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Untersuchung immortalisierter Endothelzellen auf charakteristische ...

Untersuchung immortalisierter Endothelzellen auf charakteristische ...

3 Methoden schrieben

3 Methoden schrieben durchgeführt. Auch hier gab es drei Mediumkombinationen: Eine Negativkontrolle (-/-) mit 0 x ECGM in beiden Reservoiren, eine Positivkontrolle (+/+) mit 1 x ECGM in beiden Reservoiren und eine Gradientenmessung (+/-) mit 1 x ECGM in dem einen und 0 x ECGM in dem anderen Reservoir. 3.5.3 Aufnahme am Mikroskop Um Videomikroskopie der sich bewegenden Zellen betreiben zu können, musste auf dem Mikroskop eine brutschrankähnliche Umgebung geschaffen werden. Das dafür verwendete ibidi Heating System (siehe Abbildung 5) bestand aus einer auf 37 °C erwärmten Kammer im 96well-Format, welche mit 5% CO2 durchströmt wurde (Strömungsgeschwindigkeit: 5 L/h). Die Kammer wurde von einer beheizbaren Bodenplatte mit Platz für vier µ-Slides und einem beheizbaren Deckel gebildet. Dieser bestand aus leitfähigem, transparentem ITO-Glas und vermied Kondensationseffekte durch die Aufrechterhaltung einer gleichmäßigen Temperatur innerhalb der Kammer (Kroutvar and von Guttenberg, 2012a). Die relative Feuchtigkeit des Systems wurde auf 80 % eingestellt. Luftblasen können die mikroskopischen Aufnahmen stören. Um das Auftreten dieses Störfaktors zu reduzieren wurden die Lösungen in nicht dicht geschlossene 15 ml-Röhrchen pipettiert und zusammen mit den steril verpackten Slides 24 Stunden vor Versuchsbeginn in den Brutschrank gestellt. Bei dieser Temperaturanpassung gasen Medien und Slides aus ohne später Einfluss auf das Experiment zu haben (Zantl and Horn, 2011). Eine Stunde vor Versuchsbeginn wurde die Heizung zum Vorwärmen eingeschaltet. Die befüllten µ-Slides Chemotaxis 3D wurden in die Kammer am Mikroskop gesetzt und der Deckel aufgesetzt. Pro Aufnahme wurden entweder vier µ-Slides mit adhärenten HUVEC oder vier µ-Slides mit in Collagen eingebetteten Zellen mikroskopisch betrachtet. Der Beobachtungsbereich des µ-Slides wurde mit einem 4 x Phasenkontrastobjektiv komplett erfasst. Es wurden von den Kanälen 145 Aufnahmen in einem Abstand von zehn Minuten gemacht, was einer Gesamtaufnahmedauer von 24 Stunden entsprach. Die Bildersequenzen wurden als TIFF-Dateien gespeichert und für die Auswertung in JPG-Dateien umgewandelt (Horn, 2012a). Abbildung 5: Heizsystem zur Betrachtung zellbiologischer, zeitaufgelöster Vorgänge am Mikroskop (Kroutvar and von Guttenberg, 2012a). 18

3 Methoden 3.5.4 Programmunterstützte Verfolgung der Zellen und Berechnung der Kennzahlen Für die Ermittlung der chemotaktischen Kennzahlen wurden die aufgenommenen Bildsequenzen, bestehend aus 145 Einzelbildern, herangezogen. Ausgewertet wurden bei den 2D- Chemotaxis-Assays nur die Bilder 37-108. Die ersten und letzten 6 Stunden wurden somit von der Analyse ausgeschlossen. Anhand von Erfahrungswerten konnte davon ausgegangen werden, dass eine 12h-Analyse die selben Ergebnisse erbringt, wie eine 24h-Analyse, bei gleichzeitig weniger Zeitaufwand (Mashiah, 2012). Die Zellen der 3D-Chemotaxis-Assays wurden über den gesamten Aufnahmezeitraum (24 Stunden) verfolgt. Die Bewegung der im Gel eingebetteten HUVEC wurde ebenfalls zweidimensional aufgezeichnet. Dies ist in soweit als richtig zu erachten, wie das Verhältnis der Kanallänge zur Kanalhöhe mindestens 10:1 beträgt (Horn, 2012a). Ausgewertet wurden nur Experimente ohne Luftblasen. Pro Kanal wurden 40 Zellen über einen vorher definierten Zeitraum verfolgt. Während dieser Zeit durfte sich die verfolgte Zelle nicht teilen, absterben oder aus dem Beobachtungsbereich wandern. Die Zellen wurden nach dem Zufallsprinzip ausgewählt. Zum Vermeiden der mehrfachen Analyse einer Zelle wurde diese auf dem ersten Bild markiert. Die Verfolgung der Zellen wurde mit dem Programm „ImageJ“ und des Plugins „Manual Tracking“ vorgenommen. Die Zellen wurden auf jedem Bild mittig markiert, so dass ihnen bei fortlaufender Bildsequenz ein Pfad aus Markierungspunkten folgte. Ein solches Beispiel ist in Abbildung 6 gezeigt. Zu erkennen sind die einzelnen Zellspuren und an deren Ende die jeweils markierte Zelle. Jede Zellmarkierung generierte zu dem dazugehörigen Zeitpunkt einen Ortspunkt mit x/y - Koordinaten, welcher tabellarisch gespeichert wurde. Abbildung 6: Adhärente HUVEC im Beobachtungsbereich des µ-Slides Chemotaxis 3D mit farblich überlagerter Folgespur. Der Größenbalken entspricht 500 µm. Um die Bewegung der Zellen übersichtlicher zu gestalten, wurden die Startpunkte aller Zellen in den Ursprung eines Koordinatenkreuzes gelegt. Diese Plots geben einen ersten Aufschluss darüber in welche Richtung sich die Zellen bewegen. Wie Abbildung 7 a) zu sehen, wanderten die Zellen bevorzugt in Richtung der höheren Chemoattractant-Konzentration (10 % FCS). Dies war hierbei in negativer y-Richtung der Fall. Um die verschiedenen Kennzahlen miteinander vergleichen zu können, wurde der Betrag aller Daten in y-Richtung herangezogen. Somit wurde der FMI in y-Richtung positiv 19

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