methoden hergestellten Liposomensuspensionen

Tab. 5 Verkapselungseffizienzen (VE) der nach den unterschiedlichen Methoden

hergestellten, mit R6G beladenen Liposomen

Tab. 6 prozentuale Farbstoffwiederfindung nach Verneblung der mit R6G

beladenen Liposomen mit dem Aeroneb ® Solo

Tab. 7 Verkapselungsraten (VR) der nach unterschiedlichen Methoden

hergestellten, mit R6G beladenen Liposomen nach Herstellung und nach

Verneblung

Tab. 8 Medianer Volumendurchmesser (VMD) und geometrische

Standardabweichung (GSD) der mit R6G beladenen Liposomen nach

Extrusion und nach Verneblung mit dem Aeroben ® Solo

Tab. 9 Bei der Verneblung der Liposomen untersuchte Parameter im Vergleich zur

Verneblung von NaCl (MW ± SD). MMAD: medianer aerodynamischer

Massendurchmesser; GSD: geometrische Standardabweichung. Die p-

Werte zur Benennung der Signifikanz der jeweiligen Methode im Vergleich

zu NaCl sind in runden Klammern angegeben.

Tab. 10 Prozentuale Wiederfindung von Sildenafil in Eppendorf-Reaktionsgefäßen

nach Inkubation bei 37 °C, bezogen auf die in der eingesetzten Lösung

gemessene Sildenafilkonzentration

Tab. 11 Prozentuale Wiederfindung von Sildenafil in Falcon Tubes bei

verschiedenen Temperaturen, bezogen auf die sofort nach Zugabe ins Gefäß

gemessene Sildenafilkonzentration

Tab. 12 Sildenafilkonzentrationen der gepufferten Elektrolytlösung vor

Schlauchzugabe

- 135 -

S. 45

S. 57

S. 58

S. 59

S. 60

S. 60

S. 62

S. 63

S. 66

S. 66

S. 67


8 ANHANG

Tab. 13 Prozentuale Wiederfindung von Sildenafil bei Inkubation von

Schlauchstücken aus unterschiedlichen Materialien in Sildenafillösungen.

Die prozentuale Wiederfindung bezieht sich auf die vor Schlauchzugabe im

jeweiligen Gefäß gemessene Sildenafilkonzentration.

Tab. 14 Prozentuale Wiederfindung (MW ± SD) von Sildenafil bei Zirkulation der

Sildenafillösungen in einem Schlauchsystem aus C-FLEX ® Clear Schlauch.

t = -2 min: Sildenafilkonzentration in der Lösung vor Befüllen des

Schlauchsystems

Tab. 15 Charakterisierung der mit Sildenafil beladenen Liposomen (MW ± SD,

n=5). VMD: medianer Volumendurchmesser; GSD: geometrische

Standardabweichung. Die p-Werte im Vergleich zu den jeweiligen Daten

nach Herstellung sind in runden Klammern angegeben.

Tab. 16 Verneblereigenschaften (MW ± SD) von MicroSprayer ® und Pari LC

Sprint ® Star. MMAD: medianer aerodynamischer Massendurchmesser;

GSD: geometrische Standardabweichung

Tab. 17 Bestimmung des Outputs (MW ± SD) aus dem MicroSprayer ® bei der

Verneblung von Aqua dest. und Liposomen

- 136 -

S. 67

S. 70

S. 71

S. 74

S. 74

Tab. 18 Gesamtsildenafilgehalte (µg/ml) in den in vitro Freisetzungsversuchen S. 76

Tab. 19 Sildenafilkonzentrationen im Perfusat nach Verneblung von freiem

Sildenafil in das Modell der isolierten Kaninchenlunge

Tab. 20 Sildenafilkonzentrationen im Perfusat nach Verneblung von liposomal

verkapseltem Sildenafil in das Modell der isolierten Kaninchenlunge

Tab. 21 Verteilung des Sildenafils im Modell der isolierten Kaninchenlunge nach

Verneblung von freiem bzw. liposomal verkapseltem Sildenafil (MW ± SD,

jeweils n=4)

