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Untersuchung immortalisierter Endothelzellen auf charakteristische ...

Untersuchung immortalisierter Endothelzellen auf charakteristische ...

2.5 Antikörper 2

2.5 Antikörper 2 Material Antikörper Hersteller Cat.Nr. anti-Claudin-5 Rabbit pAb Invitrogen 34-1600 anti-Occludin (H-279) Rabbit pAb Santa Cruz Biotechnology sc-5562 anti-rabbit IgG (H+L), F(ab’)2 Fragment (AlexaFluor® 555 conjugated) Cell Signaling 4413 anti-VE-Cadherin (D87F2) XP® Rabbit mAb Cell Signaling 2500S anti-von-Willebrand-Faktor Rabbit pAb Sigma-Aldrich F-3520 Tabelle 5: Für die Immunfluoreszenzfärbung verwendete primäre und sekundäre Antikörper. 2.6 Hergestellte Lösungen Bezeichnung Zusammensetzung 0x ECGM Endothel Cell Growth Medium (ECGM) 1x ECGM ECGM red. ECGM ECGM ohne weitere Zusätze + 10 % FCS (v/v) + supplement mix (2 % FCS) + supplement mix (2 % FCS) Gelatine 0,1 % 0,1 % Gelatine(v/v) in PBS Formaldehyd 2 % 2 % Formaldehyd (v/v) in PBS Triton X-100 0,1 % 0,1 % Triton® X-100 in PBS Blocking Buffer 10 % FCS 0,2 % Triton® X-100 in PBS Antibody Dilution Buffer 10 % FCS 0,05 % Triton® X-100 in PBS Tabelle 6: Zusammensetzung und Bezeichnung der hergestellten Lösungen. 12

3 Methoden 3.1 Allgemeine Zellkulturstandards 3 Methoden Die Zellkultur erfordert absolut steriles Arbeiten. Dies soll die Zellen und die Umwelt vor Kontaminationen schützen (Lindl, 2002). Alle Arbeiten mit den Zellen erfolgten unter einer Zellkulturbank. Es wurden Latex-Handschuhe verwendet und diese und alle weiteren Materialien, die unter die Zellkulturbank gelangten, gründlich mit 70 % Isopropanol desinfiziert. Eine Ausnahme stellten die Zellkulturflaschen dar, da die Zellen sonst durch eintretenden Alkohol Schaden nehmen könnten. Sterile Einwegmaterialien wurden unter der Zellkulturbank aus ihrer Verpackung genommen. Sterile Reagenzien wurden ebenfalls nur unter der Zellkulturbank geöffnet. Alle Abfälle wurden gesammelt und bei 121°C über 15 Minuten autoklaviert. Flüssigabfälle wurden ebenfalls gesammelt und mit Desinfektionsmittelkonzentrat versetzt. 3.2 Kultivierung und Passagieren der primären HUVEC Die hier verwendeten primären Endothelzellen wurden aus humanen Nabelschnurvenen isoliert (human umbilical vein endothelial cells = HUVEC). Es handelt sich hierbei um adhärente Endothelzellen. HUVEC bilden in statischer Kultivierung eine kopfsteinpflasterförmige Morphologie aus (Jaffe et al., 1973). In vivo richten sich diese Endothelzellen stromlinienförmig in Richtung des fließenden Mediums aus und nehmen dabei eine eher spindelförmige Morphologie an (Langille and Adamson, 1981; Nerem et al., 1981). Die Kultivierung der Zellen erfolgte im Brutschrank unter Standardbedingungen für Säugertierzellen (37 °C, 5 % CO2 und 100 % relative Luftfeuchtigkeit). Um Temperaturunterschiede bei der Handhabung außerhalb des Brutschrankes zu vermeiden, wurden die Medien im Wasserbad auf 37 °C vorgewärmt. Vor dem Erreichen der vollständigen Konfluenz fand das Passagieren statt. Das verbrauchte Medium wurde dabei abgesogen und durch Waschen der Zellschicht mit 10 ml PBS weiter entfernt. Nach Zugabe von 2 ml Accutase und einer dreiminütigen Inkubation im Brutschrank lösten sich die Zellen von der Oberfläche. Ein Teil dieser Suspension wurde in eine neue Zellkulturflasche (75 cm 2 ) gegeben und diese mit 13 ml einfach konzentriertem Endothel Cell Growth Medium (1 x ECGM) (Zusammensetzung nach Tabelle 6) aufgefüllt. War für ein Experiment eine Zellsuspension mit genau definierter Zellzahl notwendig, wurde die restliche Zellsuspension fünf Minuten bei 200 g sedimentiert. Die primären HUVEC wurden dreimal pro Woche passagiert. Dabei betrug der Splittfaktor 1:4 - 1:10, welcher anhand einer vorhergehenden mikroskopischen Untersuchung der bewachsenen Fläche ermittelt wurde. 3.3 Kultivierung und Passagieren der immortalisierten HUVEC Die immortalisierten HUVEC wurden durch Einschleusen von Proliferationsgenen gentechnisch verändert und sollen in der Morphologie und dem Verhalten den primären HUVEC ähneln. Somit wurde die Kultivierung und das Passagieren der immortalisierten Zellen wie bei den primären Zellen beschrieben durchgeführt (siehe Kapitel 3.2). Der einzige Unterschied bestand in einer Beschichtung der Zellkulturflasche mit Gelatine. Dafür wurden 5 ml einer 0,1 %igen Gelatinelösung (siehe Tabelle 6) auf dem Boden der neuen Zellkulturflasche verteilt, diese für 30 Minuten im Brutschrank inkubiert und wieder abgesogen. So beschichtet, konnten die Zellen darin ausgesät werden. Die immortalisierten HUVEC wurden dreimal pro Woche passagiert. Dabei betrug der Splitt- 13

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