Bedeutung in Forschung und Medizin

rationale.phytotherapie.de

Bedeutung in Forschung und Medizin

120 Jahre

E.coli

Bedeutung

in

Forschung

und

Medizin

J. Schulze · M. Schiemann · U. Sonnenborn


J. Schulze, M. Schiemann, U. Sonnenborn

120 Jahre E. coli

Bedeutung in Forschung und Medizin

Alfred-Nissle-Gesellschaft


Fotohinweis zum Titelblatt (von oben nach unten):

Wachstum von E. coli auf McConkey-Agar

Adhäsion von E. coli Nissle 1917 (EcN) an das Darmepithel

(Aufnahme L. Mandel & I. Trebichavsky)

Rasterelektronenmikroskopische Aufnahme

von EcN (Aufnahme H.J. Jacob)

Autoren:

Priv.-Doz. Dr. rer.nat. habil. Jürgen Schulze

Dipl.-Biol. Martina Schiemann

Dr. rer. nat. Ulrich Sonnenborn

Herausgeber:

Alfred-Nissle-Gesellschaft

Internationale Vereinigung zur Förderung

der mikroökologischen Forschung

und mikrobiologischen Therapie e.V.

58089 Hagen, Deutschland

Brüninghausstraße 16

Tel. +49(0)23 31- 93 95 95

Fax +49(0)23 31- 93 95 99

E-Mail: office@a-nissle-ges.de

Im Fokus dieser Broschüre

steht der am besten untersuchte

Mikroorganismus auf diesem Planeten,

das Bakterium

Escherichia coli (E. coli),

mit seiner Bedeutung für Gesundheit

und Krankheit sowie für die medizinische,

mikrobiologische, biochemische und

molekularbiologische Forschung

des 20sten und 21sten Jahrhunderts.

Alle Rechte, insbesondere das Recht der Vervielfältigung und Verbreitung sowie der Übersetzung

in fremde Sprachen vorbehalten. Kein Teil des Werkes darf in irgendeiner Form

(Fotokopie, Mikrofilm oder ein anderes Verfahren) ohne schriftliche Genehmigung reproduziert

werden.

© 2006 Alfred-Nissle-Gesellschaft e.V. · 58089 Hagen, Deutschland

ISBN 3-00-018600-X

2 3


Inhaltsverzeichnis

Seite

Theodor Escherich – Erstbeschreiber des Bacterium coli commune 7

Mikrobiologische Kurzcharakteristik von E. coli 11

E. coli K-12: Das beliebteste „Versuchstier“ der Molekulargenetiker 13

E. coli in der Biotechnologie 15

„E. coli is the first to come, and the last to go“ 17

Intra- und extraintestinal pathogene E.-coli-Varianten 19

Alfred NISSLEs Hypothese zum Koli-Antagonismus

und sein „neues Heilprinzip“ 25

Das „Auf und Ab“ der Therapie mit lebenden Mikroorganismen 29

E. coli Nissle 1917:

der weltweit am besten untersuchte probiotische E.-coli-Stamm 32

Indikationsspektrum für E. coli Nissle 1917 und klinische Studien

mit Evidence-Based-Medicine-Charakter 38

Ausblick 48

Literatur 51

4 5


Theodor Escherich –

Erstbeschreiber des Bacterium coli commune

Am 14. Juli des Jahres 1885 hielt der damals 27-jährige Theodor ESCHERICH *

vor der Gesellschaft für Morphologie und Physiologie in München einen

Vortrag mit dem Titel „Die Darmbacterien des Neugeborenen und Säuglings“

(ESCHERICH, 1885) [Abb. 1]. Er berichtete über seine Forschungsergebnisse

und trug dem Auditorium vor, dass das Mekonium

des Neugeborenen steril sei, aber innerhalb der

ersten Lebensstunden von Mikroorganismen besiedelt

werde. Weil er fest davon überzeugt war, dass

es „für die Pathologie und Therapie der mycotischen

Darmerkrankungen unentbehrlich sei“,

versuchte er, „die scheinbar ganz regellose und von

tausend Zufälligkeiten abhängige Menge der im

normalen Stuhl- und Darmkanal vorkommenden

Bacterien zu entwirren.“ Dazu entwickelte er spezielle

Kultivierungsmethoden mit flüssigen und

festen Nährmedien, die im Prinzip noch heute zum

Handwerkszeug eines klassischen mikrobiologischen

Labors gehören.

