Download - Fakultät 06
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Jürschick, Johannes – Chemotaxis in µ-Slides mit 3-dimensionalen Gelmatrizes<br />
Das Füllschema der Slides für Experimente mit Positiv- und Negativkontrolle ist in<br />
Abbildung 15 dargestellt.<br />
Abbildung 15: Schematische Darstellung der Verteilung der Chemoattraktand-Konzentrationen für<br />
Chemotaxis Versuche mit Kontrollexperimenten.<br />
Für HT-1080 Zellen wurde bei der Zusammenstellung der Gele für das Chemotaxis-<br />
Experiment und die Negativkontrolle DMEM ohne FCS verwendet. Die Positiv-Kontrolle<br />
enthielt DMEM mit 60% FCS, um nach einer Verdünnung im Rahmen des, in Anhang D<br />
gezeigten Pipettierschemas, auch im Kanalbereich an eine finale Konzentration von 10% FCS<br />
zu erhalten.<br />
Die verwendete Gelmatrix schließt Konvektionsströmungen zwischen den Reservoirs aus.<br />
Dadurch kann unmittelbar nach Aushärten des Gels ein Reservoir mit Chemoattraktant gefüllt<br />
werden ohne dass es zu Vermischung im Kanalbereich kommt. Dieses Vorgehen wird als „fast<br />
Method“ bezeichnet.<br />
In einem Großteil der beschriebenen Versuche wurden jedoch zuerst beide Reservoirs mit<br />
60µl des Hungermediums C0 gefüllt. Anschließend wurden 30µl einer Chemoattraktant-<br />
Lösung mit doppelter Konzentration auf einen der beiden Einfüllstutzen des linken Reservoirs<br />
pipettiert. Durch Absaugen von 30µl Flüssigkeit aus dem anderen Stutzen mit einer<br />
Pipettenspitze wurde das Chemoattraktant in das Reservoir gesaugt. Der Gradient sollte so<br />
schonender und mit geringer zeitlicher Verzögerung etabliert werden. Das Vorgehen nach<br />
dieser Methode wird als „slow method“ bezeichnet. Ausführliche Beschreibungen der beiden<br />
Methoden finden sich in Anhang E, auf Seite 82f.<br />
Um die Bedingungen für die Zellen während der Experimente möglichst optimal zu halten,<br />
wurden die Slides während der Laufzeit des Experimentes unter dem Mikroskop in eine, von<br />
der Firma Ibidi eigens dafür entwickelte Heizplatte mit ebenfalls beheizbarer Abdeckhaube<br />
gelegt. Die Temperatur der Bodenplatte war auf 41.5°C die Temperatur der Abdeckhaube auf<br />
43.5°C eingestellt, was einer Temperatur der Atmosphäre innerhalb dieser Kammer von etwa<br />
3.Material und Methoden 33