Tab. 22 Verkapselungseffizienzen von DPPC : CH - Liposomen für CF, Iloprost

und R6G

S. 79

S. 79

S. 81

S. 96


8.4 Materialverzeichnis

8.4.1 Substanzliste

8 ANHANG

Acetonitril Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Deutschland

Braunoderm ® B.Braun Melsungen AG, Melsungen, Deutschland

Albumin Fraktion V Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Deutschland

Aqua dest. B.Braun Melsungen AG, Melsungen, Deutschland

(Aqua Ecotainer ® )

Butylparaben Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Deutschland

(Butyl 4-Hydroxybenzoate)

Chloroform Merck KgaA, Darmstadt, Deutschland

Cholesterol Avanti Polar Lipids, Alabaster, USA

Dipalmitoyl-Phosphocholin Avanti Polar Lipids, Alabaster, USA

(DPPC)

Elektrolytlösungen Serag Wiessner, Naila, Deutschland

(1/3 und II)

Ethanol Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Deutschland

Ethylacetat Merck KgaA, Darmstadt, Deutschland

HCl Merck KgaA, Darmstadt, Deutschland

(1 mol/l; 1 )

Helium Linde Gas, Leuna, Deutschland

Heparin 25000 I.E ratiopharm GmbH, Ulm, Deutschland

Isotone Kochsalzlösung B.Braun Melsungen AG, Melsungen, Deutschland

(0,9 %)

Ketamin 10 % bela-pharm GmbH & Co. KG, Vechta, Deutschland

Methanol Avantor TM Performance Materials B.V, Deventer, Niederlande

NaOH Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Deutschland

Natriumhydrogen- Serag-Wiessner, Naila, Deutschland

carbonat (1 molar 8,4 %)

normoxisches Gasgemisch Linde Gas, Leuna, Deutschland

(21% O2, 5.3% CO2, 73.7% 2)

PBS-Puffer pH 7,4 80,0 g NaCl Karl Roth, Karlsruhe, Deutschland

2,0 g KCl Merck, Darmstadt, Deutschland

11,5 g Na2HPO4*2H2O Merck, Darmstadt, Deutschland

- 137 -


8 ANHANG

2,0 g KH2PO4 Merck, Darmstadt, Deutschland

Phosphatpuffer für HPLC 4,0826 g KH2PO4 (Merck KgaA, Darmstadt, Deutschland)

in 1 Liter Aqua dest.

Rodamin 6G Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Deutschland

Sildenafil AK Scientific, Inc., USA und

bioKEMIX, Hazel Grove, Großbritannien

Stickstoff 4.6 Linde Gas, Leuna, Deutschland

Xylazin 2 % Veva Tiergesundheit GmbH, Düsseldorf, Deutschland

Xylocain ® 1 % AstraZeneca GmbH, Wedel, Deutschland

8.4.2 Geräteliste

Aeroneb ® Solo Aerogen, Dangan, Galway, Ireland

automatischer Probengeber Knauer, Berlin, Deutschland

(Smartline Autosampler 3900)

Beatmungspumpe Hugo Sachs Elektronik, March-Hugstetten, Deutschland

(cat/ rabbit Ventilator)

beheizbarer Magnetrührer Heidolph Instruments GmbH und Co KG, Schwabach,

(Heidolph MR 3002) Deutschland

elektromechanische B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Deutschland

Druckumwandler (Combitrans)

Extruder (LiposoFast) Avestin, Ottawa, Kanada

Feinwaage Mettler Toledo; Mettler Waagen GmbH, Gießen, Deutschland

(Mettler H20T)

Fluoreszenzreader BioTek Instruments, Inc., Winooski, USA

(Synergy 2)

Gewichtsschreiber Rikadenki Elektronics, Freiburg, Deutschland

(Rikadenki R 50 Series)