Prof. Dr. med. Theodor ESCHERICH

(1857 – 1911)

Nach eineinhalbjähriger intensiver Forschung präsentierte er diese und weitere

Ergebnisse in seiner umfangreichen Habilitationsschrift „Die Darmbakterien

des Säuglings und ihre Beziehungen zur Physiologie der Verdauung“, die

1886 im Verlag von Ferdinand Enke, Stuttgart (ESCHERICH, 1886) abgedruckt

wurde. Hier teilte er u.a. minutiös seine Erkenntnisse zum Vorkommen, zur

Gestalt und zu den Eigenschaften der von ihm beobachteten Bakterien mit,

die er – je nach Häufigkeit und Menge – in obligate und fakultative

Darmbakterien einteilte. Im Säuglingsstuhl fielen ihm hauptsächlich zwei

Bakterientypen auf, die er als „obligate Milchkotharten“ bezeichnete. Eine

davon war – wie bereits in seinem 1885 gehaltenen Vortrag dargestellt –

besonders häufig in den unteren Darmabschnitten anzutreffen, weshalb

Theodor ESCHERICH sie als typische „Colonbacterien“ bezeichnete und ihnen

den Artnamen „Bacterium coli commune“, das allgemeine Dickdarmbakterium,

gab [Abb. 2]. „Dasselbe findet sich sowohl im Mekoniumkothe als bei

* Weiteres über Leben und Arbeit von Theodor Escherich kann der Monographie von

B.A. Oberbauer "Theodor Escherich – Leben und Werk", Paul-Ehrlich-Gesellschaft für

Chemotherapie (Hrsg.), Futuramed Verlag München, 1992, entnommen werden.

6 7


Abb. 2

Die erste Abbildung vom

Bacterium coli commune. Dauerpräparat

von Th. ESCHERICH, 1886: angefärbt mit

Gentianaviolett in wäßrigem Anilin.

In: Die Darmbakterien des Säuglings und ihre

Beziehungen zur Physiologie der Verdauung.

Ferdinand Enke-Verlag, Stuttgart.

Milch-, Fleischdiät und gemischter Kost

und kann insofern als ein diesen verschiedenen

Kotharten „gemeinsamer“

Spaltpilz bezeichnet werden, während

die Bakterienvegetation derselben im

Übrigen große Verschiedenheiten darbietet

...“. Später fand er das Bacterium

coli commune auch als obligates Darmbakterium

in den Fäzes Erwachsener.

Neben der Erstbeschreibung weiterer

Darmbakterien (z.B. Klebsiella, Campylobacter)

ist es ein weiteres großes

Verdienst ESCHERICHs, auch auf mikroökologische

(dieser Begriff wurde allerdings

erst 1960 von Helmut HAENEL

eingeführt) Zusammenhänge im Darm

hingewiesen zu haben. Im Stuhl von

gestillten Kindern stellte er eine auffällige

Verminderung oder sogar das

Fehlen von gelatineverflüssigenden Keimen, von Eiweißspaltprodukten und

von fäkalem Geruch fest, was später als antiputrider Effekt der Muttermilch

1885 Erstbeschreibung (TH. ESCHERICH): Bacterium coli commune

/86 später Bacterium coli

1919 Systematisierung (A. CASTELLANI, A.J. CHALMERS):

Vorschlag zur Umbenennung in

1930 Internationaler Mikrobiologenkongress, Paris:

offizielle Umbenennung in

1953 Internationaler Mikrobiologenkongress, Rom:

Streichung der Bezeichnung

zugunsten von

1958 Judicial Commission:

„Conservation of the Enterobacteriacea, ...“

verbindliche Veröffentlichung zur Bezeichnung

Escherichia coli

Escherichia coli

Bacterium coli

Escherichia coli

Escherichia coli

Abb. 1 Titelseite der Arbeit, in der ESCHERICH erstmals das Bacterium coli commune beschrieb.

Abb. 3 120 Jahre Escherichia coli: von der Erstbeschreibung als Bacterium coli commune zur heute

gültigen Bezeichnung Escherichia coli.

8 9


eschrieben wurde. Nach seinen Befunden bezeichnete ESCHERICH die

Besiedelung der oberen Darmabschnitte als monoton und spärlich, und stellte

fest, dass die Zunahme der Bakterien sprunghaft an der Ileozäkalklappe

beginnt. Er vermutete, dass die Vermehrung der Bakterien unabhängig von

der Nahrungszufuhr sei und dass die Bakterien ihren Nahrungsbedarf aus der

Verstoffwechselung von Darmsekreten decken würden.

