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Untersuchung immortalisierter Endothelzellen auf charakteristische ...

Untersuchung immortalisierter Endothelzellen auf charakteristische ...

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3 Methoden te der Versuch nicht durchgeführt werden. Die Zellsuspension wurde auf eine Konzentration von 1 x 10 6 Zellen/ml eingestellt. Mit einer 20 µl-Pipette wurden ein Tropfen von 6 µl Zellsuspension auf den Kanalzugang A pipettiert. Mit derselben Pipette wurde am gegenüberliegenden Kanalzugang B ein vorsichtiger Sog ausgeübt und die Zellen so im Kanal ausgesät. Dabei musste, um Luftblasen im Kanal zu verhindern, unbedingt darauf geachtet werden, dass die Zugänge des Kanals bis oben hin mit Medium gefüllt blieben. Der Prozess des Befüllens und ein Querschnitt der gefüllten Kanalzugänge ist in Abbildung 4 dargestellt. Nach dem Befüllen aller Kanäle wurden die Stöpsel entfernt und der Kultivierungsdeckel aufgelegt. Das Slide wurde in eine provisorische Feuchtekammer, bestehend aus einer 10 cm -Petrischale und einem feuchten Zellstofftuch, gelegt. Die Konzentration und Morphologie der Endothelzellen im Beobachtungsbereich wurde mikroskopisch überprüft. Die Feuchtekammer mit den µ-Slides wurde 2 Stunden im Brutschrank inkubiert. Während dieser Zeit setzten sich die Zellen an der Oberfläche des Kanals fest. Abbildung 4: Befüllen des µ-Slides Chemotaxis 3D (Horn, 2012a). a) Die Zellsuspension wird auf den Kanalzugang A pipettiert. b) Am Kanalzugang B wird ein Sog ausgeübt. c) Korrekt gefüllter Kanalzugang nach dem Befüllen. Zur Entfernung des serumhaltigen Mediums in den Kanälen der Negativkontrolle (-/-) und der Gradientenmessung (+/-) wurden diese mit 0 x ECGM gespült. Vorhandene Blasen in den Zugängen wurden zuvor mit einem 10 µl-Tip entfernt. Danach wurden die Zugänge C, D, E und F geschlossen. Gespült wurde jeder Kanal jeweils dreimal mit 10 µl Medium, welches auf den Zugang A pipettiert und vorsichtig hindurchgesogen wurde. Die Kanäle der Positivkontrollen (+/+) wurden mit 1 x ECGM gewaschen. Dadurch wurde ausgeschlossen, dass sich die Zellen der Positivkontrolle aufgrund des Waschschrittes anders verhalten als die restlichen Experimente. Nach dem Waschen wurden die Stöpsel eines Reservoirs (C + D oder E + F) auf die Kanalzugänge gesetzt und das offene Reservoir mit 65 µl Medium befüllt. Die Stöpsel des leeren Reservoirs wurden auf das gefüllte gesetzt und das zweite Reservoir mit 65 µl Medium befüllt. Abschließend wurden die Zellen im Beobachtungsfenster nochmals kontrolliert (Horn, 2012a). 16

3.5.2 3D-Chemotaxis-Assay - Zellaussaat 3 Methoden Für den 3D-Chemotaxis-Assay wurde das µ-Slide Chemotaxis 3D ibiTreat verwendet. Bei der ibiTreat-Beschichtung handelt es sich um eine Methode, bei der die sonst hydrophobe Oberfläche des Kunststoffes zu einer hydrophilen Oberfläche umgewandelt wurde. Somit konnten Flüssigkeiten, wie das Gel, einfacher eingefüllt werden. Die Endothelzellen wurden hier in einem Collagengel festgehalten und konnten sich somit im dreidimensionalen Raum bewegen. Pro Versuchstag wurden vier Slides befüllt und dabei je ein Kammersystem pro Slide für die Kontrollen reserviert. Dadurch ergaben sich je Ansatz 8 Experimente mit Gradient und je zwei Negativ- und Positivkontrollen. Alle Reagenzien aus Tabelle 7 wurden vor Versuchsbeginn auf Raumtemperatur gebracht. Die Reservoirzugänge (C, D, E und F) der µ-Slides wurden mit den Stöpseln verschlossen und ein Gel mit der in Tabelle 7 aufgelisteten Zusammensetzung hergestellt. Reagenz Volumen [µl] 10 x ECGM 20 ddH2O 79 NaHCO3 7,5 % 11 1 x ECGM 50 Collagen I (5 mg/ml) 90 Zellsuspension (6 x 10 6 Zellen/ml in 0 x ECGM) Tabelle 7: Reagenzien zur Herstellung eines Collagengels mit einer Endkonzentration von 1,5 mg/ml (Horn, 2012b). Die Reagenzien für die Gelherstellung wurden in der tabellarisch dargestellten Reihenfolge pipettiert. Aus 10 x ECGM, ddH2O, NaHCO3 und 1 x ECGM wurde in einem 1,5 ml-Tube ein Premix angesetzt und dieser für die Dauer der Zellpräparation in einem Kühlrack auf 0 °C gehalten. Die HUVEC wurden abgelöst und eine Zellsuspension von 6 x 10 6 Zellen/ml hergestellt. Um ein Gel mit 2 % FCS herzustellen wurde für die Zellsuspension 0 x ECGM verwendet. Somit kann der Gradientenaufbau optimal gewährleistet werden. Bevor die Zellsuspension zugegeben wurde, gab man das Collagen I zu dem kaltgestellten Premix. Ab diesem Schritt musste das Röhrchen unbedingt auf 0 °C gekühlt bleiben, um ein vorschnelles Polymerisieren des Collagens zu vermeiden (Horn, 2012b). Die 6fach konzentrierte Zellsuspension wurde luftblasenfrei mit der Matrix vermischt. In dem fertigen Gel waren somit 1 x 10 6 HUVEC/ml vorhanden. 6 µl des Gels wurden mit einer 20 µl-Pipette auf den Kanalzugang A pipettiert und dasselbe Volumen zügig, aber vorsichtig, an Zugang B durchgesogen. Die Stöpsel der Reservoire wurden entfernt und die Kanalöffnungen A und B damit geschlossen. Dabei wurde versucht das Gel nicht durch aprupte Verdrängungsmechanismen zu schädigen. Die µ-Slides wurden in einer Petrischale mit einem feuchtem Zellstofftuch für 45 Minuten im Brutschrank inkubiert. Während dieser Zeit polymerisierte das Gel aus. Die entstandene Struktur, die Zellkonzentration und mögliche Luftblasen im Beobachtungsbereich konnten mikroskopisch betrachtet werden (Horn, 2012a). Das Auffüllen der Reservoire wurde wie bei dem 2D-Chemotaxis-Assay in Absatz 3.5.1 be- 17 50 300

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