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Foto: © Carl Zeiss

LABORWELT

II/2001

Das Themenheft von

Digital

Imaging in den

Life Sciences

FISH in der

gastrointestinalen

Mikrobiologie

Mikroskopie/

Imaging

Konfokale

Bildaufnahme am

Lichtmikroskop

Fernfeld-

Fluoreszenz-

Mikroskopie

Marktübersicht

Konfokale

Mikroskopie

Bildanalyse-

Systeme

HTS-Toxizitäts-

Test VITOTOX

Modulare

Bilddatenbanken

BIOCOM AG


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I N T R O

Zum Thema

Life Science-Mikroskopie in

vier Dimensionen

Bis in die achtziger Jahre hinein war die Leistungsfähigkeit der Lichtmikroskopie

durch die Eigenschaften des menschlichen Auges begrenzt. Die Anwendung

leistungsfähiger elektronischer Verfahren hat diese Grenze fallen

lassen und darüber hinaus die Digitalisierung und Bearbeitung der entstandenen

Bilder in Echtzeit ermöglicht. Hochdynamische Prozesse an Strukturen

wie Actinfilamenten, die sich vormals nur mittels Elektronenmikroskopie

am toten Objekt nachstellen ließen, die Messung biochemischer Parameter,

der Zelldynamik (siehe Seite 6) und vieles mehr sind jetzt zeitaufgelöst

in vivo zugänglich. Man spricht daher mit Recht von dem Einzug der Elektronik

in die Lichtmikroskopie oder der „elektronischen Lichtmikroskopie“.

Unter letztere fällt das Prinzip der elektronischen Scanning-Mikroskope,

wie sie immer häufiger für Life Science-Messungen angewendet werden.

Die meist eingesetzten Konfokalen Mikroskope erzeugen ein dreidimensionales

Bild – sofern Bildfolgen aufgezeichnet werden, kommt die Zeit als

vierte Dimension hinzu. Lesen Sie dazu unsere Marktübersicht auf Seite 29.

Mit videomikroskopischen Verfahren sind die Abbildung biologischer Objekte

oder Vorgänge selbst bei niedrigster Lichtintensität mit höchster Auflösung

möglich. Unlängst fanden Göttinger Wissenschaftler eine Lösung,

die Beugungsgrenze bei Fernfeldmikroskopen zu überwinden. Wie dies

funktioniert, davon berichten sie auf Seite 4.

Bitte nutzen Sie unseren Kennziffer-Service – jetzt auch

online unter www.biocom.de:

Wenn Sie ein Produkt interessiert, einfach Nummer

ankreuzen, Name und Adresse angeben und faxen/mailen –

Sie erhalten umgehend Informationen unserer Inserenten.

Die elektronische Revolution hat neben einer Vielzahl leistungsfähiger elektronischer

Kameras, die die Aufgabe des „elektronischen“ Auges übernehmen,

auch eine platzsparende Verwaltung der Bilder und Bildinformationen

mit sich gebracht. Dokumentationssysteme, wie auf Seite 21 dargestellt,

können aber inzwischen wesentlich mehr als das reine Speichern und Beschriften

von Bildern.

Eine Vielzahl von Fluoreszenz- und Lumineszenztechniken mit einem weiten

Spektrum an Anwendungen haben ebenfalls Einzug in die Lebenswissenschaften

gehalten. Diesen widmet sich unser Schwerpunkt Imaging.

Über entsprechende mikrobiologische und toxikologische Anwendungen

informieren die Beiträge auf den Seiten 24 und 26.

Die nächste LABORWELT-Ausgabe widmet sich übrigens ausschließlich

neuesten Functional Genomics-Techniken. Auf Wunsch erhalten Organisatoren

thematisch passender Veranstaltungen LABORWELT kostenlos in

benötigter Anzahl für die Meetingteilnehmer – eine einfache Mail an

laborwelt@biocom.de genügt.

Eine angenehme Lektüre wünscht Ihnen

Ihr LABORWELT-Team

Korrektur LABORWELT 1/01

Die in LABORWELT-Ausgabe 01/01 angegebene Fax-Nummer der

Wave Biotech AG Europe sind sowohl in der Anzeige als auch im

Autorenbeitrag unrichtig. Interessenten faxen bitte an folgende

Fax-Nummer: ++41-52-3542056.

Information ordern? Kennziffer 11 LW 02 / www.biocom.de

Inhalt

4 BLITZLICHT

Fernfeld-Fluoreszenzmikroskopie

jenseits der Beugungsgrenze

STEFAN W. HELL UND THOMAS A. KLAR,

MPI FÜR BIOPHYSIKALISCHE CHEMIE, GÖTTINGEN

BLITZLICHT

17 Konfokale Bildaufnahme

mit dem Lichtmikroskop

ANNELIESE SCHMAUS

KLUGHAMMER GMBH,

MARKT INDERSDORF

REPORT

Analyse der Zelldynamik 6

durch digitale

Lichtmikroskopie

DIETER G.WEISS ET AL.,

UNIVERSITÄT ROSTOCK

REPORT

FISH in der gastrointestinalen 13

Mikrobiologie

ANDREAS SCHWIERTZ, DIFE,

BERGHOLZ-REHBRÜCKE

BLITZLICHT

Bilddatenverwaltung mit 21

IM 1000

DAGMAR ROSER,

LEICA MIKROSYSTEME GMBH,

BENSHEIM

BLITZLICHT

Bildanalyse in der 24

Toxizitätsprüfung

EDGAR WEBER,

NOVARTIS CROP PROTECTION AG,

BASEL

BLITZLICHT

26 VIVOTOX – a high throughput bioluminescence

genotoxicity and cytotoxicity test

THERMOLABSYSTEMS FINNLAND

BLITZLICHT

27 Neue konfokale und

Multiphoton-Abbildungssysteme

ANNA SMALLCOMBE,

BIO-RAD, HEMPSTEAD, UK

MARKTÜBERSICHT

29 Konfokalmikroskope

34 Produktwelt/Impressum

|transkript LABORWELT Nr. II/2001 | 3


B L I T Z L I C H T

Mikroskopie

Beugungsgrenze in der

Fernfeld-Fluoreszenzmikroskopie

überwunden

STEFAN W. HELL UND THOMAS A. KLAR

MAX-PLANCK-INSTITUT FÜR BIOPHYSIKALISCHE CHEMIE,

ARBEITSGRUPPE HOCHAUFLÖSENDE OPTISCHE MIKROSKOPIE, GÖTTINGEN

Denkt man an Fernfeldmikroskopie, das

heißt an Lichtmikroskopie mit fokussierender

Optik, so geht man davon aus, daß

Strukturen, die feiner sind als etwa ein halber

Mikrometer, nicht mehr erkennbar sind.

Die Wellennatur des Lichts verhindert das

Erzeugen fokaler Lichtflecke (engl. ‚focal

spots’), deren Abmessungen wesentlich

kleiner sind als die Wellenlänge des Lichtes.

Die Gesetze der Beugung fordern eine

Mindestausdehnung von einem Drittel der

Wellenlänge in lateraler und etwa einer Wellenlänge

in axialer Richtung. Diese Erkenntnis

geht auf den Jenaer Physiker Ernst Abbe

(1840-1905) zurück, der die Beugung als

zentrales Problem der Auflösung im Lichtmikroskop

erkannte.

Zur Erlangung höherer Auflösungen hat

man in Folge fokussiertes Licht systematisch

gemieden und andere Mikroskopieverfahren

erfunden, wie etwa die Elektronen-,

Röntgen-, Rasterkraft- und optische

Nahfeldmikroskopie. Obwohl diese Verfahren

sehr wichtig sind, konnten sie in einem

bedeutenden Anwendungsgebiet das fokussierende

Lichtmikroskop nicht ersetzen,

nämlich bei der nichtinvasiven Abbildung

des Inneren von Zellen. Diese ist mit den

‚hochauflösenden’ Verfahren nicht möglich.

In der Zwischenzeit konnte die Fernfeld-

Mikroskopie – insbesondere die Fluoreszenzmikroskopie

– ihre herausragende Stellung

in der biomedizinischen Forschung

ausbauen. Neuere Fernfeld-Fluoreszenzmikroskopieverfahren

wie die Konfokal- und

die Multiphotonenmikroskopie stellen lebende

Zellen in 3D dar – die beugungslimitierte

Auflösungsgrenze konnten aber auch

sie nicht nachhaltig überwinden.

Mit Hilfe des Konzeptes der Fluoreszenzlöschung

durch stimulierte Emission (Stimulated

Emission Depletion, STED) 1 konnte

kürzlich die Beugungsgrenze des Fluoreszenzmikroskops

auf fundamentale Weise

durchbrochen werden 2 . In einem STED-Mikroskop

verfügt man über nahezu kugelförmige

fluoreszierende fokale Spots, die in

lateraler Richtung nur noch halb so breit

sind wie beim konfokalen Mikroskop. Entlang

der optischen Achse ist ihre Ausdehnung

sogar auf ein Fünftel reduziert. Das

resultierende Volumen des Fluoreszenzspots

ist mit 670 Zeptolitern etwa 18mal

kleiner als das eines konfokalen Mikroskops

und ist somit der kleinste, jemals mit fokussierender

Optik erzeugte, fluoreszierende

fokale Spot.

Dem STED-Mikroskop liegt die Idee zugrunde,

die Fluoreszenz der Farbstoffmoleküle

am Rande des ursprünglich angeregten

Bereiches durch stimulierte Emission

zu löschen, ohne die Moleküle zu zerstören.

Dazu wird mit zwei Abfolgen ultrakurzer

Laserpulse gearbeitet, die zeitlich

genau aufeinander abgestimmt sind. In den

ersten Experimenten wurden rot fluoreszierende

Farbstoffe verwendet, wobei der

löschende STED-Puls in der langwelligen

Flanke des Emissionsspektrums angesiedelt

ist 2 . Jedem grünen Anregungspuls folgt

unmittelbar ein tief roter, abregender

Abbildung: Durchbrechen der Beugungsgrenze

in der Fluoreszenzmikroskopie: Der Fluoreszenzspot

eines konfokalen Mikroskops

(oben) wird durch stimulierte Emission in seiner

Ausdehnung deutlich unter die Beugungsgrenze

verringert: 90-110 nm volle Halbwertsbreite

(full width at half maximum FWHM) in

lateraler und axialer Richtung

(STED-)Puls. Der STED-Puls zwingt die

angeregten Moleküle am Rande des Fokalbereiches

auf ein vibratorisch angeregtes

Niveau des elektronischen Grundzustandes,

von wo sie weiter auf einen vibratorischen

Grundzustand relaxieren. Somit ist

die Fluoreszenz unmittelbar nach der Anregung

unterbunden.

Um die Fluoreszenz lediglich im Randbereich

des Fokus zu unterdrücken, wird die

Intensitätsverteilung des STED-Strahles

ringförmig um den Anregungs-Spot geformt,

so daß die Fluoreszenz in der Mitte

des Spots von der Löschung verschont

bleibt. Durch Anwendung eines STED-Fluoreszenzmikroskopes

auf lebende Hefezellen

und E. coli-Bakterien konnten die ersten

Fluoreszenzaufnahmen mit Auflösungen

unterhalb der Beugungsgrenze aufgenommen

werden und Details sichtbar gemacht

werden, die bisher mit fokussierender Fluoreszenzmikroskopie

verborgen geblieben

sind.

Während an den Grenzen der räumlichen

Auflösung noch geforscht wird, tut sich

eine weitere wichtige Anwendung des

STED-Effektes in der Mikroskopie auf.

Durch gezieltes zeitliches Verzögern des

Abregepulses, läßt sich die zeitliche Dynamik

des elektronisch angeregten Zustandes

der Farbstoffmoleküle in einer Zelle vom

Nanosekunden- bis herab in den Femtosekundenbereich

verfolgen 3 . Darüber hinaus

sind Anwendungen von STED bei der Kontrolle

chemischer Reaktionen innerhalb eines

sub-Attoliter-Volumens denkbar. Dies

könnte in Zukunft zum Beispiel auch bei

der Erzielung höherer Dichten in Datenspeicher

eine wichtige Rolle spielen.

Literatur

1. S.W. Hell and J. Wichmann, Breaking the diffraction

resolution limit by stimulated emission:

stimulated emission depletion microscopy, Opt.

Lett. 19 (11), 780-782 (1994).

2. T. A. Klar, S. Jakobs, M. Dyba, A. Egner, and S.

W. Hell, Fluorescence microscopy with diffraction

resolution limit broken by stimulated emission,

Proc. Nat. Acad. Sc. U.S.A. 97, 8206-8210 (2000).

3. M. Dyba, T. A. Klar, S. Jakobs, and S. W. Hell,

Ultrafast Dynamics Microscopy, Appl. Phys. Lett.

77, 597-599 (2000).

Korrespondenzadresse

Dr. Stefan Hell

Max-Planck-Institut für

biophysikalische Chemie

AG Hochauflösende Optische Mikroskopie

D-37070 Göttingen

eMail-shell@gwdg.de

Kennziffer 12 LW 02/www.biocom.de Info

4 | Nr. II/2001 |transkript LABORWELT


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R E P O R T

Mikroskopie

Analyse der zellulären Dynamik

durch digitale Lichtmikroskopie

DIETER G. WEISS, SERGEI A. KUZNETSOV, LICHTMIKROSKOPIE-ZENTRUM, INSTITUT FÜR ZELLBIOLOGIE UND

BIOSYSTEMTECHNIK, UNIVERSITÄT ROSTOCK

ERHARD DÖRP, INGOLF MENN, KLINIK UND POLIKLINIK FÜR INNERE MEDIZIN, UNIVERSITÄT ROSTOCK

HEINRICH KRAMBEER, KLAUS MICHEL, INSTITUT FÜR ALLGEMEINE ELEKTROTECHNIK, UNIVERSITÄT ROSTOCK

GERALD GRÜMMER, AXEL BUDDE, HASOTEC, HARDWARE & SOFTWARE TECHNOLOGY GMBH, ROSTOCK

WILLFRIED KRÖGER, TECHNOTRANS E.V., ROSTOCK

Elektronische Lichtmikroskopie

Untersuchungen der dynamischen Vorgänge

in der Zellphysiologie erfordern mikroskopische

Methoden, die Veränderungen der

Lage und der Form von Zellbestandteilen

oder der Konzentration von Substanzen als

Bildsequenz aufzeichnen und analysieren.

Analoge und digitale Videokameras am Mikroskop

haben in Kombination mit analoger

und digitaler Bildverarbeitung die Möglichkeiten

der Lichtmikroskopie weit über die

Grenzen erweitert, die dem Mikroskopieren

mit dem Auge gesetzt waren. Dies führte zu

dramatischen Verbesserungen der Auflösung,

der Lichtempfindlichkeit und des Kontrastes.

Zudem werden durch die Analyse

der elektronischen Signale viele mikroskopische

Verfahren zu quantitativen Meßmethoden.

Diese „elektronische Revolution der Lichtmikroskopie“

1 brachte uns die zahlreichen

neuen Techniken der Videomikroskopie und

der digitalen Mikroskopie. Neben Videokameras

werden auch andere elektronische Systeme

der Bildaufzeichnung am Mikroskop

genutzt, vor allem besonders lichtempfindliche

charge-coupled-device-(CCD)-Kameras

und rasternde Lichtdetektoren, so daß heute

vor allem folgende Verfahren der digitalen

Lichtmikroskopie zur Verfügung stehen:

die Video-Kontrastverstärkungs-Mikroskopie

für höchste Auflösung,

die Restlichtvideomikroskopie für Fluoreszenz

und Lumineszenz-Anwendungen

und

die elektronische Rastermikroskopie für

konfokale und 3D-Anwendungen.

Nach analoger oder digitaler Aufzeichnung

werden die Bilder vorverarbeitet und dann in

Videofrequenz (25 Hz) oder schneller in

schnellen digitalen Bildprozessoren durch

digitale Kontrastverstärkung, digitale Hintergrundsubtraktion

und digitale Filterungen

verbessert.

Zelluläre Dynamik

sichtbar gemacht

Gleichzeitig wird heute die Analyse der dynamischen

Vorgänge in der Zelle immer wichtiger,

sei es bei der Untersuchung der zellbiologischen

Abläufe, ihrer Regelung durch Signalmoleküle,

bei pathophysiologischen Veränderungen

oder bei der Analyse der Auswirkungen

genetischer Modifikationen in

transfizierten Zellen. Die elektronischen Verfahren

der Lichtmikroskopie erlauben heute

das Visualisieren aller membranumgebenen

Zellorganellen bis zu einer Größe von 40 nm

und der Cytoskelettelemente bis zu einem

Durchmesser von 20 nm. Damit können die

intrazellulären Abläufe und ihre Mechanismen

ebenso studiert werden wie die Eigenbewegungen

der Zellen oder die Mikrozirkulation

in den Kapillaren.

Video-Mikroskopie in Kombination mit Hellfeld-,

Interferenz-Kontrast- oder Polarisations-Mikroskopie,

vor allem aber die von R.D.

Allen entwickelte AVEC-DIC-(Allen videoenhanced

contrast differential interference

contrast)-Mikroskopie 2 machen die feinsten

zellulären Details sichtbar und erlauben die

Analyse ihrer Dynamik. So werden in geeigneten

Eukaryontenzellen die Elemente des

endoplasmatischen Retikulums, die Vesikel,

Mitochondrien und Lysosomen ebenso sichtbar

wie die Mikrotubuli und Aktinbündel, an

denen sie durch Motorenzyme in der Zelle

verteilt werden. Kolloidales Gold als Marker

für Antikörper wird bis zu einer Größe von 5

bis10 nm sichtbar und kann – an Antikörper

gekoppelt – als Marker für die Bewegungen

von Makromolekülen genutzt werden. So

wurden die Motorenzyme entdeckt und ihre

Rolle bei der Organellenbewegung entlang

der Cytoskelettelemente aufgeklärt.

Durch die Videomikroskopie kann die echte

Auflösung um den Faktor 2 und die Sichtbarmachung

kleiner Objekte um den Faktor 10

verbessert werden. Dies wird deshalb erreicht,

weil nur mit Kameras bei voller Nutzung der

numerischen Apertur ohne Überstrahlung

gearbeitet werden kann, und weil für elektronische

Bilderzeugung Rayleighs Auflösungskriterium

durch das vorteilhaftere Sparrow-

Kriterium ersetzt wird. 3,4 Objekte, die kleiner

als etwa 150 bis 200 nm sind, werden allerdings

als Beugungsscheibchen vergrößert

abgebildet und werden nur dann getrennt

sichtbar, also aufgelöst, wenn sie einen Abstand

von 200 nm voneinander haben.

Deutliche Fortschritte hat es auch in bezug

auf die Auflösung in der vertikalen oder z-

Achse gegeben (optical sectioning). Während

bereits die klassische Differentielle Interferenzkontrast-(DIC)-Mikroskopie

eine Auflösung

bis zu 300 nm brachte, kann diese im

AVEC-Verfahren noch weiter auf etwa 150

nm gesteigert werden. 3 In der Fluoreszenz-

Mikroskopie ist die z-Auflösung relativ

schlecht (ein bis mehrere Mikrometer); sie

kann aber durch die konfokale Laserraster-

Mikroskopie bis auf etwa 600 nm verbessert

und durch die 2-Photonen-Mikroskopie sogar

auf etwa 200 nm reduziert werden.

Abb.1: Erfassen der

Koordinaten von Zellorganellen

einer Pflanzenzelle

aus dem Live-

Bild. Die Dimensionen

der Objekte, die alle

Auswahlkriterien erfüllen,

sind in Länge und

Höhe durch rote Fadenkreuze

markiert. Der

kleine Bildschirm rechts

zeigt die akkumulierenden

Datenpunkte der

Objekte. Frame Grabber

FG32PATH (HaSoTec

GmbH, Rostock).

Bildbreite 28 µm.