Mikrobiologische Kurzcharakteristik von E. coli

E. coli gehört zur Familie der Enterobacteriaceae und steht in enger verwandtschaftlicher

Nachbarschaft zur Gattung Shigella und in naher Verwandtschaft

zu den Gattungen Citrobacter, Salmonella und Klebsiella [Abb. 4].

Trotz aller Weitsicht konnte Theodor ESCHERICH nicht ahnen, dass das von

ihm entdeckte Bacterium coli und die später nach ihm benannte Spezies

Escherichia coli (E. coli) [Abb. 3] zum weltberühmten Modellobjekt der physiologischen

und pathogenitätsorientierten Körperfloraforschung sowie der

Biochemiker und Molekulargenetiker aufsteigen sollte.

100

E. tarda

S. rubidaea

S. liquefaciens

S. marcescens

New species

H. alvei

Erwinia

Biogroups of

Enterobacter

agglomerans

ENTEROBACTERIACEAE

E. sakazakii

E. cloacae

New species

E. aerogenes

Klebsiella

species

Shigella

species

E. coli

C. freundii

C. diversus

Salmonella

Arizona

Y. ruckeri

Y. intermedia

Y. frederiksenii

Y. kristensenii

Y. enterocolitica

Y. pseudotuberculosis

Y. pestis

M. morganii

Biogroups of

P. alcalifaciens

P. stuartii

P. rettgeri

P. vulgaris

P. mirabilis

90

80

70

60

50

40

30

20

10

0

Aeromonas

Pateurella

Common Ancestor

Abb. 4 Stammbaum und Verwandtschaftsbeziehungen der Familie Enterobacteriaceae

(nach BRENNER, 1984).

Das E.-coli-Bakterium ist ein gramnegatives Stäbchen von etwa 1,1 – 1,5 µm

x 2,0 – 6,0 µm Größe. Es wächst unter aeroben und anaeroben Bedingungen

(fakultativ anaerob), weil es zwei verschiedene Redoxsysteme besitzt

(Menachinon und Ubichinon), die eine Energiegewinnung aus dem katabolen

Stoffwechsel sowohl unter aeroben als auch unter anaeroben Bedingungen

ermöglichen. Unter optimalen Wachstumsbedingungen ist die Zellteilungsgeschwindigkeit

der Kolibakterien rasant: Alle 20 Minuten kann sich die Zahl

der Bakterienzellen verdoppeln. Allerdings werden diese für die Populationsdynamik

idealen Zustände im normalen Umfeld der Bakterien nicht erreicht.

MIDTVEDT (1998) berichtet von einer Verdoppelung der Zellen im Zäkum der Ratte

nach etwa 100 Minuten, im menschlichen Darm kann es 30 Stunden dauern

und in wässrigen Biotopen im Freien bis zu mehreren Tagen (HECKER, 1998).

10 11


Bereits ESCHERICH beobachtete die morphologische Vielfalt der Kolonieformen

dieser Bakterien. Noch zahlreicher sind die serologischen Varianten.

In der medizinischen Mikrobiologie ist die Serologie ein klassisches Keimdifferenzierungsverfahren.

Die serologische Einteilung der unterschiedlichen

E.-coli-Stämme wird durch die Serotypisierung ihrer O-, K- und H-Antigene

möglich. O-Antigene stellen dabei hitzestabile Bestandteile des Lipopolysaccharid-Komplexes

(LPS) der äußeren Zellmembran, K-Antigene Polysaccharide

der Kapsel und H-Antigene Geißel- oder Flagellenantigene dar [Abb. 5].

Fimbrien

Ribosomen

Chromosom

Plasmid

Cytoplasma

Flagellen

(H-Serotyp)

Kapsel

(K-Serotyp)

Zellwandaufbau

(O-Serotyp)

Nach HACKER und KRUIS (1998) könnten rund 50.000 unterschiedliche Serovare

in der Natur vorkommen, die sich aus der Kombination verschiedener

Antigenstrukturen ergeben. Bisher sind 173 Oberflächen-(O-), 80 Kapsel-

(K-) und 56 Geißel-(H-)Antigene bei E. coli bekannt. Zudem gibt es noch mehr

als 100 Adhäsin-Varianten, die weitere Unterschiede im serologischen Verhalten

bedingen und Unterschiede in der Rezeptorerkennung aufweisen.

n n n n

Periplasma

Lipopolysaccharid

innere äußere (LPS)

Membran

Abb. 5 Schematischer Längsschnitt und Zellwandaufbau einer gramnegativen E.-coli-Zelle

(hier: E. coli vom Serotyp O6:K5:H1)

E. coli K-12:

Das beliebteste „Versuchstier“ der Molekulargenetiker

(ARBER, 1982)

