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Untersuchung immortalisierter Endothelzellen auf charakteristische ...

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Diese Arbeit wurde angefertigt unter der Aufsicht von: Dr. Stefanie Sudhop Fakultät für Angewandte Naturwissenschaften und Mechatronik Hochschule München München, Deutschland Prof. Dr. rer. nat. Karlheinz Trebesius Fakultät für Angewandte Naturwissenschaften und Mechatronik Hochschule München München, Deutschland und Dr. Roman Zantl und Dr. Julia Riedl ibidi GmbH Martinsried, Deutschland 2

Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis Abstract 5 Abkürzungsverzeichnis 6 1 Einleitung 7 2 Material 9 2.1 Reagenzien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 2.2 Geräte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 2.3 Software . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 2.4 Materialien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11 2.5 Antikörper . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12 2.6 Hergestellte Lösungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12 3 Methoden 13 3.1 Allgemeine Zellkulturstandards . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13 3.2 Kultivierung und Passagieren der primären HUVEC . . . . . . . . . . . . . . 13 3.3 Kultivierung und Passagieren der immortalisierten HUVEC . . . . . . . . . . 13 3.4 Zellen auftauen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14 3.5 Chemotaxis-Assay . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14 3.5.1 2D-Chemotaxis-Assay - Zellaussaat . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15 3.5.2 3D-Chemotaxis-Assay - Zellaussaat . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17 3.5.3 Aufnahme am Mikroskop . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18 3.5.4 Programmunterstützte Verfolgung der Zellen und Berechnung der Kennzahlen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19 3.5.5 Statistische Auswertung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21 3.6 Angiogenese-Assay . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22 3.6.1 Einfüllen des Gels . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22 3.6.2 Zellaussaat . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23 3.6.3 Aufnahme am Mikroskop . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23 3.6.4 Bildauswertung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24 3.6.5 Statistische Auswertung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25 3.7 Flow-Assay . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26 3.7.1 ibidi Pump System . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26 3.7.2 Zellaussaat . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27 3.7.3 Anschluss der µ-Slides . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28 3.7.4 Software . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28 3.7.5 Immunfluoreszenzfärbung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29 3.7.6 Aufnahme am Mikroskop . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30 3.7.7 Bildbearbeitung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30 4 Ergebnisse 31 4.1 Chemotaxis-Assay . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31 4.1.1 Rohdaten: Forward Migration Index und Ergebnisse des Rayleigh-Tests 31 4.1.2 Vergleich: Forward Migration Index . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35 4.1.3 Rohdaten: Geschwindigkeiten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36 4.1.4 Vergleich: Geschwindigkeit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37 4.2 Angiogenese-Assay . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39 3

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