Bewegungsanalysen

Seit die digitale Mikroskopie die Darstellung

der Zellorganellen erlaubt, besteht auch der

Wunsch, die lebhafte Dynamik ihrer Bewegungen

zu analysieren. So wurden Methoden

entwickelt, diese Dynamik durch eine

große Zahl von Parametern wie Geschwindigkeit,

Geradlinigkeit, Länge der Bewegungsphasen,

Richtungstreue und Richtungs-

Kennziffer 13 LW 02/www.biocom.de Info

6 | Nr. II/2001 |transkript LABORWELT


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R E P O R T

umkehr, Pausen etc. zu beschreiben. Dies

dient sowohl zur Charakterisierung der Mechanismen

der molekularen Motoren als auch

zur Beschreibung des momentanen Zustandes

der Zelle selbst.

Die modernen Software-basierten Systeme,

die in Kombination mit speziellen Frame-

Grabber-Karten arbeiten, können viele bewegte

Objekte gleichzeitig verfolgen. Üblicherweise

werden die Objekte durch eine

wählbare Grauwertschwelle in einer frei de-

A

B

C

D

E

Abb. 2: (oben) Rekonstruktion der Bahnen aller

beweglichen Objekte. Die ausgewählte

Spur (Pfeil, von rechts nach links) wurde weiter

analysiert (Abb. 3). (unten) Kumulative Bewegungsdaten

lassen Regionen gerichteten

Transports (Mitte) und solche mit Brownscher

Bewegung (oben und unten) in der Zelle unterscheiden.

finierbaren Bildregion (region of interest, ROI)

definiert. Bei den weiterentwickelten Systemen

werden auch Objekt-Parameter wie Größe,

Form und Farbe zur Definition der zu

analysierenden Objekte genutzt. Alle ausgewählten

Objekte werden zur Kontrolle online

durch Markierungen angezeigt, und ihre

Mittelpunktskoordinaten werden kontinuierlich

aufgezeichnet und dargestellt (Abb. 1).

Ein leistungsfähiges Bewegungsanalyse-System

ist FG32PATH V.4.29, bestehend aus

einer Frame-Grabber-Karte und einem geeigneten

Software-Paket. Die meisten Algorithmen

für die Bewegungsanalyse bauen auf

klassische Methoden der Zeitreihen-Analyse

auf, so daß sie für die Bewegungen der Zellorganellen,

ganzer Zellen, technischer Objekte

und von Labortieren im Test in gleicher

Weise angewendet werden können. Das von

der Firma HaSoTec in Rostock entwickelte

System FG32Path hat folgende Charakteristika:

flexibel einsetzbar in Industrie und biomedizinischer

Forschung

Schnelle Merkmalsextraktion (80 ms Intervalle)

adaptive Hintergrundbildsubtraktion

Livebilddarstellung

Objektmarkierung der Schwerpunktkoordinaten

Analyse in frei definierbaren Bildregionen

Analyse von Objekt-Interaktionen in Echtzeit.

Abbildung 1 zeigt das interaktive Monitorbild

bei der Datenaufnahme, hier am Beispiel

der Organellenbewegung an Actin-Bündeln

in einer Pflanzenzelle. Über im Programm

rechts angeordnete Bedienelemente werden

die auszuführenden Programmschritte aktiviert.

Nach dem Start der Messung werden

diese in Zyklen abgearbeitet. Die Identifikation

der Objekte erfolgt nach einem adaptiven

Schwellwertverfahren, das in der Lage ist,

Hintergrundänderungen selbständig auszugleichen.

Objektdatenfilter erlauben auch die

Selektion nach Objektparametern (Größe,

Intensität, Formfaktoren, ... ). Mit Steuerregionen

können identifizierte Objekte den Pro-

Abb. 3: Schritte der Bewegungsanalyse einer

Zellorganelle. (a) Weg der Organelle von links

nach rechts. (b) Fortschreiten der Organelle in

der Hauptbewegungsrichtung über die Zeit.

Die Steigung an jedem Ort gibt die Momentangeschwindigkeit

an. (c) Abweichung der

Ortsfunktion vom Mittel (positional deviation

from mean progression). (d) Momentangeschwindigkeiten

in Abhängigkeit von der Zeit

und vom Ort (e).

grammablauf starten, anhalten und beenden.

Während der Messung werden die identifizierten

Objekte in der Onlinedarstellung

markiert und als Punkte in einer verkleinerten

Zusatzdarstellung für die Dauer der Messung

akkumuliert. Für jedes Objekt wird die

Position, der Zeitpunkt, die Objekteigenschaften

und die Zugehörigkeit zu den einzelnen

Regionen aufgezeichnet.

Zur Datenauswertung können alle während

der Messung aufgezeichneten Objekteinträge

als Linienzug dargestellt werden. Die eigentliche

statistische Analyse erfolgt über

Auswertungsmodule. Neben der Weg/Zeit-

Auswertung stehen spezielle Auswertemodule

zur Verfügung. Für biomedizinische

Bewegungsanalysen sind beispielsweise folgende

Module von Bedeutung:

distance traveled and pattern of movements

rotation monitor

both distance/pattern and rotations

zone monitor

manual timer

manual zone monitor

overall motion monitor

zone motion monitor

object contact monitor

object distance monitor

both object distance and overall motion

monitor

distance traveled monitor.

Die Analyseergebnisse können modulabhängig

als Protokoll gedruckt werden. Außerdem

besteht die Möglichkeit der Datenübernahme

in andere Programme über ein Textexportformat.

Im Beobachtungsfeld können über Editoren

Versuchs-, Informations- und Steuerregionen

festgelegt werden. Neben Grundwerkzeugen

stehen für den Regionsentwurf je nach gewähltem

Auswertungsmodul, die passenden

Zeichenwerkzeuge zur Verfügung. Versuchsregionen

sind voneinander unabhängige, sich

im Beobachtungsfeld nicht überlappende

Bereiche. Mit Hilfe mehrerer Versuchsregionen

können einige Vorgänge gleichzeitig

überwacht werden. Für jede einzelne Versuchsregion

kann festgelegt werden, wieviele

Objekte in ihr verfolgt werden sollen. Informationsregionen

dienen der Kennzeichnung

der interessierenden Bereiche. Steuerregionen

liegen vollständig innerhalb von Versuchsregionen

und können sich gegenseitig

überlappen. Sie dienen der Programmablaufsteuerung

und der Auslösung von Aktionen

durch die überwachten Objekte selbst.

FG32PATH enthält einen Speicher für ein

Hintergrundbild, das in Echtzeit vom Eingangsbild

subtrahiert werden kann. Die Hintergrundbildinformation

kann durch die Mittelung

von 256 Bildern gewonnen werden.

Schnelle Objekte liefern dann zu vernachlässigende

Spuren. Durch die adaptive Anpassung

des Hintergrundes werden Langzeit-

8 | Nr. II/2001 |transkript LABORWELT


R E P O R T

unterschiede etwa durch unterschiedliche Beleuchtungsverhältnisse

im Verlauf des Experimentes automatisch ausgeglichen.

HaSoTec FG30PATH ist auf jedem PC-AT unter Windows 3.1 und

Windows 95 lauffähig. Für die Bewegtbilddarstellung wird ein ET4000-

kompatibler Grafikadapter mit einer Auflösung von 1024x768 Pixeln

in 256 Farben vorausgesetzt. Die Speicherkapazität des Systems sollte

mindestens 8 Mbyte betragen. Die notwendige freie Kapazität der

Festplatte richtet sich nach der Dauer der Messung und der Anzahl

der zu überwachenden Objekte.

Feinanalyse der Bewegungen

Um die Mechanismen der molekularen Motoren zu untersuchen, die

in der Zelle als Schrittmotoren im Nanometer-Bereich fungieren, ist es

erforderlich, eine hinreichend große Anzahl von Organellenbewegungen

für statistische Aussagen zu quantifizieren. Aus den Objektkoordinatenserien

werden dann die Bahnen rekonstruiert. Die in

Abbildung 1 markierten Partikel wurden nach Helligkeit, Größe

(maximum and minimum area) und nach Form (roundness, minimum

and maximum width and height) ausgewählt. Durch Verbinden

der jeweils zusammengehörigen Positionsdaten erhält man die Bahnen

(Abb. 2). Das Beispiel zeigt die Lage der Regionen mit gerichtetem

linearen Transport (Mitte), derer mit stochastischer (Brownscher)

Bewegung (oben und unten) und der Regionen ohne Bewegung. Die

Bahnen der einzelnen Partikel sind durch Mausklick für die weitere

Analyse einzeln auswählbar (Abb. 2a und Abb. 3a).

Die Koordinaten der Partikelspur werden zunächst so gedreht, daß

die Hauptbewegungsrichtung in die x-Achse fällt. Dadurch erreicht

man die Separierung der Koordinatenserie in zwei Zeitserien, wobei

die x-Serie die Bewegung in der Hauptrichtung entlang des Cytoskelettelements

beschreibt und die y-Serie die Querbewegung. Zur Analyse

des Transportmechanismus interessieren die Veränderungen der

Geschwindigkeit über die Zeit und entlang des Ortes. Im Gegensatz

zur mittleren Gesamtgeschwindigkeit wird dazu die Momentangeschwindigkeit

berechnet („instantaneous“ velocity) (Abb. 3d). Die

Durchschnittsgeschwindigkeit (Trend), die durch die Regressionslinie

repräsentiert ist, wird vom Datensatz subtrahiert (Abb. 3 b und c).

Die trendfreie Zeitreihe (positional deviation from mean progression)

kann dann einer Fast Fourier-Transformation unterworfen werden

um sie auf rhythmische Regelmäßigkeiten zu prüfen. Wir fanden, daß

die Geschwindigkeitsfluktuationen in verschiedenen Nervenfasern

zufällig und die in der Literatur berichteten Geschwindigkeitsoszillationen

auf Abtastfehler zurückzuführen sind. Auch wenn die Bewegungsepisoden

kurz sind und die FFT nicht durchgeführt werden

kann, ist die Darstellung der Rohdaten (Abb. 3) doch informativ. Die

meisten Parameter können zur besseren Charakterisierung der Zellbewegungen

kumulativ für eine Gruppe von Partikeln errechnet

werden.

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Einsatzgebiete

Die Verfahren haben weite Anwendung in der Zellbiologie gefunden

und zum Fortschritt wesentlich beigetragen. Die verbesserte Software

und die schnelleren Frame-Grabber-Karten, die heute zur Verfügung

stehen, machen immer neue Einsatzgebiete zugänglich. Der größte

Fortschritt wurde auf dem Gebiet des cytoplasmatischen Transportes

gemacht, seit es möglich ist, alle membranumgebenen Organellen,

das Cytoskelett als Schiene und die Feindynamik ihrer Interaktionen

direkt sichtbar zu machen. Beim Studium eines der wichtigsten motilen

Systeme, des axoplasmatischen Transportes, wurde gezeigt, daß

die Organellenbewegung in den Zellen höherer Tiere generell an

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|transkript LABORWELT Nr. II/2001 | 9


R E P O R T

Abb. 4: Transport von Erythrocytensäulen

durch Kapillarschlingen im Nagelfalz.

4

Mikrotubuli abläuft, aber in gewissem Ausmaß

auch an den Actin-Filamenten stattfinden

kann. 5,6 Weitere wichtige Erkenntnisse

folgten, wie die Entdeckung, daß Mikrotubuli

sich selbst aktiv bewegen können, daß dies

als in-vitro-Motilitätstest genutzt werden

kann, daß Organellen an einem Mikrotubulus

in beiden Richtungen laufen können oder

daß Organellen von Mikrotubuli auf Aktin-

Filamente umsteigen können.

Nur mit der digitalen Lichtmikroskopie und

der Bewegungsanalyse konnten die Motorenzyme

Dynein, Kinesin und Myosin isoliert

und zahlreiche biochemische Analysen damit

durchgeführt werden, da dies der einzige

Weg ist, diese Enzyme nachzuweisen und

ihre Aktivität zu messen. Weitere Studien

dienten etwa dem Verfolgen der Bewegung

von Blutzellen in Kapillaren, dem Erproben

von einzelligen Algen zum Nachweis von

Umweltschadstoffen oder der Analyse der

Phagocytose bei Makrophagen mittels Latex-

Partikeln. Es wurde gezeigt, daß in der Pflanzenzelle

Aktinbündel die Rolle der Schienen

für den Transport spielen. Durch diese und

andere Studien wurde auch unsere Kenntnis

der Muskelkontraktion, der Geißelbewegung

bei Prokaryoten und Eukaryoten sowie des

Pigment-Transportes und der Motilität bei

Protozoen wesentlich erweitert (Literatur siehe

Ref. 7).

Die quantitative Charakterisierung der dynamischen

Prozesse in einer Zelle stellt eine

gute Methode dar, mit der die physiologische

Gesamtsituation der Zelle beschrieben werden

kann, weil die Organellenbewegung eine

vitale und sehr grundlegende Eigenschaft

lebender Zellen ist. Wenn die Grundparameter

bestimmt sind, kann die Bewegungssituation

als ein sehr sensibler Parameter zur Charakterisierung

von Zellpopulationen in zellpathologischen,

pharmakologischen und toxikologischen

Studien eingesetzt werden. 8

Eliminierung unerwünschter

Objektbewegungen

Die Bewegungen biologischer Objekte können

aber auch sehr störend sein, zum Beispiel,

wenn das zu untersuchende Objekt

wegschwimmt oder Atem- und andere Bewegungen

dazu führen, daß das Objekt nicht

klar abgebildet werden kann. In diesen Fällen

kann durch on-line-Ausgabe der Koordinaten

eines durch Bildanalyse erkannten

Objektes der Mikroskoptisch motorisch nachgeführt

werden und so das Objekt immer in

der Mitte gehalten werden. Auch bei der

Blutflußmessung in Mikrozirkulationsgebieten,

etwa der Bewegung von Erythrocyten-

Säulen in den Kapillargefäßen im Nagelfalz

(Abb. 4) tritt das Problem auf, daß der Proband

die Hand unter dem Mikroskop nicht

still genug halten kann.

Die Mikrozirkulation in Haut und Organen

kann besonders elegant mittels Laser-Doppler-Methoden

untersucht werden. Dazu muß

Tabelle 1: Zellphysiologische Parameter, die an lebenden Zellen und Geweben mittels digitaler

Lichtmikroskopie gemessen werden können

1. Zellbewegung (AVEC)

2. Viskosität des Cytoplasmas (Brownsche Bewegung)

3. Elastische Eigenschaften von Membranen, Zellen, Organellen und Mikrotubuli

4. Cytoplasmatischer Transport, Axonaler Transport, Organellenbewegung, Protoplasmaströmung

(Bewegungsanalyse)

5. Zellwachstum (Ausläufer, Axone, etc.) (Bewegungsanalyse und nichtradioaktive Messung der

Trockenmasse durch Bildanalyse von Interferenzmikroskopie-Bildern)

6. Bewegungsintensität an jedem Bildpunkt (mittlere quadratische Abweichung der Variation der

Pixelintensität)

7. Bestimmung der Bewegungsgeschwindigkeit von Partikeln und gelösten Makromolekülen, Bestimmung

von Strömungsgeschwindigkeiten (Laser-Doppler-Velocimetrie-Mikroskop)

8. Messung von Kräften im mikroskopischen und molekularen Bereich (Laserpinzette)

9. Membranpotential (Fluoreszenzmarker)

10. Exo/Endocytose-Tests (z.B. Aufnahme von Latexpartikeln)

11. elektrische Aktivität („burst pattern“) (simultane Ableitung im Multielektroden-Array).

12. Zellphysiologische Regelprozesse: Messung der Ionenkonzentrationen, pH-Wert, momentane

Freisetzung von geschützten Metaboliten und second messengers („caged compounds“) durch

Blitzphotolyse

13. Diffusionskoeffizienten bzw. Viskosität: Fluoreszenz-Erholung nach Photobleichung (FRAP)

14. Austausch von fluoreszenzmarkierten Verbindungen zwischen Nachbarzellen (Mikroinjektion)

15. Tod der Zelle (Verlust der Farbstoffaufnahme; live-dead-Farbstoffe)

der Laserstrahl stets auf die gleiche Position

im Objekt treffen. Als wesentliche Neuerung

wurde dazu eine automatische Nachführung

der Optik bei Bewegungen des Meßobjektes

entwickelt. Da kein Kreuztisch benutzt wird,

mußte das Objektiv beweglich gelagert und

nachgeführt werden. Die Laser-Doppler-Anordnung

ist in den Kameratubus eines speziellen

Videomikroskops integriert (Abb. 5). Der

divergente Laserstrahl wird über einen teildurchlässigen

Einkoppelspiegel so in den Kamerastrahlengang

eingeblendet, daß dessen

Fokus in der Objektebene in der Mitte des

Bildfeldes entsteht. Zwischen dem Einkoppelspiegel

und der Sensorfläche der Kamera befindet

sich ein dichroitischer Strahlteiler, der

das gestreute Laserlicht (670nm, rot) auf einen

Fotodetektor umlenkt, während das Abbild

der grün beleuchteten Hautoberfläche zur

Kamera gelangt. Durch das Bewegen des Kameraobjektivs

verschiebt sich der abgebildete

Objektbereich. Der Laserfokus behält dabei

seine feste Position in Bezug zum Bild.

Nach einer groben Justierung der gesamten

optischen Anordnung auf den zu untersuchenden

Hautbereich, kann mittels PC-gesteuerter,

elektromechanischer Aktoren eine

Feinverstellung des Objektivs vorgenommen

werden. Durch den Anwender wird der Laserfokus

auf den aufsteigenden oder abfallenden

Ast einer Mikrokapillare zentriert. Im

Fotodetektor überlagert sich das Streulicht

der sich bewegenden Erytrozythen mit dem

Streulicht des Gewebes in der Umgebung der

Kapillare. Aufgrund der Rückstreuung des

Lichtes wird die Geschwindigkeitskomponente

in Richtung der Laserstrahlachse erfaßt.

Aus der gemessenen Dopplerfrequenz

kann die Relativgeschwindigkeit der Erytrozythen

bezüglich ihrer lichtstreuenden Umgebung

errechnet werden.

Parallel zur Doppler-Signalverarbeitung mittels

A/D-Wandler und zeitaufgelöster Spektralanalyse

wird mittels Bildauswertung die

Verschiebung des gesamten Bildes ermittelt.

Über einen Regelalgorithmus im PC werden

die Aktoren so angesteuert, daß die Lageabweichung

möglichst schnell rückgängig gemacht

wird, um die Doppler-Blutflußmessung

dann am selben Ort fortzusetzen. Um

den PC nicht mit zeitkritischen Bildauswerteprozeduren

zu überfordern, wird der Frame-Grabber

FG32PATH verwendet, der

grundlegende Algorithmen zur Bewegungsanalyse

mittels feldprogrammierter Logik

realisiert und dem Programm zur Lageregelung

die Koordinaten und Merkmale erfaßter

Objekte übergibt.

Messung anderer

dynamischer Parameter

in lebenden Zellen

Zur Charakterisierung des zellulären Zustandes

kommen weitere Verfahren zur Messung

dynamischer Parameter zum Einsatz. Mittels

10 | Nr. II/2001 |transkript LABORWELT


R E P O R T

Dynamic Phase Microscopy 7 können in ungefärbten, unfixierten biologischen

Objekten interferometrische Messungen der optischen

Weglänge gemacht werden. Aus dieser lassen sich bei transparenten

Objekten der Brechungsindex und seine zeitliche Fluktuation bestimmen,

die Hinweise auf Makromolekülfluktuationen geben.

Mikroskope werden oft für Geräte gehalten, mit denen man lediglich

Bilder der Objekte machen kann. Das trifft auf digitale Mikroskope,

die Bilder erzeugen, bei denen jeder Grau- oder Pseudocolor-Ton

quantitative Information über physikalische oder chemische Parameter

wie Konzentration, pH-Wert, Viskosität, Doppelbrechung oder

Phasenverschiebung enthält, nicht zu. Digitale Mikroskope können

so Eigenschaften von Spektralphotometern, Interferometern oder

Spektralfluorometern annehmen, auch wenn ihr dynamischer Bereich

oft eingeschränkter ist. Aber dies wird durch den Vorteil wettgemacht,

daß sie die Informationen nicht nur über einen Punkt

(Küvette) liefern, sondern bildgebend in zwei Dimensionen (x,y),

oder in drei und mehr Dimensionen (x,y,z,t oder Konzentration) sind.

