Aminosäureanalyse und N-terminale ... - funnycreature.de

Biochemisches
Biochemisches
Grun Grundpraktikum
Grun praktikum
Versuch Versuch Nummer Nummer GG-04
G 04 04: 04
Aminosäureanalyse Aminosäureanalyse und und NN
N N
terminale terminale Endgruppenbestimmung
Endgruppenbestimmung

Versuch Nummer G-04 04 BC-Grundpraktikum
Gliederung:
I. N-terminale Endgruppenbestimmung von Insulin .......................................... 2
a) Theoretische Grundlagen............................................................................................ 2
b) Versuchsziele, Aufgaben............................................................................................. 3
c) Versuchsdurchführung ................................................................................................ 3
d) Meßergebnisse ........................................................................................................... 3
e) Auswertung und Diskussion ........................................................................................ 4
II. Aminosäuretrennung ......................................................................................... 5
a) Theoretische Grundlagen............................................................................................ 5
b) Versuchsziele, Aufgaben............................................................................................. 6
c) Versuchsdurchführung ................................................................................................ 6
d) Meßergebnisse und Beobachtungen........................................................................... 6
e) Auswertung und Diskussion ........................................................................................ 6
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Versuch Nummer G-04 04 BC-Grundpraktikum
I. N-terminale Endgruppenbestimmung von Insulin
a) Theoretische Grundlagen
Insulin ist physiologisch von großer Wichtigkeit; als Hormon der Bauchspeicheldrüse
ist es für die Regulation des Blutzuckerspiegels verantwortlich. Ein Insulinmangel
bewirkt die Zuckerkrankheit. Eine großtechnische Produktion ist sehr wichtig, und
da Rinder- und Schweineinsulin Nebenwirkungen zeigen, hat gentechnologisch
hergestelltes menschliches Insulin eine enorme Bedeutung erlangt (siehe unten).
Bei Insulin handelt es sich um ein Polypeptid, das aus zwei Ketten aufgebaut ist
(siehe Abb. I-1). Die A-Kette besteht aus 21 AS, die B-Kette aus 30. Die beiden Ketten
sind durch zwei interchenare Disulfidbrücken zwischen den Cysteinen CA7 und CB7
sowie CA20 und CB19 verbunden. Die A-Kette wird zusätzlich durch eine intrachenare
Disulfidbrücke (CA6 und CA11) stabilisiert.
Innerhalb einer Zelle liegt ein stark
reduzierendes Milieu vor, das die
Ausbildung von Disulfidbrücken (die ja eine
oxidative Verknüpfung zweier
Thiolfunktionen sind) verhindert.
Interessant ist daher die Biosynthese des
Insulins:
Sie erfolgt in den !-Zellen des Pankreas über
eine einkettige, 84 AS lange Vorstufe, das sog.
Proinsulin. Sie ist physiologisch inaktiv und
enthält ein 33 AS langes Verbindungspeptid (C-Kette); es verknüpft den Carboxy-
Terminus der A-Kette mit dem Amino-Terminus der B-Kette. In diesem Zustand
erfolgt die Faltung des Proteins unter Ausbildung der Disulfidbrücken. Durch
proteolytische Spaltung (die häufigste Art der posttranslationalen Modifikation) wird
anschließend das interne C-Peptid entfernt.
Proinsulin ist allerdings nicht die erste Stufe des Hormons: Insulin wird wie viele
andere zur Sekretion bestimmte Proteine (oder Transmembranproteine) mit einem Nterminalen
Signalpeptid aus 19 (vorwiegend hydrophoben) AS im Cytoplasma
synthetisiert (Präproinsulin). Die Sequenz dient dazu, die Kette zum rauhen ER zu
dirigieren. Diese Sequenz wird von einem Signal-Erkennungspartikel (SRP) erkannt,
das das synthetisierende Ribosom an einen Rezeptor auf der Membran des rER
bindet. Anschließen führt es das Signal-Peptid durch die Membran hindurch und
spaltet die Signalsequenz mit einer spezifischen Peptidase ab. Dadurch wird das
Präproinsulin in Proinsulin umgewandelt. Proinsulin wird über den Golgi-Apparat
in sekretorische Granula transportiert, wo das C-Peptid proteolytisch abgespalten
wird. Durch Exocytose der reifen Speichergranula werden die Insulinmoleküle
schließlich sezerniert.
