Aufrufe
vor 4 Jahren

Untersuchungen der Bildungsprozesse und der Struktur des ...

Untersuchungen der Bildungsprozesse und der Struktur des ...

6 Lokalisierung von

6 Lokalisierung von Calciumionen im Mantelepithel von Haliotis tuberculata Abb. 6.7: STEM Aufnahmen des gleichen Probenbereichs im Mantelepithel von Haliotis tuberculata. (a) Vor der Behandlung mit 100 mM EDTA. (b) Nach der Behandlung mit 100 mM EDTA. Der gelbe bzw. weiße Pfeil markiert jeweils die gleiche Stelle, an der sich in (a) einige Antimonatpräzipitate befinden, die durch die EDTA - Behandlung (b) aufgelöst wurden. 6.3.4 Referenzproben Eine Fragestellung, die unbedingt beachtet werden muss, ist die, ob sich das Calcium tatsächlich ursprünglich in den Epithelzellen befand oder ob es eventuell durch die Präparation in die Zelle gelangt sein könnte. Um dies zu prüfen wurden Referenzproben aus Gelatine untersucht, die, wie in Abschnitt 6.2.3 beschrieben, präpariert wurden und denen keinerlei Calcium-, Magnesium- oder Natriumionen extra zugesetzt wurden. Bei Abwesenheit dieser Ionen ist zu erwarten, dass sich keine antimonhaltigen Präzipitate bilden. In der STEM Aufnahme einer Gelatineprobe in Abb. 6.8 sind jedoch einige bis zu 500 nm große Präzipitate zu erkennen. Dies bedeutet, dass die Probe nicht frei von Ionen ist, die mit dem Kaliumantimonat reagieren und 106 Abb. 6.8: STEM Aufnahme von mit Kaliumantimonat behandelter Gelatine. Obwohl die Gelatine weder Calcium, Magnesium noch Natrium enthalten sollte, sind Präzipitate zu erkennen. Die löchrige, den gesamten Bildausschnitt überziehende Struktur stammt vom Kohlenstofffilm des TEM - Netzchens.