Es war reiner Zufall, dass 1922 aus dem Stuhl eines an Diphtherie erkrankten

Patienten eine E.-coli-Variante isoliert wurde, die wegen ihrer völligen Harmlosigkeit

auffiel und mit der Laborbezeichnung „K-12“ einen Platz in der

bakteriologischen Stammsammlung der Medical School der Stanford-

University in Kalifornien fand. Bereits im zweiten Drittel des vergangenen

Jahrhunderts suchten Genforscher mit der Absicht, die Frage zu beantworten:

„Wie funktionieren Gene und wie kontrollieren sie spezifische Merkmale?“

nach Studienobjekten, die leicht und schnell und in unbegrenzter Menge zu

züchten waren, und die zudem geeignet waren, genetische Veränderungen

anhand phänotypischer Ausprägungen offenzulegen. So fand die K-12-Variante

von E. coli das besondere Interesse eines amerikanischen Forscherteams

um J. LEDERBERG und E. TATUM (1946). Als dann bei diesem E. coli K-12

parasexuelle Vorgänge – d.h. die Fähigkeit des Austausches genetischen

Materials zwischen zwei Bakterienzellen – entdeckt wurden, war die Basis

für die Durchführbarkeit von experimentellen Genaustauschen gegeben, und

E. coli K-12 avancierte zum Standardobjekt der Mikrobengenetiker und Molekularbiologen.

Ähnlich wie die klassischen Tier- und Pflanzenzüchter suchten auch die Mikrobiologen

unter ihrem „Haustier“ E. coli nach neuen Stämmen. Mit Hilfe von

Röntgen- und UV-Strahlen führten sie verschiedene Mutationen in den K-12-

“Wildstamm“ ein. Sehr bald wurde mit dem Ausgangsstamm und den daraus

hergestellten Varianten in vielen Laboratorien weltweit gearbeitet. Diese

Stämme weisen Veränderungen in den verschiedensten Genen auf, sie tragen

z.B. Merkmale für Auxotrophien (Stämme mit zusätzlichen Nährstoffbedürfnissen),

Resistenzen und andere Mutationen. Als Sicherheitsmaßnahme

wurden diese Mutantenstämme so verändert, dass sie

– keine Adhäsionsorganellen (Fimbrien) haben, um den Darm zu besiedeln,

– fremde Plasmide ohne die Möglichkeit der Weitergabe an artfremde Zellen

zuverlässig aufnehmen können,

in der freien Natur nicht überlebensfähig sind, und

– UV- und Chemikalien-empfindlich sind.

12 13


Unterdessen sind schätzungsweise mehr als 3000 verschiedene Mutanten

von E. coli K-12 bekannt, mit deren Hilfe grundlegende Erkenntnisse zur

Biochemie und Zellphysiologie, zur Genregulation und zum Gentransport

erhalten wurden. Einer der ersten Bakterienstämme, dessen Genom vollständig

sequenziert wurde, war folgerichtig ein E. coli K-12-Stamm (MG 1655)

(BLATTNER et al., 1997). Die erste genetische Karte des E. coli K-12-Genoms

wurde bereits im Jahr 1964 u.a. mit Hilfe von Restriktionsenzymen, die Stränge

der DNA an spezifischen Basensequenzen schneiden, erstellt (TAYLOR &

THOMAN, 1964). Während auf ihr

99 Gene vermerkt waren, wies die

Genkarte aus dem Jahr 1990 schon

1403 Gene auf (BACHMANN, 1990).

Die 1997 veröffentlichte vollständige

Genomsequenz des E. coli K-12-Stammes

ergab etwa 4300 Gene [Abb. 6].

Mit einer Größe von 4,7 x 10 6 Basenpaaren

ist das Genom von E. coli K-12

um den Faktor 1000 kleiner als das

menschliche Genom.

Die Bedeutung von Escherichia coli für

den internationalen Wissenschaftsfortschritt

wird auch dadurch unterstrichen,

dass in den letzten 50 Jahren

14 Nobelpreise für Arbeiten an und

mit E. coli vergeben wurden.

Abb. 6 Genom E. coli K-12 (MG1655),

Größe 4,7 x 10 6 Basenpaare

(BLUM-OEHLER, 2001).

E. coli in der Biotechnologie

Im Laufe der immer genaueren Charakterisierung des Genoms von E. coli

erschlossen sich mit gentechnisch veränderten E.-coli-Bakterien vielfältige

Anwendungsgebiete. S. COHEN und H. BOYER zeigten 1973, wie man

menschliches Insulin mit Hilfe eines gentechnisch veränderten E.-coli-Stammes

herstellen kann. Der modernen Gen- und Biotechnologie gelang es nun,

rekombinante Arzneimittel herzustellen. Dabei wird das Gen für ein menschliches

Protein in das Erbgut der Bakterien eingeschleust, die anschließend

dieses Eiweiß herstellen [Abb. 7].