In der gentechnologischen Produktion werden die beiden Genabschnitte in
verschiedene Plasmide eingebaut, getrennt exprimiert und dann zusammengefügt.
N
SO 2 Cl
Dansylchlorid
N
N SO 2 Cl
Dabsylchlorid
- 2 -
Abb. I-1: AS-Sequenz von Insulin
Abb. I-2: Markierungsreagenzien Abb. I-3: Fluordinitrobenzol
NO 2
F
NO 2

Versuch Nummer G-04 04 BC-Grundpraktikum
Die Existenz von zwei Ketten kann z.B. durch die Analyse der N-terminalen
Aminosäuren nachgewiesen werden. Bei einer solchen Analyse wird spezifisch das
Aminoende des Polypeptids markiert, so daß eine spätere Auswertung möglich ist. In
Abb. I-2 sind zwei wichtige Markierungsreagenzien aufgeführt. Dansyl- und
Dabsylchlorid, haben das historische Fluordinitrobenzol (Abb. I-3) ersetzt. Im
versuch wird das Insulin mit Dansylchlorid markiert, was nach folgendem
Mechanismus geschieht:
N
SO 2 Cl
Nach dem Markierungsvorgang wird das Dansyl-Peptid einer Totalhydrolyse
unterworfen. Die Lösung wird mit einem hohen Überschuß an 6 M HCl bei 160° C für
40 min erhitzt. Dabei spalten sich die Peptidbindungen, so daß die einzelnen
Aminosäuren frei in Lösung gehen. Allerdings wird Tryptophan dabei zerstört und
Asparagin und Glutamin gehen in ihre Amine über (N→D, Q→E). Die Auswertung
erfolgt oft über die Dünnschichtchromatographie: Das Hydrolysat wird neben
Referenz-Dansyl-AS auf die Platte aufgetragen und in einem Laufmittel entwickelt.
Anhand der Referenzsubstanzen läßt sich eine Zuordnung der N-terminalen AS
treffen. Bei Dabsyl-AS muß mit UV-Licht (370 nm) gearbeitet werden, da hier eine
Fluoreszenz sichtbar ist.
b) Versuchsziele, Aufgaben
Im ersten Versuch soll, wie schon erwähnt, die Endgruppen der N-Termini bestimmt
werden. Dies geschieht nach der oben genannten Methode.
c) Versuchsdurchführung
Der Versuch wurde bis auf wenige Abwandlungen wie im Skript beschrieben
durchgeführt. Zu diesen gehören folgende Arbeitsschritte:
1. Außer des Glycin-Standards wurden noch Dansyl-Standards von Pro, Phe, Ala
und "-Lys sowie von Dansylsäure und Dansylamin verwendet.
2. Die Hydrolysierung von Insulin dauerte nur 40 min bei 160° C
d) Meßergebnisse
+
H 2 N-R
Die Abbildung auf der nächsten Seite ist eine (bearbeitete) Kopie der Dünnschicht-
Platte.
- 3 -
HCl
N
SO 2
N R
H

Versuch Nummer G-04 04 BC-Grundpraktikum
Unsere Markierung ist A.
e) Auswertung und Diskussion
Für die Auswertung sind folgende Punkte von Bedeutung:
i) Art der AS
ii) welche zusätzlichen Substanzen sind sichtbar
iii) Rf-Werte der einzelnen Spots
Auf die Art der AS kann man aufgrund der Referenzsubstanzen schließen (siehe a),
Seite 2). Bei unserer Auftrennung sind vier Spots zu erkennen. Die zwei, die bei der
Anfangslinie liegen, sind zum einen "-Dansyl-Lysin ("-DNS-Lys), zum anderen
Dansylsäure (DNS-OH). Dies sind Produkte von Nebenreaktionen (siehe Abb. I-4,
Seite 5); das Dansylamin (DNS-NH2) beispielsweise entsteht sehr leicht durch
Reaktion mit Ammoniak aus der Luft. Während Glycin deutlich zu erkennen ist,
kann bei dem nächsten Spot keine genaue Aussage getroffen werden. Es könnte sich
sowohl um Phenylalanin als auch um Alanin handeln. Für eine genaue Aussage
wären daher weitere Messungen mit z.B. anderen Laufmitteln notwendig.