6.4 Diskussion Präzipitate bilden. Die Quelle dieser Ionen liegt in den verwendeten Chemikalien und Lösungen. Da für die Präparation die gleichen Chemikalien verwendet wurden wie für die Präparation des Mantelepithels, ist es sehr wahrscheinlich, dass auch die im Mantelepithel beobachteten Präzipitate zu einem großen Teil nur Artefakte der Präparation sind und nicht durch in den Zellen vorkommendes Calcium erzeugt wurden. 6.4 Diskussion Die Untersuchung der Referenzproben zeigte deutlich, dass die Kaliumantimonatmethode nicht geeignet ist, um die Calciumverteilung in den Zellen zu bestimmen. Ebenso ungeeignet sind andere Ausfällungsmethoden wie die Ammoniumoxalat- und die Natriumfluoridmethode, da auch in diesen Fällen Lösungen und Chemikalien verwendet werden, die Verunreinigungen durch Calcium aufweisen können. Bereits in bidestilliertem Wasser können Calciumkonzentrationen von 1 µM vorliegen. Durch die Verwendung von Salzen und Puffern kann dieser Wert dann noch weiter ansteigen. Das in den Versuchen verwendete KH2PO4 trug zwar die Bezeichnung ” purum p.A.“ (pro analysis), wies aber lediglich eine Reinheit von > 99,0% auf. Der Calciumanteil in diesem Salz betrug < 0,005%. Dies entspricht in dem verwendeten Phosphatpuffer einer Calciumkonzentration von 6,8 µM (Berechnung siehe Anhang A.12). Da Calciumionen in Zellen jedoch meist nur in sehr geringen Konzentrationen im Bereich von 100 nM vorkommt, handelt es sich bei dem Hauptteil des in den Zellen vorkommenden Calciums tatsächlich um artifizielles Calcium, das durch die Präparation in die Zellen gelangt ist. Allerdings bezieht sich der genannte Wert auf Zellen, die nicht wie das Mantelepithel von Haliotis tuberculata eine wichtige Rolle im Schalenwachstum spielen. Es ist daher durchaus wahrscheinlich, dass in den untersuchten Epithelzellen ein weitaus höherer Calciumanteil vorliegt. Dennoch bleibt die Calciumkonzentration in den verwendeten Lösungen im Vergleich sehr hoch und liegt in einem Bereich, der eine Untersuchung der Proben hinsichtlich der Calciumverteilung unmöglich macht. Eine weitere Quelle artifiziellen, intrazellulären Calciums ist zudem der Extrazellularraum, aus dem nach dem Tod des Tieres Calcium in die Zellen und die Pufferlösungen diffundieren kann. Es gibt im Wesentlichen zwei Ansätze, die die Calciumdetektion in Zellen erlauben, ohne Artefakte zu erzeugen. • Calciumsensitive Fluoreszenzfarbstoffe können verwendet werden, um freies Calcium zu messen [166]. Da es bei dem Mantelepithelgewebe von Meeresschnecken nicht umsetzbar ist, dieses im lebenden Zustand mit einem Fluoreszenzfarbstoff zu markieren und zu untersuchen, muss ein Teil des Gewebes entfernt werden. Eine Fixierung des Gewebes, um den Zersetzungsprozess zu stoppen, ist nicht möglich, da auf diese Weise wieder Calciumverschmutzungen in die Probe gelangen könnten. Aus dem gleichen Grund kann auch keine Einbettung vorgenommen werden. Eine Möglichkeit, das Gewebe vor der Zersetzung zu schützen und es zudem für fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen präparieren zu können, besteht darin, die Proben schockzugefrieren und mit einem Kryoultramikrotom Dünnschnitte der Probe zu erzeugen. Diese Dünnschnitte können anschließend mit einem Fluoreszenzfarbstoff, der Calciumionen anfärbt, behandelt werden. Der Nachteil dieser Methode ist, dass die Auflösung nur im Bereich der Lichtwellenlänge liegt und daher nur Gebiete in den Zellen mit unterschiedlichen Calciumkonzentrationen unterschieden werden können, eine genauere Bestimmung der Position des Calciums in bestimmten Organellen jedoch schwieriger wird. Der Vorteil ist, das die Calciumverteilung über einen relativ großen Bereich betrachtet werden kann. • Untersuchungen im TEM können eine weitaus bessere Auflösung bieten. Für derartige Untersuchungen können die Gewebestücke ebenfalls schockgefroren und mit einem Kryoultramikrotom 107

Kapitel 3 Untersuchungen zur Struktur
Untersuchung lichtinduzierter Strukturen in PMMA mit ...
Untersuchung über die Zusammenhänge zwischen Struktur und ...
Untersuchung zur Struktur-Eigenschafts- Beziehung von Gips - DGZfP
Untersuchungen zur Struktur und zum Katalysemechanismus der ...
Untersuchungen zur Struktur und Funktion des Multienzyms ...
Untersuchungen zur Struktur und Substratspezifität des AAA+ ...
Theoretische Untersuchungen zur elektronischen Struktur ... - Cobalt
Untersuchung der Struktur des Nukleons mit reellen Photonen ...
Untersuchungen zur Struktur und Stabilität neuer, durch Genome ...
Theoretische Untersuchungen zur elektronischen Struktur ... - Cobalt
Untersuchung von reziproken Strukturen valenter Substantive in der
Parameterfreie Untersuchung der elektronischen Struktur - Friedrich ...
Experimente mit reellen Photonen Untersuchung der Struktur des ...
Frühförderung Untersuchung der Strukturen in europäischen ...
Untersuchungen über die histologische Struktur ... - The Human Brain
Untersuchung neuartiger Mikrofluidik-Strukturen - Fakultät für Physik ...
Untersuchung der Struktur von Quark- und Gluonjets in Z-Zerf allen
Untersuchungen zu Struktur-Funktionsbeziehungen in der trna ...
Elektronenmikroskopische Untersuchungen des Polymer/Mineral ...
Elektrochemische in-situ SHG-Untersuchungen zur Struktur ...
Theoretische und praktische Untersuchungen zur Akustik von ...
Untersuchung von Einzelausscheidungen in Aluminiumlegierungen ...
Untersuchungen zum Dotieren mit Molekülen an ZnO-Schichten ...
Untersuchung organischer Adsorbate auf ... - Markus Lackinger
Oberfl¨achenanalytische Untersuchungen zu Metall-Tr¨ager ...