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Untersuchungen der Bildungsprozesse und der Struktur des ...

Untersuchungen der Bildungsprozesse und der Struktur des ...

5 Zentrale

5 Zentrale Struktur in Aragonitplättchen • 5mal 15 min waschen mit TBS - T • Blocken mit 3 - 5% BSA und 1% Gelatine in TBS - T für 2 h • Erster Antikörper 1:500 verdünnt in TBS - T mit 3 - 5% BSA über Nacht bei 4 ◦ C • 5mal 15 min waschen mit TBS - T mit 3 - 5% BSA • Zweiter Antikörper 1:40 verdünnt in TBS - T mit 3 - 5% BSA bei RT für 2 h • 5mal 15 min waschen mit TBS - T • 3mal 15 min waschen mit doppelt destilliertem Wasser Die so behandelten Schalenstücke wurden anschließen bei 37 ◦ C getrocknet und mit Kohlenstoff bedampft. TBS - T steht für Tris buffered saline (Tris - gepufferte Salzlösung), das 1% Tween 20 enthält und auf einen pH Wert von 8 eingestellt wurde. Der Puffer TBS setzt sich aus 50 mM Tris und 150 mM NaCl zusammen. Zum Blocken wurden Gelatine und Rinderserumalbumin (bovine serum albumin, BSA) verwendet. Bei diesem Vorgang werden die freien Bildungsstellen der organischen Bestandteile der Schale mit Gelatine und BSA blockiert. Auf diese Weise wird vermieden, dass die Antikörper an diese Bindungstellen binden und somit ein spezifischer Nachweis von Antigenen verhindert wird. Ähnlich wie Gelatine und BSA hat auch Tween 20 eine blockierende Wirkung auf freie Bindungsstellen. Bei dem ersten Antikörper handelt es sich um einen im Kaninchen erzeugten Perlucinantikörper (Probennummer 1232). Der zweite Antikörper ist ein mit kolloidalem Gold (10 nm) konjugierter Ziege - anti - Kaninchen - Antikörper. 5.2.3.2 Lift - out einzelner Aragonitplättchen aus einem ” Plättchenpuder“ Wie in Abschnitt 5.2.1 beschrieben, wurden die Schalen von Haliotis laevigata von der Calcitschicht befreit und zerkleinert. Ebenfalls wurden die Perlmuttstücke in ein Eppendorf - Reaktionsgefäß 6% Natriumhypochlorid gegeben, für 1,5 min auf einem Reagenzglasschüttler gemischt und für 1 min zentrifugiert. Die Waschschritte zur Entfernung des NaOCl erfolgten wie in Abschnitt 5.2.1 beschrieben. Die Plättchenlösung wurde dann auf Aluminiumfolie gegeben, bei 37 ◦ C getrocknet und mit Gold besputtert, um Aufladungen der Probe im SEM zu vermeiden. Mittels Manipulatornadel wurden in der FIB einzelne Aragonitplättchen (in einigen Fällen auch zwei noch lateral miteinander verbundene Plättchen) aus dieser Plättchenansammlung herausgehoben und an einem TEM - Halter befestigt. Auf der Oberkante wurde Platin deponiert, um im Falle zweier Plättchen eine verbesserte Stabilität zu erreichen und ein Ablösen des äußeren, nicht direkt am TEM - Halter befestigten Plättchens im TEM zu vermeiden. Die Dünnung der Plättchen erfolgte mit Galliumionen. Die Durchstrahlungsrichtung im TEM verlief etwa entlang der c - Richtung der Aragonitplättchen. 5.2.4 Untersuchungen mittels TEM Zur elektronenmikroskopischen Untersuchung der Aragonitplättchen wurde das TEM TITAN 80/300 im transmissionselektronenmikroskopischen (TEM) und im rastertransmissionselektronenmikroskopischen (STEM) Modus verwendet. Die Einstellungen des Mikroskops sowie die Aufnahmemedien entsprechen den in Abschnitt 4.2.6 beschriebenen. 80