Information über mehrere Wellenlängenbereiche oder sogar echte

spektrale Information erhält man durch Fourier-Analyse von Bildserien

9 . Dadurch wird das Arbeiten mit fünf oder mehr Fluoreszenzmarkern

möglich. Einige der Parameter zur Charakterisierung des

physiologischen Gesamtzustands der lebenden Zelle sind in Tabelle

1 wiedergegeben. Die meisten der neuen Techniken bringen die

deutlichsten Verbesserungen der Bildqualität mit ungefärbten Proben,

sie sind also besonders gut für lebende Zellen geeignet.

Anzeige

Abb. 5: Schwenkbare

Videomikroskop-Anordnung

mit elektromechanisch

verstellbarem

Mikroskopobjektiv

(Hexapod-Anordnung)

zur Blutflußmessung

am Nagelfalz.

Die Finger des

Probanden können

mit Hilfe einer Peltier-

Temperiervorrichtung

definierten thermischen

Reizen ausgesetzt

werden. Bild:

TechnoTrans e.V.

Die Einführung des Green Fluorescent Protein (GFP) als Expressionsmarker

ist eine der wichtigsten Bereicherungen für die dynamische

Lichtmikroskopie. 10 Damit kann die zeitliche Dynamik spezifischer

Proteine nicht nur in bezug auf ihre Synthese, sondern auch als

Marker für Organellen und andere subzelluläre Strukturen in vivo

untersucht werden. In Kombination mit der digitalen Lichtmikroskopie

kann GFP in Studien zum Protein-Sorting und Vesikeltransport

eingesetzt werden. 11 Bei Verwenden verschiedener spektraler GFP-

Varianten können in der lebenden Zelle die gemeinsame Verteilung

und die Interaktion zwischen zwei Proteinspezies mit der FRET-

Technik (fluorescence resonance energy transfer) aufgeklärt werden.

Kennziffer 15 LW 02 oder www.biocom.de Info ordern?

|transkript LABORWELT Nr. II/2001 | 11


R E P O R T

Verbesserungen der Optik, modulare Bauweise und Quantifizierbarkeit

vieler Verfahren durch Echtzeit-Bildverarbeitung haben die Lichtmikroskopie

in den vergangenen zwanzig Jahren zu einer der modernsten

und aussagekräftigsten Methoden der Biologie gemacht.

Man spricht von einer Renaissance der Lichtmikroskopie, die durch

eine Vielzahl neuer optischer und elektronischer Methoden repräsentiert

wird. Diese elektronische Lichtmikroskopie wird in Zukunft

weiter an Bedeutung gewinnen, weil sie die Brücke von der mikroskopischen

Morphologie zur Biochemie, zur Molekularbiologie und zur

Physiologie schlagen kann. Die elektronische Lichtmikroskopie erlaubt

direkte und integrative Untersuchungen der Komplexität der

lebenden Zelle in ihrem momentanen Zustand. Dieses Forschungsgebiet

könnte als „Cellomics“ neben „Genomics“ und „Proteomics“ das

nächste heiße Thema der Lebenswissenschaften werden. So ist bei den

großen Herstellern bereits zu beobachten, daß die Mikroskopentwicklung

entsprechend den neuen Einsatzgebieten in Richtung „Life

cell imaging stations“ geht und daß die Einrichtung von Zentren wie

dem Rostocker Zentrum für digitale Mikroskopie der lebenden Zelle

im Trend liegt.

News

Canberra-Packard firmiert in

Packard BioScience GmbH um

Seit dem 1. April 2001 ist nun auch der neue Name Packard Bio

Science GmbH in Deutschland gültig. Der ehemalige Zusammenschluß

aus Canberra und Packard ist durch den Wechsel der Canberra-Gruppe

aufgehoben worden. Damit trägt Packard BioScience

weiterhin der neuen Ausrichtung hinsichtlich Produkten und Zielmärkten

Rechnung.

Die kürzliche Integration der

Packard BioChip Technologies

steht ebenso für die Ausrichtung

zur Biotechnologie und den Life

Dank

Die Autoren danken für die finanzielle Förderung der Entwicklung

videomikroskopischer Techniken der DFG (Innovations-Kolleg INK-

27 und Schwerpunktprogramm Neue mikroskopische Methoden),

Hamamatsu Photonics K.K., Japan, dem Ministerum für Bildung,

Wissenschaft und Kultur Mecklenburg-Vorpommern, und dem BMBF.

Literatur

1. D. Shotton, The current renaissance in light microscopy. I. Dynamic studies of

living cells by video enhanced contrast microscopy. Proc Roy Microsc Soc 22, 37-47.

(1987).

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contrast optical microscopy. Ann Rev Biophys biophys Chem 14, 265-290.

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Press, New York, 1997).

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in Biology. A Practical Approach, 2 nd Ed., A. J. Lacey, Ed., (Oxford University Press,

1999) 73-149.

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squid axoplasm: Evidence for an active role of microtubules in cytoplasmic transport

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7. D. G. Weiss, V. P. Tychinsky, W. Steffen, A. Budde (2000) Digital light microscopy

techniques for the study of living cytoplasm. Chapter 12 in: Image Analysis: Methods

and Applications. Ed., D.-P. Häder (ed.). CRC Press, Boca Raton, 209-239

8. D. G. Weiss, Videomicroscopic measurements in living cells: Dynamic determination

of multiple end points for in vitro toxicology. Molec Toxicol 1, 465-488, (1987).

9. R. Gemperlein, What can you do with a complex color stimulus. Appl Optical Engin

to the Study of Cellul Pathol 2, 99-119. (1999).

10. M. Chalfie, S. Kain, GFP, Green Fluorescent Protein: Strategies and Applications.

(John Wiley and Sons, New York, 1996).

11. J. A. Steyer, W. Almers, Tracking single secretory granules in live chromaffin

cells by evanescent-field fluorescence microscopy. Biophys J 76, 2262-2274. (1999).

Korrespondenzadresse

Prof. Dr. Dieter G. Weiss

Lichtmikroskopie-Zentrum

Institut für Zellbiologie und Biosystemtechnik

Universität Rostock

D-18051 Rostock

Tel.: 0381-498 1919, Fax: 0381-498 1918

eMail: dieter.weiss@biologie.uni-rostock.de

Science-Bereichen wie die Erweiterung des Produktprogramms.

Dieses ist jetzt optimal auf diese Märkte und deren Applikationen

abgestimmt. Somit bietet Packard BioScience weltweit als eine der

ersten Firmen ein Produktprogramm, das nicht nur aus aufeinander

abgestimmten Systemen inklusive der Verbrauchsmaterialien

besteht, sondern auch die Applikationen und deren Optimierung

durch technisches „Know-how“ unterstützt. So könnenzum Beispiel

die Systeme für die radioaktive und nichtradiaoktive Messungen

ideal den Bedürfnissen etwa in der Umweltanalyse adaptiert

werden.

Auch im „Liquid Handling“ sind nicht nur für die Standard-

Verfahren im Laborbereich, sondern speziell auch für die komplexen

Technologien der

DNA- und Proteinanalyse

optimale Lösungen

vorhanden. Besonders

für den Einsatz im

Forschungsbereich

oder im DDT-Screening

bietet Packard

BioScience neben den

erforderlichen Lösungen

zur Automatisierung,

auch diverse Testverfahren wie beispielweise BRET exklusiv

an. Für den Anwender erhöht sich dadurch sowohl die Effizienz bei

den Applikationen, als auch deren Spezifität.

Auch die neue Linie der Produkte zur Be- und Verarbeitung von

Biochips ermöglicht dem Anwender die komplette Lösung. Von der

Präparation der Proben über die automatisierte Herstellung, der

Auswertung mit konfokalen Scannern bis hin zur Dokumentation

und Auswertung der Daten mit dem entsprechenden Softwaremodul

kann er sich nun für eine „One Hand“-Lösung entscheiden.

Weitere Informationen

Packard BioScience GmbH

Robert-Bosch-Str. 32

D-63303 Dreieich

Tel.: 06103-385-151, www.packardbioscience.com

12 | Nr. II/2001 |transkript LABORWELT


R E P O R T

Mikrobiologie

Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung

in der Gastrointestinalen Mikrobiologie

DR. ANDREAS SCHWIERTZ, DEUTSCHES INSTITUT FÜR ERNÄHRUNGSFORSCHUNG, BERGHOLZ-REHBRÜCKE

Die Zusammensetzung einer komplexen bakteriellen Lebensgemeinschaft, wie sie der Gastrointestinaltrakt

darstellt, wird in der Regel durch die Erfassung der Lebendzellzahl bestimmt. Auf dieser Basis

kann ein Bakterium nur nachgewiesen werden, wenn es kultivierbar ist. Da bei weitem nicht alle

Bakterien auf den herkömmlichen Nährmedien angezüchtet werden können, werden schon seit

längerem alternative Methoden zu ihrer Identifizierung und Quantifizierung entwickelt und eingesetzt

– dazu zählt die Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung (FISH). Diese eröffnet die Möglichkeit,

spezifische Nukleinsäuresequenzen (RNA- oder DNA-Sequenzen) bis auf Einzelzellniveau nachzuweisen

und das sie enthaltende Bakterium im biologischen Präparat „in situ“, also direkt vor Ort, zu

lokalisieren. Die Technik erlaubt schnelle, sichere und aussagekräftige Ergebnisse bei der Beurteilung

mikrobieller Ökosysteme. Zu Beginn der neunziger Jahre wurde die FISH-Technik erstmals zur

Untersuchung bakterieller Lebensgemeinschaften eingesetzt und ist seither stetig weiterentwickelt

worden. Das Methodenspektrum umfaßt mittlerweile Anwendungen zur Beschreibung der Diversität

eines Ökosystems, Quantifizierung ausgewählter Organismen und Erfassung bakterieller Aktivitäten.

Key Words: Hybridisierung, gastrointestinal microflora, in situ, Gensonden

Sondenmarkierung

Fluorochrome Farbstoffe, wie Acridin-Orange

oder DAPI (4‘6-Diamidino-2-phenylindol)

werden schon seit einiger Zeit in der

Mikrobiologie zum Nachweis und zur Auszählung

der Gesamtzellzahl von Bakterien

in ihrem natürlichen Habitat eingesetzt. Der

Einsatz dieser Farbstoffe allein ermöglicht

jedoch weder die Identifikation der untersuchten

Bakterien noch Aussagen zu ihrer

Lebensfähigkeit oder metabolischen Aktivität.

Erst die Kombination fluoreszierender

Farbstoffe mit der in situ-Hybridisierung

erlauben es – allein oder kombiniert mit

anderen molekularbiologischen Techniken

– Aussagen zur Zusammensetzung und

Aktivität der untersuchten Populationsgemeinschaften,

wie etwa im humanen Gastrointestinaltrakt

oder in Biofilmen auf ausgewählten

Oberflächen, zu treffen.

Die molekulare Grundlage der Fluoreszenzin

situ-Hybridisierung (FISH) ist die Fähigkeit

einzelsträngiger Nukleinsäuren mit

komplementären Partnern, wie etwa rRNA

oder DNA, zu binden (hybridisieren). Die

eingesetzten Oligonukleotide (Gensonden)

müssen markiert werden, um die Bindung

an die Zielsequenz nachweisen zu können.

Hierzu werden fluoreszierende Farbstoffe

an das 5‘-Ende der Gensonde gebunden. Bei

geeigneten Versuchsbedingungen binden die

so markierten Gensonden stabil an ihre Zielregion.

Für jede entwickelte und zum Einsatz

kommende Gensonde müssen diese Bedingungen

in bezug auf etwa den Salzgehalt

des Hybridisierungspuffers oder die Hybridisierungstemperatur

optimiert werden. Solche

Zielregionen befinden sich im allgemeinen

auf den ribosomalen Ribonukleinsäuren

(rRNA) der zu untersuchenden Bakterien

– es handelt sich um die 16S- und die 23S-

Mehr Informationen ordern? Kennziffer 16 LW 02 oder www.biocom.de

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|transkript LABORWELT Nr. II/2001 | 13


R E P O R T

Abb. 1: Prinzip der Fluoreszenz-in situ-

Hybridisierung

rRNA. Die 16S-rRNA eines Bakteriums besteht

durchschnittlich aus 1.500 Nukleotiden

gegenüber etwa 3.000 Nukleotiden der

23S-rRNA. Diese Moleküle haben den Vorteil,

daß sie sich aufgrund ihrer lebenswichtigen

Funktionen im Laufe der Evolution

nur wenig verändert haben und deshalb

geeignet sind, als diagnostische Marker herangezogen

zu werden. Ein weiterer Vorteil

dieser Moleküle ist ihre Anzahl in den Zellen.

So können in einer Bakterienzelle mehr

als 10 4 Ribosomen und somit ebensoviele

16S- und 23S-rRNA-Moleküle vorliegen.

Aufgrund der seit Jahren gewonnenen Daten

zur Phylogenie der Bakterien, die überwiegend

auf der Analyse ihrer 16S- bzw.

23S-rRNA-Sequenzen beruhen, existiert bereits

eine große Menge an Datenmaterial.

Dieses ermöglicht es, spezifische Gensonden

zum Nachweis von Bakterien mittels geeigneter

Softwareprogramme zu entwickeln, wie

es etwa mit dem Programm ARB der TU

München (http://www.mikro.biologie.tumuenchen.de/)

möglich ist. Allein in den

frei zugänglichen Datenbanken wie Genbank

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov), EMBL

(http://www.ebi.ac.uk), der De Wachter-

Datenbank in Antwerpen (http://rrna.uia.

ac.be) und dem ribosomalen Datenbank-Projekt

in den USA (RDP; http://rdpwww.

life.uiuc.edu/index2.html) findet man mehr

als 10.000 16S-rRNA-Sequenzen, und ihre

Zahl steigt ständig. Ausgehend von diesen

Daten lassen sich auf den rRNAs Regionen

bestimmen, die es ermöglichen, Mikroorganismen

auf den unterschiedlichen taxonomischen

Ebenen wie Domäne, Familie, Gattung

oder Spezies zu identifizieren.

Anwendung

Beim Nachweis von Bakterien mittels FISH

werden spezifische Gensonden, die in der

Regel 15 bis 25 Nukleotide lang und komplementär

zu einer ausgewählten Region auf

der Ziel-rRNA sind, in besonders vorbereitete

Zellen geschleust. Die Zellen werden

hierzu mittels Paraformaldehyd- bzw. Ethanol-Behandlung

fixiert und permeabilisiert

und die Zielregionen auf der rRNA somit

zugänglich gemacht. Findet die mit einem

fluoreszierenden Farbstoff [Fluorescein, Texas

Red, Indocarbocyanin (cyl3-7)] markierte

Gensonde ihre Zielsequenz, so hybridisiert

sie daran. Zellen, in denen die Sonden

an ihre Zielsequenz gebunden haben, können

aufgrund ihrer Fluoreszenz nachgewiesen

werden. Der Nachweis erfolgt hierbei

mittels Epifluoreszenzmikroskopie. In unserer

Arbeitsgruppe stehen zu solchen Dokumentationszwecken

zwei Axioplan 2-Mikroskope

der Firma Zeiss mit einer 12bit-

Videokamera zur Verfügung. Die Bilder

können anschließend mit dem Software-Paket

KS400 (Zeiss, Jena) analysiert und bearbeitet

werden. Eine weitere Möglichkeit ist

die Laser-Scanning-Mikroskopie, die eine

3D-Darstellung des zu untersuchenden Objektes

erlaubt. Durch den Einsatz von Gensonden,

die mit unterschiedlichen Fluroreszenzfarbstoffen

markiert sind, ist es mit entsprechenden

optischen Filtern möglich, verschiedene

Bakterienspezies in ein- und derselben

Probe nachzuweisen (Abb. 1). Die

Technik der FISH wird bereits von einer

Vielzahl mikrobiell ausgerichteter Arbeitsgruppen

zur Beantwortung ihrer spezifischen

Fragestellungen in dem betreffenden

Habitat eingesetzt. Unter anderem wurde

die mikrobielle Diversität des humanen Intestinaltraktes

im Rahmen eines EU-Projektes

(FAIR-CT97-3035) mit Hilfe von Gensonden

untersucht. In diesem Projekt wurden

verstärkt gruppen- bzw. clusterspezifische

Oligonukleotidsonden entwickelt und neue

Erkenntnisse in bezug auf die Zusammensetzung

der Gastrointestinalflora gewonnen.

Neueste Forschungsvorhaben zielen darauf

ab, auch die Anwendung der sogenannten

„molecular beacons“ und der Microarrayund

Biochip-Technologie zur Erfassung der

humanen Intestinalflora nutzbar zu machen.

Molecular beacons – zu deutsch: molekulare

Leuchtfeuer – sind kurze Oligonukleotide,

die eine Haarnadelstruktur ausbilden. An

das 5‘-Ende dieser Oligonukleotide wird eine

fluoreszierende Substanz gebunden, während

am 3‘-Ende ein nicht-fluoreszierender

Quencher plaziert wird. Unter geeigneten

Hybridisierungsbedingungen binden sie an

ihre Zielregion, verlieren ihre Haarnadelstruktur

und fluoreszieren. In Kombination

mit den sogenannten DNA-„Biochips“ oder

-Microarrays ist es möglich, eine Vielzahl

von Bakterien simultan zu detektieren. Hierzu

werden ausgesuchte „molecular beacons“

an eine Oberfläche gebunden und anschließend

eine Probe aus dem Ökosystem aufgebracht.

Bindet nun die Zielregion eines Bakteriums

an einen spezifischen „molecular

beacon“, so fluoresziert dieser. Erste Versuche

hierzu werden an der TU München in

der Arbeitsgruppe von PD. Dr. M. Wagner

in Kooperation mit der MWG-Biotech AG

durchgeführt (http://www.mikro.biologie.

tu-muenchen.de/microbio/wagner/index.

html). Diese hoffnungsvollen Ansätze sind

noch in ihrer Anfangsphase und haben bisher

keine Marktreife erlangt.

Bedenkt man die physiologische Mannigfaltigkeit

der Bakterien, so ist ersichtlich, daß

deren Nachweis noch keine Information über

ihre tatsächliche Funktion und insbesondere

Aktivität liefert. In den vergangenen fünf

Jahren wurden bereits zahlreiche Methoden

zum Nachweis der Genexpression in Kombination

mit FISH entwickelt. Eine Möglichkeit

ist etwa die Fusion von zu untersuchenden

Genen mit Reportergenen, welche anschließend

im Fluoreszenzmikroskop nachgewiesen

werden können. Ein Beispiel für

einen derartigen Reporter ist das Grün Fluoreszierende

Protein (GFP). Bakterien, die so

manipuliert worden sind, können wieder in

das Ökosystem eingebracht und auf die zu

untersuchende Genexpression im Fluoreszenzmikroskop

hin kontrolliert werden.

Weiterhin kann die Aktivität ausgewählter

Enzyme und indirekt ihre Genexpression

mittels fluoreszierender Substrate nachgewiesen

werden. Hierfür werden ausgewählte

Substrate mit fluoreszierenden Substanzen

kovalent verbunden: Wenn das Substrat

von der Bakterienzelle aufgenommen und

verstoffwechselt wird, akkumuliert die fluoreszierende

Substanz in der Zelle. Ein Beispiel

hierfür ist der Nachweis der β-Galaktosidase-

und β-Glucoronidase-Aktivität in

Verbindung mit 4-Methylumbelliferyl-β-D-

Galactosid bzw. -Glucoronid als Substrat,

dessen Produkt in der Zelle akkumuliert

14 | Nr. II/2001 |transkript LABORWELT


R E P O R T

Kennziffer 17 LW 02 oder www.biocom.de Info ordern?

und zu einer blau fluoreszierenden Bakterienzelle führt 1 . Diese

Untersuchungen erlauben jedoch nur ein Erfassen von Mikroorganismen,

die das markierte Substrat verwerten können.