Wie Fremdgene in E. coli eingeschleust werden

DNA

Menschliche Zelle

Restriktionsenzyme

Ligase

DNA

E.-coli-Zelle

Abb. 7

Aus einer menschlichen Zelle wird die DNA isoliert. Mit Restriktionsenzymen („molekulare Scheren“)

wird ein DNA-Fragment mit dem gesuchten Gen ausgeschnitten und mit Hilfe von Ligasen in einen

ebenfalls aufgeschnittenen DNA-Plasmidring von E. coli eingeführt. Nach Einschleusung dieses

Konstrukts in die E.-coli-Zelle enthält das Genom nun z. B. die genetische Information für das

menschliche Hormon Insulin. Artfremde Proteine, die in Bakterien exprimiert werden, nennt man

rekombinante Proteine.

14 15


Als erstes rekombinantes Medikament wurde 1982 das Hormon Humaninsulin

in den Markt eingeführt. Danach wurden Gene für weitere Proteine

menschlicher, tierischer, pflanzlicher und bakterieller Herkunft erfolgreich in

das E.-coli-Genom integriert [Abb. 8].

Von E. coli exprimierte Pharmaproteine:







Humaninsulin

Wachstumshormone (Somatostatin, Somatotropin)

Immunmodulatoren (Interferone, Interleukine, TNFα)

Wachstumsfaktoren (G-CSF, EGF)

Blutfaktoren, Gerinnungshemmer (t-PA, Staphylokinase)

Enzyme

„E. coli is the first to come, and the last to go”

(MIDTVEDT, 1998)

Bis zur Geburt entwickelt sich der Fetus im Mutterleib unter keimfreien Bedingungen.

Die Beobachtung ESCHERICHs, dass sich bereits wenige Stunden

nach der Geburt „Colonbacterien“ im Mekonium nachweisen lassen, hat auch

heute noch Bestand. Die sich ansiedelnden Keime stammen aus der Körperflora

der Mutter oder aus der Umgebung während der Geburt bzw. der ersten

Lebensstunden (SONNENBORN et al, 1990). Fakultativ anaerobe Keime, allen

voran E. coli, sind die Erstbesiedler des menschlichen Gastrointestinaltrakts

[Abb. 9].

Abb. 8 Beispiele für von E. coli exprimierte pharmazeutisch verwendete Proteine und Peptide.

10

Keimzahl (log/g Fäzes)

8

6

4

14 15 17 20 1 8 11 14 16 3 8 16 6 1 12 6 8 21 8 12 14 3 12 24 6 10 18 Stunden

1

2

3 4 5 6 7 8 9 Tage

Aerobier: E. coli

Lactobacillus Enterococcus

Anaerobier:

Bacteroides

Bifidobacterium

Abb. 9 Sequenzielle mikrobielle Besiedlung des Neugeborenendarms durch aerobe und anaerobe

Bakterien (nach HOOGKAMP-KORSTANJE et al., 1979).

Sie betreiben anfangs im zunächst noch sauerstoffhaltigen Dickdarm einen

aeroben Stoffwechsel und senken dadurch den O 2 -Gehalt und das Redoxpotential

im Darmlumen so weit herab, dass sich nachfolgend anaerobe

Darmbakterien – wie Bifidobakterien, Bacteroides-Keime u. a. – ansiedeln

können. Den Verbrauch von Sauerstoff durch die Colonbakterien hatte bereits

ESCHERICH beobachtet. Da über die Nahrung durch Abschlucken, aber auch

über die Darmwand ständig neuer Sauerstoff in das Darmlumen eingebracht

wird, bleibt diese Aufgabe der „Milieubereitung“ für E. coli während des

gesamten Lebens des Wirtsorganismus erhalten. Die Besiedlungsdichte des

16 17


Magen-Darmtrakts nimmt von proximal nach distal zu [Abb. 10]. Die durchschnittliche

Keimkonzentration von E. coli im Dickdarm unterliegt interindividuell

aber auch intraindividuell großen Schwankungen und beträgt beim

gesunden Erwachsenen zwischen 10 4 und 10 10 Kolonie-bildende Einheiten

pro Gramm Fäzes (KBE/g). Da der über die Dickdarmwand ins Darmlumen

diffundierende Sauerstoff für die Kolibakterien als chemotaktischer Reiz wirkt,

sind diese sowohl im Lumen als auch in großer Zahl an der Mukosa zu finden.

