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Jürschick, Johannes –

Jürschick, Johannes – Chemotaxis in µ-Slides mit 3-dimensionalen Gelmatrizes Zur vollständigen Vernetzung des Collagens wurden die Slides anschließend wieder für 30 Minuten in den Inkubator gestellt. Die auszuwertenden Bilddaten wurden mit dem EVOS fl. Fluoreszenz-Mikroskop der Firma AMG generiert. Die Wellenlänge des anregenden Lichts betrug 470nm, die des detektierten emittierten Lichts 525nm. Als Referenzwert für die anschließenden Messungen wurde die Hintergrundfluoreszenz des Collagen-Gels festgelegt. Zur Bestimmung der Hintergrundfluoreszenz wurde die Detektionszeit und die Intensität des anregenden Lichtes variiert bis unter dem integrierten Fluorit-Objektiv (10x/0.3) ein deutlicher Unterschied der Emissionsintensität zwischen der Messung im Collagen-Gel und einer Referenzmessung in einem leeren Reservoir erkennbar war. Die Werte betrugen im untersuchten Fall 500ms Belichtungszeit bei 50% der, zur Verfügung stehenden Anregungsintensität des Mikroskops. Über Verdünnungsreihen der beiden verwendeten Fluoreszenz-Farbstoffe wurden diejenigen Konzentrationen ermittelt, bei denen die, als 8-bit Grauwert auf einer Skala von 0 (Schwarz) bis 255 (Weiß) dargestellte Emissionsintensität etwa im mittleren Bereich lag. Für FiTC-Dextran ergab sich in Folge dessen eine Konzentration von 1µg/ml, für Alexa 488 wurde eine 100nM Lösung gewählt. 4. Ergebnisse 37

Jürschick, Johannes – Chemotaxis in µ-Slides mit 3-dimensionalen Gelmatrizes Die Entwicklung der Fluoreszenzfarbstoffkonzentration im Gel wurde im Anschluss an die Referenzmessung in 3 Schritten bestimmt: 1.Schritt: Überschichten der Gele mit Fluoreszenz-Farbstoff und anschließender 30-minütiger Diffusionszeit. 2.Schritt: Erste Messung unmittelbar nach Austausch der Farbstofflösung mit PBS. 3.Schritt: Drei weitere Messungen nach jeweils 15-minütiger Diffusionszeit und Austausch des PBS. Abbildung 17: Schematische Darstellung der Versuchsdurchführung in einer Kammer des Angiogeneseslide. Die schwarzen Pfeile deuten die Farbstoffdiffusion in das und aus dem Gel (brauner Bereich) an. Durch den Austausch lediglich der überschichteten Flüssigkeit kann der Farbstoff nur durch erneute Diffusion wieder aus dem Gel gelöst werden. Ein Auslösen oder Ausbrechen von gebundenen Molekülen durch mechanische Scherkräfte oder Konvektionsströme kann somit ausgeschlossen werden. Die Fokusebene wurde anhand der Bilddarstellung im Phasenkontrast so positioniert, dass die Struktur der Collagenfasern zu erkennen war. Auf diese Weise wurde sichergestellt, dass die Messungen der Fluoreszenzintensität innerhalb der Gelmatrix durchgeführt wurden. Die Grauwerte der gemessenen Bilder wurden über das jeweilige Gesamtbild gemittelt und tabellarisch aufgetragen. 4. Ergebnisse 38

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