Oft ist es jedoch wünschenswert, Aussagen über die Bildung von

bakteriellen Produkten in einem Ökosystem treffen zu können. Eine

Vielzahl von Forschergruppen hat hierzu methodische Ansatzpunkte

erarbeitet 2-4 . Zwei solcher Ansatzpunkte sollen hier kurz vorgestellt

werden. Der Nachweis interessanter metabolischer Fähigkeiten

einer Bakterienspezies kann beispielsweise über die in situ-Detektion

spezifischer mRNAs erfolgen. Die zu untersuchende mRNA wird

hierfür mit Hilfe der RT-PCR in-situ amplifiziert und anschließend

mittels FISH oder fluoreszenzmarkierten Primern nachgewiesen 2 .

Eine weitere, indirekte Möglichkeit bietet der Nachweis von Bakterien

mit besonderen metabolischen Fähigkeiten durch den Einsatz von

speziesspezifischen Gensonden. Mit diesem Ansatz ist es möglich

abzuschätzen, welche Bedeutung spezielle Bakterien im Ökosystem

haben, da ihr zahlenmäßiges Vorkommen genau erfaßt werden kann 3 .

Die Anwendung von Gensonden erlaubt jedoch nicht die Unterscheidung

lebender, aktiver Zellen von toten. Um solche Fragen

mittels FISH beantworten zu können, müssen alternative Methoden

eingesetzt werden. Eine Möglichkeit, die Lebensfähigkeit der untersuchten

Bakterien mit FISH zu erfassen, ist die Verwendung des

sogenannten LIVE/DEAD -Kits (Molecular Probes, Eugene, Oregon).

Grundlage des Kits ist, daß lebende Zellen eine intakte Cytoplasmamembran

aufweisen, während diese bei toten Zellen geschädigt

ist. Hier erfolgt der Nachweis nicht aufgrund einer spezifischen

Zielregion, sondern anhand von morphologischen Merkmalen. Bakterien

mit einer intakten Cytoplasmamembran fluoreszieren grün,

Bakterien mit beschädigter Membran rot (Abb. 2). Dieses System ist

bereits erfolgreich zur Bestimmung der Vitalität von Bakterien im

Gastrointestinaltrakt eingesetzt worden 5 .

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Grenzen der FISH

Ein Problem der FISH ist, daß die bisher entwickelten Methoden

nicht universell anwendbar sind, sondern dem jeweiligen Probenmaterial

und den darin befindlichen Zellen angepaßt werden müssen.

Das betrifft unter anderem die notwendige Fixierung und

Permeabilisierung des Probenmaterials. Die Schritte zur Fixierung

des Materials sind abhängig von der Zusammensetzung der Zellwand

der zu untersuchenden Bakterien. So müssen Gram-negative

Bakterien anders fixiert werden als Gram-positive 6 . Wird trotzdem

Abb. 2: Live/Dead-Kit der Firma Molecular Probes

|transkript LABORWELT Nr. II/2001 | 15


R E P O R T

kein Signal mit dem Zielorganismus detektiert,

so ist der eingeschränkte oder nicht

mögliche Zugang der Gensonde zu ihrer Zielsequenz

eine mögliche Erklärung. Dies kann

einerseits durch die Impermeabilität der Zellwand

bedingt sein oder an der Blockierung

der Zielsequenz durch andere Komponenten

der Ribosomen liegen. Bisher existiert

nur eine Studie zur Zugänglichkeit der 16SrRNA

für Gensonden 7 , in der gezeigt werden

konnte, daß die Regionen der 16S-rRNA für

Sonden unterschiedlich gut zugänglich sind.

Hieraus wird ersichtlich, daß die Anzahl der

zugänglichen spezifischen Bereiche auf der

16S-rRNA limitiert ist. Eine Möglichkeit, solche

Bereiche zugänglich zu machen, ist der

Einsatz von sogenannten Helfer-Oligonukleotiden.

Bei dieser Technik werden zusätzlich

zu den markierten Gensonden unmarkierte

Oligonukleotide eingesetzt, die an benachbarte

Bereiche der Zielregion binden und

einen besseren Zugang für die Gensonde

bewirken 8 . Aufgrund der begrenzten Größe

der 16S-rRNA wird in Zukunft verstärkt auf

die 23S-rRNA zurückgegriffen werden. Erste

Bemühungen sind bereits unternommen

worden (RDPII, ARB). Allerdings ist die Datenmenge

insbesondere in bezug auf Spezies

aus dem Intestinaltrakt immer noch begrenzt.

Ein nicht unerhebliches Problem der FISH ist

ihr Mangel an Sensitivität. Dies ist wohl darauf

zurückzuführen, daß die Anzahl der

rRNA-Zielmoleküle in einer Zelle in ihrem

natürlichen Habitat geringer ist als in Reinkultur.

So können diverse Faktoren, wie Substratmangel,

einen Einfluß auf die Kopienzahl

der rRNA-Moleküle in einer Zelle haben

9 . Deshalb überrascht es nicht, daß die

Intensität der Fluoreszenzsignale von Zellen

im natürlichen Ökosystem geringer ist als in

Reinkultur. Zusätzlich können unspezifische

Bindungen an feste Bestandteile wie etwa

Fasern die Detektion beeinflussen. Deshalb

wird versucht, durch den Einsatz alternativer

Markierungstechniken die Sensitivität zu

steigern, wozu es in jüngerer Zeit zahlreiche

technische Entwicklungen gab. Dazu zählt

die Entwicklung neuer Fluoreszenzfarbstoffe

(http://pingu.salk.edu/fcm/fluo.html),

der Versuch, das Ausbleichen der Proben zu

verhindern (SlowFADE Antifade Kit, Molecular

Probes, Leiden), und der Einsatz von

Amplifikationssystemen (TSA, NEN Research

Products). Bei letzterem wird Meerrettich-Peroxidase

kovalent an eine Gensonde

gebunden und anschließend über einen

geeigneten Reporterassay nachgewiesen.

Dies kann zu einer erheblichen Erhöhung

des spezifischen Fluoreszenzsignals führen 10 .

Obwohl diese Methode eine Signalverstärkung

bewirkt, tritt mitunter das Problem auf,

daß der Markierungskomplex aufgrund seiner

Größe nicht an seine Zielregion in der

Zelle gelangen kann.

Wie bereits erläutert, kann die FISH eine sehr

wirkungsvolle Methode zur Bakterienidentifizierung

und -quantifizierung sein. Gleichwohl

ist das manuelle Auszählen der fluoreszierenden

Zellen am Mikroskop sehr zeitaufwendig

und bedarf geschulten Personals.

Ziel muß es deshalb sein, schnelle computergestützte

Auswertungen zu entwickeln. Erste

Arbeiten hierzu erlaubten die Unterscheidung

von Bakterienzellen sowie die Erfassung

der jeweiligen Fluoreszenzintensität 11 .

Alternativ zu der manuellen Auszählung

wird schon seit längerer Zeit von vielen Arbeitsgruppen

die Durchfluß-Cytometrie eingesetzt.

Die Durchflußzytometrie stellt ein

optisches Meßsystem für einzelne in einem

Flüssigkeitsstrom fokussierte Partikel dar

und basiert auf dem Prinzip der quantitativen

Fluorochromierung, das heißt der Färbung

verschiedener Komponenten mit geeigneten

Fluorochromen. Im Falle der Untersuchung

von Bakterien in ausgewählten

Ökosystemen erfolgt diese Färbung mit den

spezifischen Gensonden, die fluoreszierende

Farbstoffe tragen. Diese Methode hat den

großen Vorteil, daß einzelne, spezifisch markierte

Zellen sehr schnell und genau erfaßt

werden können. Ihr Einsatz in der intestinalen

Mikrobiologie war jedoch bisher aufgrund

der zahlreichen in Faeces enthaltenen Partikel,

an die der eingesetzte Fluoreszenzfarbstoff

bindet, nicht möglich. Neben der Durchfluß-Cytometrie

wird verstärkt die konfokale

Lasermikroskopie in Verbindung mit fluoreszenzmarkierten

Gensonden eingesetzt. Sie

erscheint ideal, um die Struktur der divers

zusammengesetzten intestinalen Mikroflora

aufzuklären, da bisher nur wenig über die

räumliche Verteilung der einzelnen Populationsgruppen

bekannt ist.

Ausblick

Die jüngsten Entwicklungen und Anwendungen

der FISH-Technik haben zu einem verbesserten

Überblick über die humane Intestinalflora

geführt. So ist eine Vielzahl von Gensonden

zum Nachweis von Bakterien auf

unterschiedlichen taxonomischen Ebenen

publiziert worden. In den nächsten Jahren

wird die technische Entwicklung verstärkt

auf die Automatisierung des Einsatzes dieser

Sonden hinzielen. Die ersten kommerziellen

Kits zum Nachweis von intestinalen Bakterien

mittels FISH werden von der niederländischen

Firma Ribotechnologies (http://

www.ribotechnologies.com/) angeboten.

Zusätzlich werden vermehrt die sogenannten

„molecular beacons“ und die Biochip-

Technologie bei der Erfassung der humanen

Intestinalflora zum Einsatz kommen. Mit diesen

Methoden wird ein noch schnellerer Nachweis

von Bakterien möglich sein.

Literatur

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Microbiol 64: 1018-23.

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Schleifer, K. H. (1994) Microbiology 140: 2849-58.

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I., Ludwig, W., and Amann, R. (1998) Appl Environ

Microbiol 64: 4973-82.

[8] Fuchs, B. M., Glockner, F. O., Wulf, J., and Amann,

R. (2000) Appl Environ Microbiol 66: 3603-7.

[9] Amann, R. I., W. Ludwig, and K.-H. Schleifer

(1995) Microbiol Rev 59: 143-169.

[10] Schonhuber, W., Fuchs, B., Juretschko, S., and

Amann, R. (1997) Appl Environ Microbiol 63: 3268-73.

[11] Wilkinson, M. H., Jansen, G. J., and van der

Waaij, D. (1994) Trends Microbiol 2: 485-9.

Korrespondenzadresse

Dr. Andreas Schwiertz

Gastrointestinale Mikrobiologie

Deutsches Institut für Ernährungsforschung

Arthur-Scheunert-Allee 114-116

D-14558 Bergholz-Rehbrücke

Tel.: 033200-88402

Fax: 033200-88407

eMail: andy@www.dife.de

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16 | Nr. II/2001 |transkript LABORWELT


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4D-Mikroskopie

Konfokale Bildaufnahme am

Lichtmikroskop

ANNELIESE SCHMAUS, KLUGHAMMER GMBH, MARKT INDERSDORF

Die Mikroskopie hat in den vergangenen zwanzig Jahren umfangreiche technologische Neuerungen erfahren.

Eine, die konfokale Mikroskopie, hat es Biologen, Physikern und Technikern erst ermöglicht, eine vollkommen

neue Dimension in ihre Ansicht der biologischen Zellen und Halbleiter einzubringen. War bis dahin nur die

Betrachtung eines Objektes mit scharfen und unscharfen Bereichen in einem Bild möglich, so erlaubt das

konfokale Mikroskop erstmals die Trennung scharfer und unscharfer Bereiche. Der Hauptvorteil des konfokalen

Mikroskops liegt darin, daß alle unscharfen Bereiche in einem Bild ausgeblendet werden. Diese Trennung

ermöglicht es, die Z-Achse des Mikroskops schrittweise zu verfahren und nach jeder Veränderung der Z-Achse

ein scharfes Bild aufzunehmen. Dadurch entsteht ein Bildstapel. Ist das Mikroskop mit einem motorisierten

Tisch für den Verfahrweg in Z-Richtung ausgerüstet, so sind der Anfang, das Ende und die Abstände der

einzelnen Bilder voneinander bekannt. Diese Informationen ermöglichen eine exakte digitale 3D-Rekonstruktion

des Objektes und liefern genaue Meßwerte aus dem dreidimensionalen Raum. Diese 3D-Rekonstruktion

ist der Hauptgrund für den Einsatz konfokaler Mikroskope.

Nipkow- und

Laser Scanning-Prinzip

Bisher wurden hauptsächlich

zwei Methoden in der konfokalen

Mikroskopie eingesetzt. Bei

der ersten Methode handelt es

Abb 1: Funktionsweise eines

Konfokalen Laser-Scanning-

Mikroskops. © Zeiss

sich um das sogenannte Nipkow-Prinzip.

Bei diesem Prinzip

rotiert eine Scheibe mit vielen

Löchern. Das Ergebnis ist

ein konfokales Bild, welches mit

Hilfe der rotierenden Scheibe

ermittelt wird.

Bei der zweiten Methode handelt

es sich um das Konfokale

Laser-Scanning-Mikroskop

(CLSM). Bei diesem fällt ein Laserstrahl

durch eine kleine Öffnung

und scannt die Fokusebene

ab. Die ermittelte Lichtintensität

wird an einen Photomultiplier

weitergegeben,

und das Ergebnis ist auf dem

Computerbildschirm dargestellt.

Das bedeutet: je weiter

sich das Objekt außerhalb des

Fokusebene befindet, umso

schwächer wird die Lichtintensität.

In einem korrekt eingestellten

konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop

werden nur

die Bereiche sichtbar dargestellt

die sich exakt in der Fokusebene

befinden (Abb. 1).

Der Grund, warum diese aufwendige

Technik sogenannte

„Pinholes“ (die Löcher) und

den Laser benötigt, ist einfach:

Bislang stand keine alternative

Technik zur Verfügung. Denn

die konventionelle Mikroskopbeleuchtung

war bisher nicht

in der Lage, genügend Licht

durch die äußerst kleinen Löcher

zu schicken. Das Laserlicht

wird demnach nur aufgrund

seiner Helligkeit eingesetzt. Die

Position der Löcher muß mikrometergenau

erfolgen, was

die Fertigungskosten bisher

bekannter konfokaler Mikroskope

erhöht.

Abb 2: Konfokales Grid-System

OptoLine mit Zeiss-Mikroskop

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Leistungsstark – CGS

OptoLine konfokales

Mikroskop

Das konfokale Mikroskop OptoLine

läutet eine neue Generation

in der Konfokalmikroskopie

ein. Jetzt hat jeder, der ein

wissenschaftliches Mikroskop

besitzt, Zugang zu konfokaler

Bilderzeugung in Echtzeit-Darstellung

und Forschungsquali-

Abb 3: Prinzip

der Fokussierung

mit dem

Rochi-Gitter

|transkript LABORWELT Nr. II/2001 | 17


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B L I T Z L I C H T

A

Abb 4: A. Ronchi-Gitter außerhalb der Fokusebene.

B. Ronchi-Gitter im Fokus

tät. Zusätzlich zu den bisher bekannten

Methoden wie Confocal Laser Scanning

Microscope (CLSM) und Nipkow Konfokales

Mikroskop gibt es nun eine dritte

Variante, das Konfokale Grid-System (CGS)

(Abb. 2).

OptoLine kann an viele bereits vorhandenen

Hellfeld- und Fluoreszenzmikroskope

adaptiert werden. Es arbeitet in Verbindung

mit einem PC-Arbeitsplatz und einer

CCD-Kamera. Das System verwandelt wissenschaftliche

Auflicht- und Inversmikroskope,

zum Beispiel von Leica, Nikon,

Olympus und Zeiss, in ein vollwertiges

Konfokalmikroskop. Mit den ermittelten

Bilddaten werden optische Sektionierung,

Bildstapelverarbeitung für 2D- und 3D-

Rendering ermöglicht. OptoLine ist damit

eine weniger kostenintensive Lösung für

industrielle und biologische Anwendungen

der Konfokalmikroskopie, für Hellfeldund

Fluoreszenzmikroskopie.

Das Prinzip

Der sogenannte OptoLine-Slider wird im

Strahlengang des Mikroskops installiert.

Hierbei wird eine vorhandene Öffnung des

Mikroskopes verwendet, oder es wird modifiziert.

Das Objektiv dient als Projektions-

sowie auch als Abbildungsoptik. Ein

eindimensionales Streifenbild (Gitter) mit

einfacher Ortsfrequenz wird auf das Objekt

projiziert und bildet die Objektoberfläche

umgekehrt auf dem Sensor der CCD-

Kamera ab. Hierbei kommt das sogenannte

Ronchi-Ruling-Prinzip zum Einsatz (Abb.

3).

Das Objekt kann weiterhin bei entsprechend

eingestelltem Strahlteiler durch die

Okulare betrachtet werden. Die Aufnahme

der konfokalen Schichtbilder wird am Monitor

in Echtzeit dargestellt. Bei dem Ver-

B

fahren des konfokalen Gittersystems wird

die geringe Tiefenschärfe des Auflichtmikroskops

ausgenutzt (Abb. 4).

Nur die Objektbereiche, die innerhalb der

Fokusebene liegen, werden scharf abgebildet,

die unscharfen Bereiche dagegen nicht.

Das Verstellen des Objekttisches entlang

der Z-Achse ermöglicht die Aufnahme mehrerer

Bildschichten. Die Aufnahme der

Schichten wird automatisch über eine Software

gesteuert. Die Art und Weise wie man

zu scharfen Bild kommt, unterscheidet sich

damit von der eines traditionellen Laser-

Scanning-Mikroskops. Die Ergebnisse sind

jedoch mit denen eines CLSM direkt vergleichbar.

Die laterale Auflösung eines

CLSM ist geringfügig besser, die axiale Auflösung

ist aufgrund der Eigenschaften der

Objektive gleich.

Anders als die konventionelle Mikroskopie

verarbeitet OptoLine nur Bilddaten, die

sich in der Fokusebene befinden, ohne Berücksichtigung

der unscharfen Bereiche.

Die Bilder werden nach einem patentierten

Verfahren aufgenommen und miteinander

verrechnet. OptoLine verarbeitet inkrementale

Fokusebenen, genannt „optische

Schnitte“, die so fein einstellbar sind, wie

es die Stellvorrichtung des Mikroskops erlaubt.

Diese Schnitte werden über eine

CCD-Kamera auf dem Computermonitor

dargestellt und auf der Festplatte zur späteren

Bildverarbeitung gespeichert.

Mit der Fähigkeit, digitale optische Schnitte

zu erzeugen, bietet OptoLine eine Vielseitigkeit,

die ideal für die 3D-Darstellung

stark strukturierter Proben ist. Es können

nicht nur Dimensionen entlang der optischen

Achse direkt gemessen werden, sondern

es können auch Stapel der optischen

Schnitte für die Erzeugung von 3D-Modellen

einer Probe verwendet werden.

Schlußfolgerung

Der Erfinder des konfokalen Grid-Systems,

Tony Wilson von der Universität Oxford, sieht

in dem neuen System ein absolut innovatives

Verfahren, das ab sofort jedem Wissenschaftler

die Möglichkeit bietet, mit kostengünstiger

konfokaler Technik zu arbeiten.

Abb 6: oben: Zellen mit Lichtmikroskop aufgenommen.

unten: Zellen mit CGS OptoLine aufgenommen.

OptoLine erweist sich als wichtige Neuerung

in der Analyse von Objekten die eine

echte Tiefenverarbeitung und dreidimensionale

Analyse erfordern. Es erweist sich

als kostengünstiges, einfach zu bedienendes

System für die Aufnahme konfokaler

Bilder. OptoLine wird in zukünftigen Studien

ein wichtiges Mikroskopsystem darstellen.

Kontakt

klughammer gmbh

Anneliese Schmaus

Marketing Managerin

Strassbach 9

D-85229 Markt Indersdorf

Tel.: 08136-6011

Fax: 08136-7098

eMail: info@klughammer.de

www.klughammer.de

A

B

Abb 5: A. Pollen mit

Lichtmikroskop

aufgenommen.

