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Untersuchung immortalisierter Endothelzellen auf charakteristische ...

Untersuchung immortalisierter Endothelzellen auf charakteristische ...

5 Diskussion kontrolle.

5 Diskussion kontrolle. Die vorherige Annahme, dass Klon 2 der immortalisierten HUVEC stärker auf Nährstoffknappheit reagieren als die anderen getesteten Zellen, ist somit hinfällig. Es muss vermutet werden, dass durch die gentechnische Veränderung dieses Klones Rezeptoren oder der Bewegungsapparat der Zellen beschädigt wurden. Somit kann es, wie gezeigt, bei Abwesenheit eines Konzentrationsgradienten zu anderen Ergebnissen kommen wie erwartet. Insgesamt zeigte sich jedoch, dass die immortalisierten HUVEC bei der chemotaktisch induzierten Migration kein auffällig anderes Verhalten aufweisen wie die primären HUVEC. Das unterschiedliche Verhalten von Klon 2 der immortalisierten HUVEC bei den Kontrollen ist zu beobachten, aber vorerst kein ausschlaggebendes Kriterium für eine Nichteignung dieses Klons als kulturfähige Endothelzelllinie. 5.2 Angiogenese-Assay Anhand der Anzahl der gebildeten Zellröhren (hier TTL) kann auf die Fähigkeit zur Neubildung von Blutgefäßen geschlossen werden (Folkman and Haudenschild, 1980a). Wie in den Experimenten auf Matrigel gezeigt (vergleiche Abbildung 21 in Kapitel 4.2), ist die TTL der primären und immortalisierten HUVEC in FCS-reduziertem Medium (red. ECGM) annähernd gleich. In Basalmedium ohne Zusätze (0x ECGM) werden jedoch größere Unterschiede registriert. Der auffälligste Unterschied ist hierbei, dass nur die primären HUVEC bei einer Abwesenheit des Nährstoffes FCS auch weniger Tubes bilden. Beide Klone der immortalisierten HUVEC bilden ohne FCS mehr Tubes. Dieser Effekt konnte schon in internen, nicht veröffentlichten Daten beobachtet werden (von Ledebur-Wicheln, 2011). Die Zelllinie EA.hy926, welche dabei in FCS-freiem Medium auch mehr Tubes bildete, ist ein Hybrid primärer HUVEC mit Thioguanin-resistenten Klonen von A549 (Rieber et al., 1993). Die Daten dieser beiden Zelllinien würden darauf hinweisen, dass fötales Kälberserum den Tube formation-Prozess inhibieren kann. Bei primären HUVEC ist solch eine Inhibition durch FCS nicht bekannt, da das komplexe Serum in vielen Fällen sogar zur Induktion von Tube formation-Prozessen genutzt wird (Miura et al., 2004). Der Unterschied des FCS-Gehalts von dem verwendeten Kulturmedium (12 %) zu dem Versuchsmedium (0 bis 2 %) kann zu den Unterschieden der immortalisierten HUVEC geführt haben. Oft werden gerade in den Versuchsmedien viel höhere Serumkonzentrationen (15 bis 30 %) verabreicht (Franke et al., 1979). Da die genaue Zusammensetzung jedes Serums von Spender zu Spender schwankt, können beobachtete Effekte nicht genau zugeordnet werden. Man geht daher dazu über serumfreie Medien zu verwenden und Nährstofffaktoren gezielt und in bekannter Konzentration zuzusetzen (Brunner et al., 2010). Für weitere Versuche würde es sich auch anbieten Humanserum zu testen. Dieses findet bei Angiogenese-Forschern verstärkt Beachtung, da ja auch die zu testenden Zellen humanen Ursprungs sind (Folkman and Haudenschild, 1980b). In Vorversuchen wurde die für die Tube formation geeignete Zelldichte der primären HUVEC herausgefunden. Diese wurde auf 51000 Zellen/cm 2 eingestellt (Wagner, 2012b). Die immortalisierten HUVEC sollen dieselben Eigenschaften wie die primären HUVEC aufweisen. Daher wurde dieselbe Zelldichte, wie bei den primären HUVEC, für alle Klone verwendet, obwohl bekannt war, dass die Zelldichte Einfluss auf die Tube formation-Prozesse haben kann (Arnaoutova et al., 2010). Wäre bei Vorversuchen eine veränderte Zelldichte ermittelt worden, hätte man schon hier von einem veränderten Verhalten der immortalisierten HUVEC ausgehen können. 48

