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Untersuchung immortalisierter Endothelzellen auf charakteristische ...

Untersuchung immortalisierter Endothelzellen auf charakteristische ...

3.6.4 Bildauswertung 3

3.6.4 Bildauswertung 3 Methoden Bestimmung der Zellzahl Die erste Bilderserie (direkt nach der Aussaat) wurde mit dem Cell-Counting-Tool von Wimasis (WimCount) ausgewertet. Dabei wurden kreisförmige Strukturen bestimmter Größen erkannt und deren Anzahl im Bildausschnitt ermittelt. Aufgrund der Kenntnis der Größe dieses Ausschnittes konnte die Zellzahl im gesamten well berechnet werden. Bestimmmung der Netzstruktur Um die verschiedenen Zelltypen auf die Fähigkeit Zellröhren zu bilden untersuchen zu können, wurden 6 Stunden nach dem Aussäen Bilder der Zellen gemacht. Es wurden nur Bilder untersucht, in denen die Zellkonzentration zu Beginn des Versuches 1 x 10 4 ± 1000 Zellen/well betrug. Somit wurden Effekte, die durch unterschiedliche Zelldichte auftreten können, ausgeschlossen. Mit Hilfe des Tube formation - Tools (WimTube) der Firma Wimasis wurde die Netzstruktur ausgewertet. Ein solchermaßen bearbeitetes Bild ist in Abbildung 10 b) zu sehen. Erkannt wurden dabei die von Zellen bedeckte Fläche (blau), die Gesamtlänge der Tubes (rot), die Verzweigungspunkte (weiß) und die durch das Netz gebildeten Schlaufen (gelbe Zahlen). Erfahrungswerte mit primären HUVEC zeigten einen gleichzeitigen Anstieg dieser Strukturmerkmale über die Zeit (Wagner, 2012c). Daher konnte davon ausgegangen werden, dass dies ebenso bei den immortalisierten Zellen der Fall sein würde. Stellvertretend für alle Strukturmerkmale wurde die Gesamtlänge der Tubes (Total Tube Length = TTL) untersucht. Dabei wurde sowohl die Auswirkung von verschiedenen Medien auf die Zellen als auch die Angiogenese-Fähigkeiten der primären und immortalisierten HUVEC miteinander verglichen. 24

3 Methoden Abbildung 10: Netzstruktur von HUVEC auf Matrigel. Der Größenbalken entspricht 500 µm. a) Phasenkontrastaufnahme 6 Stunden nach der Aussaat. b) Mit WimTube ausgewertete Netzstruktur. Zu erkennen sind die mit Zellen bedeckte Fläche (blau), die Tubes (rot), die Verzweigungspunkte (weiß) und die gebildeten Schlaufen (gelbe Zahlen). 3.6.5 Statistische Auswertung Die statistische Auswertung bezog sich auf den Vergleich der Zellen in verschiedenen Medien. Es wurde ein Zweistichproben t-Test mit der Nullhypothese „Proben sind gleich“ gemacht. Es wurde untersucht, ob sich die TTL im Basalmedium maßgeblich von der TTL in FCSreduziertem Medium unterscheidet. Ein weiterer paarweiser t-Test stellte die Angiogenese- Eigenschaften der primären denen der immortalisierten HUVEC gegenüber. Hierbei wurde die Annahme überprüft, ob die TTL der primären HUVEC und die TTL der immortalisierten HUVEC signifikant verschieden sind. 25

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