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Untersuchungen der Bildungsprozesse und der Struktur des ...

Untersuchungen der Bildungsprozesse und der Struktur des ...

6 Lokalisierung von

6 Lokalisierung von Calciumionen im Mantelepithel von Haliotis tuberculata in eine Fixierlösung gegeben. Diese bestand aus den folgenden Komponenten: • 2,25 ml entionisiertes Wasser • 1,5 ml Glutaraldehyd 25% → 2,5% • 3,75 ml Paraformaldehyd 8% → 2% • 7,5 ml Natriumcacodylatpuffer 0,2 M → 0,1 M • 262 mg Meersalz • pH 7,7 mit 0,1 M NaOH einstellen Der Natriumcacodylatpuffer setzte sich aus 25 ml 0,2 M Cacodylsäure Natriumsalz Trihydrat und 1,8 ml 0,2 N HCl zusammen. Nach der Fixierung wurden die Probenstücke 3 - 4 mal für jeweils 5 - 10 min in 0,1 M Natriumcacodylatpuffer gewaschen. Dabei wurden mit Pipetten die Lösungen in den Schnappdeckelgläschen gewechselt. Die Proben selbst wurden nicht berührt, um Schädigungen zu vermeiden. Nach dem Waschvorgang erfolgte für 1 - 2 Stunden eine Nachfixierung mit: • Osmiumtetroxid 4% → 2% • Kaliumhexacyanoferrat(III) (K3[Fe(CN)6]) 1,6% → 0,8% • beide Lösungen 1:1 gemischt Nach diesem Schritt wurden die Proben über eine ansteigende Alkoholreihe entwässert. Dazu wurden nacheinander 30%, 50%, 70% und 90% Ethanol für jeweils 2 - 3 min auf die Proben gegeben. Zur Kontrastierung erfolgte für mindestens 30 min bei 37 ◦ C eine Behandlung mit 2%iger Uranylacetatlösung (in Ethanol). Zur vollständigen Entwässerung wurde anschließend 2 - 3 mal 100% Ethanol für jeweils 30 min auf die Gewebestücke gegeben. Darauf folgte 2 mal für 5 - 10 min die Behandlung mit Propylenoxid. Dies hatte eine vollständige Entfernung des Ethanols zur Folge. Zudem besitzt Propylenoxid eine sehr geringe Viskosität und kann somit gut in die Proben eindringen. Abschließend wurde das Propylenoxid langsam durch Einbettharz ersetzt. Die Verwendung des Propylenoxids bewirkt an dieser Stelle ein gutes Eindringen des Einbettmediums in die Proben. • 2:1 Propylenoxid : Einbettharz (15 min) • 1:1 Propylenoxid : Einbettharz (30 min) • 1:2 Propylenoxid : Einbettharz (30 min bei 37 ◦ C) • pures Einbettharz (über Nacht) Am folgenden Morgen wurden die Proben mit einem abgeflachten Zahnstocher aus den Schnappdeckelgläschen gehoben und in Ausbettformen in frisches Einbettharz gelegt. Die Aushärtung des Harzes fand bei 60 ◦ C statt. Das verwendete Einbettharz setzte sich wie folgt zusammen: 100 • Stammlösung I – 155 g Epon 812

– 250 g Dodencenylbernsteinsäureanhydrid DDSA • Stammlösung II – 200 g Epon 812 – 178 g Methylnadicanhydrid MNA 6.2 Material und Methoden Zur Erzeugung einer Gebrauchslösung wurden 6 Teile der Stammlösung I und 4 Teile der Stammlösung II für etwa 30 min gut gemischt. Anschließend wurden 1,5% Tris(dimethyl - aminomethyl)phenol als Beschleuniger hinzugegeben. Nach einem erneuten guten Mischen wurde das Einbettharz im Kühlschrank gelagert und innerhalb von 24 Stunden verbraucht. 6.2.2 Gewebeeinbettung unter Verwendung von Kaliumantimonat Um eine Ausfällung des Calciums im Gewebe zu erreichen, wurde eine Präparation unter Verwendung von Kaliumantimonat KSb(OH)6 durchgeführt. Die Fixierlösung setzte sich in diesem Fall folgendermaßen zusammen: • 11,5 ml Phosphatpuffer 0,2 M + Kaliumantimonat 2% → 0,153 M; 1,53% • 3 ml Glutaraldehyd 25% → 5% • 0,5 ml Tanninsäure 3% → 0,1% Die Stücke des Mantelepithels wurden für eine Stunde in diese Lösung gegeben. Der 0,2 M Phosphatpuffer wurde aus 60 ml entionisiertem Wasser, 0,327 g KH2PO4 und 1,643 g K2HPO4 angesetzt. Um das prinzipiell schwer lösliche Kaliumantimonat in Phosphatpuffer zu lösen, wurden 0,8 g Kaliumantimonat, 40 ml Phosphatpuffer und ein Magnetrührstäbchen in einen Glasmesskolben gegeben, der mit einem Glasstopfen verschlossen wurde. Der Messkolben wurde in ein Wasserbad gestellt und unter Rühren mittels eines Magnetrührers über Nacht auf 80 ◦ C erhitzt. Am folgenden Morgen wurde die Lösung auf Eis gekühlt und mit einem 0,2 µm Filter filtriert. Der pH Wert wurde auf 7,7 eingestellt. Die Gewebestücke wurden nach dem Fixieren 2 - 3 mal für jeweils 5 - 10 min gewaschen. Als Waschlösung wurde verwendet: • 15 ml Phosphatpuffer 0,2 M + Kaliumantimonat 2% → 0,1 M; 1% • 15 ml entionisiertes Wasser Die Nachfixierung erfolgte für 1 Stunde mit: • 4 ml Phosphatpuffer 0,2 M + Kaliumantimonat 2% → 0,1 M; 1% • 2 ml entionisiertes Wasser • 2 ml Osmiumtetroxid 4% → 1% Zum anschließenden Waschen wurde 2 mal für 5 - 10 min 0,05 M Phosphatpuffer verwendet. Die Entwässerung über eine ansteigende Alkoholreihe und die weitere Behandlung erfolgte wie in dem vorhergehenden Abschnitt 6.2.1 beschrieben. 101

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