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Untersuchung immortalisierter Endothelzellen auf charakteristische ...

Untersuchung immortalisierter Endothelzellen auf charakteristische ...

3.7 Flow-Assay 3

3.7 Flow-Assay 3 Methoden HUVEC bilden unter Fluss Merkmale aus, welche charakteristisch für Endothelzellen sind. Dies sind z. B. morphologisch die Ausrichtung der Zellen in Flussrichtung (Kumar et al., 1987). Physiologisch kann die Bildung von Zell-Zell-Kontakten (tight junctions) und Veränderung des von Willebrand-Faktors (Schneider and Schneider, 2008) festgestellt werden. Um diese Veränderungen untersuchen zu können, wurden die HUVEC in ein Kanalslide ausgesät und unter Mediumfluss gesetzt. Dafür wurde das in Abbildung 11 gezeigte µ-Slide I 0.4 Luer ibiTreat in Verbindung mit dem ibidi Pump System verwendet. Das µ-Slide I 0.4 Luer besteht aus einem 0,4 mm hohen Kanal, der über Schläuche mit einem „Perfusion Set“ verbunden werden kann. Das ibidi Pump System besteht aus einer Luftdruckpumpe und ventilgeschalteten Reagenzienreservoiren. Trotz wechselndem Flüssigkeitsstand der Medienreservoire des „Perfusion Sets“ ändert sich die Flussrichtung im Kanal nicht (Wagner, 2012a). Durch gezielte Wahl des Luftdruckes kann nun eine definierte Flussrate und damit ein definierter Scherstress im Kanalinneren erzeugt werden, welcher somit auch auf die dort wachsenden Zellen wirkt. Die vereinfachte Formel für das µ-Slide I 0.4 Luer zur Berechnung des Scherstresses aus der Flussrate lautet (Zantl, 2012): τ: Scherstress Φ: Flussrate τ[ dyn ml ] = 1.316 Φ[ cm2 min ] Um während der gesamten Laufzeit bakteriellen Kontaminationen vorzubeugen wurden alle Medien mit Penicillin/Streptomycin versehen. Zur Vermeidung von Luftblasen wurden die µ-Slides, Schläuche und Medien zum Ausgasen 24 h in den Brutschrank gegeben. Abbildung 11: µ-Slide I 0.4 Luer. Die Homogenität des laminaren Scherstresses über den gesamten Kanal ist anhand der Farben erkennbar. Nur am Kanalrand entstehen inhomogene Bereiche (Zantl, 2012). 3.7.1 ibidi Pump System Vor der Zellaussaat wurde das ibidi Pump System aufgebaut. Dazu wurde eine „Fluidic Unit“ in den Brutschrank gestellt und die Anschlüsse für Luft und Elektrik nach außen verlegt. Außerhalb des Brutschranks wurde die ibidi Pump mit der „Fluidic Unit“ und einem PC verbunden (Aufbauschema siehe Abbildung 12). Mit Hilfe der Software „Pump Control“ konnten der Pumpendruck und die Schaltvorgänge gesteuert werden. Zum Äquilibrieren und Entfernen der eingeschlossenen Luft wurde das „Perfusion Set“ befüllt 26

3 Methoden in die „Fluidic Unit“ eingespannt und im Brutschrank laufen gelassen (Pumpenparameter siehe Tabelle 8). Es wurden 12 ml entgasten Mediums (1 x ECGM) auf die Reagenzienreservoire verteilt und dabei eingeschlossene Luftblasen entfernt. Abbildung 12: Schematischer Aufbau des ibidi Pump Systems unter positivem Pumpendruck. Um Korrosionen im Pumpengehäuse zu vermeiden, wird die angesaugte Inkubatorluft durch eine Trockenflasche geleitet (Kroutvar and von Guttenberg, 2012b). 3.7.2 Zellaussaat Für das Flussexperiment wurden nur Zellkulturflaschen mit einer Konfluenz von 60-90 % und einer Viabilität von mindestens 90 % verwendet. Die Konzentration der Zellsuspension wurde mit 1 x ECGM auf 20 x 10 5 Zellen/ml eingestellt. Es wurden 5 µ-Slides mit je 100 µl Zellsuspension befüllt. Zum Vergleich der Zellen unter dynamischem Fluss mit statisch wachsenden Zellen wurden auch HUVEC ohne Fluss kultiviert. Zeitgleich zu dem Flussexperiment wurden die HUVEC in einem µ-Dish 35 mm, high ibiTreat ausgesät und beobachtet. Die befüllten µ-Slides und das µ-Dish wurden für eine halbe Stunde im Brutschrank inkubiert. Danach wurden die µ-Slide-Reservoire mit 120 µl Medium bzw. das µ-Dish mit 1 ml Medium aufgefüllt und die Zellen für 2 Stunden im Brutschrank inkubiert. War nach mikroskopischer Betrachtung der µ-Slides ein konfluenter Zellrasen zu sehen, konnten sie angeschlossen werden. 27

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