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Untersuchung immortalisierter Endothelzellen auf charakteristische ...

Untersuchung immortalisierter Endothelzellen auf charakteristische ...

3.7.3 Anschluss der

3.7.3 Anschluss der µ-Slides 3 Methoden Die µ-Slides wurden erst durch „Serial Connectors“ untereinander verbunden und dann mit dem schon befüllten „Perfusion Set“ (Wagner, 2012a). Dabei durften keine Luftblasen eingeschlossen werden. Der genaue Vorgang ist in der Application Note 13 (Wagner, 2012a) beschrieben. Die „Fluidic Unit“ wurde von der Pumpe getrennt und aus dem Brutschrank genommen. Die Schläuche des „Perfusion Sets“ wurden mit einer Schlauchklemme abgeklemmt. Somit konnte nach Entfernen des Verbindungsstücks kein Medium austreten. Die gut befüllten Reservoire des Anfangs- und Endslides wurden mit den Luersteckern des „Perfusion Sets“ verbunden. Der Volumenfluss geht bei unidirektionaler Schaltung und positivem Druck durch die Slides in Richtung eines markierten Schlauchs (Wagner, 2012a). Zur besseren Nachverfolgung der Zellausrichtung wurde die Flussrichtung auf den Slides vermerkt. Die Zellen wurden mikroskopisch auf vollständige Konfluenz untersucht. Die „Fluidic Unit“ mit mediumgefülltem „Perfusion Set“ und den verbundenen µ-Slides wurde wieder in den Brutschrank gestellt und an die Pumpe angeschlossen (Luftdruckschlauch und Kabel). Die Zellen im µ-Dish wurden jeden zweiten Tag mit frischem Medium versorgt, so dass sich auch unter statischen Bedingungen ein konfluenter Zellrasen ausbilden konnte. 3.7.4 Software Die HUVEC wurden 5 Tage unter einem Scherstress von 10 dyn/cm 2 kultiviert. Zum Steuern des Scherstresses wurde die Software „Pump Control“ der ibidi GmbH verwendet. Die Oberfläche der Software ist in Abbildung 13 gezeigt. Durch einen anfangs hohen Scherstress im Kanal würden sich die Zellen lösen. Um die Zellen somit erst an den Volumenstrom zu gewöhnen wurde eine Rampe mit zunehmendem Scherstress gefahren (siehe Tabelle 8). Die Parameter wurden zeitabhängig eingegeben, so dass der Scherstress nach Ablauf der ersten Phase automatisch gesteigert wurde. Durch das Hintereinanderschalten mehrerer Slides kann es zu Differenzen zwischen dem eingestellten und dem tatsächlichen Volumenstrom kommen und dadurch zu einem unterschiedlichen Scherstress. Daher wurde der Volumenstrom während der ersten Phase überprüft und gegebenenfalls korrigiert (Kroutvar and von Guttenberg, 2012b). Druck Scherstress Zeit (1) 50 mbar keiner (keine Slides) 30 min (2) 5 mbar 5 dyn/cm 2 30 min (3) 22 mbar 10 dyn/cm 2 unbegrenzt Tabelle 8: Parameter der Software „PumpControl“ für die Steuerung des ibidi Pump Systems. (1) Parameter zur Entfernung der Luftblasen. (2) und (3) Parameter zur Flussgenerierung mit bewachsenen Slides. Hierbei nimmt der Scherstress nach einer halben Stunde zu. Die Druckangaben bei (2) und (3) sind nur ungefähre Werte, da das Hauptaugenmerk auf dem Scherstress liegt. 28

3 Methoden Abbildung 13: Oberfläche der Pumpensteuersoftware „PumpControl“. Auf der linken Seite werden der Pumpendruck und die Ventilschaltung manuell eingestellt. Auf der rechten Seite hat man nach Wahl des verwendeten µ-Slides und des „Perfusion Sets“ die Möglichkeit entweder den Scherstress oder den Volumenfluss gezielt einzugeben. 3.7.5 Immunfluoreszenzfärbung Nach Ablauf der 5 Tage unter Fluss wurde der Fluss gestoppt, die µ-Slides vom „Perfusion Set“ und voneinander getrennt und angefärbt. Auch das µ-Dish wurde für die Fluoreszenzfärbung mitbehandelt. Die Kanäle der µ-Slides wurden dabei mit 120 µl Lösung versetzt, das µ-Dish mit 500 µl. Zwischen den einzelnen Fixier- und Färbereagenzien wurde dreimal mit PBS gewaschen. Die Zellen wurden mit 2 % Formaldehyd überschichtet und 30 Minuten bei Raumtemperatur fixiert. Perforiert wurde mit 0,1 % Triton® X-100 für 4 Minuten bei Raumtemperatur. Die folgenden Färbeschritte wurden in einem lichtarmen Raum durchgeführt und die Slides während den Einwirkzeiten im Dunklen aufbewahrt. Das Aktin des Cytoskeletts wurde mit AlexaFluor 488 Phalloidin (0,5 units/ml) angefärbt. Die Färbelösung wurde mit PBS verdünnt und die Zellen damit 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Mit 0,1 µg/ml DAPI wurde innerhalb von 4 Minuten der Zellkern bei Raumtemperatur angefärbt. Zum Blockieren unspezifischer Bindungsstellen wurden die Zellen vor dem Auftragen der Antikörper eine Stunde bei Raumtemperatur mit dem Blocking Buffer überschichtet und danach nicht gewaschen. Nun wurden drei verschiedene Zellproteine spezifisch mit Antikörpern markiert und diese durch einen zweiten Antikörper dargestellt. Pro Slide wurde eine Antikörperfärbung durchgeführt. In dem µ-Dish wurde nur eine Antikörperfärbung durchgeführt. Bei den markierten Proteinen handelte es sich um die Zellkontaktproteine Claudin-5 (0,625 µl/ml) und VE-Cadherin (1:400) und den von Willebrand-Faktor (1:200). Verdünnt wurden alle Antikörper mit dem Antibody Dilution Buffer (siehe Tabelle 6). Die Färbungen wurden im Kühlschrank (4 °C) über Nacht inkubiert. Am folgenden Tag wurde der sekundäre Antikörper anti-rabbit IgG 29

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