Mikrobiolobie - Bakteriologie I - PharmXplorer

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Mikrobiolobie - Bakteriologie I - PharmXplorer

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Feinstruktur

- Prokaryontes Kernäquivalent: Nukleoid = "nacktes" DNA-Molekül.

Dieses prokaryonte Kernäquivalent entspricht funktionell dem

eukaryonten Zellkern. Bei der Vermehrung der Bakterien steht am

Anfang immer die Reduplikation des Nukleoids.

- Plasmide: extrachromosomale, ringförmige, doppelsträngige DNA-

Struktur: Pathogenitäts- Resistenzplasmide und metabolische Plasmide

- Zytoplasma: große Zahl von in Wasser gelösten nieder- und

hochmolekularen Stoffen, RNS, und viele Ribosomen (70S;

Proteinbiosynthese), Reservestoffe in unlöslicher Form

- Zytoplasmamembran = "unit membrane": Phospholipiddoppelschicht

mit eingebetteten Polypeptidmolekülen.

* semipermeabel

* aktiver Transport von außen nach innen (spezif. Permeasen)

* ausschleusen von Proteinen (Exoenzyme, Exotoxine) nach außen

* Sitz zahlreicher Enzyme für die Biosynthese von

Zellwandstrukturelementen (+Ribosomen)


Zellwand

+ Schutz des Protoplasten vor äußeren Noxen

+ Abbau der osmotischen Druckdifferenz

+ Formgebung der Zelle

Mureinschicht: (verantw. für die Rigidität d. Zellwand):

- Polysaccharidketten (abwechselnd N-Acetylmuraminsäure[MUR] und

N-Acetylglucosamin [GLU]); Ketten sind durch Peptide miteinander

verbunden.

Grampos. Bakterien: bis 40 Mureinschichten; 30% der Trockenmasse der

Zellwand. gramneg. Bakterien: 10% der Trockenmasse der Zellwand.

Äußere Membran: (nur bei gramnegativen Bakterien vorhanden): "unit

membrane" über Lipoproteine mit dem Murein verbunden. Die äußere

Membran enthält Porinproteine, die Kanäle oder Poren bilden. Weiters

ist an die äußere Membran das Lipopolysaccharid (LPS) angelagert,

das auch als Endotoxin!!! bezeichnet wird (Lipid A -

Kernpolysacch.(Core) - O-spezifischen Ketten! Typisierung).

Endotoxin stimuliert Makrophagen zur Produktion des endogenen,

hitzestabilen Pyrogens Interleukin 1.


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Kapseln: Schleim aus Polysacchariden: Schutz vor Phagocytose,

lytischen Enzymen, Phagen, Antigenstruktur (K-Antigene; ca 80

Serotypen bei Pneumokokken).

Geißeln: Beweglichkeit; Protein Flagellin; Geißelproteine sind gute

Antigene (H-Antigen der Enterobakterien). Sie dienen zusammen mit

dem O-Antigen (O-spez. Kette d. LPS) der Typisierung dieser Bakterien.

Pili, Fimbrien, Glykokalix: oberflächliche Anhangsgebilde, die kürzer

sind als Geißeln.Fimbrien und Pili sind zarte Proteinfäden, die für

adhäsive Vorgänge (Kolonisierung von Schleimhäuten) verantwortlich

sind (Adhäsine). Konjugationspili sind fädige Proteinhohlrohre, welche

die Konjugation ermöglichen.

Als Glykokalix werden Polysaccharidfäden bezeichnet, die das "Kleben"

an Zellen oder glatten Oberflächen ermöglichen.

Bakteriensporen: Dauerformen, die das bakterielle Genom bei

"ungünstigen äußeren Bedingungen" schützen. Zytoplasmamembran

stülpt sich ein, wächst um das Nukleoid herum, schnürt sich ab und

bildet einer doppelwandige Endospore. Sporen weisen erhebliche

Resistenzen gegenüber chemischen und physikalischen Noxen auf.


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Physiologie: Bakterienstoffwechsel

(Gesamtheit d. chemischen Reaktionen in der Bakterienzelle)

- anabol oder synthetisch: endergonisch (unter Energieverbrauch)

* photosynthetisch

* chemosynthetisch

Aus einfachsten Nährstoffen können Bakterien in kurzer Zeit

hochkomplizierte organische Moleküle synthetisieren.

