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Untersuchung immortalisierter Endothelzellen auf charakteristische ...

Untersuchung immortalisierter Endothelzellen auf charakteristische ...

3.6 Angiogenese-Assay 3

3.6 Angiogenese-Assay 3 Methoden Für die Untersuchung der Sprossungs- und Spaltungsvorgänge beim Wachstum von Blutgefäßen wurde von der ibidi GmbH das µ-Slide Angiogenesis entwickelt. Es besteht aus demselben Kunststoff wie das µ-Slide Chemotaxis (vergleiche Kapitel 3.5) und hat 15 Vertiefungen (wells), welche jeweils eine kleine und eine darüber liegende weitere Öffnung haben (siehe Abbildung 8). Mit dieser well-in-well-Konstruktion wird erreicht, dass sich bei angezeigtem Volumen eine ebene Oberfläche des Mediums bildet, welche einfacher zu mikroskopieren ist. In die untere Vertiefung wurde eine Gelmatrix mit verschiedenen Wachstumsfaktoren gegeben. Das hier verwendete Matrigel wurde aus dem Engelbreth-Holm-Swarm - Tumor in Mäusen gewonnen. Dieser Tumor ist reich an extrazellulären Matrixproteinen wie Laminin, Collagen IV, Heparan-sulfat-proteoglykanen und Entaktin (Kleinman et al., 1982). Dazu kommen noch tumoreigene Wachstumsfaktoren wie bFGF, EGF, IGF-1, PDGF, NGF und TGF-beta (Vukicevic et al., 1992). Auf diesem Gel vereinzelt ausgesäte Zellen bildeten nach einiger Zeit netzförmige Strukturen und konnten somit auf ihre Fähigkeit Zellröhren zu bilden (Tube formation) untersucht werden. Für den Angiogenese-Assay wurden nur HUVEC mit einer Konfluenz von 60 - 95 % und die Passagen 3 bis 5 der primären bzw. die Passagen 22 bis 28 der immortalisierten Endothelzellen verwendet. Pro Versuchstag wurden zwei µ-Slides Angiogenesis ibiTreat verwendet, wobei ein Slide mit HUVEC in Basalmedium (0x ECGM) und das andere mit HUVEC in FCS-reduziertem Medium (red. ECGM) pipettiert wurde (siehe Tabelle 6). Abbildung 8: µ-Slide Angiogenesis mit Maßen und Volumina der Vertiefungen (Wagner, 2012b). 3.6.1 Einfüllen des Gels Auch in diesem Assay waren Luftblasen störend, da sie im Gel vorhanden das Volumen veränderten und im Medium die Sicht auf die Zellen nahmen. Somit wurden die verwendeten Medien, mit Ausnahme von Matrigel, im Brutschrank äquilibriert (siehe Abschnitt 3.5). Um ein möglichst schonendes Auftauen des Gels zu garantieren, wurde dieses 24 Stunden vor dem Experiment im Kühlschrank bei 4 °C gelagert. Außerdem wurde eine Box mit 20 µl- 22

3 Methoden Spitzen bei -20 °C vorgekühlt. Als Matrix wurde ein im Wachstumsfaktorengehalt reduziertes Matrigel ohne Phenolrot verwendet. Davon wurden mit den vorgekühlten Pipettenspitzen 10 µl mittig in die Vertiefung pipettiert. Wegen der hohen Viskosität des gekühlten Gels durfte die Spitze nur 1-2 mm tief eintauchen und das Aufziehen musste langsam erfolgen. Das Slide wurde bis zum vollständigen Erstarren des Gels verschlossen und in einer Petrischale mit feuchtem Zellstofftuch liegend für 30 Minuten in den Brutschrank gegeben. 3.6.2 Zellaussaat Die Zellen lagen nach dem Ablösen mit Accutase in Basalmedium (0 x ECGM) oder FCSreduziertem Medium (red. ECGM) vor und wurden so konzentriert, dass nach Absinken aller Zellen 1 x 10 4 Zellen/well vorlagen. Dies entsprach bei 50 µl Volumen einer Zellsuspension von genau 2 x 10 5 Zellen/ml. Bei einer well-Größe von 0,1963 cm 2 liegen somit rechnerisch ˜51000 Zellen/cm 2 vor. Eine gleichmäßige Zellverteilung in allen 15 Wells wurde durch gründliches Mischen der Suspension vor jedem Pipettieren sichergestellt. Das Volumen wurde mit Hilfe eines Millimeterpapiers überprüft. Dazu wurde das Slide auf ein Rack gelegt und die Millimeterstruktur in den Vertiefungen betrachtet (siehe Abbildung 9) und gegebenenfalls mit Medium korrigiert. Abbildung 9: µ-Slide Angiogenesis mit unterschiedlich gefüllten Vertiefungen. Durch zuviel oder zuwenig Lösung entsteht ein Meniskus, welcher wie eine Linse das darunterliegende Millimeterpapier vergrößert oder verkleinert. Durch Korrektur des Volumens verschwindet der Meniskus (Wagner, 2012b). 3.6.3 Aufnahme am Mikroskop Unverzüglich nach dem Absinken der ausgesäten Zellen und dann nach 6 Stunden wurden von jeder Vertiefung beider Slides ein Bild (4x Objektiv) gemacht. Um möglichst vergleichbare Bilderserien zu bekommen wurde jede Vertiefung am Mikroskop mittig ausgerichtet und ungefähr 60 % der Oberfläche aufgenommen. Die Slides wurden bis zum nächsten Zeitpunkt wieder in den Brutschrank gestellt. 23

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