Interaktion von Masernviren mit Dendritischen Zellen - OPUS ...

Methoden 70
wurden diese aus den Zellkulturplatten in FACS-Röhrchen überführt und
zunächst mit 1 Milliliter FACS-Puffer gewaschen (5 min, 300 x g, 4° C) und
anschließend mit Paraformaldehyd (100 µl, 4%ige Lösung/Probe) für 20
Minuten auf Eis fixiert. Nach einem weiteren Waschschritt (s. o.) wurden die
Zellen mit Saponinpuffer permeabilisiert (10 min, RT). Nach dem Pelletieren der
Zellen wurde der Saponinpuffer vorsichtig abgesaugt, die Zellen wurden
anschließend in 50 Mikroliter Saponinpuffer/Probe mit dem Antikörper in
entsprechender Verdünnung resuspendiert und für 30 Minuten bei RT im
Dunkeln inkubiert und danach erneut mit Saponinpuffer (1 ml/Probe)
gewaschen (s. o.). Nichtmarkierte Antikörper wurden mit einem fluoreszenz-
farbstoff-markierten Sekundärantikörper (2.6) detektiert (30 min, RT, dunkel).
Dieser wurde gemäß Herstellerangaben in Saponinpuffer verdünnt und in
einem Volumen von 50 Mikroliter/Färbung eingesetzt. Vor der Analyse der
Proben wurde überschüssiger Antikörper durch Waschen mit Saponinpuffer
sowie überschüssiges Saponin durch Waschen mit FACS-Puffer entfernt
(jeweils 1 ml/Probe) (300 x g, 5 min, 4° C).
3.7.3 Quantitative Durchflusszytometrie
Zur direkten Bestimmung der Zellzahl in einer Probe wurden
fluoreszenzfarbstoff-markierte Mikrokügelchen in definierter Konzentration
verwendet. Die zu zählenden Zellen wurden dazu aus den Zellkulturplatten in
FACS-Röhrchen überführt, mit 100 Mikroliter der Mikrokügelchen vermischt und
im Durchflusszytometer gezählt. Zur Bestimmung der Zellzahlen wurden
verschiedene Regionen definiert (Abbildung 3—5): eine Region definierte
Größe und Granularität der Zellen (Region 1), die zweite Region definierte die
Morphologie und das Fluoreszenzmuster der Mikrokügelchen. Die
Einstellungen des Durchflusszytometers wurden weiterhin so gewählt, dass die
Messung nach 1000 gemessenen Ereignissen in der Region 2 abgebrochen
wurde. Über die Anzahl der gemessenen Ereignisse in der Region 1 (Zellen)