Anwendung in der technischen Mikrobiologie:

z.B. Gewinnung von Antibiotika, Aminosäuren, Vitaminen

- katabol: exergonisch (liefern Energie durch Nährstoffabbau)

* lithotroph = anorganische Nährstoffe

* organotroph = organische Nährstoffe

Humanpathogene Bakterien sind chemosynthetisch - organotroph!

+ Energiequelle in Form von oxidierbaren organischen Substraten

+ C- und N-Quellen zur Synthese zahlreicher organischer Verbindungen

+ Mineralien (P, Ca, Mg..) als Aktivatoren von Enzymen

+ organische Verbindungen, die Bakterien nicht selbst synthetisieren


Als Nährstoffe kommen praktisch alle in der Natur vorkommenden

organischen Stoffe in Frage. Die Verarbeitung dieser Stoffe erfolgt

über eine vielfältige Reihe enzymatischer Prozesse, die in 4 Phasen

abläuft:

1) Verdauung: Spaltung organischer Energiequellen außerhalb der Zelle

durch Exoenzyme (manchmal wichtige Pathogenitätsfaktoren!).

2) Aufnahme niedermolekularer Nährstoffe durch passive Diffusion oder

aktiven Transport.

3) Vorbereitung zur Oxidation: z.B. Abspaltung von Carboxyl- oder

Aminogruppen, Phosphorilierung...

4) Oxidation: Entzug von Elektronen und H2-Ionen.

Je nach H2-Akzeptor unterscheidet man die

Respiration oder Atmung: H2-Akzeptor ist der Sauerstoff

anaerobe Respiration: H2-Akzeptor ist Sauerstoff als Bestandteil

eines anorganischen Salzes

Fermentation oder Gärung: H2-Akzeptor ist organische

Verbindung


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CHEMOTHERAPEUTIKA:

chemisch-synthetisch hergestellte, antimikrobiell wirksame

Substanzen,

wie z.B. Sulfonamide

ANTIBIOTIKA:

biosynthetisch gewonnene, antimikrobiell wirksame

Naturstoffe,

wie z.B. Penicillin


BAKTERIOSTASE:

reversible antibiotische Hemmung

des Wachstums bzw. der Vermehrung

einer Bakterienpopulation

z.B. Sulfonamide, Tetracycline...

BAKTERIZIDIE:

irreversible Schädigung und

Abtötung einer Bakterienpopulation

z.B. Penicilline, Cephalosporine...


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Resistenz

Bakterielle Eigenschaft, Antibiotikakonzentrationen, die im

Makroorganismus erreicht werden können, zu tolerieren („klinische

Resistenz“)!

1. natürliche Resistenz: stets vorhandene Unempfindlichkeit, d.h.

Lücke im Wirkungsspektrum des Antibiotikums

2. erworbene (chromosomale) Resistenz (primär oder sekundär):

Mutation im Chromosom lokalisiertere Gene; nur unter Selektionsdruck

kann sich eine resistente Population entwickeln!

3. extrachromosomale ("infektiöse") Resistenz: extrachromosomale

Gene als Träger von Resistenzfaktoren (Plasmide)


Resistenzeigenschaften können durch parasexuelle Prozesse

übertragen werden:

+ Konjugation: Übertragung von DNA über Plasmabrücken

+ Transformation: Übertragung von DNA von lysierten

Zellen auf spezifische Akzeptoren

+ Transduktion: Übertragung von Bakterien-DNA durch Phagen

(versehentliches "Miteinpacken" von Bakterien-DNA)


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Veränderung des Arzneimittelrezeptors

Antibiotika haben verschiedene Angriffspunkte in der Bakterienzelle.

Wird durch Mutation die Struktur dieser Angriffspunkte verändert, so kann

das Antibiotikum keine Bindung mehr eingehen und wird wirkungslos.

Beispiel: Streptomycin-Resistenz: beruht auf einer

Veränderung der 30-S-Ribosomen-Untereinheiten

Veränderung der Penetration des Antibiotikums

Bevor der Wirkstoff seinen Rezeptor erreicht, muss er durch die Zellwand penetrieren.

Durch Veränderungen im aktiven Transportgeschehen oder durch eine

herabgesetzte Permeabilität der äußeren Membran kann das Antibiotikum nicht mehr in die

Bakterienzelle gelangen.

