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Untersuchungen der Bildungsprozesse und der Struktur des ...

Untersuchungen der Bildungsprozesse und der Struktur des ...

A Anhang A.6 Bradford

A Anhang A.6 Bradford Assay Der Bradford Assay ist eine von M. M. Bradford entwickelte Methode zur Bestimmung des Proteingehalts in Lösungen [119]. Bei dieser Methode wird ausgenutzt, dass der Farbstoff Coomassie Blau G - 250 an Proteine bindet und eine Verschiebung des Absorptionsmaximums von 465 nm zu 595 nm verursacht. Zur Bestimmung der Proteinkonzentration in einer Lösung, in unserem Fall der Konzentration der Proteine der löslichen Matrix in deionisiertem Wasser, ist es notwendig, zunächst Kalibriermessungen mit Lösungen bekannter Proteinkonzentration vorzunehmen. Wir verwendeten Lysozym, das in Konzentrationen zwischen 0 µg/ml und 15 µg/ml in deionisiertem Wasser angesetzt wurde. Die Lysozymlösungen wurde mit jeweils 200 µl Bradford Assay gemischt und in Küvetten gegeben. Die Messung der Absorption muss in einem Zeitraum von mindestens 5 Minuten bis höchstens einer Stunde nach Mischung der beiden Komponenten durchgeführt werden. Die untere Grenze der Zeitangabe Absorption bei 595nm 1.3 1.2 1.1 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0 5 10 15 Proteinkonzentration [µg/ml] Abb. A6: Kalibrierkurve zur Bestimmung der Proteinkonzentration mittels Bradford Assay. Die Messpunkte wurden durch Messung der Absorption bei verschiedenen Lysozymkonzentrationen erhalten. kommt dadurch zustande, dass die vollständige Reaktion zwischen Farbstoff und Protein gewährleistet sein muss. Da die Protein - Farbstoff - Komplexe mit der Zeit aggregieren und sich somit die Farbe der Lösung ändert, ergibt sich eine obere Grenze für die Zeit. Die Messung der Absorption fand in einem Photometer bei 595 nm statt. Die Werte einer typischen Kalibriermessung sind in Abb. A6 dargestellt, wobei jeder Datenpunkt den Mittelwert zweier Messungen repräsentiert. Die Proteinkonzentration der löslichen Matrix wurde folgendermaßen bestimmt. Die Lösung der löslichem Matrix wurde unterschiedlich stark mit deionisiertem Wasser verdünnt und mit 200 µl Bradford Assay vermischt. Nach einer entsprechenden Wartezeit wurden die Absorptionswerte der Lösungen in dem Photometer gemessen. Mit Hilfe der Eichkurve konnten diesen Werten Proteinkonzentrationen zugeordnet werden. Auch für diese Proben wurden jeweils zwei Messungen vorge- 132

A.7 Präparation der SDS - PAGEs nommen und die Werte gemittelt. Zudem wurden die Proteinkonzentrationen, die sich für verdünnte Lösungen der löslichen Matrix ergaben, in Konzentrationen für unverdünnte Lösungen umgerechnet und gemittelt. A.7 Präparation der SDS - PAGEs Zur Bestimmung der Größen der in der löslichen und unlöslichen Matrix von Haliotis laevigata vorkommenden Proteine wurden SDS - PAGEs (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) erzeugt. Verwendet wurden dafür NuPAGE 12% Bis - Tris - Gele. Im Wesentlichen werden in der Gel Elektrophorese zwei Puffer verwendet: der Probenpuffer, in den die zu untersuchenden Proteine gegeben werden, und der Laufpuffer, der in die Laufkammer gefüllt wird. Der Probenpuffer beinhaltet Mittel, die zu einer negativen Ladung der Proteine führen und die zu einer Lösung der Disulfidbrücken führen. Probenpuffer: - 180 µl Laemmli Puffer (negative Ladung) - 18 µl Mercaptoethanol (Denaturierung) Laemmli Puffer (2fach konzentriert, 50 ml): - 130 mM Tris, pH 6,8 - 6,6% SDS (durch Erhitzen in entionisiertem Wasser lösen) - 20% Glycerol - 0,01% (w/v) Bromphenolblau Von diesem Probenpuffer werden 10 µl auf 15 µl Probenlösung gegeben. Zur weiteren Denaturierung der Proteine wird dieses Gemisch für etwa 3 min in ein 95 ◦ C warmes Wasserbad gegeben. Laufpuffer: - 1 ml Antioxidant - 379 ml entionisiertes Wasser - 20 ml NuPAGE Laufpuffer Vom Protein Marker wurden 5 µl und von den Proben jeweils 15 - 18 µl verwendet. Die Elektrophorese wurde bei einer Spannung von 120 V und einer Laufzeit von 1 - 2 Stunden durchgeführt. Nach dieser Laufzeit wurden die Gele 2 mal für 5 min in entionisiertem Wasser gewaschen und anschließend mit einer Coomassie Färbelösung für 10 min gefärbt. Coomassie Färbelösung: - 2,5 g Coomassie Blau G250 - 450 ml Methanol - 90 ml Essigsäure - 460 ml entionisiertes Wasser 133

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