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Jürschick, Johannes –

Jürschick, Johannes – Chemotaxis in µ-Slides mit 3-dimensionalen Gelmatrizes Für jeden der beiden Farbstoffe wurde jeweils nur eine Referenzmessung zu C100 beziehungsweise C0 durchgeführt. Durch Pipettierungenauigkeit und eine leicht variable Messposition in den jeweiligen Slides ist die Aussagekraft der Referenzlösung allerdings auf die Kammer beschränkt in welcher die zugehörige Messung unternommen wurde. Es hätten Referenzmessungen für jeden Slide und für jede seiner 3 Kammern durchgeführt werden müssen. Aussagen über den Zeitraum der Etablierung wie über den genauen Ablauf konnten deshalb mit dieser Methode nur ungenau und qualitativ getroffen werden. Erkennbar ist, dass sich die Konzentrationsprofile ausgehend von der 2-Stunden Messung im Beobachtungsbereich weitestgehend linear verlaufen. Unterschiede zwischen den unterschiedlichen Ansätzen sind kaum vorhanden. Das zeigt sich auch an der Analyse der Entwicklung des Gradienten über die Zeit. Die in Abbildung 23 gezeigten Werte wurden über eine Anpassung der Steigung der Konzentrationsprofile aus Abbildung 22 im linear abfallenden Bereich zwischen -500µm und +500µm von der Kanalmitte ermittelt. Abbildung 23: Die Gradienten von (A) Alexa 488 und (B) FiTC-Dextran aufgetragen über die Zeit von 0- 36h. Nach anfänglichem steilem Anstieg und einem leichten „Einschwingen“ bleiben die 4. Ergebnisse 45

Jürschick, Johannes – Chemotaxis in µ-Slides mit 3-dimensionalen Gelmatrizes Gradienten nahezu konstant. Auch die Analyse des Gradienten zeigt einen, im Rahmen des Messfehlers vergleichbaren Verlauf der Ansätze unterschiedlicher Gelkonzentration. Um detaillierte Informationen über Etablierung und Verlauf des Gradienten zu erhalten wurden auf ein anderes Verfahren mit geringerer Fehleranfälligkeit zurückgegriffen das bezüglich der notwenigen Referenzmessungen einfacher zu handhaben ist und dadurch auch eine höhere Zeitauflösung erlaubt. 4.1.3. FCS-Messungen Durch die Fluoreszenz-Korrelations Spektroskopie (FCS) lassen sich die Fluoreszenzsignale einzelner fluoreszierender Moleküle an Messpunkten mit ~ 1 µm Schichtdicke bestimmen. Durch die Integration der Signale in Abhängigkeit von der Diffusionszeit, die bestimmt, wie lange einzelne Moleküle im Durchschnitt im Beobachtungsfenster der laufenden Messung verbleiben, lässt sich eine sehr präzise Aussage über die Konzentration eines fluoreszierenden Stoffes an einem bestimmten Punkt im Untersuchungsbereich formulieren. Die Messungen sollen bei minimaler Fehleranfälligkeit detailliert Auskunft über den zeitlichen Verlauf und die Etablierung des Gradienten geben. Bestimmung des Messprinzips: Der verwendete Farbstoff war in allem Ansätzen Alexa 488 mit den in Punkt 3.3.2.2. beschriebenen Konzentrationen. Den folgenden Messungen von Konzentrationsprofilen wurde ein eigens erstellter Verdünnungsgraph zugrunde gelegt, um für Messkurven und Kalibrierungswerte gleiche Voraussetzungen bezüglich eventuell auftretender Messfehler oder Alterungsprozesse des Fluoreszenzfarbstoffes zu schaffen. Dafür wurde der Konzentrationsgradient zwischen C100 und C0 in 11 Stufen zu Schritten von je 5nM Konzentrationsunterschied unterteilt. Alle Verdünnungen wurden aus der Stammlösung zu C100 erstellt und in eine Kammer eines Chemotaxis 3D µ-Slides gefüllt. Gemessen wurde in der Kanalmitte bei einer z-Verschiebung von 35µm relativ zur Kanaldecke. 4. Ergebnisse 46

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