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Untersuchung immortalisierter Endothelzellen auf charakteristische ...

Untersuchung immortalisierter Endothelzellen auf charakteristische ...

1 Einleitung dere

1 Einleitung dere Zellen, wie zum Beispiel Fibroblasten, mit isoliert und es entsteht somit eine heterogene Zellpopulation (Jaffe et al., 1973). Primärzellen verlangen zudem meist ein speziell auf sie abgestimmtes komplexes Medium und sind durch Transfektion nur mit erhöhtem Aufwand zu manipulieren (Hamm et al., 2002). Aufgrund dieses Mehraufwandes bei primären Zellen wird versucht stabile Zelllinien mit den selben Eigenschaften zu finden bzw. zu entwickeln. Quellen solcher Zelllinien können Tumore sein, welche aufgrund ihrer Eigenschaft als Tumorzelle eine Immortalisierung aufweisen (Jacoby, 2009). Eine weitere Möglichkeit ist, die isolierten Zellen so zu behandeln, dass daraus immortalisierte Zellen entstehen. Diese aktive Immortalisierung wird bei Ruley (1983) mit Adenoviren vorgenommen und dabei gezielt Gene der Zellalterung ausgeschalten. Eine neuere Möglichkeit der Immortalisierung ist das gezielte Einschleusen von Genen, welche die primären Zellen zur Proliferation bringen (May et al., 2012). Dadurch wird eine homogene Zellpopulation gewonnen, deren Erbstruktur gentechnisch weiter veränderbar ist. Das allerwichtigste Kriterium hierbei ist aber die unbegrenzte Verfügbarkeit der Zellen. Die immortalisierten Zellen können lange Zeit in Kultur gehalten werden. Somit sind auch Versuche über einen längeren Zeitraum mit derselben Zelllinie möglich und die damit erzielten Ergebnisse bleiben vergleichbar. In der vorliegenden Arbeit soll untersucht werden, ob sich primäre, frisch isolierte HUVEC von gentechnisch veränderten und dadurch immortalisierten HUVEC unterscheiden. Diese Immortalisierung wurde mit der Methode nach May et al. (2012), wie oben genannt, vorgenommen. Der Schwerpunkt der Arbeit liegt hierbei in der Untersuchung verschiedener endothelzellenspezifischer Charakteristika. Diese können mit nur vier verschiedenen Experimenten festgestellt werden. Die Migration der Endothelzellen wird in zwei- und dreidimensionalen Chemotaxis-Assays ermittelt. Die Fähigkeit zur Tube formation wird im Angiogenese-Assay getestet. Das Verhalten unter Fluss und physiologische Merkmale werden im Flow-Assay untersucht. Das Ziel dieser Arbeit ist mit den genannten Assays stabile kulturfähige HUVEC zu selektieren, so dass die Verwendung primärer HUVEC auf lange Sicht überflüssig wird. 8

2 Material 2.1 Reagenzien 2 Material Reagenz Hersteller Cat.Nr. 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Carl Roth 6335.1 Accutase PAA 11-007 AlexaFluor® 488 Phalloidin Molecular Probes A-12379 Collagen I, rat tail, 5 mg/ml, non-pepsinized ibidi 50201 ddH2O, Rotipuran® Carl Roth T172.3 Endothelial Cell Basal Medium 10x PromoCell customer formulation Endothelial Cell Growth Medium (ECGM) PromoCell C-22010 Fötales Kälberserum (FCS) PAA A15-104 Formalin, 10 % (enthält 4 % Formaldehyd) Sigma-Aldrich HT50-1-1 Gelatin Solution, 2 % in H2O Sigma-Aldrich 111M60002 Immersion Oil Type DF Cargille / Matrigel (growth factor reduced, phenolredfree) BD 356231 Mounting Medium ibidi 50001 Natriumbicarbonat 7,5 % ccpro Z-30-M PBS 1x ccpro PL-12-L Penicillin/Streptomycin ccpro Z-13-M Supplement Mix (Wachstumsfaktoren und Serum) PromoCell C-39215 Triton® X-100 solution Sigma-Aldrich 93443 Trypan Blue 0,4 % Sigma-Aldrich T8154 Tabelle 1: Verwendete Reagenzien und Chemikalien. 9

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