5.3 Ergebnisse 5.3 Ergebnisse Bereits in SEM Aufnahmen der Schale von Gastropoden sind die Strukturen im Zentrum der Aragonitplättchen deutlich zu erkennen, die von Checa et al. [38], Schäffer et al. [37] und Manne et al. [130] über aufwendigere Methoden wie AFM und SEM an speziell präparierten Proben nachgewiesenen wurden. Abb. 5.3 (a) zeigt eine SEM Aufnahme einer ebenen, mit Kohlenstoff bedampften Bruchfläche des Perlmutts von Haliotis tuberculata. Die Pfeile markieren zwei der zuvor erwähnten zentralen Strukturen. Es hat den Anschein, dass die Dichte des Materials in diesen Bereichen geringer ist. Die Betrachtung der Abb. 5.3 (b) und (c) verdeutlicht diese Beobachtung. Diese Abbildungen zeigen SEM Aufnahmen einer ebenen Perlmuttbruchfläche, die, wie in Abschnitt 5.2.3.1 beschrieben, vorbehandelt wurde. Durch die Verwendung verschiedener Waschlösungen während dieser Behandlung wurde die Oberfläche des Perlmutts leicht angelöst. Dies geht nicht nur aus den wesentlich deutlicher erkennbaren zentralen Strukturen hervor (Abb. 5.3 (c), Pfeil), sondern auch aus den nun ausgeprägteren intertabularen Zwischenräumen. Diese bevorzugte Lösung des Materials in dem zentralen Bereich kann durchaus dafür sprechen, dass an dem Ort kristallines Material einer geringeren Dichte (beispielsweise durch organische Einschlüsse) oder organisches bzw. inorganisches, amorphes Material vorliegt. Dieses bevorzugte Auflösen wird im Folgenden noch näher behandelt werden. Abb. 5.3: SEM Abbildungen einer ebenen Bruchfläche des Perlmutts von Haliotis tuberculata. (a) Vergrößerte Abbildung der ebenen Bruchfläche einer mit Kohlenstoff bedampften, darüber hinaus unbehandelten Probe. Die Pfeile markieren zentrale Strukturen in den Aragonitplättchen. (b) Übersichtsaufnahme einer, wie in Abschnitt 5.2.3.1 beschrieben, vorbehandelten Probe. (c) Vergrößerte Abbildung der ebenen Bruchfläche der in (b) gezeigten Probe. Der Pfeil markiert eine zentrale Struktur in einem der Aragonitplättchen. 5.3.1 TEM Untersuchung einzelner Aragonitplättchen ohne und mit Essigsäurebehandlung Um zunächst zu untersuchen, ob die Aragonitplättchen einen organischen Kern oder zumindest einen Kern reich an organischem Material beinhalten, so wie es von Nakahara [60] und Checa et al. [38] angenommen wurde, wurden einzelne Aragonitplättchen, wie in Abschnitt 5.2.1 beschrieben, präpariert und im TEM entlang der Plättchennormalen durchstrahlt. Typische Aufnahmen dieser Plättchen sind in Abb. 5.4 dargestellt. Die Bildteile (a) und (e) zeigen TEM Aufnahmen zweier Aragonitplättchen. Auf den Bildteilen (b) und (f) sind die dazu gehörigen Hellfeldaufnahmen, in (c) und (g) die Dunkelfeldaufnahmen und in (d) und (h) die STEM Aufnahmen dargestellt. Die Struktur der beiden Plättchen unterscheidet sich deutlich. Das erste Plättchen ((a) - (d)) weist eine klare zentrale Struktur auf (Pfeil). Nähere Betrachtungen zeigen, dass sich dieses Plättchen aus unterschiedlich orientierten Untereinheiten zusammensetzt. Die zentrale Struktur befindet sich dort, wo diese Untereinheiten zusammentreffen. Das zweite Aragonitplättchen ((e) - (h)) hingegen ist vollständig einkristallin, was durch Elek- 81

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