Inaktivierung des Antibiotikums

Je nach Antibiotikum sind unterschiedliche Enzyme dafür verantwortlich.

Beispiel: β-Lactamasen: bewirken hydrolytische Spaltung des

β-Lactam-Rings von Penicillinen und Cephalosporinen


Resistenzmechanismen

Inaktivierende Enzyme: Hydrolyse oder Modifikation des

Antibiotikums z.B. Betalactamase (hydrolysiert Betalactamring)

Resistente Zielmoleküle: Durch Mutation werden Gen-Produkte

gebildet, die eine geringere Affinität zum Antibiotikum

aufweisen.

Permeabilitätsmechanismen: Reduzierter Influx bzw Efflux


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Chemotherapeutika: Antimikrobielle Wirkstoffe!

* Wirkungsspektrum: (natürliche Resistenz)

Schmalspektrum - Breitspektrum

* Wirkungsweise: bakteriostatisch - bakterizid

* Wirkungsmechanismen (Pharmakodynamik):

Angriffspunkt ist Zellwand, Zytoplasmamembran oder

Proteinsynthese

* Pharmakokinetik:

Resorption, Bindung an Serumeiweiß, Verteilung,

Gewebsdiffusion, Umbau, Abbau, Metabolisierung und

Ausscheidung

* chemisch-physikalische Eigenschaften

pH-Optimum, Stabilität, Löslichkeit

* Nebenerscheinungen

Toxizität, Allergie, Eliminierung der Normalflora

* Resistenzlage


Virulenzfaktoren

+ als Strukturelemente der Bakterienzelle (nicht toxisch)

+ als Stoffwechselprodukte (extrazellulär bzw. toxisch)

Biologische Funktion der Virulenzfaktoren

- Adhäsion: zur Kolonisation mittels wirtspezifischer Adhäsine

(z.B. Fimbrien, Pili)

- Invasion/Ausbreitung: gewebsschädigende Exoenzyme

(z.B. Streptokinase, Hyaluronidase, Kollagenase, Proteasen...)

- Toxine: Endotoxine (werden bei Zelltod frei; z.B. LPS)

Exotoxine (Eiweißstoffe, die von Bakterium nach Außen

abgegeben werden)

Zytotoxine, Neurotoxine, Enterotoxine


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Strategien gegen Infektabwehr des Wirtes:

- Antiphagocytose: Kapseln, Phagocytentoxine ...

- Immuntoleranz: Molekulare Mimikry (das Immunsystem erkennt

Bakterien nicht als fremd)

- Antigenvariation: Variabilität der Antigenproteine (z.B. Pili..)

- IgA-Proteasen: Bakterien zerstören spez. Antikörper


Epidemiologie

Lehre über Ursache, Entstehung und Verbreitung von Krankheiten!

Infektionskette:

a) Infektionsquelle:

primäre Qu. (Ort, an dem sich Erreger aufhält oder vermehrt; Mensch,

Tier=Zoonosen), Inkubationsausscheider,

Rekonvaleszenzausscheider, Dauerausscheider

sekundäre Quellen (Wasser, Boden, Luft)

b) Übertragungsweg: Tröpfcheninfektion (z.B. Erkältungskrankheiten)

Kontakt- und Schmierinfektion (z.B. Geschlechtskrankheiten)

c) empfindliches Individuum: Eigenschaften der Erregers (z.B. Virulenz)

und des Makroorganismus (z.B. Abwehrvermögen)


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Züchtung oder Kultivierung von Bakterien

Bakterien außerhalb ihres natürlichen Standortes zur Vermehrung

bringen.

Inokulation: Verbringung bakterienhältigen Materials in ein

Kulturmedium

Inkubation: "Bebrütung" der beimpften Kulturmedien

Kultur: die durch Vermehrung entstandene Bakterienpopulation

flüssige Kulturmedien: Nährbouillon (Fleischextrakt, Pepton, Glucose)

feste Kulturmedien: Nährbouillon + 2% Agar (Polysaccharid aus

Seetang)

- Minimalmedium: "Existenzminimum"

- Optimalmedium: Substrate im Überfluss

- Selektivmedium: selektiv für einzelne Keimgruppen

wachstumshemmend; zur Anreicherung "interessanter" Keime

um sie von Begleitflora zu trennen

- Differentialmedium: enthalten Stoffe, welche von einzelnen

Bakterienarten metabolisiert werden --> Stoffwechselprodukte

werden z.B. durch Farbindikatoren angezeigt ("Bunte Reihe")


