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Untersuchungen der Bildungsprozesse und der Struktur des ...

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6 Lokalisierung von

6 Lokalisierung von Calciumionen im Mantelepithel von Haliotis tuberculata Abb. 6.3: Schema der Reaktion von Osmiumtetroxid mit Doppelbindungen. Neben der Vernetzung wird auch eine Färbung über Osmiumdioxid erzeugt. len Aldehydgruppen an den Enden auch in der Mitte der Kette welche. Diese Gruppen vernetzen die Aminogruppen verschiedener Proteine miteinander. Nach der Hauptfixierung wird noch eine Nachfixierung durchgeführt. Bei diesem Schritt wird Osmiumtetroxid verwendet, das mit den Doppelbindungen von ungesättigten Lipiden und von Proteinen reagiert. Abb. 6.3 zeigt ein Schema dieser Reaktion. Neben der Vernetzung wird als Nebenprodukt OsO3 erzeugt, das instabil ist und in unlösliches, schwarzes Osmiumdioxid und Osmiumtetroxid umgewandelt wird (2OsO3 → OsO2 (s) + OsO4) [135]. Neben der Vernetzung kommt es daher auch zu einem Färben der Proben durch Osmiumdioxid. 6.1.3 Gewebefärbung Neben der Färbung mit OsO4 wird meist eine Färbung mit Uranylacetat (UO2(CH3COO)2· 2H2O) vorgenommen. Aufgrund der hohen Ordnungszahl (Z = 92) und der daraus resultierenden starken Elektronenstreuung ist Uran ein geeignetes Kontrastmittel. In erster Linie findet eine Bindung des Uranylacetats an die Phosphatgruppen der Nukleinsäuren statt [139]. Um die für TEM Untersuchungen angefertigten, ultradünnen Schnitte des Gewebes nachzukontrastieren, wird Bleicitrat verwendet. Die genaue chemische Wirkungsweise dieser Färbung ist jedoch noch unbekannt [138]. 6.1.4 Calciumausfällung in Gewebe mit der Antimonatmethode Die Antimonatmethode ist eine verbreitete Methode, um Calciumionen in Gewebe auszufällen und somit im TEM leicht als antimonreiche (Ordnungszahl Z = 51) Präzipitate sichtbar zu machen. Beschreibungen der Verwendung dieser Methode wurden sowohl in älteren Artikeln vor 2000 von Slocum et al. [140] (Hamster Nierenzellen), Hales et al. [141] (Rattenfettzellen), Chaubal et al. [142, 143] (Hirse), Northover [144] (weiße Blutkörperchen, Kaninchen), Bielefeld et al. [32] (Biomphalaria glabrata, Süßwasserschnecke), Kitamura et al. [145] (Kaninchenkarzinom), Cardasis et al. [146] (Seeigeleier), Deporter [147] (Zahnschmelz), Legato et al. [148] (Hundemyocardium) und Yeh et al. [149] (Katzenherzmuskel), als auch in neueren Artikeln nach 2000 von Ge et al. [150] (Tabak), Hong et al. [151] (Trespenblätter), An et al. [152] (Gerstenblätter) und Zhao [153] (Lilie) für verschiedene Organismen veröffentlicht. Oft enthält die Fixierlösung neben Glutaraldehyd, Phosphatpuffer und Kaliumantimonat auch Tanninsäure. Diese erfüllt den Zweck, das Eindringen des Antimonats in das Gewebe zu verbessern [32]. Eine Kritik an der Antimonatmethode wurde bereits 1972 von Klein et al. [154] veröffentlicht. Darin wurde bemängelt, dass nicht nur Ca 2+ - Ionen, sondern auch Mg 2+ - und Na + - Ionen über Kaliumantimonat ausgefällt werden. Die Mengen der Ionen, die vorhanden sein müssen um eine Präzipitatbildung zu bewirken, sind jedoch sehr unterschiedlich. So müssen mindestens 10 −6 M Ca 2+ , 10 −5 M Mg 2+ oder 98