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Versuch Nummer G-04 04 BC-Grundpraktikum
Die Rf-Werte geben das Verhältnis der zurückgelegten Strecke von Substanz zur
Laufmittelfront. an. Sie sind neben den Spots angegeben. Ein Rf-Wert von null
bedeutet keine Wanderung, einer von eins, daß die Substanz die gesamte Strecke
mitgelaufen ist.
1. Hydrolyse
N
2. Aminierung
N
N
SO 2 Cl
SO 2 Cl
SO 2 Cl
+ O
H 2
+ NH 3
N
H 2
+ R N
H
O
HCl
HCl
3. Dansylierung einer aminhaltigen Lysin-Seitenkette
O
- 5 -
R'
Peptid mit
Lysin-Seitenkette
Abb. I-4: Nebenreaktionen bei der Dansylierung
II. Aminosäuretrennung
N
N
O
HCl
O
S O
OH
S O
NH 2
N
O
S O
NH
R N
H
O
a) Theoretische Grundlagen
Eine wichtige Methode zu Trennung von Aminosäuren ist die Ionenaustausch-
Chromatographie. Grundlage dieser Methode ist die unterschiedliche Affinität der
unterschiedlich geladenen AS bei verschiedenen pH-Werten. Handelt es sich bspw.
um einen Kationenaustauscher, so werden positiv geladene Teilchen (wie AS) länger
festgehalten als neutrale oder negativ geladene. Als Kriterium berechnet man die
Ladung nach der HENDERSON-HASSELBALCH-Gleichung für Puffersysteme:
[ A ]
lg
[ HA]
−
pH = pK +
Hierbei ist [A-] die Konzentration der Base, [HA] die der Säure. Ein konkretes Beispiel
ist unter e) Seite 7 vorgerechnet.
O
R'

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b) Versuchsziele, Aufgaben
Mit Hilfe der Chromatographie sollten die Aminosäuren getrennt und durch
Berechnen der Ladung identifiziert werden. Die Auswertung des relativen
Verhältnisses wird durch photometrische Messung der mit Ninhydrin behandelten
AS-Lösung gemacht.
c) Versuchsdurchführung
Gegenüber dem der Durchführung des Skripts wurde der Nullabgleich der
photometrischen Messung mit der (scheinbar) optisch klarsten Probe gemacht.
d) Meßergebnisse und Beobachtungen
Die nach dem Inkubieren entstandene Färbung verschwindet bei vielen Proben fast
vollständig, nachdem mehrere Minuten intensiv geschüttelt wurde. Die genauen
Intensitäten sind dem Diagramm und Tabelle II-1 zu entnehmen.
Tabelle II-1: Extinktionen
Fraktions-
"578
zahl
Fraktionszahl
- 6 -
"578
1 0.000 26 0.024
2 0.023 27 0.541
3 0.007 28 0.533
4 0.005 29 0.222
5 -0.010 30 0.130
6 0.018 31 0.073
7 0.012 32 0.037
8 0.003 33 0.030
9 -0.004 34 0.032
10 0.033 35 0.028
11 0.083 36 0.014
12 0.217 37 0.011
13 0.337 38 0.017
14 0.478 39 0.014
15 0.605 40 0.017
16 0.513 41 0.036
17 0.428 42 0.044
18 0.288 43 0.027
19 0.170 44 0.040
20 0.096 45 0.042
21 0.060 46 0.044
22 0.031 47 0.050
23 0.026 48 0.060
24 0.013 49 0.053
25 0.025 50 0.072
26 0.024
e) Auswertung und Diskussion
Die gemessenen Werte wurden während der Messung auf Millimeterpapier
übertragen und auch dort bezüglich der relativen Menge ausgewertet. Das ungefähre
Verhältnis ist 3.187:1.446=2.20:1.

Versuch Nummer G-04 04 BC-Grundpraktikum
Um nun auf die Aminosäure selbst zu schließen, muß die Ladung berechnet werden.
