Download - Fakultät 06

Jürschick, Johannes – Chemotaxis in µ-Slides mit 3-dimensionalen Gelmatrizes
Zellkulturflaschen (gelber Verschluss, Cell+) in DMEM-Medium (C-C-Pro) mit 10% FCS
kultiviert.
Die genaue Zusammensetzung des Mediums findet sich in Anhang G auf Seite 100. Im
Folgenden darf davon ausgegangen werden, dass DMEM soweit nicht anders beschrieben
immer mit 10% FCS verwendet wurde. Die Kultivierung der Zellen erfolgte in einem
Brutschrank bei 37°C und 5% CO2. Im Abstand von 2 Tagen wurde die Konfluenz der Zellen
unter dem Phasenkontrastmikroskop überprüft. Das Wachstum von HT-1080 Zellen ist
weitgehend unabhängig von Zell-Zell Kontakten [Collins, 1978]. Um die Zellzahl dennoch
stabil zu halten, wurde versucht die Zellen stets so lange in einer Flasche zu kultivieren bis
die Zellschicht zu mindestens 80% optisch konfluent war. Anschließend wurden die Zellen in
den Kulturflaschen mit 10 ml PBS gewaschen Zellen und nach Absaugen des PBS durch
Trypsinierung mit 2ml Trypsin-EDTA vom Flaschenboden gelöst. Die gelösten Zellen wurden
mit 10 ml DMEM versetzt und anschließend, abhängig von der Zelldichte in einem Verhältnis
etwa 1:4 mit frischem Medium verdünnt. Auf diese Weise wurde die Zellzahl bei etwa 1x10 5
bis 1x10 6 Zellen stabil gehalten.
Die überschüssigen Zellen wurden durch 5-minütiges Zentrifugieren bei 1500 RPM wieder
vom Medium getrennt und abhängig von der vorhandenen Gesamtzellmenge in etwa 500µl
DMEM resuspendiert um eine finale Zellzahl von ungefähr 1,7x10 7 Zellen für
Chemotaxisexperimente zu erhalten.
Die mit LifeAct transfizierten Zellen wurden aufgrund des langsameren Wachstums in der
Regel nur im Verhältnis 1:2 verdünnt. Zusätzlich wurde hier dem Medium noch G418-Sulphat
in einer Konzentration von 375µg/ml zugefügt, um den Selektionsdruck auf die transfizierten
Zellen aufrecht zu erhalten.
3.Material und Methoden 23