B. Pollen mit CGS

OptoLine aufgenommen

Abb 7: Dreidimensionale Darstellung eines

konfokalen Stacks, aufgenommen mit CGS

OptoLine

20 | Nr. II/2001 |transkript LABORWELT


B L I T Z L I C H T

Bilddatenverwaltung

IM 1000 – eine auf individuelle

Bedürfnisse angepaßte Bilddatenbank

WOLFGANG BRÜHL, LEICA MIKROSYSTEME VERTRIEB GMBH, BENSHEIM

Mit dem professionellen Bildmanagement-System IM 1000 lassen sich Bilddaten komfortabel verwalten

und bearbeiten. Das uneingeschränkt netzwerktaugliche Datenbank-System arbeitet auf der Basis der

Standard-Software MS-Access ist kompatibel mit allen gängigen Office-Paketen und daher ohne großen

Lernaufwand zu bedienen. Es bietet eine Vielzahl von Export- und Bearbeitungsmöglichkeiten und auf

dieser Basis eine hohe Flexibilität – mehr als 25 verschiedene Dateiformate werden unterstützt. Da sich

IM 1000 aus 15 unabhängig voneinander funktionellen Modulen aufbaut, ist eine Anpassung an

spezifische Bedürfnisse möglich. Dieser Beitrag gibt eine kurze Übersicht über die verschiedenen Module

dieses leistungsfähigen Tools, das sich ideal mit Leica-Mikroskopen und den Leica-Digitalkameras

ergänzt.

Abb. 1: Modul Bildüberlagerung

Digitale Bildtechniken ziehen unaufhaltsam

auch in die Lebenswissenschaften ein. Insbesondere

für die Mikroskopie sind sie nicht

mehr wegzudenkende Hilfmittel, die einen

Überblick über die oft gewaltige Datenfülle

bei begrenztem Speichereinsatz gewährleisten.

Eine immer größere Rolle spielt daher

die Dokumentation und professionelle Verwaltung

dieser Bilddaten, zusammen mit einem

Berichtswesen, das wesentliche Informationen

zum gespeicherten Bildmaterial zur

Verfügung stellt. Darüber hinaus übernehmen

heute die Bilddatenbanken neben der

reinen Archivierungsfunktion oft weitere

Aufgaben, wie die Bildanalyse, die sie zu

einem leistungsfähigen Auswerte- und -informationssystem

machen.

Die Firma Leica bietet ein solches System an,

das sich sowohl in Computernetzwerken als

auch im Einzelnutzerbetrieb eine Vielzahl von

Möglichkeiten bietet. Diese lassen sich mittels

einzelner Bausteine zu einem System zusammenstellen,

das optimal auf die individuellen

Nutzerbedürfnisse abgestimmt ist – das Leica

IM 1000. Die Datenbank arbeitet auf Basis von

MS-Access und kommt damit dem Windowsgewohnten

Nutzer mit einer bekannten Oberfläche

entgegen, die in allen Funktionsbereichen

einheitlich gehalten ist, in mehreren Sprachen

zur Verfügung steht und benutzerspezifisch

angepaßt werden kann.

Bedienungskomfort bietet die sogenannter

„Splitter-Technik“, die das gleichzeitige An-

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|transkript LABORWELT Nr. II/2001 | 21


B L I T Z L I C H T

zeigen aller Daten ermöglicht, ohne sich durch

überlappende Fenster klicken zu müssen.

Thumbnails ermöglichen flüssiges Arbeiten

auch bei großen Bilddateien. Die Berichterstellung

erfolgt mit MS-Word, die Übergabe

von Meßwerten mit Excel. Zusätzlich ist das

Erstellen von Präsentationen im Powerpoint-

Format möglich. Das System ist hinsichtlich

Bild-Import und -Export flexibel und unterstützt

insgesamt 26 Dateiformate (Tab. 1).

Modul Bildmanager

Das Modul Bildmanager ermöglicht, Bilder

aus dem Archiv auf andere Datenträger auszulagern,

zu verschieben, zu kopieren, zu

mailen, zu extrahieren zu exportieren und zu

bearbeiten. Bilder lassen sich in gewünschter

Qualität und Größe als eMail-Beilage versenden

und nachbearbeiten.

Modul Berichterstellung

Dieser Baustein ermöglicht das automatisierte

Erstellen von MS-Word-Berichten mit Bildund

Textmaterial aus dem Leica-IM 1000-

Tab. 1: Systemvoraussetzungen

und unterstützte Dateiformate

System

Pentium II 266 MHz

> 64 MB RAM, 4MB Video RAM

1024x168

> 6 GB Festplatte

24 x CD ROM-Laufwerk

MS-Windows 95-98/NT (ab ServPack3)

MS WORD 97 für Berichte

unterstützte Bildformate

BMP Bitmap (*.bmp)

CAL CALS Raster (*.cal)

CMP LEAD (*.cmp)

CUR Windows Cursor (*.curl)

DIC Dicom (*.dic)

EPS PstScript Raster (*.eps)

FPX Kodak FLashPix (*.fpx)

FXS Winfax (*.fxs)

GIF CompuServe GIF (*.gif)

ICA IOCA (*.ica)

ICO Windows Icon (*.ico)

IMG GEM Image (*.img)

IMS Bitplane Imaris 3D Images/Viewer

(*.ims)

JPG JPEG (*.jpg)

MAC MacPaint (*.mac)

MSP Microsoft Paint (*.msp)

PCD Kodak PhotoCD (*.pcd)

PCT Macintosh Picture (*.pct)

PCX ZSoft PCX (*.pcx)

PNG Portable Networks Graphics (*.png)

PSD Adobe Photoshop 3.0 (*.psd)

RAS Sun Raster (*.ras)

TGA Targa (*.tga)

TIF TIFF (*.tif)

WMF Windows Metafile (*.wmf)

WPG Word Perfect (*.wpg)

Abb. 2: Modul Multifokus

Archiv. Bilder und dazugehörende Daten

werden dabei in benutzerdefinierte Vorlagen

oder aber in den laufenden Text eingebunden.

Die Thumbnail-Technik erlaubt ein zügiges

Arbeiten und Ausdrucken, da keine

Originalbilder von Word verwaltet werden

müssen.

Modul Mikroskopeinstellungen

einlesen

Dieses Modul speichert die Parameter des

angeschlossenen Mikroskops während des

Bildeinzugs. Die Werte werden bei der Bildakquisition

automatisch in Systemfelder abgelegt.

Die Felder werden dem entsprechenden

Bild bei der Erzeugung des Datenbankeintrags

automatisch zugeordnet und können

beliebige Parameter enthalten, zum Beispiel

Vergrößerung, verwendete Fluoreszenzfilter,

xy-Tisch, Fokuspositionen etc. Die gespeicherten

Daten ermöglichen damit das

Wiederherstellen exakt reproduzierbarer

Verhältnisse.

Modul Bildkalibrierung

Dieses Hilfsmittel bietet eine automatische

oder manuelle Kalibrierung sowie das Einbinden

von Meßbalken und kann an verschiedene

Mikroskoptypen angebunden werden.

Zu jedem Bild legt das System eine Kalibrierung

(z.B. Maßstab) im Archiv ab, die

auch der Benutzer definieren kann. Parameter,

wie Objektivdaten, Bildbeschreibung,

Bildname oder ein Kalibrierungsbalken können

ein- oder ausgeblendet werden. Mittels

der „Einbrenntechnik“ lassen sich Meßdaten

und Beschriftungen auch irreversibel mit dem

Bildinhalt verschmelzen.

Modul Framegrabber

Der Matrox Meteor II-Framegrabber erlaubt

die Darstellung von Livebildern (bei 25 Bilder/s),

das Erfassen und Speichern von Bildern

verschiedenster Bildquellen wie Video

Y/C und RGB-Videosignale, hochauflösend

analog und digital, ohne Zusatzmonitor.

Modul Bildbearbeitung

Diese Option ermöglicht die automatische

und interaktive Bildbearbeitung. Im interaktiven

Betrieb kann das Bild mit allen zur

Verfügung stehenden Funktionen in Echtzeit

verändert werden. So können etwa Fensterbereich

ausgeschnitten, vergrößert, gedreht,

gespiegelt oder verwischt werden. Zudem

stehen Funktionen wie Binarisierung, Farbtiefeveränderung,

Gradation, Histogramm

und Relief zur Verfügung. Funktionsabläufe

lassen sich dabei als Makros speichern.

Präsentation

Zum Erstellen von Bildpräsentationen auf

LCD-Projektoren dient das Modul Präsentation.

Aus der Bildgalerie lassen sich Bilder in

ein Leuchtpult ziehen. Diese können mit oder

ohne Begleittext – ähnlich einer Powerpoint-

Präsentation – als Bildfolge in frei wählbarer

Qualität gezeigt und ausgedruckt werden.

Ab Juni 2001 ist zusätzlich das Modul MS-

Power Point-Generator erhältlich. Dieser ermöglicht

das automatisierte Erstellen von

Powerpoint-Präsentationen mit Bild- und

Textdateien aus dem Image Manager-Archiv.

Das Einbetten von Einzelbildern oder Bildserien

in benutzerdefinierte Vorlagen oder Folien

erfolgt in frei wählbarer Auflösung.

Modul Bildvergleich

Dieser Baustein ermöglicht den direkten Vergleich

mehrerer archivierter Einzelbilder.

Durch die verschiedenen Betrachtungsarten –

Transparent, Überlagerung mit automatischer

Feinjustierung sowie Nebeneinander/Übereinander

– können fehlende oder verschiedene

Elemente oder Strukturen im jeweiligen

Bild leicht aufgespürt werden. Transparente

Vergleichsbilder und nebeneinander plazierte

Bilder lassen sich als neue Bilder abspeichern.

Dieses Modul ist speziell für die Qualitäts-

und Echtheitsprüfung sehr gut geeignet.

Abb. 3: Modul Messen

Modul Bildüberlagerung

Dieses Modul (Abb. 1) ist primär für die

Bildaufnahme von Fluoreszenzbildern bei

Einsatz mehrerer Farbfilter konzipiert worden.

Es erlaubt den Einzug und das Überlagern

von bis zu acht Schwarzweiß- oder Farb-

Einzelbildern mit automatischer oder manueller

Farbzuordnung. Die volle Einbindung

22 | Nr. II/2001 |transkript LABORWELT


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Kennziffer 22 LW 02 oder www.biocom.de Info ordern?

in das System IM 1000 ermöglicht das Speichern von farb- und

filterspezifischen Kameraeinstellungen.

Modul Timelapse

Zum Erfassen zeitlicher Abläufe unter dem Mikroskop werden von

jeder unterstützten Bildquelle Zeitreihenbilder erstellt.

Modul Multifokus

Mit dieser Option (Abb. 2) werden Bilder mit optimaler Tiefenschärfe

aus der Kombination mehrerer Bilder mit lokal unterschiedlichen

Schärfebereichen berechnet. Diese Funktion ist hauptsächlich bei

mikroskopischen Aufnahmen interessant, bei denen das aufzunehmende

Objekt den Schärfebereich der verwendeten Optik übersteigt.

Durch Aufnahme einer Bildserie, die das Objekt in allen Ebenen

einmal scharf abbildet, kann ein Bild erzeugt werden, das nur die

scharfen Anteile jedes Teilbildes verwendet.

Modul Messen

Dieser Baustein (Abb. 3) erlaubt das interaktive Vermaßen, Beschriften

und Markieren von Bildern. Die Bilddaten werden dank der

Overlay-Technik nicht verändert, da die Messungen und Texte eigenes

auf einer Zeichenebene über dem Bild ausgeführt und individuell

numeriert, beschriftet und in Schriftart, Größe, Farbe und Dicke

verändert werden. Eine manuelle oder automatische Kalibrierung

erleichtert das korrekte Vermaßen. Anbindungen an verschiedene

Mikroskoptypen erlauben das automatische Auslesen der aktiven

Vergrößerung. Der Export der Messungen in Excel- und Word-Dateien

ist möglich.

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Modul Bildüberlappung

Diese Funktion ist besonders hilfreich, wenn ein mikroskopisches

Objekt in einer hohen Auflösung erfaßt werden soll, die die verwendete

Kamera nicht unterstützt. Wird das Objekt durch Verschieben

des xy-Triebes aus mehreren, sich überlappenden Einzelbildern aufgenommen,

läßt sich daraus mit den Hilfsmitteln dieser Option ein

neues Gesamtbild erstellen.

Modul Analog Video

Das Erzeugen und die Widergabe von Filmsequenzen in voller Videoauflösung

wird von diesem Modul bei 25 Bildern pro Sekunde unterstützt.

Eine flexible Intervallsteuerung erlaubt zudem das Erzeugen

von Zeitraffer-Sequenzen im Bereich von Millisekunden bis Tagen.

Damit kann das System zum Erfassen langsamer Prozesse, wie dem

Zellwachstum, eingesetzt werden. Beim Abspielen wird beliebiges

Bewegen in der Filmsequenz mit der Zoomfunktion ebenso unterstützt

wie die Extraktion von Einzelbildern in die Zwischenablage

oder direkt in das Archiv, wo sie für die Verwendung in Berichten und

Präsentationen zur Verfügung stehen.

Korrespondenzadresse

Wolfgang Brühl

Leica Mikrosysteme Vertrieb GmbH, Bensheim

Lilienthalstraße 39-45

D-64625 Bensheim

Tel.: 06251-136 0

Fax: 06251-136 133

eMail: wolfgang.bruehl@leica-microsystems.com

www.leica-microsystems.com

|transkript LABORWELT Nr. II/2001 | 23


B L I T Z L I C H T

Bildanalytik

Zellproliferationsanalysen im Rahmen

der toxikologischen Untersuchung

neuer Pflanzenschutzmittel

DR. EDGAR WEBER, NOVARTIS CROP PROTECTION AG, BASEL, SCHWEIZ

Bei der Novartis Crop Protection AG werden Zellproliferationsanalysen mittels bildanalytischer

Verfahren im Rahmen toxikologischer Untersuchungen neuer Pflanzenschutzmittel eingesetzt.

Vorrangiges Ziel dieser toxikologischen Untersuchungen ist die Sicherstellung der gesundheitlichen

Unbedenklichkeit der entsprechenden Produkte.

Key Words: Bildanalyse, BrdU-Antikörper, analySIS-Software, Imaging C

Die Charakterisierung des Zellwachstums

in Organen oder Geweben über die Zellproliferation

hat sich als spezielle Untersuchungsmethode

auch in der Toxikologie etabliert.

Die für diese Analyse herangezogenen

Techniken basieren auf intrazellulären

Vorgängen während der Zellteilung – der

Verdopplung des zellulären Genoms durch

DNA-Replikation – und können mit Hilfe

der Bildanalyse untersucht werden.

Zur Identifikation sich teilender Zellen in

histologischen Schnitten wird Labortieren

Bromodesoxyuridin (BrdU) appliziert. Im

Überschuß angeboten, wird BrdU anstelle

von Thymidin bei der Synthese neuer DNA

in die Zellkerne eingebaut. Mit Hilfe spezifischer

Antikörper gegen BrdU und einer anschließenden

Farbreaktion lassen sich BrdUenthaltende

Zellkerne in den Gewebeschnitten

visualisieren. Als Maß der Zellteilungsaktivität

wird der BrdU-Markierungsindex

A

C

B

D

Tabelle 1: Anzahl detektierter Hepatozyten

verwendet. Dieser ist als prozentualer Anteil

BrdU-enthaltender Zellkerne zur Gesamtzahl

der Kerne definiert.

Zur Auswertung wird die Bildanalyse-Software

analySIS der Firma Soft Imaging System

aus Münster eingesetzt. Die Software

dient zur weitgehend automatischen Bestimmung

der Proliferationsrate von Nagerhepatozyten.

Beispielhaft werden lichtmikroskopische

Aufnahmen von Gewebeschnitten

aus Mäuselebern ausgewertet.

In der hier vorliegenden Aufgabenstellung

sind von allen in der Leber vorkommenden

Zelltypen allein die Hepatozyten von Interesse.

Andere Zellen, wie unter anderem Endothel-

oder Kupfferzellen, deren Kerne sich

in Form und Größe von den Hepatozytenkernen

unterscheiden, dürfen bei Bestimmung

der Leberzellproliferation nicht berücksichtigt

werden.

Hepatozyten

Nicht-Hepatozyten

BrdU-Markierungs-Index (%) 6 0

BrdU-markiert Gesamtzahl 6,25 0

Gesamtzahl 96 52

Abb. 1: a. Kontrastverstärktes

Bild, b. Grünauszug,

c. detektiertes Bild

und d. klassifiziertes Bild

aller Hepatozytenkerne

A

B

Abb. 2: a. Blauauszug und b. BrdU-markierte

Hepatocytenkerne

Zur Bestimmung der prozentualen Zellteilungsaktivität

der Hepatozyten müssen lichtmikroskopische

Aufnahmen hinsichtlich der

Gesamtzahl als auch der Anzahl BrdU-gefärbter

Zellkerne bildanalytisch ausgewertet

werden.

Die Lösung

Die Auswertung der Gesamtzahl der Hepatozytenkerne

erfolgt an Feulgen-gefärbten

Gewebeschnitten. Bei dieser Färbung wird

mittels verdünnter Säure die RNA aus den

Zellkernen gelöst und gleichzeitig die Aldehydgruppen

der DNA freigesetzt. Diese

werden spezifisch mit fuchsinschwefliger

Säure dargestellt, wobei sich die DNA durch

das basische Fuchsin violett färbt (Abb. 1a).

Braungefärbt erscheinen dagegen die mit

der BrdU-Immunohistochemie gefärbten,

proliferierenden Zellkerne.

Die zuvor mittels der Software aufgenommenen

Farbbilder werden nach einer

Shadingkorrektur zunächst kontrastverstärkt

(Abb. 1a). Ein Grünauszug des Farbbildes

erfaßt sowohl die braune als auch die

violette Anfärbung (Abb. 1b). Über eine geeignete

Schwellwertsetzung lassen sich zunächst

alle Zellkerne vom Hintergrund trennen

(Abb. 1c). Zur Extraktion der hier interessierenden

Hepatozyten gegenüber anderen

im Bild vorkommenden Zellkerntypen

wird eine entsprechende Unterteilung im

Anschluß an die Partikelanalyse definiert.

Hierbei werden Artefakte, Nicht-Hepatozyten-

und Hepatozytenkerne über ihre Größe

und ihren Formfaktor unterschieden. Die

beiden Klassifikationsparameter sind über

eine logische UND-Verknüpfung miteinander

verbunden. Das Ergebnis dieser Operationen

zeigt Abbildung 1d. Die Anzahl detektierter

Hepatozyten ist in der Tabelle 1

wiedergegeben.

Im Blauauszug des Originalbildes sind vornehmlich

die BrdU-gefärbten Zellkerne im

Vordergrund zu sehen (Abb. 2a). Durch eine

24 | Nr. II/2001 |transkript LABORWELT


erneute Schwellwertsetzung und die nachfolgende Partikelanalyse

erhält man die BrdU-markierten Hepatozytenkerne (Abb. 2b). Die in

der Tabelle 1 aufgelisteten Daten dienen zur Berechnung des prozentualen

BrdU-Markierungsindexes, in der letzten Zeile der Tabelle

dargestellt. Die gesamte Analyse läßt sich über Makros automatisieren,

wobei kritische Operationen, wie etwa die Schwellwertsetzung,

interaktiv auszuführen bleiben. Eine weitergehende Automatisierung

wird durch das Erstellen von Modulen erreicht, die in der

integrierten Programmiersprache Imaging C geschrieben und innerhalb

der Anwendung kompiliert werden. Imaging C ist mit seiner

Funktionen-Bibliothek speziell auf diese Art von Bildanalyseaufgaben

abgestimmt und ermöglicht den Aufbau komplexer Programme.