5 Diskussion Für eine Eignung der immortalisierten HUVEC als kulturfähige Endothelzelllinie sollte gerade die Angiogenese-Fähigkeit genau der der primären HUVEC entsprechen. Ein genau konträres Verhalten würde für starke Unterschiede der Zellen sprechen und wäre somit nicht wünschenswert. 5.3 Flow-Assay Endothelzellen richten sich unter Fluss in Richtung des Volumenstroms aus. Diese Orientierung ist in vitro zu beobachten (Langille and Adamson, 1981) und konnte auch bei den primären HUVEC festgestellt werden. Bei den immortalisierten HUVEC kann solch eine Orientierung auf den ersten Blick nicht beobachtet werden. Diese Annahme stützt sich auf den Vergleich der Phasenkontrastbilder in Abbildung 22. Durch die Analyse der Phasenkontrastbilder mit der Testversion einer eigens dafür entwickelten Software, konnte gezeigt werden, dass sich die immortalisierten HUVEC unter Fluss doch mehr ausrichten wie auf den ersten Blick zu sehen war. Dennoch entsteht ausschließlich bei den primären HUVEC ein klar strukturierter und einschichtiger Zellrasen, was gegen die Verwendung der immortalisierten HUVEC für weitere Flow-Assays spricht. Weitere Merkmale, welche bei Endothelzellen vorkommen bzw. sich unter Fluss verändern, konnten bei den immortalisierten HUVEC nicht oder nur in sehr geringem Ausmaß festgestellt werden. Der Nachweis an VE-Cadherin konnte bei den immortalisierten HUVEC erbracht werden. VE-Cadherine sind in den „adherens junctions“ von Endothelzellkontakten zu finden (Wheelock and Johnson, 2003). In früheren internen Experimenten war VE-Cadherin auch bei statisch kultivierten Endothelzellen nachzuweisen. Bei Endothelzellen unter Fluss sind die Begrenzungen jedoch deutlicher ausgeprägt (Wagner, 2012a) Der von Willebrand-Faktor ist nur in Endothelzellen und Megakaryozyten vorhanden (von Willebrand, 1999). Bei den immortalisierten HUVEC konnte er nur in einigen wenigen Zellen nachgewiesen werden. Dies spricht alleine für sich für eine starke genetische Veränderung der Zellen. Auch konnte in den wenigen Zellen keine Streckung des von Willebrand-Faktors (vWF) beobachtet werden. Dies ist für ein erfolgreiches Zusammenspiel des vWFs mit den Thrombozyten jedoch unerlässlich (Fuchs et al., 2010). Eine Färbung des vWFs unter statischen Bedingungen wurde nicht gemacht. Laut Schneider and Schneider (2008) kann aber davon ausgegangen werden, dass dabei keine auffällige Streckung zu sehen ist. Einzig bei den dynamisch kultivierten primären HUVEC konnten durch die Claudin-5-Färbung die „tight junctions“ nachgewiesen werden. Diese werden laut Walsh et al. (2011) erst nach einigen Stunden unter dem Einfluss von Scherstress gebildet. Diese Bildung konnte in den Versuchen zumindest bei den primären HUVEC eindrucksvoll gezeigt werden. Die Anfärbung eines Teils des Spindelapparates durch anti-Claudin-5 deutet auf eine zu geringe Spezifität des verwendeten Antikörpers hin. Da sich die Zielproteine hier jedoch nicht überlappen, liegt nur eine vernachlässigbare Störung vor. Am deutlichsten konnte der Einfluss von Scherstress auf die Zellen bei der Aktinfärbung gesehen werden. Durch den Scherstress, welcher unter Fluss auf die Zellen wirkt, bilden sich sogenannte „stress fibers“ aus (Wojciak-Stothard and Ridley, 2003). Diese sind vor allem bei den primären HUVEC gut zu sehen. Dort sind sie auch schön parallel zum Fluss angeordnet. Bei Klon 2 der immortalisierten HUVEC sind die „stress fibers“ nicht ganz parallel zum Fluss. Bei Klon 1 der immortalisierten HUVEC fehlen sie sogar fast komplett und auch das restliche Aktingerüst der Zelle sieht sehr ungeordnet aus. Dies spricht stark dafür, dass zumindest Klon 1 durch den Scherstress nicht beeinflusst wird. Es könnte noch untersucht 49

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