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Untersuchung immortalisierter Endothelzellen auf charakteristische ...

Untersuchung immortalisierter Endothelzellen auf charakteristische ...

3 Methoden (AlexaFluor®

3 Methoden (AlexaFluor® 555 gelabelt) (2 µl/ml) auf die gewaschenen Zellen gegeben und 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Im Anschluss wurde überschüssiger Antikörper weggewaschen und die Zellen mit Mounting Medium überschichtet. Dies verhindert ein schnelles Ausbleichen des Fluoreszenzfarbstoffes während der mikroskopischen Betrachtung. 3.7.6 Aufnahme am Mikroskop Zur besseren Übersicht wurden nach Ablauf der 5 Tage unter Fluss Phasenkontrastbilder in niedriger Vergrößerung (4 x Objektive) gemacht. Dabei wurden auch die Zellen in statischer Kultur aufgenommen. Einen genaueren Einblick davon, was in den Zellen nach einigen Tagen unter Fluss geschieht, bekam man durch eine fluoreszenzmikroskopische Aufnahme in großer Vergrößerung (60 x Ölimmersionsobjektiv). Hierbei wurden die angefärbten Strukturen wie Zellkern, Aktin, Zell- Zell-Kontakte und von Willebrand-Faktor sichtbar. Durch Wahl des geeigneten Filters konnten von diesen gezielt Aufnahmen gemacht werden. Somit wurden pro Slide und Dish drei Aufnahmen gemacht: Aktin, Zellkern und vWF bzw. Zell-Zell-Kontakte. 3.7.7 Bildbearbeitung Die Bilder wurden mit einem Größenbalken versehen und bei den Aufnahmen der dynamischen Zellen ein Pfeil, der die Flussrichtung anzeigt, eingefügt. Außerdem wurden die Bilder entsprechend ihrer Anregungswellenlänge eingefärbt. Somit wurde der Zellkern blau, das Aktin grün und die antikörpermarkierten Strukturen rot dargestellt. Durch Überlagerung der drei eingefärbten Aufnahmen, konnten gegebenenfalls Bilder erzeugt werden, auf denen das Zusammenspiel der Strukturen erkennbar wurde . Für eine genauere Analyse der Zellorientierung wurde versucht eine Software zu entwickeln. Diese befindet sich aber noch in der Testphase und wird hier als weiter zu verfolgendes Analyseinstrument vorgestellt. Die Software analysiert Phasenkontrastbilder in geringer Vergrößerung und legt eine Ellipse über jede detektierte Zelle. Die Ausrichtung der längeren Ellipsenachse bezogen auf die Flussrichtung (= 0°) wird berechnet und tabellarisch gespeichert. Aus allen Analysen pro Bild wurde ein Histogramm erstellt, welches die Ausrichtung aller Zellen von 0° bis ± 90° anzeigt. 30

4 Ergebnisse 4 Ergebnisse In Abschnitt 3 wurde die Durchführung von 2D- und 3D-Chemotaxis-Assays, Angiogenese- Assays und Flow-Assays beschrieben. Da aus ihnen eine Fülle von Daten hervorgeht, wurden diese zur besseren Übersicht zusammengefasst. Bei allen Diagrammen wurde der arithmetische Mittelwert dargestellt. Um außerdem einen Aufschluss über die Streuung der Messwerte zu geben, wurde ein Fehlerbalken angezeigt. Dieser entspricht der Standardabweichung der Stichprobe. Die Ergebnisse des Student-t-Tests wurden als Signifikanzniveaus direkt im Diagramm angegeben. Welche Daten dabei miteinander verglichen wurden, wird aus den grünen Klammern ersichtlich. Der hierbei verwendete Zweistichproben t-Test bezieht sich auf das Signifikanzniveau α=0.05 und geht von unterschiedlichen Varianzen aus. α > 0.05 (> 5 %) nicht signifikant α = 0.01 bis 0.05 (1 bis 5 %) signifikant (*) α = 0.001 bis 0.01 (0.1 bis 1 %) hoch signifikant (**) α ≤ 0.001 (≤ 0.1 %) höchst signifikant (***) Tabelle 9: P-Werte des Student-t-Tests und deren Aussage bezüglich Signifikanz (Bender and Lange, 2001). 4.1 Chemotaxis-Assay In den folgenden Abbildungen (Abbildungen 14 bis 18) sind die Kennzahlen Forward Migration Index (FMI), Ergebnisse des Rayleigh-Tests und die Zellgeschwindigkeiten für die 2Dund 3D-Chemotaxis-Assays zu sehen. Dabei entspricht ein Diagramm den jeweiligen Messwerten pro Zelltyp. In den Diagrammen des FMI und der Geschwindigkeit sind die einzelnen Versuche als graues Symbol und der Mittelwert dieser Versuche als roter Balken zu sehen. Die roten Fehlerbalken des Mittelwertes repräsentieren die Standardabweichung der Messwerte. Die Diagramme des Rayleigh-Tests zeigen die einzelnen Versuche als graue Symbole und eine gestrichelte Linie als Markierung des Signifikanzniveaus (siehe Rayleigh-Test in Abschnitt 3.5.4). 4.1.1 Rohdaten: Forward Migration Index und Ergebnisse des Rayleigh-Tests In Abbildung 14 zeigen die Diagramme a), c) und e) die parallelen und senkrechten FMIs der zweidimensionalen Gradientenmessung (+/-) und deren Kontrollen (Positivkontrolle (+/+); Negativkontrolle (-/-)). Bei allen drei Zelltypen beträgt der parallele FMI des Gradienten ungefähr 0,2. Der senkrechte FMI des Gradienten liegt bei ungefähr 0. Dieser Unterschied zwischen dem parallelen und dem senkrechten FMI der Gradientenmessung ist bei allen Zellen höchst signifikant. Die FMI (parallel und senkrecht) der Positiv- und Negativkontrollen liegen bei ungefähr 0. Auch hier sind diese Unterschiede zwischen parallelem FMI des Gradienten und den Kontrollen signifikant. Die Diagramme b), d) und f) der Abbildung 14 zeigen die Ergebnisse des Rayleigh-Tests. Das bei einem P-Wert von 0,05 gesetzte Signifikanzniveau sagt aus, ob eine Zellbewegung als zufällig (≥ 0,05) oder gerichtet (< 0,05) gesehen werden kann. Die P-Werte der Gradientenmessung liegen größtenteils unter 0,05. Bei Klon 1 bzw. Klon 2 der immortalisierten HUVEC liegen ein bzw. zwei Versuche leicht darüber. 31

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