Durch diese „Anreicherung“ von E. coli an der Darmschleimhaut erhöht sich

der Gehalt der wandständigen Mikroflora an aeroben Keimen.

Mund

Ösophagus

Magen

Duodenum

Jejunum

Ileum

Kolon

Rektum

0

Aerobier

Anaerobier

E. coli Laktobazillen

[KBE/g] [KBE/g]

0 - 10 2 10 3 - 10 6

0 - 10 2 10 3 - 10 6

0 - 10 3 0 - 10 5

10 2 - 10 7 10 2 - 10 8

10 4 - 10 10 10 4 - 10 9

10 2 10 4 10 6 10 8 10 10 10 12

Intra- und extraintestinal pathogene E.-coli-Varianten

ESCHERICH war anfangs überzeugt, dass es sich bei dem Bacterium coli

commune um einen „harmlosen Schmarotzer“ handelt. Sicher hatte er damit

recht, weil die meisten der oben erwähnten rund 50.000 Serovare zu den

kommensalen Darmkeimen zu zählen sind. Allerdings berichtete ESCHERICH

bereits 1894 in einem publizierten Vortrag „über Cystitis bei Kindern

hervorgerufen durch das Bacterium coli commune“ (ESCHERICH, 1894).

Er vermutete, dass die Darmbakterien als Quelle für Harnwegsinfektionen

(Blasen- und Niereninfektionen) in Frage kämen. Diese frühe Hypothese, dass

u.U. harnwegspathogene E. coli im Darm symptomlos persistieren und aus

verschiedenen Gründen in die harnableitenden Organe gelangen und dort

Entzündungen verursachen könnten, ist unterdessen mit modernen biochemischen

und molekularbiologischen Methoden bestätigt worden (HACKER et al.,

1983; BLUM et al., 1995; PLOS et al., 1995).

Über die wirtsspezifische pathogene Potenz verschiedener E.-coli-Varianten

[Abb. 11] gibt es mittlerweile eine enorm umfangreiche Sammlung von

Publikationen.

Darminfektionen

Harnwegsinfektionen

Sepsis

Meningitis

Diarrhö

Sepsis

Mastitis

Abb. 10 Unterschiedliche Populationsdichten an aeroben und anaeroben Keimen in verschiedenen

Abschnitten des Oro-Gastro-Intestinaltrakts.

Obwohl sich in den letzten Jahren Laborbefunde mehren, dass Neugeborene

in den hochindustrialisierten Ländern immer später mit E. coli besiedelt werden,

und dass die Keimzahlen von E. coli in Stuhlproben von Patienten (vornehmlich

von Allergikern) reduziert sind, bzw. sich manchmal sogar keine Kolibakterien

nachweisen lassen (ADLERBERTH et al, 2006; NOWROUZIAN et al., 2003;

SEPP et al., 2000), gilt auch heute noch die Aussage von ESCHERICH:

„Die Keime der Colonbacterien, die eine sehr große Verbreitung zu besitzen

scheinen, … finden sich regelmäßig schon im Mekonium und bleiben von da

bis zum Tode des Wirthes und darüber hinaus ständige Bewohner des Darmkanals.“

Diarrhö

Ödemkrankheiten

Harnwegsinfektionen

Diarrhö

Sepsis

Sepsis

Abb. 11 Wirtsspektrum und Krankheitsbilder intestinaler und extraintestinaler pathogener E. coli.

18 19


In Abhängigkeit von der Schädigungsstrategie werden pathogene E. coli

in sog. „Pathotypen“ eingeteilt (HACKER & HEESEMANN, 2000) [Abb. 12].

Pathogene E.-coli-Varianten sind durch das Vorkommen verschiedener

Virulenzfaktoren, wie z. B. verschiedenen Toxinen, besonderen Fimbrien-

Adhäsinen, Invasinen oder Sekretionssystemen, gekennzeichnet [Abb. 13].

Sie können sowohl plasmid- oder phagen- als auch chromosomal kodiert im

Bakteriengenom vorliegen.

