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4.1.4 Verschiedene

4.1.4 Verschiedene Erntemethoden zur Ergebnisverbesserung Wie bereits beschrieben, können mPiezo1-Kanäle durch entsprechende mechanische Stimuli bereits vor der Messung permanent inaktiviert werden. Ein weiterer möglicher Ansatzpunkt, diese Inaktivierung eventuell zu vermeiden, liegt in der Variation des Ernteverfahrens. Möglicherweise tritt bereits während dieses Vorgangs die Inaktivierung ein. In den meisten Papern (wie B. Coste 2010, B. Coste 2012, A. Dubin 2012), die sich diversen Fragestellungen des Piezo-Kanals annehmen, wurde mit einem konventionellen Patch-Clamp-Aufbau gemessen. Es fallen also auch mögliche Probleme einer Desensibilisierung der Kanäle während des Ernteverfahrens weg, da die konventionelle Patch-Clamp-Technik auf das Ernten der Zellen komplett verzichtet. Eine Veränderung, den Vorgang für spätere Messungen zu optimieren, lag im Verzicht auf das oft bei adhärenten Zellen verwendete Ablösemittel Trypsin. Laut A. Dubin konnte bei Messungen mit Trypsin kein passender Strom ausgemacht werden, so dass eine Alternative nötig war. Das schwächer wirkende Ablösemittel PBS-EDTA, selten auch Trypsin LE, wurde ab hier statt Trypsin verwendet. Durch die Verwendung von PBS-EDTA blieb jedoch der Großteil der adhärenten Zellen auf der Schalenoberfläche zurück. Nur durch mechanisches Einwirken mittels Pipette konnten genügend Zellen von der Platte gelöst werden. Eine Inaktivierung der Kanäle wäre wiederum eine vorstellbare Folge. Eine weitere Variation bestand im Verzicht auf den Zentrifugiervorgangs. Dabei wurden zunächst, nach Entfernung des Mediums, die verbliebenen adhärenten Zellen mit 2ml PBS-EDTA und 4minütiger Einwirkzeit so schonend wie möglich von der Schalenoberfläche gelöst. Da PBS-EDTA, nicht wie Trypsin, Proteine an bestimmten Stellen spalten und damit unbrauchbar machen kann, war ein Herauszentrifugieren der Substanz auch nicht zwingend erforderlich. 40

4.1.5 Änderung der Passagiermethode zur Ergebnisverbesserung Um mögliche Störung des Trypsins zu vermeiden wurde nicht nur die Erntemethode, sondern auch alle weiteren Passagiermethoden entsprechend angepasst. Der Verzicht des Trypsins beim Umsetzvorgang gab mehr Sicherheit, dass die Proteinkomplexe nach dem Passagieren noch intakt waren. Eine weitere Veränderung der standardisierten Passagiermethode war ein dünnes Verteilungsverhältnis von Zellen der Vorgängerkulturplatte auf Platten, mit denen in den kommenden Tagen Messungen durchgeführt werden sollten. Dadurch waren die Zellen bereits auf den Kulturplatten gut vereinzelt und beim Erntevorgang weniger mechanischer Belastung ausgesetzt. Unglücklicherweise wuchsen die HEK-Zellen dadurch auch sehr schlecht und anschließende Messungen blieben ebenfalls ohne Erfolg. 41

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