Das in Abbildung 1a gezeigte Meßfeld stellt nur einen sehr kleinen

Ausschnitt aus dem gesamten Feulgen/BrdU-gefärbten Gewebeschnitt

dar. Für einen repräsentativen BrdU-Markierungsindex müssen

zahlreiche Meßfelder oder – wenn möglich – der ganze Schnitt

analysiert werden. Hierzu ist am Analyse-Mikroskop ein motorisierter

Tisch angebracht, der den Gewebeschnitt aufnimmt und von der

Softwareapplikation gesteuert wird. Eine integrierte Autofokus-Funktion

gewährleistet, daß beim Anfahren einer neuen Position im

Gewebeschnitt das mikroskopische Bild fokussiert bleibt. Bei der

Auswertung eines Gewebeschnittes wird zu Beginn der Gesamtmeßbereich

festgelegt, der anschließend von analySIS mäanderförmig

durchfahren wird. Dabei wird jedes einzelne Meßfeld den beschriebenen

Bildanalyseoperationen unterzogen und die gewonnenen

Meßwerte werden sequentiell in eine Ergebnisdatei geschrieben.

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Das Resultat

Die mit der Bildanalyse erstellte Ergebnisdatei wird anschließend in

ein Tabellenkalkulationsprogramm übertragen, mit dem die Meßergebnisse

weiterverarbeitet und summarisch zusammengefaßt werden.

Somit liefert der oben geschilderte Einsatz bildanalytischer

Verfahren repräsentative und objektive Messungen des BrdU-Markierungsindexes

und ermöglicht zuverlässige Aussagen zur Zellteilungsaktivität

der Hepatozyten. Diese Informationen fließen in die

toxikologische Bewertung ein und dienen damit letztlich der Sicherstellung

der gesundheitlichen Unbedenklichkeit neuartiger Produkte

der Novartis Crop Protection AG.

Korrespondenzadresse

Dr. Manfred Kässens

Soft Imaging System GmbH

Hammer Straße 89

48153 Münster

Tel.: 0251-798000

Fax: 0251-7980099

eMail: marketing@soft-imaging.net

www.soft-imaging.net

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|transkript LABORWELT Nr. I/2001 | 25


B L I T Z L I C H T

Biolumineszenz

VITOTOX – a High-Throughput

Bioluminescent Genotoxicity and

Cytotoxicity Test

THERMOLABSYSTEMS FINNLAND

Labsystems is introducing a unique method

that allows for rapid and cost effective highthroughput

genotoxicity and toxicity screening.

Known as the VITOTOX test and

developed at the Flemish Institute for Technological

Research (Vito), the assay exploits

the bacterial SOS response mechanism 1,2 . The

two recombinant test strains used in the

assay are designed to determine both genotoxicity

and cytotoxicity and are constructed

from the same bacterial strain, Salmonella

typhimurium TA104, that is used for the Ames

test. The reporter system for genotoxicity

detection contains the luciferase gene under

control of a modified recN promoter. Luciferase

activity can be measured by light

emission and is a function of the genotoxicity

of the test compound. Normally, the recN

promoter is strongly repressed, but in the

presence of a DNA damaging genotoxic compound

the RecA regulator protein recognizes

the resultant free ends or mismatches in

DNA, initiating a cascade of reactions known

as the SOS response, that derepresses the

strong recN promoter. One of the major differences

with the Ames test is that the entire

DNA content of the cell functions as a target

for the genotoxin to display its effect. In

contrast, the Ames test monitors mutations

only in genes related to histidine synthesis.

This results in a significantly higher (up to

1000 fold) sensitivity of the VITOTOX test.

An important control for the system is a

cytotoxicity test performed alongside each

sample dose, this to ensure that a positive

signal in the genotoxicity test is not due to a

nonspecific enhancement in luminescence

and that a negative response is not due to

toxicity of the test compound resulting in

cell death 2 .

The test is very simple and cost efficient to

perform. Bacteria reconstituted the night

before grow to the correct density in approximately

15 hours. For the current versions

of the test, compounds are pipetted into 96-

well or 386-well microplates in a dilution

series along with blanks, positive control

samples, and with or without S9 metabolic

extract. The plate then goes into a reader,

and it’s hands off for the entire four-hour

assay period, during which the plate is read

every 15 minutes. Although luminometers

from other manufacturers will read the samples,

Labsystems sells the Luminoskan

Ascent plate reader complete with dispensers

that perform most of the pipetting as

well as the software that will automatically

run the experiment, crunch the data and

generate a report with the test results. With

the 386-well microtiter plate setup, 24 samples

can be simultaneously tested. Combining

this with the Assist robot it is possible

to easily test over 800 compounds per 24

hours. This allows integrating the VITO-

TOX test in a high-throughput screening

program. At present a 1,536-well microtiter

plate setup is under evaluation.

Since the VITOTOX test is miniaturized

and very sensitive, only small amounts of

the test compound are required to perform

the test. The usefulness of this system as a

prescreening for the Ames test is further

validated by the high correlation (in excess

of 99 percent) between the Ames test and

VITOTOX test (3). This allows early identification

of compounds that would ultimately

be eliminated by Ames testing in the initial

stage of the product discovery phase when

only small amounts of the test compounds

are available, saving valuable resources.

Literature

1. van der Lelie D., L. Regniers, B. Borremans, A. Provoost

and L. Verschaeve (1997). The VITOTOX“ test, a

SOS-bioluminescence Salmonella typhimurium test

to measure genotoxicity kinetics. Mutation Res.389:

279-290.

2. Verschaeve L., Van Gompel J., Thilemans L., Regniers

L., Vanparys Ph. and van der Lelie D (1999). The

VITOTOX‚ genotoxicity and toxicity test for the rapid

screening of chemicals. Environ. Mol. Mutagen.33,

240-248.

3. Amy F (2000). Cutting-edge technologies in molecular

toxicology promise to speed drug development.

The Scientist 14 (1): 18

Contact

Fig. 1: General principle

of SOS induction. Derepression

of the recN gene

can be followed by placing

a lux reporter system

under transcriptional

control of the recN

promoter.

Karsten Spring

ThermoLabsystems

Labsystems GmbH

Berner Str. 53

60437 Frankfurt

Tel. 069/50919672

www.labsystems.fi

Mehr Informationen ordern? Kennziffer 24 LW 02 oder www.biocom.de

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26 | Nr. II/2001 |transkript LABORWELT


M A R K T Ü B E R S I C H T

Bilddatenverwaltung

New Confocal and Multi-photon

instrumentation

BY DR. ANNA SMALLCOMBE, BIO-RAD MICROSCOPY DIVISION, HEMEL HEMPSTEAD, UK

Confocal and multi-photon microscopy are both techniques which use lasers as illumination sources

and which perform optical sectioning through biological material containing fluorescent molecules.

These techniques therefore significantly reduce the amount of microtome sectioning required before

good information can be gained from a chemically fixed sample. Typically, it is possible to generate an

entire three dimensional reconstruction of a biological sample which is totally in focus. This enables

scientists to assess the localisation of several different structures (or proteins) simultaneously and their

relationship to each other in three dimensions.

Key words: confocal, multi-photon, blue diode laser, ROI scanning, upgradeablility

Most users of confocal and multi-photon technology

will be using immunohistochemistry

or immunocytochemistry to study their samples.

Specific antibodies can be purchased

from commercial companies which are already

conjugated to a fluorescent molecule

(such as fluorescein). Different fluorescent

molecules fluoresce different colours when

excited by laser light, so by careful choice of

optical filters (which only allow a certain

colour through), it is possible to study the

localisation of three or four different antigens

in the same sample (Fig. 1)

Another important reason to use confocal and

multi-photon microscopy is the ability to study

Fig. 1: Confocal image of a prospective wing

blade region of wing imaginal disc of Drosophila,

showing expression of apterous (red),

wingless (blue) and Delta (green) *.

living cells and tissues. Many biological samples

fluoresce naturally (autofluorescence), but it is also

possible to use fluorescent probes which bind to

certain types of ions, membrane or subcellular

compartments (such as mitochondria or nuclei)

and image the physiological or morphological

changes over time.

Fig. 2: Confocal

image of GFP-tagged

mitotic spindles

in a wholemount

leiving Drosophila

embryo *

The biggest breakthrough in imaging living

cells and organisms has been the commercial

availability of GFP (Green Fluorescent Protein)

and its sister proteins (BFP, CFP, YFP and

DsRed from ClonTech Living Colors ® Fluorescent

Proteins, Fig. 2). These are small,

naturally fluorescent proteins which can be

induced to express themselves only in specific

subcellular compartments or when a specific

target protein is present. The GFP-DNA

can be permanently incorporated into the

genome of a cell line or an entire organism

where it will continue to express bright fluorescence

across many generations.

It can therefore be imaged with a confocal or

multi-photon system without the addition of

antibodies or fluorescent dyes and is the least

invasive means of investigating living tissue.

GFP has been a major scientific advance in the

study of cell biology and developmental biology

and disease-inducing mechanisms. Most

commercial confocal companies will have a

special set of optical filters designed for using

one or more of these fluorescent proteins.

The New Radiance2100 Laser

Scanning imaging system

Bio-Rad have just launched a new generation

of confocal and multi-photon imaging systems

(Fig. 3) with an enhanced range of laser

options, flexible ROI scanning with FRAP

capability and other major scanning advancements.

The Radiance2100 series is totally

upgradeable from a one laser, one PMT system

through to the full combined confocal

and multi-photon system.

The choice of lasers offered with these systems

means that the range of applications

cover everything from DAPI in the UV ,

CFP/YFP FRET, BFP, GFP, YFP and RFP

transfections multilabelling as well as the

more usual FITC/Txred or Alexa dye standard

visible fluorochrome multi-labelling for

immunocytochemistry (Fig. 4, Tab. 1)

These multi-photon systems have also proved

extremely successful in the market place

Fig. 3: The Radiance2100 system

due to their quality, flexibility and sensitivity.

Their sensitive external detectors enable

all light (including scattered light) to be collected

from each focal plane of the sample,

thus increasing the signal to noise leading to

improved clarity. This is especially important

deeper down into the sample, but also improves

the chances of survival for living cells

since with higher detector sensitivity, it is

possible to use even lower levels of laser

excitation. Figure 5 shows the wavelength

range that can be used to excite a variety of

familiar fluorochromes and probes with multi-photon

lasers.

Features

Permanent alignment with thermally

matched components

Unique Scanhead design

Fig. 4: Triple

labelled Drosophila

brain

|transkript LABORWELT Nr. II/2001 | 27


M A R K T Ü B E R S I C H T

Fig. 5: Multi-photon

cross-sections for

some fluorophores*

and 3D image processing and measurement

packages called LaserPix and Laser-

Vox respectively. There are special features

such as co-localisation analysis and

volumetric object measurements. All three

packages read the Bio-Rad PIC file format.

Expert Support

Bio-Rad offers Technical and Applications

support and provides innovative tools

for customer use such as the interactive

fluorescence database on Fluorescence.

bio-rad.com

Microscope adaptablity means that you

are not limited to one type of microscope

or set of objective lenses.

AOTF or ND for controlling laser power

Flyback blanking to reduce photobleaching

The increased scan speeds and ROI scanning

allow FRAP and timecourse experiments.

The sequential line by line (Lamba Strobing)

scanning mode collects multi-channel

images almost as fast as simultaneous

scanning, but without any bleed-through

problems.

The new Bi-directional scanning mode

allows data to be collected while the laser

beam is scanning in both directions, thus

enabling faster data collection

Photon Counting up to 30 photons per

pixel per scan dramatically increases signal

to noise with an excellent linearity of

response.

Prismatically enhanced PMTs for

increased sensitivity

Optimised transmitted light DIC – optical

fibers retain laser beam polarity.

Independent confocal irises allow iris optimisation

for different emission wavelengths

or for the same ‘optical section’

to be collected into each PMT. This is not

possible with single or fixed pinholes during

simultaneous imaging.

Digital Mixers allow real-time bleedthrough

correction.

External triggering allows scanning to be

triggered from an external electronic signal

Beam Conditioning unit enables optimum

filling of lens back aperture. Beam recolli-

Trademarks

SYTO ® Alexa Fluor ® Bodipy ® Fluo-3 FM1-43 DiI DiO

(Molecular Probes, Inc. Eugene, Oregon, USA)

EBFP, CFP, GFP, YFP, DsRed Living Colors ® Fluorescent proteins

(Clontech Laboratories Inc. Palo Alto, California, USA)

Cy2, Cy3 and Cy5 are all Trademarks of Amersham International

PLC © 1995

Radiance2100, LaserSharp 2000, LaserPix and Laser-

Vox (Bio-Rad Microscience Ltd).

Acknowlegements

Figure1: Photograph by Craig Michhelli (Micchelli et al. (1997) Development

124, 1485-1495. Reproduced with permissin from S.

Blair and the Conpany of Biologists

Figure 2: SA Endow and DJ Komma, Duke University, NC, USA

Figure 4: J. Mc Cormick et al., University of Michigen, USA

Figure 5: Watt Webb, Cornell University

mation device corrects the chromatic shift

between visible and infrared lasers.

Software options

Bio-Rad offers a data acquisition software

called LaserSharp 2000 as well as 2D

Tab. 1: Applications with the new Radiance2100 series

Confocal

Lasers Wavelengths Application 1 Applications 2 Applications 3

Argon ion 457 CFP Lucifer Yellow Fixed DAPI

Chlorophyll.Alexa430

477 wtGFP less excitation of

YFP than 488

488 EGFP standard green fluors. Fluo-3 calcium green

514 EYFP Syto11, 15, in vivo FM1-43 memebrane dye

nuclear stains

Krypton/Argon 488 EGFP DsRed standard green red Cy2, FITC, Alexa 488,

double labelling double labelling DiO

568 DsRed standard red fluors. RxRed, Lissamine

Green HeNe 543 Cy3 Tritc standard orange/red RH-414

Propidium

Dil

Red Diode 638 Cy5 Allophycocyanin

Options

Blue Diode 406 CFP/YFP DAPI Hoechst

FRET Bimane

BFP • wtGFP

HeCAD 442 CFP/YFP Lucifer Yellow, Lyso

FRET Green chlorophyll, Alexa 430

Krypton 568 DsRed Texas Red & standard

red Fluors., Alexa 568

Multiphoton

Spectra 680-1050 DAPI FITC, Tritc Serotonin (3-photon)

Physics

Hoechst

Tsumani

Bimane

CFP/YFP, FRET

CoherentMira 690-1000 as above

Spectra 750-850 or standard green &

Physics Mai 780-920 orange fluors.

Tai

CFP/YFP, FRET

Coherent 700-760 DAPI Hoechst

Vitesse XT

Bimane

760-860 DAPI Hoechst, Lucifer Yellow

Bimane

CFP/YFP, FRET

780-920 as above FITC

Coherent 800 DAPI Hoechst, wtGFP

Vitesse

Bimane,

CFP/YFP, FRET

Contact

Dr. Hans Pankau

BIO-RAD GmbH

Tel.: 06723-913655

Fax: 06723-913656

eMail: Hans_Pankau@Bio-Rad.com

28 | Nr. II/2001 |transkript LABORWELT


,

.

K O N F O K A L M I K R O S K O P E

1 . Firmenanschrift

CHROMAPHOR Analysen-Technik Gmb H

Herr Hugo Ostermann

Keniastr. 12

D-47269 Duisburg

Tel.: 0203 - 99 86 28

Fax: 0203 - 99 86 30

eMail: CHROMAPHOR@T-online.de

www.chromaphor.de

klughammer GmbH

Frau Anneliese Schmaus

Strassbach 9

D-85229 Markt Indersdorf

Tel.: 08136-6011

Fax: 08136-7098

eMail: info@klughammer.de

www.klughammer.de

2 . Gerätebezeichnung

V oxCellScan Spinning Disk Confocal mit Micro Lens Arra y

CGS OptoLin e

3. Abmessungen des Systems

(Breite x Tiefe x Höhe, cm)

S cankopf nur 18 x 18 x 20 cm

abhängig von den Mikroskopabmessunge n

5.

Kurzbeschreibung

Komponenten

des

Systems

und

Das CGS OptoLine wird in den Strahlengang des Mikroskops eingeschoben. Ein eindimensionales

Streifenbild (Gitter) mit einfacher Ortsfrequenz wird auf das Objekt projiziert. Mit Hilfe des bewegten Gitters

ermittelt die Bildverarbeitungs-Software die konfokalen Bereiche. Die Art und Weise, wie CGS zu den

scharfen Bildern kommt, unterscheidet sich von der eines traditionellen Laser-Scanning-Mikroskops. Die

Ergebnisse sind mit denen eines CLSM Confocal Laser Scanning-Mikroskops jedoch direkt vergleichbar.

6.

mögliche

Anwendung

6 .1 Einsatzbereich

Einfach und mehrfach fluoreszenzmarkierte Präparate, Zellkulturen, Gewebsschnitten lebenden Organisme n Biologie, Medizin, Industrie

mit Videorate 25 bis 360 Bilder/s

4 . Komplettsystem/Zusatzgerät

K omplettsystem und Zusatz für ZEISS-, LEICA-, OLYMPUS- und NIKON-Mikroskop e

für Leica-, Nikon-, Olympus- und Zeiss-Lichtmikroskop e

Kompakter Scankopf über C-Mount mit Mikroskop und CCD-Kamera verbunden. Gleichzeitige Anregung

und Emission von 1200 Bildpunkten, dadurch hohe Scangeschwindigkeit bis 360 Bilder/s.

Lasereinkopplung über Faseroptik, Anregung 457, 488, 514, 532, 568, 647 nm, schnelle Umschaltung mit

AOTF. DUAL Emission mit Filterrad oder DUAL-CCD-Kameraadapter. Piezo-elektrische Fokussierung mit

10nm Auflösung. Umfangreiche 2-D-, 3-D- und 4-D-

(3-D über Zeit) Bildanalyse. • System unter Microsoft

Windows NT, Apple Mac OS9 und Unix einsetzbar • Optionale RatioImaging-Software für konfokales

Kalzium-Imaging lieferbar

6 .2 optimiert für bestimmte Anwendung? Lebendbeobachtung von GFP-, YFP-, CFP- und RFP-markierten Zellkulturen, Gewebsschnitten und “whole

m ounts” C elegans, Zebrafisch, Xenopu s ....

für alle gleich gut einsetzbar

7.

Lichtquelle

7 .1 Laser/Typ?

L aser: a) Argon-Ionen-Laser, b) Krypton-Argon-Ionenlaser c) NeodymYAC-Lase r

Auflicht-Hellfeld, Auflicht-Fluoreszenz, Auflicht-Polarisatio n

7 .2 Wellenlängenbereich

a ) 457, 488, 514 nm, b) 488, 568, 647 nm, c) 532 n m

je nach Beleuchtun g

7 .3 Leistung [W]/ stand-by-Betrieb?

L eistung 15 -50 mW c w

je nach Mikrosko p

8.

Scanner

8 .1 Scangeschwindigkeit (Aufnahmerate/Zeit/Pxl) N IPKOW-Disk-Scanner mit 20.000 Mikrolinsen, 360 Bilder (full frame) pro Sekund e

Aufnahmegeschwindigkeit: schnell, da kein Scanner verwendet wir d

9.

Auflösung

9 .1 in x/y-Richtung

< 0, 2 µm abhängig vom Mikroskop und den Objektive n

9 .2 in z-Richtung

0 6 µm abhängig vom Mikroskop und den Objektive n

9 .3 zeitlich (Bilder/s)

3 60/ s

abhängig von der Integrationsdauer der Kamer a

1 0. z-Motor (Art)

z-Motor, Piezo-elektrische Objektivantrie b

1 0.1 z-Intervall (kleinste Schrittweite)

1 0 n m

abhängig vom Mikrosko p

1 0.2 Geschwindigkeit (Schritte/s)

1 0 -15 Schritte/ s

abhängig von der z-Achsensteuerun g

1 0.3 Reproduzierbarkeit (nm)

1 0n m

abhängig von der z-Achsensteuerung und dem Mikrosko p

1 1. Meßkanäle

keine Angabe n

1 1.1 für Reflexionskanal

kein Refexionskanal vorhande n

1 1.2 für Fluoreszenz

2 Kanäle simultan oder bis zu 6 seriell

1 1.3 für zusätzl. Kanal-Durchlicht

Live-Durchlicht und DIC-Kana l

1 2. Photomultiplier

H ochempfindliche gekühlte CCD-Kamera mit hoher Quanteneffizienz, wahlweise mit Lichtverstärke r keine Angabe, da mit CCD-Kameras gearbeitet wir d

13.