Darmpathogene E. coli werden aufgrund ihrer in den letzten Jahren aufgedeckten

Virulenzfaktoren in derzeit 6 Klassen unterteilt, die Durchfallerkrankungen

mit unterschiedlichen klinischen Erscheinungsformen verursachen

(KAPER et al., 2004). Dabei werden die klinische Symptomatik sowie die von

den Stämmen gebildeten Virulenzmerkmale, die Adhäsionsfaktoren und

Toxine, als Einteilungskriterien verwendet. Die in früheren Jahren vor allem

angewandte Serotypisierung zur Identifizierung und Klassifizierung klinischer

Isolate wird heute immer mehr durch den molekulargenetischen Nachweis der

jetzt bekannten bakteriellen Virulenz- und Pathogenitätsgene ersetzt, unterstützt

durch den Nachweis spezifischer pathogener Merkmale.

EPEC

EIEC

EHEC

Toxinbildung

Toxinbildung

Toxinbildung

ETEC

Toxinbildung

EAggEC

UPEC SEPEC MENEC

Abb. 12 Pathotypen und Pathogenitätsmechanismen humanpathogener E. coli

(nach HACKER & HEESEMANN, 2000).

Enteropathogene E. coli (EPEC) wurden erstmals in den 40er Jahren des

vergangenen Jahrhunderts als Erreger der Säuglingsenteritis während eines

massiven Ausbruchs in Großbritannien isoliert. Enteropathogene E. coli nutzen

zum Andocken an die Darmschleimhaut spezifische Fimbrien-Adhäsine

Virulenzmerkmale





Adhäsine (CFA I/II-, P-, M-, S-Fimbrien)

Toxine

(Shiga-Toxine, hitzestabile und hitzelabile Toxine, Hämolysin, CNF)

Invasine

Typ-III-Sekretionsapparat (biologische „Injektionsspritze“)

Abb. 13 Beispiele für Virulenzfaktoren pathogener E.-coli-Stämme.

(bundle-forming pili, Bfp) und injizieren über ein Typ-III-Sekretionssystem

bakterielle Signalproteine in die Epithelzelle, was zu Veränderungen des

Aktingerüsts führt und letztlich zu einer Destruktion der Mikrovilli. Sie gelten

heute vor allem in Entwicklungsländern als Verursacher von wässrigen Durchfallerkrankungen

mit Fieber und Erbrechen bei Säuglingen und Kleinkindern

unter 2 Jahren (LEVINE & EDELMAN, 1984; CRAVIOTO et al., 1991). EPEC

sind auch für Tiere pathogen und verursachen z.B. beim Kaninchen große

Verluste in der Jungtieraufzucht.

Infektionen durch enterohämorrhagische E. coli (EHEC) traten erstmals

1982 in den USA auf. Sie sind im Gegensatz zu anderen darmpathogenen

E.-coli-Stämmen, die sich nur beim Menschen finden und deren Übertragung

durch fäkal kontaminiertes Gemüse oder durch Schmierinfektionen erfolgt,

als Zoonoseerreger einzustufen (BALJER & WIELER, 1999). Sie repräsentieren

eine Untergruppe der auch als Shiga-Toxin-produzierende (STEC) bzw. Vero-

Toxin-produzierende (VTEC) bezeichneten E. coli und kommen in der Natur

relativ häufig vor. E. coli dieses Typs sind Auslöser meist blutiger Diarrhöen

(MACDONALD et al., 1988). Bei 10 -20 % der Erkrankten entwickelt sich als

schwere Verlaufsform eine hämorrhagische Kolitis. Enterohämorrhagische

E. coli schleusen nach der Anheftung Enterohämolysin und weitere Toxine in

die Mukosazelle ein, was zu blutigen Läsionen im Darm führen kann. Da die

Toxine auch in andere Organe gelangen können, kommt es u.U. zu fatalen

Schäden im Nierengewebe (Hämolytisch-urämisches Syndrom, HUS) sowie

zur Thrombotisch-Thrombozytopenischen Purpura (TTP) (MACDONALD et al.,

1988; KARMALI, 1989). Nach heutiger Kenntnis sind landwirtschaftliche

Nutztiere in Massentierhaltung, vor allem Rinder, die wichtigsten Erregerreservoire

für Infektionen des Menschen (BEUTIN et al., 1995).

Durch enterotoxische E. coli (ETEC) bedingte Infektionen sind eine weit

verbreitete Ursache von Darmerkrankungen bei Kleinkindern sowie bei

Reisenden in tropischen und subtropischen Ländern (Reisediarrhö). ETEC

besitzen typische Adhäsine und schädigen die Enterozyten über zwei Toxine

20 21


(hitzelabile und/oder hitzestabile Enterotoxine). ETEC-Infektionen äußern

sich in einem Cholera-ähnlichen Krankheitsbild. Es kommt zu wässrigen

Durchfällen, abdominalen Krämpfen, Fieber und Erbrechen (LEVINE, 1987).

