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Jürschick, Johannes –

Jürschick, Johannes – Chemotaxis in µ-Slides mit 3-dimensionalen Gelmatrizes Als Chemoattraktant wurde in allen untersuchten Fällen N-Formylmethionyl-Lencyl- Phenylalanin (fMLP) verwendet. Zur Menge des verwendeten Chemoattraktant variieren die Literaturangaben stark in Abhängigkeit der verwendeten Untersuchungsmethode. Zur Ermittlung der idealen Konzentration wurden für C100 verschiedene Konzentrationen getestet. Tabelle 4 soll auf die wichtigsten kurz Bezug nehmen. Für alle aufgeführten chemotaktischen Untersuchungen wurde das Chemoattraktant in das links vom Mittelkanal gelegene Reservoir eingefüllt. Eine dadurch ausgelöste gerichtete Zellbewegung ist folglich in Form einer Wanderung in negativer x-Richtung zu erwarten. Die Bewegung von Einzelzellen wurden wie in Punkt 3.5.2. beschrieben mit Hilfe des „manual tracking“ Plugins der Software ImageJ verfolgt und in Tabelle 4 dargestellte Werte anschließend durch das Chemotaxis and Migration Tool der Firma Ibidi generiert. Konzentration p-Value ǁ(x)-FMI ⊥(y)-FMI Directness Velocity[µm/min] Tracks 1µM 0,763 -0,014 0,026 0,153 4,85 21 200nM 0,024 -0,048 -0,035 0,148 5,46 24 10nM 0,092 -0,038 -0,013 0,139 4,39 22 5nM 0,022 -0,097 -0,013 0,192 1,68 7 Tabelle 4: Gemessene Chemotaxis-Parameter einer Versuchsreihe mit unterschiedlichen Chemoattraktant Konzentrationen. Tracks bezeichnet hier die Anzahl verfolgter Zellen. Diese dient auch als Maß für die statistische Signifikanz der Werte. Die gemessenen Werte zeigen tendenziell eine Zunahme des Verhältnisses der Beträge von x und y-FMI. Die Konzentration von 1µM ausgenommen, überschreitet der p-wert bei keinem der Experimente den Wert 0.01. Die Direktionalität der Zellenmigration ist für alle Ansätze weitestgehend einheitlich. Die Geschwindigkeit der Zellen liegt in dem Versuch mit 5nM fMLP um den Faktor 15, mit höheren fMLP-Konzentrationen in etwa um den Faktor 5 unterhalb des Erwartungswertes von 22-27µm/min für vergleichbare neutrophile Granulozyten. [Foxman et al. 1999] 4. Ergebnisse 59

Jürschick, Johannes – Chemotaxis in µ-Slides mit 3-dimensionalen Gelmatrizes Die Entwicklung der FMI spricht für einen ansteigenden chemotaktischen Effekt mit Rückgang der Chemoattraktant Konzentration. (Tendenz in negative x-Richtung zu wandern nimmt zu) Die Geschwindigkeit und allgemeine Beweglichkeit der Zellen bei Zugabe von nur 5nM fMLP waren zu gering um verwertbare Daten zu produzieren. Für weiterführende Untersuchungen wurde deshalb eine fMLP-Konzentration von 10nM als Chemoattraktant gewählt. An dieser Stelle sei angemerkt, dass die in der Tabelle 4 gelisteten Werte chemotaktische Stimuli andeuten, aber weit hinter einer erwarteten Reaktion zurückbleiben. Es war im Rahmen des praktischen Zeitkontingents dieser Arbeit leider nur möglich ein einziges Chemotaxis Experiment an HL-60-Zellen durchzuführen, dessen Ergebnisse deutlich genug ausfallen, um daraus die andeutungsweise weiterführende Zusammenhänge abzuleiten. Es ist vor Abschluss der Versuchsreihen nicht gelungen, dessen Reproduzierbarkeit zu gewährleisten. Im Folgenden soll es unabhängig davon einer kurzen Analyse und einer Abschätzung der Zusammenhänge zum Diffusionsprofil im µ-Slide unterzogen werden. HL-60 Zellen wurden nach einem Differenzierungszeitraum von 5 Tagen in einer Collagen Matrix in Chemotaxis 3D µ-Slides eingebettet und etwa 30 Minuten nach Befüllen der Reservoire mit Chemoattraktant über einen Zeitraum von 3 Stunden beobachtet. Die Schrittweite der Zeitraffer Aufnahmen wurde auf 1 Minute festgelegt. Als Chemoattraktant wurde fMLP mit einer Konzentration von 10nM verwendet. Die ermittelten Parameter sind in Tabelle 5 aufgelistet. Chemoattraktant p-Value ǁ(x)-FMI ⊥(y)-FMI Directness Velocity [µm/min] Tracks 10nM fMLP 2.2542*10 -7 -0.189 0.040 0.2471 7.243 26 Tabelle 5: Chemotaxis Parameter des zum Vergleich mit den Diffusionsmessungen herangezogenen Experiments. Um festzustellen, ob sich die untersuchten Zellen innerhalb der Gelmatrix bewegen, muss die Morphologie während der Migration betrachtet werden. Die Form der Zellen ist im ruhenden Zustand meist rundlich und während der Bewegung langgezogen und spindelförmig. 4. Ergebnisse 60

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