HPLC-Anlage Agilent Technologies, Waldbronn, Deutschland

(Agilent 1100)

Laserdiffraktometer Sympatec, Clausthal-Zellerfeld, Deutschland

Magnetrührer IKA ® -Werke GmbH & Co. KG, Staufen, Deutschland

(IKA ® Model Big Squid)

Messverstärker Hugo Sachs Elektronik, March-Hugstetten, Deutschland

(Plugsys DBA 660)

- 138 -


MicroSprayer ®

(Model IA-1B)

8 ANHANG

Penn-Century, Inc., Pennsylvania, USA

Pari LC Sprint ® Star PARI GmbH, Starnberg, Deutschland

Perfusor (Injectomat S) Fresenius AG, Bad Homburg, Deutschland

Peristaltikpumpe Fresenius, Bad Homburg, Deutschland

(Roller Pump BP 742)

pH/ Blood Gas Analyzer Siemens Healthcare Diagnostics GmbH, Eschborn, Deutschland

(RAPIDLAB 348)

pH-Meter (Labor- Knick Elektronische Messgeräte GmbH & Co. KG, Berlin,

pH-Meter 766 Calimatic ® ) Deutschland

Rotationsevaporator Büchi, Flawil, Schweiz

(Büchi Rotavapor R-114)

Rüttelplatte Fisher Scientific, Schwerte, Deutschland

(TopMix FB15024)

Schwenktisch VWR international, Löwen, Belgien

(utating Mixer)

Staubsauger Miele & Cie. KG, Gütersloh, Deutschland

(Miele S 6350 Compact)

Tischzentrifuge Hettich Zentrifugen, Tuttlingen, Deutschland

(Mikro 200 R)

Ultraschall-Bad Badelin electronic, Berlin, Deutschland

(Bandelin Sonorex Digitec DT 52 H)

Vakuumpumpe Vacuumbrand GmbH + Co KG, Wertheim, Deutschland

(Membran-Vakuumpumpe MD 1C)

Vortexer VWR International GmbH, Darmstadt, Deutschland

(Lab dancer S40)

Waage Kern & Sohn GmbH, Balingen-Frommen, Deutschland

(Analysenwaage Modell ALJ 220-4M)

Wägezelle (Typ U1) Hottinger Baldwin Messtechnik, Deutschland

Wärmeregler Braun, Melsungen, Deutschland

(Thermomix BU)

Wärmeschrank (IR 1500) Flow Laboratories, Irvine, Großbritannien

Wärmeschrank (Thermo Thermo Electron LED GmbH, Langenselbold, Deutschland

Scientific Heraeus Function Line, Typ UT 12)

- 139 -


8 ANHANG

Wasserbad Büchi, Flawil, Schweiz

(Büchi Waterbath B-480)

8.4.3 Verbrauchsmaterialien und sonstiges

Aerosolfilter TeleFLEX Medical, High Wycombe, Großbritannien

(ISO-Gard ® Filter S)

Dreiwegehähne B.Braun Melsungen AG, Melsungen, Deutschland

(Discofix ® C)

Einmalhandschuhe B.Braun Melsungen AG, Melsungen, Deutschland

(Vasco ® itril white)

Einmalspritzen B.Braun Melsungen AG, Melsungen, Deutschland

Eppendorf-Reagiergefäße Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Deutschland

(1,5 ml)

Falcon Tubes Becton Dickinson Labware

(Blue Max ® Polypropylene Conical Tube, 50 ml)

Filter Pall Biomedical Inc., Fajardo, USA

(Pall ® Cardioplegia Plus ® 0,2 µm)

Glasgefäße

(Schott Duran ® )

Schott AG, Mainz, Deutschland

Heidelberger Verlängerung B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Deutschland

HPLC-analytische Säule Merck, Darmstadt, Deutschland

(LiChroCART ® 124*4 mm Säule, gefüllt mit LiChrospher ® 100, RP-18e, 5 µm)