Dafür wurden die folgenden pK-Werte des Versuchs G-01 aus dem Skript (Seite 5)
benutzt:
pK (#-COOH) pK (#-NH2) pK (Seitenkette)
Leucin 2.36 9.6
Asparaginsäure 2.09 9.82 3.86
Die Berechnung der Ladungen wird zunächst allgemein, dann konkret am Beispiel
von Asp bei pH=2.2 vorgerechnet.
In die HENDERSON-HASSELBALCH-Gleichung werden die bekannten Werte (pH und
pK) eingesetzt und nach dem Säure-Base-Verhältnis aufgelöst:
−
−
[ A ] [ A ] ( pH−pK)
pH = pK + lg ⇔ = 10
[ HA]
[ HA]
Da man gewöhnlich das Verhältnis xx:1 erhält, ist die Gesamtmenge n ges der
Ladungen gegeben durch n ges
( pH−pK)
= 1 + 10 . Mit diesem Wert läßt sich der Anteil der
−
[ A ]
1
Base und Säure ableiten: = Anteil Base ,
nges
nges
= Anteil Säure . Für die Ladung ist
entscheidend, ob die funktionellen Gruppen protoniert oder deprotoniert sind. Die
Berechnungen werden für sämtliche Amino- und Carboxylgruppen durchgeführt,
wie am Beispiel für Aspartat bei pH=2.2:
• #-COOH-Gruppe:
10 (2.2-2.09)=1.288:1
⇒ Gesamtmenge: 2.288
⇒ Anteil Base (neg.): 1.288:2.288=0.563
Anteil Säure (ungel.): 1:2.288=0.437
• #-NH2-Gruppe:
10 (2.2-9.87)=2.399⋅10-8 ⇒ Gesamtmenge: $1
⇒ Anteil Base (ungel.): $2.398⋅10-8 Anteil Säure (pos.): $1
• Seitenkette (COOH):
10 (2.2-3.86)=0.0219:1
⇒ Gesamtmenge: 1.0219
⇒ Anteil Base (neg.): 0.0219:1.0219=0.021
Anteil Säure (ungel.): 1:1.0219=0.879
In der Tabelle auf der nächsten Seite sind alle berechneten Werte abgedruckt.
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Versuch Nummer G-04 04 BC-Grundpraktikum
Tabelle II-2 : Ladungen
pK pK
pK pK pK
(#-COOH) (#-NH2)
(#-COOH) (#-NH2) (Seitenkette)
Leucin 2.36 9.6 Aspartat 2.09 9.82 3.86
pH= 2.2 pH= 2.2
Gesammenge 1.692 1.000 2.288 1.000 1.022
Anteil Base 0.409 3.981E-08 0.563 2.399E-08 0.021
Anteil Säure 0.591 1.000 0.437 1.000 0.979
Gesamtladung 0.591 0.416
pH= 3 pH= 3
Gesammenge 5.37 1.00 9.13 1.00 1.14
Anteil Base 0.814 2.512E-07 0.890 1.514E-07 0.121
Anteil Säure 0.186 1.000 0.110 1.000 0.879
Gesamtladung 0.186 -0.012
pH= 5 pH= 5
Gesammenge 437.52 1.00 813.83 1.00 14.80
Anteil Base 0.998 2.512E-05 0.999 1.514E-05 0.932
Anteil Säure 0.002 1.000 0.001 1.000 0.068
Gesamtladung 0.002 -0.931
Die grünen Werte bedeuten eine positive Ladung, die roten eine negative und die
schwarzen repräsentieren die ungeladenen Anteile. Aufgrund der Gesamtladungen
bei den verschiedenen pH-Werten kann nun eine Peakzuordnung gemacht werden.
Bei pH=2.2 werden beide AS zum größten Teil festgehalten. Bei pH=3.0 hingegen
zeigt sich schon eine unterschiedliche Gesamtladung, weshalb hier Aspartat eluiert.
wird der pH weiter auf 5.0 erhöht, so kann auch Leucin eluieren, da der positive
Anteil mit 0.02 sehr gering ist. Deshalb ist der erste Peak dem Aspartat und der
zweite dem Leucin zuzuordnen.
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