Auswertungs-Software

1 3.1 Bildaufnahme

V isiTech VoxCellscan, ImagePro Plus, Metamorph (PC)oder IP-Lab Spectrum (Macintosh )

ImagePro Plu s

1 3.2 Quantitative Analyse

I magePro Plus, Metamorph (PC)oder IP-Lab Spectrum (Macintosh )

ImagePro Plus, Mark II I

1 3.3 Rendering

V isTech VoxCellScan 3D, VAYTEK VoxBlast 3D incl. “MICROTOME” Deconvolutio n

VoxBlas t

1 4. Extras

Extras: Perfusionkammern, Objektivheizungen, schwingungsgedämpfte Tische. Der Scankopf und Lase r

kann an vorhandene Videoimaging Plätze mit entsprechenden CCD-Kameras angeschlossen werden. Dies

erspart die Beschaffung einer weiteren empfindlichen CCD-Kamera mit Software und Mikroskop

Anpassung an viele Mikroskope • wenig

schnelle Bildaufnahme • kostengünstig


Photodamaging durch

einfache Handhabung

geringe

Lichtintensität


optional:

sehr

|transkript LABORWELT Nr. II/2001 | 29


,

/

M A R K T Ü B E R S I C H T

3. Abmessungen des Systems

(Breite x Tiefe x Höhe, cm)

1 890 mm x 730 mm x 1490 mm

1 890 mm x 730 mm x 1490 m m

1200 mm x 800 mm x 740 m m

Leica ICM 1000 • Konfokalmikroskop für die Materialwissenschaften

und Qualitätssicherung

4 . Komplettsystem/Zusatzgerät

Komplettsystem passend für Leica-Forschungsmikroskope DMR, DMIR ,

DMLFS

5.

6.

Kurzbeschreibung

Komponenten

mögliche

des

Anwendung

Systems

und

High-End-System für alle Anregungswellenlängen VIS, UV, IR • Spektrale

Detektion für alle Photomultiplier • Benutzerdefinierte Einstellung der

Emissionsbereiche • Wellenlängenabhängiger Scan • Einstellbare

Pupillenausleuchtung • Scanfeldrotation • Programmierbare Scanmodi •

2048x2048 Pixel, 12 Bit • Benutzeroberfläche konfigurierbar •

Scanfeldgröße 22mm • Live xz-Scanning

Komplettsystem passend

DMLFS

für

Leica-Forschungsmikroskope

DMR,

DMIR,


Komplettsystem für

Leica

DM LM-Mikroskope

Kompaktgerät für Reflexionsmessungen im

materialwissenschaftlichen Bereiche zur

Oberflächencharakterisierung von Metallen,

Papier, Lacken etc.

Polymeren,

Keramik,

6 .1 Einsatzbereich

Forschungsbereich Biologie, Medizin, Biotechnologie, Pharmaforschung ,

Geologie

Forschungsbereich Biologie, Medizin,

Geologie, Materialwissenschaften

Biotechnologie,

Pharmaforschung,

Reflexionsmessungen

1 . Firmenanschrift

Leica Mikrosysteme Vertrieb Gmb H

Frau D. Schroth

Lilienthalstr. 39-46

D- 64625 Bensheim

Tel.: 06251- 136-0

Leica Mikrosysteme Vertrieb GmbH

Frau D. Schroth

Lilienthalstr. 39-46

D- 64625 Bensheim

Tel.: 06251- 136-0

Leica Mikrosysteme Vertrieb GmbH

Frau D. Schroth

Lilienthalstr. 39-46

D- 64625 Bensheim

Tel.: 06251- 136-0

2 . Gerätebezeichnung

Leica TCS SP 2

Spektrales Konfokal- und Multiphoton-System

Leica TCS SL

Spektrales Konfokal- und Multiphoton-System

Persönliches System für Anregungswellenlängen im sichtbaren Bereich

Spektrale Detektion für alle Photomultiplier • Benutzerdefinierte

Einstellung der Emissionsbereiche • Wellenlängenabhängiger Scan •

Programmierbare Scanmodi • 2048x2048 Pixel, 12 Bit • Benutzeroberfläche

konfigurierbar • Scanfelddröße 22mm • Live xz-Scanning

6 .2 optimiert für bestimmte Anwendung? F luoreszenz, Reflexio n

F luoreszenz, Reflexio n

Rauhigkeitsmessungen nach DIN, Höhenmessungen ,

Winkelmessungen, Volumenmessungen, 3-D-

Oberflächenquantifizierung

7 . Lichtquelle

Diodenlaser 635 n m

7 .1 Laser/Typ?

Ar-UV Laser 50 mW 351,364 nm • HeCD-Laser40 mW 442 nm •

Ar-Laser 50 mW 457, 488, 514 nm • ArKr-Laser 74 mW 488, 568,

nm • Kr-Laser 25 mW 568 nm • HeNe 1.2 mW 543 nm • HeNe 10

Ti:Sa Laser, fs oder ps 1 W 720-1000 nm

647

mW •

Ar-Laser

mW

7 .2 Wellenlängenbereich

3 50-1000 n m

457-647 n m

50

mW 457,

488,

514

nm •

HeNe

1.2

mW 543

nm •

HeNe

10

7.3 Leistung [W]/ stand-by-Betrieb?

8. Scanner

8 .1 Scangeschwindigkeit (Aufnahmerate/Zeit/Pxl) 2 000 Linien/s, 3 Bilder/s 512x512 Pixel, 20 Bilder/s 512x32 Pixe l 2 000 Linien/s, 3 Bilder/s 512x512 Pixel, 20 Bilder/s 512x32 Pixe l 10 Bilder/s 640x512 Pixe l

9. Auflösung

9 .1 in x/y-Richtung

x y 150 n m

x y 150 n m

xy 300 n m

9 .2 in z-Richtung

x z 350 n m

x z 350 n m

xz 600 n m

9.3

zeitlich

(Bilder/s)

10.

z-Motor

(Art)

1 0.1 z-Intervall (kleinste Schrittweite)

1 0 nm kleinste Schrittweit e

1 0 nm kleinste Schrittweit e

1 nm Auflösungsvermöge n

1 0.2 Geschwindigkeit (Schritte/s)

2 0 Schritte s

2 0 Schritte s

10 Bilder/ s

1 0.3 Reproduzierbarkeit (nm)

4 0 nm Reproduzierbarkeit

4 0 nm Reproduzierbarkeit

25 nm Reproduzierbarkeit

11. Meßkanäle

1 1.1 für Reflexionskanal

4 Kanäle für Fluorezenz, Reflexion variabel einsetzba r

2 Kanäle für Fluorezenz, Reflexion variabel einsetzba r

1 Reflexionskana l

1 1.2 für Fluoreszenz

1 Durchlichtdetekto r

1 Durchlichtdetekto r

1 Photodiod e

1 1.3 für zusätzl. Kanal-Durchlicht

P MT für Auflicht, 1 PMT für Durchlich t

PMT für Auflicht, 1 PMT für Durchlich t

12.

Photomultiplier

13.

Auswertungs-Software

1 3.1 Bildaufnahme

xyz-, xzy-, xz-, xt-, xyl-, xyt-, xyzt-Aufnahmemodi, frei programmierbar e

Timelapse-Maske

xyz-, xzy-, xz-, xt-, xyl-, xyt-, xyzt-Aufnahmemodi, frei programmierbare xyz Mode

Timelapsemaske

1 3.2 Quantitative Analyse

L änge, Breite, Höhe, Tiefe, Fläche, Intensität, Volumen, Winke l L änge, Breite, Höhe, Tiefe, Fläche, Intensität, Volumen, Winke l

Länge, Breite, Höhe, Tiefe, Fläche, Intensität, Volumen, Winke l

1 3.3 Rendering

Maximum-Projektion, Average-Projektion, Transparent-Projektion ,

SFP-Projektion, Surface-Projektion

1 4. Extras

VBA programmierbar, Mikroskopzubehör adaptierbar, externer Port zu r

Adaption von z.B. Raman-Spektrometern

Maximum-Projektion, Average-Projektion,

SFP-Projektion, Surface-Projektion

VBA

programmierbar,

Mikroskopzubehör

Transparent-Projektion,

adaptierbar

Maximum-Projektion, Average-Projektion,

SFP-Projektion, Surface-Projektion

Transparent-Projektion,

30 | Nr. II/2001 |transkript LABORWELT


/

K O N F O K A L M I K R O S K O P E

1 . Firmenanschrift

Nikon Gmb H

Dr. Anja-Rose Strohmaier

Tiefenbroicher Weg 25

D- 40472 Düsseldorf

Tel.: 0211-9414-214

Fax: 0211-9414-322

eMail: anja.strohmaier@nikon.de

Olympus Optical Co (Europa) GmbH

Mikroskopie National, Marketing

Andrea Jensen

Wendenstr. 14-16

D- 20097 Hamburg

eMail: microscopy@olympus-europa.com

2 . Gerätebezeichnung

P CM2000 (Personal Confocal Microscope 2000 )

F luoview50 0

Fluoview30 0

3.

Abmessungen

(Breite x Tiefe

x

des Systems

Höhe, cm)

Scankopf:

Laser: H =

Mikroskop:

Controler:

Computer:

Benötigte:

Höhe = 23 cm, Tiefe = 24 cm,

20 cm, T = 75 cm, B = 30 cm

H = 80 cm (inkl Scankopf), T

H = 45 cm, T = 45 cm, B = 27

H = 45 cm, T = 45 cm, B = 27

Tischbreite ca. 120 cm

4 . Komplettsystem/Zusatzgerät

Zusatzgerät, geeignet für alle Nikon-Forschungsmikroskope (E600, E800 ,

E1000, TE200/300).

5.

6.

7.

Kurzbeschreibung

Komponenten

mögliche

des

Anwendung

Systems

und

kompaktes, leistungsstarkes, einfach

guten Preis-/Leistungsverhältnis

zu

Breite

=

40

cm

cm

=

9

cm,

cm

B

bedienendes

6 .2 optimiert für bestimmte Anwendung? Optimiert für Fluoreszenzanwendunge n

Lichtquelle

7 .1 Laser/Typ?

Argon-Ionen Laser 457, 488, 514 nm • Helium-Neon-Laser 543 nm •

Helium-Neon-Laser 633 nm

=

27

Gerät

cm

mit

einem

1 50 x 120 x 80

150 x 120 x 8 0

Konfokales LSM-System in

Forschungsmikroskopen der

Verbindung mit

Fa. Olympus

aufrechten

und

inversen

Integrale vollautomatisierte Systemlösung für Forschungsanwendungen

in der Konfokalmikroskopie, bestehend aus Forschungsmikroskopsystem,

LSM-Scanner, Laser-Combining-Unit, Elektr. Steuerkomponenten,

Betriebssoftware

Olympus Optical Co (Europa) GmbH

Mikroskopie National, Marketing

Andrea Jensen

Wendenstr. 14-16

D- 20097 Hamburg

eMail: microscopy@olympus-europa.com

Konfokales LSM-System in

Forschungsmikroskopen der

Verbindung mit

Fa. Olympus

aufrechten

und

inversen

b io-medizinische Applikationen in der Fluoreszenzmikroskopie

bio-medizinische Applikationen in der Fluoreszenzmikroskopie

AOTF-gesteuert • Multiline/Singleline Argon (457nm, 488 nm, 514nm) •

Green HeNe (543nm), 1 mW • Red HeNe (633nm),10 mW • HeCd

(442nm), 12 mW • UV-Argon (351nm), 40 mW • IR laser diode (750nm),

2 mW •

7 .2 Wellenlängenbereich

A nregung: 450 nm – 633 nm, Emission: 460 nm – 900 n m

U V-VIS-I R

UV-VIS-I R

7 .3 Leistung [W]/ stand-by-Betrieb?

Argon-Ionen 25 mW, HeNe rot grün 1 m W

AOTF-gesteuert

514nm) • Green

HeCd (442nm),

diode (750nm),

2

• Multiline/Singleline Argon (457nm, 488 nm,

HeNe (543nm), 1 mW • Red HeNe (633nm),10

12 mW • UV-Argon (351nm), 40 mW • IR laser

mW

8 . Scanner

g alvanometer-getriebenes X-Y-Spiegelsystem (Pointscanning )

Galvanometer-getriebenes X-Y-Spiegelsystem (Pointscanning )

9.

8 .1 Scangeschwindigkeit (Aufnahmerate/Zeit/Pxl) c a. 3 – 7 5 µ s/Pixe

l

2 000 H z

2000 H z

Auflösung

9 .1 in x/y-Richtung

x /y: 0,18 0 µm c a. 250 n m

ca. 250 n m

9 .2 in z-Richtung

0 ,40 0 µm c a. 350 n m

ca. 350 n m

9 .3 zeitlich (Bilder/s)

1 Bild/sec bei 512x512 Pixel (max. Pixelzahl 2048x2048 )

c a. 4 fps (512 x 512, bidirektional)

ca. 4 fps (512*512, bidirektional)

1 0. z-Motor (Art)

S chrittmoto r

Schrittmoto r

1 0.1 z-Intervall (kleinste Schrittweite)

z -Intervall a) 0,0 5 µ m Standardmotor b) 10 nm Piez o

25

n m

25 n m

10.2

10.3

Geschwindigkeit

Reproduzierbarkeit

(Schritte/s)

(nm)

1 1. Meßkanäle

m ax 4 Kanäle für Fluoreszenz und Reflexion, 1 Kanal für Transmisio n max 2 Kanäle für Fluoreszenz und Reflexion, 1 Kanal fü r

Transmision

1 1.1 für Reflexionskanal

Eine r

1 1.2 für Fluoreszenz

Max. 3

1 1.3 für zusätzl. Kanal-Durchlicht

1 Durchlicht + 2 Fluoreszen z

1 2. Photomultiplier

M ax 3

m ax 4 1

max 2 1

1 3. Auswertungs-Software

Integrales Softwaresystem zur Kontrolle der Scanfunktionen, Verwaltun g

der Experimentdaten, Bildaufnahme, Bildauswertungs sowie

Darstellungsfunktionen in 2D und 3D

1 3.1 Bildaufnahme

3D plus Zeit also 4 D

Manuelles System für Routine-

und Forschungsanwendungen in

der Konfokalmikroskopie, bestehend aus

Forschungsmikroskopsystem, LSM-Scanner, Laser-Combining-Unit,

Elektr. Steuerkomponenten, Betriebssoftware

6 .1 Einsatzbereich

medizinische und biologische Forschung, Fluoreszenz- un d

Reflektionsaufnahmen, Mehrfachfluoreszenzfärbungen, GFP-

Visualisierung

Integrales Softwaresystem zur Kontrolle der Scanfunktionen,

Verwaltung der Experimentdaten, Bildaufnahme, Bildauswertungssowie

Darstellungsfunktionen in 2D und 3D

m •

1 3.2 Quantitative Analyse

Ratio-Imaging, Tiefenkodierun g

1 3.3 Rendering

Volume Rendering mit Möglichkeit zur Filmerstellun g

1 4. Extras

Life-Time-Modul zur Messung der Fluorszenz-Lebensdauer vo n

Fluorochromen

Ausbau zu 2-Photon-System ist

für physiologische Applikationen

möglich,

umfangreiche

Sonderfunktionen

Ausbau zu 2-Photon-System ist möglich, umfangreiche

Sonderfunktionen für physiologische Applikationen

|transkript LABORWELT Nr. II/2001 | 31


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M A R K T Ü B E R S I C H T

1 . Firmenanschrift

Carl Zeiss Jena Gmb H

Carl-Zeiss-Promenade

D- 07745 Jena

Tel.: +49 3641 643400

Fax: +49 3641 643144

eMail: micro@zeiss.de

www.ziess.de/PASCAL

10

2 . Gerätebezeichnung

LSM 5 PASCA L

3. Abmessungen des Systems

Je nach Ausstattung (verwendeter Systemtisch, Lasermodule)

(Breite x Tiefe x Höhe, cm)

4 . Komplettsystem/Zusatzgerät

Komplettsystem; es stehen mehrere aufrechte und inverse Mikroskopstative aus dem Hause Zeiss (Axioplan 2 imaging, Axioskop 2, Axioskop 2 FS, Axiovert 200 M) zur Auswah l

5.

Kurzbeschreibung

Komponenten

des

Systems

und

6.

mögliche

Anwendung

6 .1 Einsatzbereich

Fluoreszenz-, Durchlicht und Reflektions-Mikroskopie: • bio-medizinische Anwendungen • Materialanalys e

6 .2 optimiert für bestimmte Anwendung? b io-medizinische Anwendungen : aufgrund der extrem hohen Empfindlichkeit, Flexibilität und Geschwindigkeit besonders optimiert für die Detektion schwacher Fluoreszenzsignale und die Beobachtung dynamische r

P rozessse in sensiblen lebenden Zellen, Geweben und Organismen (z.B. GFP, FRET, Ionen-imaging) • M aterialanalyse : berührungslose Analyse von 3D-Mikrostrukturen und Oberflächen in Reflexion, Fluoreszenz un d

Polarisation. Präzise Bestimmung von geometrischen, funktionellen und Rauheits-Parametern.

7 . Lichtquelle

Typ Wellenlängen Leistung Stand-b y

Ar 458/488/514 25mW/ja • Ar/Kr /488/568

HeNe 633 5mW / N/A • Software-gesteuerte

/30mW / ja • HeNe

Intensitätsregelung

543

aller

1mW / N/A

Laserlinien


in

Promille-Schritten

(kalibriert).

8 . Scanner

2 symmetrische, unabhängige galvanometrische Scan-Spiegel für Rotation, Zoom und Offset • Scanfeld in Schritten von 0. 1 ° u m 36 0 ° frei rotierbar • Scanzoom 0.7x bis 40x in Schritten von 0. 1

8 .1 Scangeschwindigkeit (Aufnahmerate/Zeit/Pxl) 1 3 x 2 Scangeschwindigkeiten von 4Hz bis 2600Hz Zieilenfrequenz • Pixel dwell time: 0.64 bis 6553. 6 µ s • m ax. Geschwindigkeit : 2600 lines/s (bidirektionales scanning) • 5 frames/s 512 Pixel x 512 Pixel • 7 7

frames/s 512 Pixel x 32 Pixel

9.

Auflösung

9 .1 in x/y-Richtung

Z oom 0.7x bis 40x in Schritten von 0.1 • Bilddimensionen von 1 x 4 bis zu 2048 Pixel x 2048 Pixel frei einstellbar • maximale Bildgröße: 4096 x 4096 Pixel (TileScan-Modus) • Optisches Auflösungsvermö g en :

beugungs-begrenztes Design des optischen Systems: Daraus ergibt sich eine maximale laterale Auflösung von ca. 130nm (FWHM) bei 458nm und NA=1.4 • Grauwertauflösung: 12 bit (4096 Stufen) je Kanal

9 .2 in z-Richtung

o ptisches Auflösungsvermögen: beugungs-begrenztes Design des optischen Systems: daraus ergibt sich eine maximale axiale Auflösung von ca. 340nm (FWHM) fü r λ = 458nm, n=1.52 und NA=1.4 • Minimale r

Abstand benachbarter optischer Schnitte bestimmt durch den verwendeten z-Motor (siehe 10.)