6.2 Material und Methoden etwas unter 10 −2 M Na + vorhanden sein, um einen Niederschlag zu erzeugen. Andere Gruppen haben sich diesen Umstand zunutze gemacht und die Antimonatmethode verwendet, um Magnesium- und Natriumionen in Organismen nachzuweisen. Beispiele hierfür sind die Veröffentlichungen von Shiina et al. [155], Torack et al. [156], Spicer et al. [157] und Simson et al. [158]. Um eine Unterscheidung zwischen calcium-, magnesium- und natriumhaltigen Präzipitaten zu machen, ist es folglich unbedingt notwendig, eine Analyse der Ausfällungen durchzuführen. Diese Analyse kann eine spektroskopische Untersuchung mit beispielsweise Elektronenenergieverlustspektroskopie (EELS) oder energiedispersiver Röntgenspektroskopie (EDX) sein. EDX ist dabei die schlechtere Wahl um Calcium nachzuweisen, da die Antimon- und Calciumsignale sehr dicht beieinanderliegen. Die Sb Lα - und Lβ - Linien liegen bei 3,604 und 3,843 keV und die Ca Kα - und Kβ - Linien bei 3,693 und 4,014 keV. Und auch ein eindeutiges EELS Signal für Calcium ist bei kleinen Präzipitaten schwer zu erhalten, wie in Abschnitt 6.3.2 gezeigt werden wird. Eine oft verwendete Methode, um zu prüfen, ob die Antimonatpräzipitate Calcium enthalten, ist die Verwendung von Ethylenglycoltetraessigsäure EGTA oder Ethylendiamintetraessigsäure EDTA [140, 146, 148, 149, 150, 151, 152]. Da beide Substanzen Chelatoren sind, die Komplexe mit Kationen, die eine Ladungszahl von mindestens +2 aufweisen, eingehen, können sie genutzt werden, um Calcium- und Magnesiumatimonatpräzipitate aus dem Gewebe zu lösen. Ungelöste Präzipitate könne auf diese Weise als Natriumniederschlag identifiziert werden. Eine Unterscheidung von Calcium und Magnesium ist nach Wick et al. [159, 160] ebenfalls über die Verwendung von EDTA und EGTA möglich. Ihre Untersuchungen wurden an Proben durchgeführt, die entweder nur CaCl2 oder nur MgSO4 enthielten und darüber hinaus mit Kaliumantimonat und Kaliumphosphatpuffer behandelt und anschließend dehydriert und eingebettet wurden. Die Behandlungen mit 0,2 M EGTA oder 0,2 M EDTA für gleiche Zeiten zeigten, dass die Calciumantimonatpräzipitate eine höhere Löslichkeit als die Magnesium enthaltenden Niederschläge aufwiesen. Somit kann eine grobe Unterscheidung zwischen diesen beiden Präzipitaten vorgenommen werden. Neben der Antimonatmethode gibt es noch zwei weitere gebräuchliche Methoden zur Ausfällung von Calciumionen in Gewebe: die Natriumfluorid- [161] und die Ammoniumoxalatmethode [162, 163]. 6.2 Material und Methoden Die für diesen Teil verwendeten Tiere der Gattung Haliotis tuberculata wurden in einem Aquarium gehalten. Zur Präparation des Mantelepithels wurde jeweils ein Tier mit einer Länge von 1 - 3 cm in eine mit Seewasser gefüllte Petrischale gelegt, die auf Eis gestellt wurde. Nachdem die Schnecke reaktionsträge geworden war, wurde sie zügig mit einem Skalpell längs durchtrennt. Das Mantelepithel wurde unvermittelt mit einer Pinzettenschere in etwa 1 mm × 1 mm große Stücke zerteilt, die mit einer Pinzette aus dem Seewasser gehoben wurden und in Schnappdeckelgläschen in die jeweilige Fixierlösung gegeben wurden. Bei diesem Prozess muss beachtet werden, dass die Gewebestücke tatsächlich nur auf der Pinzette aufliegen, so dass keine Materialschädigung durch Quetschung entsteht. Die Präparation der verschiedenen Fixierlösungen und die weiteren Präparationsschritte sind im Folgenden erläutert. Sofern keine Umgebungstemperatur angegeben ist, fand die Präparation bei Raumtemperatur (d.h. ∼23 ◦ C) statt. 6.2.1 Konventionelle Gewebeeinbettung Die in diesem Abschnitt beschriebene Gewebepräparation wird an dieser Stelle als konventionell bezeichnet, da die präparierten Proben eine Betrachtung der Gewebestruktur im TEM erlauben, aber darüber hinausgehende Untersuchungen, wie z.B. die Lokalisation von Calcium, nicht möglich sind. Bei der konventionellen Präparation wurden die Stücke des Mantelepithels zunächst für eine Stunde 99

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