Direkter Nachweis von Bakterien oder deren Produkten

* Mikroskop: nativ - Einfachfärbungen - Differentialfärbungen

Form- und Größe der Zellen, Flagellen, Kapseln, Sporen usw.,

Pseudozellverbände, Färbeverhalten

* Kultivierung: auf festen und flüssigen Nährmedien

- Makroskopisch-morphologische Merkmale der Kolonien

Physiologische Merkmale

- Wachstumsbedingungen (t°C, pH, pO2, pCO2, osmot.Druck,

Nährstoffe,Mineralien )

- Stoffwechseleigenschaften (Verwertung von C- und N-Quellen,

Nachweis von Stoffwechselprodukten und Enzymen)

- Chemische Merkmale (DNA-Struktur, Antigen-Struktur)


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• Schnelltest zur Unterscheidung von

• Staphylokokken und Streptokokken

positiv negativ

• Durchführung:

Bakterienkolonie wird mit einem Tropfen 3%iger

H2O2-Lösung Lösung

beträufelt. Aufsteigende Gasblasen zeigen die

Anwesenheit des Atmungskettenenzyms

Katalase an.


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• Schnelltest zur Unterscheidung von:

• Staphylococcus aureus ! positiv

Staph. Staph.

epidermidis ! negativ

• Durchführung:

Bakterienkolonie wird auf einen Objektträger aufgebracht und

mit einem Tropfen Latexsuspension verrührt. Die Latexteilchen

sind mit Humanfibrinogen und IgG beschichtet. Bei positiver

Reaktion kommt es zur Klumpenbildung.

Prinzip: Zur Agglutination kommt es durch Bindung des IgG an

das an der Zelloberfläche von Staph. Staph.

aureus-Stämmen

aureus Stämmen lokalisierte

Protein A und durch den Clumping-Faktor

Clumping Faktor, , der mit Fibrinogen

reagiert.


Kligler Zuckerspaltung

Dextrose

Lactose

H 2 S-

Bildung

BUNTE REIHE

Identifizierung von Enterobacteriaceae

Indol Harnstoff Citrat Nitrat Beweglichkeit

Glucose Tryptophan Harnstoff Kohlenstoff- Nitrat

Lactose

zu Ammoniumquelle !

Saccarose

carbonat

Nitrit

beweglich

unbeweglich


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BUNTE REIHE

Farbumschläge bei positiven Reaktionen und Zusatz von

Reagenzien

Harnstoffreagenz:

Indolreagenz: Phenolphtalein

p-Dimethylaminobenzaldahyd

Nitratreagenzien:

Sulfanilsäure

α-Naphthylamin

Essigsäure



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Das Testsystem beruht auf dem Prinzip der Bunten Reihe :

In einem Teststreifen mit 20 Mikroröhrchen befinden sich verschiedene

dehydrierte Testsubstanzen, die mit einer Bakteriensuspension in Aqua dest.

befüllt werden. Der Test wird anschließend bei 37°C ca. 24 Std. bebrütet.

Ein meist indikatorbedingter Farbumschlag zeigt an, ob die getesteten

Substanzen von Bakterien umgesetzt wurden.

Anhand der positiven Reaktionen lässt sich ein Zahlencode erstellen, der zur

Identifizierung der Keime führt.

+ + + + +

QNPG ADH LDC ODC ‚CIT H 2S URE TDA IND VP GEL GLU MAN IND SOR RHA SAC MEL AMY ARA OX

5 1 4 4

Kodierungsprinzip des API-Systems

z.B.: Escherichia coli

+ + + +

5 1 2






Gelbe Seite :

Anreicherungsmedium

für alle

Bakterien

Rote Seite:

Selektivmedium

für gram-neg.

Bakterien

Häufigste Erreger bakterieller Harnwegsinfektionen:

akute Infektionen, Escherichia coli

nicht hospitalisierte Patienten

Weiße Seite:

Selektivmedium

für Enterokokken

chronische Infektionen Proteus, Pseudomonaden, Klebsiella

hospitalisierte, kathederisierte Enterobacter, Enterococci,

Patienten Staphylococci


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