HPLC-Vorsäule Merck, Darmstadt, Deutschland

(LiChroCART ® -Kartusche 4*4 mm, LiChrospher ® RP-18e, 5 µm)

Kanülen BD Medical Systmes, Drogheda, Irland

(BD MicrolanceTM 3)

Mikrotiterplatte Corning Incorporated, Corning, USA

(Costar Assay Plate, 96 Well)

Nadel-Faden-Kombination Ethicon, Norderstedt, Deutschland

(Mersilene 4, 1 SH)

Parafilm ® M Pechiney Plastic Packaging Company, Chicago, USA

Perfusor ® -Spritzen B.Braun Melsungen AG, Melsungen, Deutschland

(OPS 50 ml)

- 140 -


8 ANHANG

Pipetten Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland

(Eppendorf Research)

Pipettenspitzen Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Deutschland

Polycarbonatmembran Avestin Europe GmbH, Mannheim, Deutschland

(400 nm)

Schläuche

- C-FLEX ® , Clear C-FLEX ® , Cole-Parmer ® Instrument Company, Illinois, USA

C-FLEX ® MasterFLEX (Pumpenschlauch)

- Polyurethan, PTFE LIQUID-scan GmbH & Co.KG, Überlingen, Deutschland

Venenpunktionsbesteck Dispomed Witt oHG, Gelnhausen, Deutschland

(Ecoflo®)

- 141 -


Danksagung

Ich möchte mich bei allen bedanken, die mich bei der Erstellung dieser Arbeit begleitet und

unterstützt haben.

Ein herzliches Dankeschön gebührt meiner Erstbetreuerin, Fr. Prof. Dr. Kerstin Fey, für die

angenehme und hilfreiche Zusammenarbeit und die konstruktiven Diskussionen, vor allem in

der Endphase der Arbeit. Danke auch für das in mich gesetzte Vertrauen.

Hr. Prof. Dr. Werner Seeger danke ich für die Überlassung des Promotionsthemas und für die

Möglichkeit, in seiner Arbeitsgruppe promovieren zu dürfen.

Zu danken habe ich weiterhin der Arbeitsgruppe Schmehl/ Gessler. Dabei gilt mein Dank im

Einzelnen

- Thomas, Tobias und Moritz für die fachliche Unterstützung (danke, Thomas, für

„Alles wird gut.“!)

- Helene für ihre unendliche Geduld und die viele praktische Hilfe

- Katharina für immer wieder leckere Aufmunterung in Form von Kuchen oder

Schokolade

- Julia für die vielen lustigen Stunden, die wir zusammen im Labor verbracht haben

- allen anderen aus unserer AG und dem Labor, die ich hier nicht alle namentlich

erwähnt habe.

Ein riesiges Dankeschön geht – last but not least – an alle Freunde und an meine Familie, die

mich während der Bearbeitungszeit mit ihren Höhen und Tiefen unterstützt und motiviert

haben. Dabei danke ich vor allem Armand, der es auch in schwierigen Phasen immer wieder

geschafft hat, mich zum Durchhalten zu ermutigen; Danke für Deine Geduld!


ERKLÄRUNG

Ich erkläre: „Ich habe die vorgelegte Dissertation selbständig und ohne unerlaubte fremde

Hilfe und nur mit den Hilfen angefertigt, die ich in der Dissertation angegeben habe. Alle

Textstellen, die wörtlich oder sinngemäß aus veröffentlichten oder nicht veröffentlichten

Schriften entnommen sind, und alle Angaben, die auf mündlichen Auskünften beruhen, sind

als solche kenntlich gemacht. Bei den von mir durchgefühen und in der Dissertation

erwähnten Untersuchungen habe ich die Grundsätze guter wissenschaftlicher Praxis, wie sie

in der „Satzung der Justus-Liebig-Universität Gießen zur Sicherung guter wissenschaftlicher

Praxis“ niedergelegt sind, eingehalten.“


édition scientifique

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