9 .3 zeitlich (Bilder/s)

Maximale zeitliche Auflösung: 2600 Linien/s • 5 frames/s 512 Pixel x 512 Pixel • 77 frames/s 512 Pixel x 32 Pixe l

1 0. z-Motor (Art)

i nterne DC Servo-oder Schrittmotoren mit opto-elektronischer Kodierung • Option: galvanisch angetriebener hochauflösender z-Trieb (HRZ-200, Fokussierweite: 20 0 µ m )

1 0.1 z-Intervall (kleinste Schrittweite)

interner DC Motor ab 25nm • Galvanometer stage HRZ-200 7n m

1 0.2 Geschwindigkeit (Schritte/s)

Galvanometer stage HRZ-200 10H z

1 0.3 Reproduzierbarkeit (nm)

Galvanometer stage HRZ-200 40n m

1 1. Meßkanäle

bis zu 8/Bild + 2 zusätzliche Ratio-Kanäle

1 1.1 für Reflexionskanal

bis zu 8 + 2 zusätzliche Ratio-Kanäle

1 1.2 für Fluoreszenz

bis zu 8 + 2 zusätzliche Ratio-Kanäle

1 1.3 für zusätzl. Kanal-Durchlicht

bis zu 8 + 2 zusätzliche Ratio-Kanäle

1 2. Photomultiplier

2x Reflektion/Fluoreszenz, 1x Transmissio n

1 3.1 Bildaufnahme

E inige spezielle Features: Multitacking für Multifluoreszenzaufnahmen ohne Durchbluten der Kanäle, u. a. für FRET-Messungen • ROIs - frei definierbare regions of interest • Physiologie /Zeitserien – erweitert e

Z eitserienfunktionalität mit Mean-of-ROI-Messungen zur Bestimmung von pH, Ca2+ etc. • Multitimeseries – zur automatisierten Kombination verschiedener Einzelexperimente für live-cell-imaging • ReUse vo n

Aufnahmeparametern per Knopfdruck für einfachste Wiederholung und Standardisierung von Experimenten

1 3.2 Quantitative Analyse

2 -D Messfunktionen: Strecken, Winkel, Umfänge, Flächen, Histogramm, Profile, etc. • Topographie - 3-D Messfunktionen: Oberflächen-, Profil-, Rauhigkeits-, Volumenmessungen nach DIN-Regularien • 3D f o r LSM –

R ekonstrukion und Messung an 3D-Bildern • Physiologie /Zeitserien - Intensitätsverteilung unter multiplen ROIs über der Zeit • 2D und 3D Dekonvolution – Verbesserung der Auflösung von x-z-frames und 3 D- bzw .

4D-Stapeln auf der Basis einer berechneten point spread function

komplett integriertes, hoch-motorisiertes System, bestehend aus Mikroskopstativ, Lasermodul, Elektronikmodul, Scanning- und Detektionseinheit und Bildaufnahme-

und Auswertungssoftware. Hoher

A utomatisierungsgrad - Alle motorisierten Komponenten zur Steuerung der Mikroskop-

und Scanmodul-Funktion wie z-Position, x-y-Tisch, Objektivrevolver, Fluoreszenzfilter, Pinhole-Position und –Durchmes ser ,

K ondensoren, Blenden, Lampen, etc. werden unterstützt • Software-gesteuerte Laser-Intensitätsregelung • Hochflexible Kontrolle des Scanprozesses durch schnelle DSP-Steuerung (DSP: Digitaler Signalpro zessor )

1 3. Auswertungs-Software

L SM Software unter Windows NT für die Aufnahme, Prozessierung, Präsentation und Archivierung von Bilddaten, inklusive 3D-Funktionen, Zeitserienaufnahme, Multitracking, Dual Direction Scanning, Spline - Sca n

(Scanning entlang frei-definierbarer Linie), ROI (Benutzer-definierter Scan-Bereich), 3D-Projektion, quantitativer Meßfunktionen, 20 Export- und Import-Formate.

1 3.3 Rendering

Image VisArt - 3D und 4D-Render-Darstellungs- und Animationsfunktionen (inklusive Schattenprojektion mit virtueller Lichtquelle )

1 4. Extras

Trigger (je 4 Triggerein- und –ausgänge )

32 | Nr. II/2001 |transkript LABORWELT


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/

f

K O N F O K A L M I K R O S K O P E

1 . Firmenanschrift

Carl Zeiss Jena Gmb H

Carl-Zeiss-Promenade

D- 07745 Jena

Tel.: +49 3641 643400,

www.ziess.de/PASCAL

10

Fax:

+49

3641

643144,

eMail:

micro@zeiss.de

2 . Gerätebezeichnung

LSM 51 0

3. Abmessungen des Systems

Je nach Ausstattung (verwendeter Systemtisch, Lasermodule)

(Breite x Tiefe x Höhe, cm)

4 . Komplettsystem/Zusatzgerät

Komplettsystem; es stehen mehrere aufrechte und inverse Mikroskopstative aus dem Hause Zeiss Axioplan 2 imaging, Axioskop 2, Axioskop 2 FS, Axiovert 200 M) zur Auswah l

5.

Kurzbeschreibung

Komponenten

des

Systems

und

6.

mögliche

Anwendung

6 .1 Einsatzbereich

Fluoreszenz-, Durchlicht und Reflektions-Mikroskopie: • bio-medizinische Anwendungen • Materialanalys e

6 .2 optimiert für bestimmte Anwendung? b io-medizinische Anwendungen : aufgrund der extrem hohen Empfindlichkeit, Flexibilität und Geschwindigkeit besonders optimiert für die Detektion schwacher Fluoreszenzsignale und die Beobachtung dynamische r

P rozessse in sensiblen lebenden Zellen, Geweben und Organismen (z.B. GFP, FRET, FRAP, Ionen-imaging) • M aterialanalyse : berührungslose Analyse von 3D-Mikrostrukturen und Oberflächen in Reflexion, Fluoreszen z

und Polarisation. Präzise Bestimmung von geometrischen, funktionellen und Rauheits-Parametern.

7 . Lichtquelle

Typ Wellenlängen Leistung Stand-b y

A r 351/364 80mW / ja • Kr 413 40mW / ja • Ar 458/477/488/514 30mW / ja • Ar/Kr 488/568 30mW / ja • HeNe 543 1mW / N/A • HeNe 633 5mW / N/A • vorbereitet für den Einsatz von NI R-Laser n

u nd Multiphotonen-Mikroskopie • Ti/Sapphire 690 – 1064 verschiedene Fabrikate • Software-gesteuerte Intensitätsregelung aller Laser in Promille-Schritten kalibriert • Aufrüstbar für die Verwendung von gepulste n

NIR-Lasern • zusätzliche Option: Monitordiode

8 . Scanner

2 symmetrische, unabhängige galvanometrische Scan-Spiegel für Rotation, Zoom und Offset • Scanfeld in Schritten von 0. 1 ° u m 36 0 ° frei rotierbar • Scanzoom 0.7x bis 40x in Schritten von 0. 1

8 .1 Scangeschwindigkeit (Aufnahmerate/Zeit/Pxl) j e 13 Scangeschwingikeiten unidirektional und bidirektional • Zeilenfrequenz 4 – 2600Hz • Pixel dwell time: 0.64 bis 6553. 6 µ s • max. Geschwindigkeit: 2600 lines/s (bidirektionales scanning) • 5 fra m es/s 512 Pixel x

512 Pixel • 77 frames/s 512 x 32

9.

Auflösung

9 .1 in x/y-Richtung

Z oom 0.7x bis 40x in Schritten von 0.1 • von 1 x 4 bis zu 2048 Pixel x 2048 Pixel frei einstellbar • maximale Bildgröße: 4096 x 4096 Pixel (TileScan-Modus) • Optisches Auflösungsvermögen: beugungs-be g renzte s

Design des optischen Systems: Daraus ergibt sich eine maximale laterale Auflösung von ca. 100nm (FWHM) bei 351nm und NA=1.4 • Grauwertauflösung: 12 bit (4096 Stufen) pro Kanal

9 .2 in z-Richtung

o ptisches Auflösungsvermögen: beugungs-begrenztes Design des optischen Systems: daraus ergibt sich eine maximale axiale Auflösung von ca 250nm (FWHM) fü r λ =351nm, n=1.52 und NA=1.4. • Minimaler Abstan d

benachbarter optischer Schnitte bestimmt durch den verwendeten z-Motor (siehe 10.)

9 .3 zeitlich (Bilder/s)

maximal: 2600 Linien/s • 5 frames/s 512 Pixel x 512 Pixel • frames/s 512 Pixel x 32 Pixe l

1 0. z-Motor (Art)

i nterne DC Servo-oder Schrittmotoren mit opto-elektronischer Kodierung • Option: galvanisch angetriebener hochauflösender z-Trieb (HRZ-200, Fokussierweite: 20 0 µ m )

1 0.1 z-Intervall (kleinste Schrittweite)

interner DC Servomotor ab 25nm • Option Galvanometer stage HRZ-200 7n m

1 0.2 Geschwindigkeit (Schritte/s)

Galvanometer stage HRZ-200 10H z

1 0.3 Reproduzierbarkeit (nm)

Galvanometer stage HRZ-200 40n m

1 1. Meßkanäle

bis zu 8/Bild + 2 zusätzliche Ratio-Kanäle

1 1.1 für Reflexionskanal

bis zu 8 + 2 zusätzliche Ratio-Kanäle

1 1.2 für Fluoreszenz

bis zu 8 + 2 zusätzliche Ratio-Kanäle

1 1.3 für zusätzl. Kanal-Durchlicht

bis zu 8 + 2 zusätzliche Ratio-Kanäle

1 2. Photomultiplier

4 x Reflektion/Fluoreszenz, 1x Transmission, Faserauskopplung zum Anschluß eines externen Detektors • 2 x NDD (non-descanned detection) Auflichtfluoreszenz/Reflektion, 2 x NDD Transmission; zusätzlic h 1

Monitordiode

1 3.2 Quantitative Analyse

2 -D Messfunktionen: Strecken, Winkel, Umfänge, Flächen, Histogramm, Profile, etc. • Topographie - 3-D Messfunktionen: Oberflächen-, Profil-, Rauhigkeits-, Volumenmessungen nach DIN-Regularien • 3D f o r LSM –

R ekonstrukion und Messung an 3D-Bildern • Physiologie /Zeitserien - Intensitätsverteilung unter multiplen ROIs über der Zeit • 2D und 3D Dekonvolution – Verbesserung der Auflösung von x-z-frames und 3 D- bzw .

4D-Stapeln auf der Basis einer berechneten PSF

1 3.3 Rendering

Image VisArt - 3D und 4D-Render-Darstellungsfunktionen (inklusive Schattenprojektion mit virtueller Lichtquelle )

komplett integriertes, hoch-motorisiertes System, bestehend aus Mikroskopstativ, Lasermodul, Elektronikmodul, Scanning- und Detektionseinheit und Bildaufnahme-

und Auswertungssoftware. • Hoher

Automatisierungsgrad – automatisiertes Mikroskop-, Scan- und Lasermodul. Alle motorisierten Komponenten zur Steuerung der Mikroskop-

und Scanmodul-Funktion wie z-Position, x-y-Tisch, Objektivrevolver,

F luoreszenzfilter, Pinhole-Position und –Durchmesser,Kondensoren, Blenden, Lampen, etc. werden unterstützt. Software-gesteuerte Intensitätsregelung für alle Laser und Laserlinien. • Hochflexible Kontr olle de s

Scanprozesses durch schnelle DSP-Steuerung (DSP: Digitaler Signalprozessor)

1 3. Auswertungs-Software

L SM Software unter Windows NT für die Aufnahme, Prozessierung, Präsentation und Archivierung von Bilddaten, inklusive 3D-Funktionen, Zeitserienaufnahme, Multitracking, Dual Direction Scanning, Spline - Sca n

(Scanning entlang frei-definierbarer Linie), ROI (Benutzer-definierter Scan-Bereich), 3D-Projektion, quantitativer Meßfunktionen, 20 Export- und Import-Formate.

1 3.1 Bildaufnahme

E inige spezielle Features: Multitacking (Linien- oder frame-weise) für Multifluoreszenzaufnahmen ohne Durchbluten der Kanäle, u.a. für FRET Messungen • Physiologie /Zeitserien – erweiterte Zeitserien f unktionalität mit

M ean-of-ROI-Messungen zur Bestimmung von pH, Ca2+ etc. • Multitimeseries – zur automatisierten Kombination verschiedener Einzelexperimente für live-cell-imaging (incl. Autofokus- und Bleichfunktionalität)

• Rea l

R OIs – frei definierbare und selektiv abgetastete regions of interest durch Punkt-genaue Steuerung der Laserintensität mit Hilfe von AOTF (acusto optical tunable filter) • Bleich-ROIs – Bleichen von rei definierbare n

P robenstellen für FRAP-

und FRET-Messungen etc.; hoch präzises uncaging von photo-aktivierbaren caged compounds • ReUse per Knopfdruck für einfachste Wiederholung und Standardisierung von Experimenten •

Makroprogrammierung mit Visual Basic

1 4. Extras

S eparates Pinhole für jeden Detektions-Kanal • Vorbereitet für Multiphotonenanregung • Kombination mit Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie-Modul zum LSM 510 ConfoCor 2 Combi • Faserauskopplung e ine

s

D etektionskanals z.B. zum Anschluß eines Spektralphotometers • Bis zu 4 Kanäle für NDD (non-descanned detection) • Option FLIM (fluorescence life-time imaging) • Trigger (je 4 Triggerein- und –ausgäng e )

|transkript LABORWELT Nr. II/2001 | 33


P R O D U K T W E L T

Kennziffer 25LW02

Automatische Bildanalyse-Software

Kennziffer 26LW02

ERGONOM 500, ein neues Lichtmikroskop

Die Bildanalyse-Software SigmaScan

5.0 kombiniert umfangreiche

Funktionen für die Bildanalyse

und Datenmanipulation

mit einer Makrosprache auf

der Basis von Visual Basic. Das

Programm wird zum Studium

der Struktur und Größe visueller

Informationen eingesetzt,

indem Bilder zur Analyse in

Daten umgesetzt werden. Daher

eignet sich SigmaScan Pro

auch besonders zur Erzeugung

von Daten für Anwendungen,

die schwer zu messen, aber

leicht zu fotografieren sind. SigmaScan

Pro ist ein Werkzeug

zur Zählung, Messung und

Analyse digitaler Bilder am PC

und wird in der Mikroskopie

ebenso eingesetzt wie zur Röntgenbildvergrößerung,

zur Zellzählung

und -sortierung, zur

Oberflächenanalyse sowie zur

Analyse der Teilchenverteilung.

Bilder nach Form, Größe, Farbe

u.ä. kalibriert und analysiert

werden. Mit den im Programm

enthaltenen Algorithmen lassen

sich bis zu 64.000 Bilder separieren,

zählen und numerieren.

Die 140 Arbeitsblatt-Zell-Funktionen

im MS Excel-Stil ermöglichen

eine bequeme Transformation

der Daten. Fünf sich

überlagernde Ebenen erlauben

die gleichzeitige Erfassung von

Messungen wie Intensität, Färbung,

Sättigung, Entfernung,

Perimeter, Neigung, Winkel,

Fläche, Volumen und Massenmittelpunkt.

Die Bilder können

aus jeder TWAIN-unterstützten

Vorrichtung gewonnen werden

und sind mit einer Vielzahl von

Dateiformaten kompatibel und

können dementsprechend geöffnet,

verändert und gespeichert

werden.

Nach den physikalischen Gesetzen

der Optik nimmt mit

zunehmender Vergrößerung

die Tiefenschärfe ab, die maximale

Auflösung beträgt 0,5 λ.

Das ERGONOM 500 kennt

nach Angaben des Herstellers

keine Abhängigkeit zwischen

Tiefenschärfe, Vergrößerung

und Auflösung. Bei einer Auflösung

bis weit unter 250 nm

bleibt die Tiefenschärfe einstellbar,

dadurch wird eine bisher

nie erreichte räumliche Tiefenwirkung

erreicht. Das ER-

GONOM 500 schließt die große

Lücke zwischen den herkömmlichen

Lichtmikroskopen

und dem Raster-Elektronen-

Mikroskop. Die farbgetreue

Wiedergabe der Präparate

durch das ERGONOM 500 ermöglicht

auch bei starken Vergrößerungen

Beobachtungen

am lebenden Objekt. Abläufe

können aufgezeichnet werden.

Präparate werden weder bedampft,

noch oberflächenbehandelt

oder eingefärbt. Dadurch

sind Schäden und Verfälschungen

am Präparat ausgeschlossen.

Es wird ohne Vakuum

bei normaler Raumtemperatur

gearbeitet. Die Erwärmung

der Präparate durch das

ERGONOM 500 ist gering.

Die auf Visual Basic basierende

integrierte Makrosprache automatisiert

Bildmanipulation,

Bildmessung und Bildanalyse

und spart so vor allem bei oft

wiederholten Bildanalyseroutinen

viel Zeit. Der Zugriff auf

SigmaScan Pro aus anderen

Applikationen erfolgt über die

OLE-Automation oder über die

Einbindung von SigmaScan Pro

Skripts in eigene C++ oder Visual

Basic Programme.

In SigmaScan Pro können Bilder

in verschiedenen Bildtypen

gespeichert und konvertiert

werden. Diese – einschließlich

10-, 12- und 16-bit Graustufenbildern

– lassen sich vergrößern

und transformieren, gegenseitig

einfügen oder zusammenfügen.

Darüber hinaus ermöglichen

mehr als 50 Meßoptionen die

Konvertierung von Bildern in

analytische Daten, indem die

Kennziffer 27LW02

BX 61 von Olympus

Ein neues Mikroskop der BX2-

Serie, das vollständig durch einen

Motor gesteuert und bedient

werden kann, hat die

Olympus GmbH vorgestellt.

Objektivrevolver, Kondensor,

Auflichtkondensor, Filterräder

und die Fokussierung in z-Achsenrichtung

können mittels Motor

betrieben werden. Dadurch

sind komplexe Steuervorgänge

speicher- und damit reproduzierbar.

Da sich das BX-61 in

vollautomatische Systeme integrieren

läßt, ist es auch für telematische

Anwendungen geeignet.

Die Steuerung kann über

Tasten im Stativ, über einen PC

oder einen Handschalter erfolgen.

Die einzelnen Module des

BX61 können auch unabhängig

voneinander eingebaut werden.

Kennziffer 28LW02

High Speed-

Illuminator

Für Fluoreszenz–Imaging,

Multi-Dye Experimente, High

Speed-Photometrie etc. stellt

der DeltaRAM V von PTI-PhotoMed

die ideale Anregungslichtquelle

dar. Mit höchster

Lichtleistung, stufenlos einstellbarer

Bandbreite, verbesserter

Streulichtunterdrückung

und einem Wellenlängenwechsel

in weniger als 3 Millisekunden

ist der DeltaRAM V erste

Wahl, wenn es um Ratio-Fluoreszenzmessungen

geht. Zum

Schutze der zu messenden Probe

ist standardmäßig ein computergesteuerter

Shutter eingebaut.

Die Adaption des patentierten

Beleuchtungssystems

über eine Flüssiglichtleitfaser

ist an alle gängigen Mikroskope

und auch direkt an Probenkammern

möglich.

Der DeltaRAM V ist auch ohne

Lichtquelle als Monochromator

DeltaRAM V-E lieferbar. Diese

Version ist für verschiedene Einsätze

denkbar, z.B. als schneller

Emissions-Monochromator.

Impressum

Die Themenhefte |transkript

LABORWELT erscheinen vierteljährlich

als Supplement des Nachrichtenmagazins

BioTechnologie

|transkript im Verlag der

BIOCOM AG

Stralsunder Str. 58-59

D- 13355 Berlin

Tel. 030/264921-50

Fax 030/264921-11

eMail: laborwelt@biocom.de

Internet: www.biocom.de

Redaktion:

Dipl. Biol. Thomas Gabrielczyk

Dr. Pablo Serrano

Anzeigenleitung:

Oliver Schnell

Tel. 030/264921-45

eMail: schnell@biocom.de

Leserservice:

Tel. 030/264921-40

Graphik & Bildredaktion:

Heiko Fritz

Alle Beiträge sind urheberrechtlich

geschützt. Ohne schriftliche Genehmigung

der BIOCOM AG darf kein

Teil in irgendeiner Form reproduziert

oder mit elektronischen Systemen

verarbeitet, vervielfältigt oder

verbreitet werden.

© BIOCOM AG, Berlin

Bildnachweis: © Titelbild mit freundlicher

Genehmigung der Firma Zeiss

Kennziffer 29 LW 02 oder www.biocom.de Information ordern?

34 | Nr. II/2001 |transkript LABORWELT


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