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Untersuchung immortalisierter Endothelzellen auf charakteristische ...

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3 Methoden faktor 1:5 -

3 Methoden faktor 1:5 - 1:12, welcher anhand einer vorhergehenden mikroskopischen Untersuchung der bewachsenen Fläche ermittelt wurde. 3.4 Zellen auftauen Das Auftauen der immortalisierten HUVEC musste zur Vermeidung von Zellschäden zügig durchgeführt werden. Dazu wurden noch vor der Entnahme aus dem Stickstofftank 13 ml 1 x ECGM in die gelatinisierte Zellkulturflasche gegeben. Das Medium wurde für jeden Zellklon frisch angesetzt. Das Kryoröhrchen wurde für drei Minuten ins Wasserbad (37 °C) gestellt und die aufgetaute Zellsuspension vorsichtig mit einer 2 ml-Pipette in die Zellkulturflasche überführt. Am darauffolgenden Tag wurde das Medium ausgetauscht. Dadurch wurden Reste von aus dem Einfriermedium stammendem, zelltoxischem DMSO entfernt. 3.5 Chemotaxis-Assay Um die gerichtete Zellmigration mikroskopisch untersuchen zu können wurde von der ibidi GmbH das µ-Slide Chemotaxis entwickelt (siehe Abbildung 2). Hierbei handelt es sich um einen Objektträger, welcher aus optisch hochwertigem und biokompatiblem Kunststoff besteht. Pro Objektträger sind drei Kammersysteme vorhanden, in welchen voneinander unabhängige chemotaktische Experimente stattfinden können. Der Beobachtungsbereich einer Kammer grenzt an zwei Reservoire. Durch Füllen dieser Reservoire mit Medium unterschiedlichen Lockstoffgehalts entsteht im Beobachtungsbereich ein linearer Konzentrationsgradient dieses Stoffes. Somit kann eine mikroskopische Untersuchung der Zellen, bezogen auf den Lockstoff, stattfinden (Zantl and Horn, 2011). Abbildung 2: Darstellung des µ-Slides Chemotaxis 3D . Die drei unabhängigen Kammersysteme sind mit den Ziffern 1 bis 3 nummeriert. Dabei besteht ein System aus einem mittig angeordneten Kanal, welcher den Beobachtungsbereich darstellt, sowie den beiden flügelartigen Medienreservoiren (Horn, 2012a). Für die 2D- und 3D-Chemotaxis-Assays wurden nur Zellen mit einer Konfluenz von 60 - 95 % und einer Viabilität über 90 % verwendet. Die Zellen wurden in Medium (2D) oder in Gel (3D) suspendiert und ausgesät. Als Chemoattractant diente bei den 2D- wie auch 3D- Experimenten fötales Kälberserum. Die Versuche wurden mit Passage 4 und 5 der primären HUVEC und den Passagen 22 bis 28 der immortalisierten HUVEC durchgeführt. Beispielbilder des Beobachtungsbereiches mit Zellen in 2D und in 3D sind in Abbildung 3 gezeigt. 14

3 Methoden Abbildung 3: Beobachtungsbereich der µ-Slides Chemotaxis 3D . Der Größenbalken entspricht 500 µm. a) Adhärente Endothelzellen auf Collagen IV. b) Endothelzellen eingebettet in einer Collagenmatrix. 3.5.1 2D-Chemotaxis-Assay - Zellaussaat Für den 2D-Chemotaxis-Assays wurde das µ-Slide Chemotaxis 3D Collagen IV verwendet. Das Chemotaxis-3D-Kit enthält ein µ-Slide, einen Kultivierungsdeckel und Stöpsel für die Pipettierzugänge. Die Zellen wurden im Beobachtungsfenster ausgesät. Durch die Beschichtung mit Collagen IV ist es den Zellen möglich sich am Boden zu verankern und darauf fortzubewegen. Es wurden vier Slides befüllt und dabei je ein Kammersystem pro Slide für die Kontrollen reserviert. Durchgeführt wurden drei verschiedene Mediumkombinationen: Eine Negativkontrolle (-/-) mit 0 x ECGM in beiden Reservoiren, eine Positivkontrolle (+/+) mit 1 x ECGM in beiden Reservoiren und eine Gradientenmessung (+/-) mit 1 x ECGM in dem einen und 0 x ECGM in dem anderen Reservoir (Zusammensetzung der Medien siehe Tabelle 6). Dadurch ergaben sich je Ansatz 8 Experimente mit Gradient und je zwei Negativ- und Positivkontrollen. Die ausgegasten µ-Slides wurden unter der Sterilbank mit Stöpseln versehen. Dabei wurden pro Kammersystem immer die Reservoirzugänge C, D, E und F zugestöpselt und die Kanalzugänge A und B offen gelassen (siehe Abbildung 4). Die Zellen wurden mikroskopisch untersucht. Lagen entsprechend viele tote Zellen vor oder war 100 % Konfluenz erreicht konn- 15

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