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3.2.1 Zellbiologische

3.2.1 Zellbiologische Methoden Alle hier beschriebenen Tätigkeiten wurden in der Zellkultur durchgeführt. Die Zelllinien selbst werden in Brutschränken bzw. Inkubatoren aufbewahrt, in denen strikte Bedingungen eingehalten und überprüft werden müssen. Dazu zählen neben einer Temperatur von 37°C und einem CO2-Gehalt von 5% auch eine relative Luftfeuchtigkeit von 90%. Außer den elektrophysiologischen Messungen selbst wurden alle Arbeiten mit Zellen unter einer Sterilbank durchgeführt. Das Passagieren der Zellen gehört zu den wichtigsten dieser Tätigkeiten. Zweck des alle zwei bis drei Tage durchgeführten Passagierens oder Umsetzens war eine für elektrophysiologische Messungen optimal vorbereitete Zelllinie. Wird in einem zu dünnen oder zu dichten Verhältnis umgesetzt, ist ein suboptimales Wachstum die Folge. Im schlimmsten Fall können Zellen auch für die Messung essentielle Ionenkanäle verlieren oder absterben. Der Passagiervorgang läuft immer recht ähnlich ab. Zunächst wird eine Kulturschale mit der passenden Zelldichte (etwa 80%) mit Hilfe eines Lichtmikroskop ausgewählt. Anschließend muss das alte Medium verworfen werden und die verbliebenen, adhärenten Zellen werden mit PBS gewaschen. Eine dreiminütige Einwirkzeit von Trypsin oder PBS-EDTA löst schließlich die Zellen von der Kulturschale. Da Trypsin Proteine an spezifischen Stellen spalten kann, muss dieses direkt nach der Einwirkzeit durch einen Zentrifugiervorgang (2,5 Minuten bei 1500 U/min) entfernt werden. Danach wird das Zellpellet oder die Zellsuspension mit nicht trypsinhaltigem Ablösemittel in mit 10ml frischem Medium gefüllten Schalen aufgeteilt. Je nach gewünschter Dichte und geplanten Messtagen wird das Mengen- und Verteilungsverhältnis entsprechend variiert. Für die Messungen müssen die jeweiligen Zellen geerntet werden. Dazu wird wie zunächst wie beim Passagieren verfahren. Das Zellpellet bzw. die Zellsuspension 30

wird aber nicht auf neue Schalen aufgeteilt, sondern abhängig von der Zelldichte in ca. 1ml externer Lösung gelöst / gegeben und für die Messung bereitgestellt. 3.2.2 Elektrophysiologische Methoden Alle in dieser Bachelorarbeit gezeigten Messungen wurden mit Hilfe der planaren Patch-Clamp-Technik durchgeführt. Dafür wurde das Port-a-Patch von Nanion verwendet, dessen Aufbau samt benötigter Apparatur in Abbildung 3.1 zu sehen ist. Abbildung 3.1: Messaufbau mit PC, Verstärker und Port-a-Patch mit dazugehöriger SuctionControl. (Nanion Port-a-Patch Product Sheet, 2012) Bevor mit den eigentlichen Messungen begonnen werden kann, bedarf es einiger Vorbereitung. Ist die planare Konfiguration wie in Abbildung 3.1 aufgebaut, müssen der PC und die Verstärkereinheit eingeschaltet werden. Danach werden die Programme PatchControl und PatchMaster gestartet; es sind die Protokolle zur Erlangung des gewünschten Sealwiderstandes und für den eigentlichen Messvorgang einmalig zu erstellen, alle weiteren male nur noch aufzurufen. 31

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