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Download - Fakultät 06

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Jürschick, Johannes – Chemotaxis in µ-Slides mit 3-dimensionalen Gelmatrizes<br />

Das Füllschema der Slides für Experimente mit Positiv- und Negativkontrolle ist in<br />

Abbildung 15 dargestellt.<br />

Abbildung 15: Schematische Darstellung der Verteilung der Chemoattraktand-Konzentrationen für<br />

Chemotaxis Versuche mit Kontrollexperimenten.<br />

Für HT-1080 Zellen wurde bei der Zusammenstellung der Gele für das Chemotaxis-<br />

Experiment und die Negativkontrolle DMEM ohne FCS verwendet. Die Positiv-Kontrolle<br />

enthielt DMEM mit 60% FCS, um nach einer Verdünnung im Rahmen des, in Anhang D<br />

gezeigten Pipettierschemas, auch im Kanalbereich an eine finale Konzentration von 10% FCS<br />

zu erhalten.<br />

Die verwendete Gelmatrix schließt Konvektionsströmungen zwischen den Reservoirs aus.<br />

Dadurch kann unmittelbar nach Aushärten des Gels ein Reservoir mit Chemoattraktant gefüllt<br />

werden ohne dass es zu Vermischung im Kanalbereich kommt. Dieses Vorgehen wird als „fast<br />

Method“ bezeichnet.<br />

In einem Großteil der beschriebenen Versuche wurden jedoch zuerst beide Reservoirs mit<br />

60µl des Hungermediums C0 gefüllt. Anschließend wurden 30µl einer Chemoattraktant-<br />

Lösung mit doppelter Konzentration auf einen der beiden Einfüllstutzen des linken Reservoirs<br />

pipettiert. Durch Absaugen von 30µl Flüssigkeit aus dem anderen Stutzen mit einer<br />

Pipettenspitze wurde das Chemoattraktant in das Reservoir gesaugt. Der Gradient sollte so<br />

schonender und mit geringer zeitlicher Verzögerung etabliert werden. Das Vorgehen nach<br />

dieser Methode wird als „slow method“ bezeichnet. Ausführliche Beschreibungen der beiden<br />

Methoden finden sich in Anhang E, auf Seite 82f.<br />

Um die Bedingungen für die Zellen während der Experimente möglichst optimal zu halten,<br />

wurden die Slides während der Laufzeit des Experimentes unter dem Mikroskop in eine, von<br />

der Firma Ibidi eigens dafür entwickelte Heizplatte mit ebenfalls beheizbarer Abdeckhaube<br />

gelegt. Die Temperatur der Bodenplatte war auf 41.5°C die Temperatur der Abdeckhaube auf<br />

43.5°C eingestellt, was einer Temperatur der Atmosphäre innerhalb dieser Kammer von etwa<br />

3.Material und Methoden 33

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