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Untersuchungen der Bildungsprozesse und der Struktur des ...

Untersuchungen der Bildungsprozesse und der Struktur des ...

6 Lokalisierung von

6 Lokalisierung von Calciumionen im Mantelepithel von Haliotis tuberculata Abb. 6.1: Schematische Darstellung des Aufbaus einer Mantelepithelzelle von Biomphalaria glabrata (Süßwasserschnecke). Bl: Basallamina, Gl: Glykogen, G: Golgi, Li: Lipid, M: Mitochondrium, MV: Mikrovilli, N: Nukleus, rER: raues endoplasmatisches Retikulum, Ve: Vesikel, V: Vakuole. Adaptiert aus [33]. (Süßwassermuschel), die Mucopolysaccharide 1 sekretieren, durch. Der schematische Aufbau einer typischen Mantelepithelzelle von Gastropoden wurde von Bielefeld et al. [33] erstellt und ist in Abb. 6.1 abgebildet. Diese dargestellte Zelle weist zahlreiche Mikrovilli (MV) auf, die in Richtung des extrapallialen Raums gerichtet sind. Zudem befinden sich neben dem Nukleus (N), den Mitochondrien (M), dem Golgi - Apparat (G) und dem rauen endoplasmatischen Retikulum (rER) zahlreiche Vakuolen (V) und Vesikel (Ve) in der Zelle. Außerdem wurde von Bielefeld et al. [33] das Vorkommen von Lipidtropfen in Vakuolen und von Glykogen 2 in den Zellen beschrieben. 6.1.2 Gewebefixierung Um Gewebe unter einem Elektronenmikroskop zu untersuchen, bedarf es einer besonderen Präparation. Von besonderer Bedeutung ist eine gute Fixierung der Probe, um die ursprüngliche Struktur der Zellen möglichst unbeschädigt zu erhalten. Die ersten Artefakte treten jedoch bereits unmittelbar nach Entnahme des Gewebes aus dem Tier auf. Da die Versorgung der Zellen unterbrochen wird, kommt es rasch zu morphologischen Veränderungen der Zellen. Zunächst schwellen die Zellen an, die Proteine denaturieren und letztlich kommt es zur Autolyse 3 . Ein zügiges Arbeiten ist daher Voraussetzung für minimale Artefakte. 1Auch bekannt unter dem Begriff Glykosaminoglykane. Sie sind saure Polysaccharide, die linear aus sich wiederholenden Disacchariden aufgebaut sind. 2Glykogen ist ein verzweigtes Polysaccharid aus Glucose - Einheiten, das der kurzfristigen Speicherung von Glucose dient. 96 3 Selbstauflösung der Zellen durch Enzyme.

6.1 Einleitung Abb. 6.2: Schema der Reaktion von Formaldehyd mit den Aminogruppen benachbarter Polypeptidketten. Die gelben, ovalen Formen symbolisieren Proteine. Die Fixierung des Gewebes wirkt Schäden durch die Autolyse entgegen, indem das Gewebe stabilisiert wird. Wichtig ist, dass die Proben möglichst klein sind und somit ein Eindringen der Fixierlösung in alle Bereiche der Probe gewährleistet sein kann, bevor die Autolyse zu weit fortgeschritten ist. Zur Fixierung können zahlreiche unterschiedliche Chemikalien verwendet werden, deren Wahl von dem jeweiligen zu untersuchenden Gewebetyp abhängt. In diesem Abschnitt soll nur auf die in dieser Arbeit zur Fixierung verwendeten Chemikalien eingegangen werden. Die darüber hinaus gehenden Fixiermethoden können beispielsweise in den Fachbüchern [135], [136], [137] und [138] nachgeschlagen werden. Für die eher konventionelle Fixierung, die unter anderem in dieser Arbeit verwendet wurde und die lediglich eine Untersuchung der Morphologie, aber beispielsweise keinen Calciumnachweis erlaubt, wurden die Chemikalien Glutaraldehyd, Paraformaldehyd und Cacodylatpuffer verwendet (basierend auf dem Originalrezept von Karnovsky 4 ). Zudem wurde Meersalz zu der Fixierlösung gegeben. Dieser Zusatz erfolgte, um die Osmolarität der Fixierlösung auf etwa 1130 mosmol einzustellen. Dieser Wert entspricht ungefähr der Osmolarität von Meerwasser. Auf diese Weise sollte ein Quellen der Zellen verhindert werden. Der Cacodylatpuffer ist ein zur Präparation von elektronenmikroskopischen Proben gängiger Puffer und hat die Aufgabe, den pH Wert in einem physiologischen Bereich zu halten. Dies ist der Bereich, in dem Aldehyde in der Fixierlösung am besten funktionieren [135]. Die Chemikalien, die tatsächlich eine vernetzende Wirkung auf das Gewebe haben, sind Glutaraldehyd und Paraformaldehyd. Paraformaldehyd ist ein Polymer, das selbst keine fixierende Wirkung hat. Nötig ist eine Lösung des Paraformaldehyd Pulvers in Wasser und eine Erhitzung auf 60 ◦ C, um die Polymere in Formaldehyd Monomere (HCHO) zu teilen. Diese Monomere können an Proteine binden, wodurch freie Hydroxymethylgruppen (-CH2-OH) entstehen. Über diese Gruppen können Querverbindungen zu anderen funktionellen Gruppen der Proteine erzeugt werden. Die meisten dieser Vernetzungen bilden sich zwischen freien Aminogruppen in benachbarten Polypeptidketten unter Bildung von Methylbrücken (siehe Abb. 6.2) [138]. Die Zellproteine werden somit stabilisiert. Formaldehyd dringt zwar schnell in das Gewebe ein, die Vernetzungsreaktionen verlaufen aber sehr langsam. Eine ausreichende Fixierzeit ist daher notwendig. Je höher die Umgebungstemperatur ist, desto schneller verlaufen die Reaktionen. Auf der anderen Seite verläuft bei höheren Temperaturen auch die Autolyse schneller, so dass im Falle der in dieser Arbeit durchgeführten Fixierung mit einer Fixierzeit von 1 - 2 Stunden bei Raumtemperatur ein Mittelweg gewählt wurde. Glutaraldehyd (O=CH-CH2-CH2-CH2-CH=O) ist ein Dialdehyd, das in wässriger Lösung polymerisiert. Es entstehen vorrangig Dimere und Trimere. Das Auftreten unterschiedlich langer Moleküle ist wahrscheinlich mitverantwortlich für die gute Fixierung mit Glutaraldehyd. Zu lange Ketten können jedoch nicht mehr ins Gewebe eindringen. Die Glutaraldehydpolymere besitzen neben den funktiona- 4 Dieses Rezept wird in einigen Lehrbüchern behandelt, z.B. [135]. Die Originalveröffentlichung von Karnovsky wird als M. J. Karnovsky, A formaldehyde - glutaraldehyde fixative of high osmolality for use in electron microscopy, J. Cell Biol., 27: 137A-138A, 1965 zitiert, konnte jedoch nicht erhalten werden. 97

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