Beim Tier sind vor allem neugeborene Lämmer, Kälber und Ferkel betroffen

(KENNAN & MONCKTON, 1990; TZIPORI et al., 1981).

Enteroaggregative E. coli (EAggEC) wurden bisher vor allem bei Kindern als

Infektionserreger nachgewiesen und verursachen wässrige, oft persistierende

Durchfälle. EAggEC haften an den Enterozyten des Dünndarms und lagern

sich in typischer Weise zu Aggregaten zusammen (NATARO & KAPER, 1998).

Sie schädigen durch Bildung eines besonderen Toxins (EAST I), das dem

hitzestabilen Enterotoxin der ETEC ähnelt.

Enteroinvasive E. coli (EIEC) besitzen die Fähigkeit, in die Darmwand einzudringen.

Sie sind bezüglich ihrer pathogenen Eigenschaften den Ruhrbakterien

(Shigellen) vergleichbar und verursachen beim Menschen Ruhr-ähnliche

Symptome, wie anhaltende Bauchkrämpfe (Tenesmen) und breiige, blutige

und blutig-schleimige Diarrhöen (FORMAL, 1983). Es kommt zu lokalen

Entzündungen mit Bildung von Geschwüren durch Einwandern der Erreger in

die Dickdarmwand. Eine Tierpathogenität ist nicht bekannt.

Diffus adhärente E. coli (DAEC) wurden als Infektionsauslöser vor allem bei

Kindern mit wässrigen Durchfällen nachgewiesen (NATARO & KAPER, 1998).

Über ihre Pathogenitätsmechanismen ist noch wenig bekannt.

Nekrotoxische E. coli (NTEC) zeichnen sich durch die Bildung eines bestimmten

Typs von Toxinen, den Cytonekrose-Faktoren (CNF) aus (DE RYCKE

et al., 1990). CNF1-bildende NTEC sind vor allem beim Menschen mit extraintestinalen

Koli-Infektionen nachgewiesen worden, während CNF2-bildende

NTEC bei Kälbern sowohl mit Durchfall als auch mit Septikämien in Verbindung

gebracht werden (CAPRIOLI et al., 1987).

Extraintestinale Infektionen entstehen durch das Vordringen von Kolibakterien,

die sich z.T. aus der eigenen Darmflora rekrutieren, in ansonsten sterile oder

spärlich besiedelte Bereiche des Organismus, in denen eine Vermehrung

begünstigt wird. Bei extraintestinalen Infektionen spielt E. coli vor allem als

Erreger von Harnwegsinfekten (UPEC = uropathogene E. coli) eine wichtige

Rolle (JOHNSON & STAMM, 1989). Uropathogene E. coli heften sich mit

spezifischen Adhäsinen (z. B. P-Fimbrien, S-Fimbrien) an uroepitheliale Zellen

und setzen zur Schädigung des Epithels ein cytolytisch wirkendes Toxin

(α-Hämolysin) ein. Gleichzeitig entziehen sie sich den Attacken der Immunabwehr

durch Kapselbildung. UPEC können die Harnwege von Menschen,

Affen und Hunden infizieren.

Ein wesentlich selteneres Krankheitsbild ist die Sepsis oder Meningitis bei

Neugeborenen, die durch Sepsis/Meningitis-assoziierte E. coli (SEPEC,

MENEC) hervorgerufen werden kann (DAWSON et al., 1999). Sepsisauslösende

E. coli nutzen ähnliche Pathogenitätsfaktoren wie die UPEC. Durch E. coli

ausgelöste Sepsis kommt bei Mensch, Rind, Schaf, Schwein und Geflügel vor.

SEPEC schützen sich vor der Attacke durch das Komplementsystem durch

Besitz bestimmter Kapseltypen und langkettiger Lipopolysaccharide. Dies

ermöglicht ihnen, längerfristig im Blutserum zu überleben. SEPEC werden

daher als „serumresistent“ bezeichnet. Meningitisauslösende E. coli (MENEC)

sind E.-coli-Varianten, die auch Harnwegsinfektionen verursachen können.

Sie werden beim Menschen während der Geburt von der Mutter auf das

Neugeborene übertragen, bei dem sie eine Meningitis auslösen können.

MENEC schützen sich ebenfalls durch Bildung einer Kapsel (oft vom K1-Serotyp).

Sie docken mit pathogenen S-Fimbrien-Adhäsinen an Epithel- und Endothelzellen

an und können diese Gewebsbarrieren durchdringen.

Nach der vollständigen Genom-Sequenzierung des E. coli K-12-Stammes

MG 1655 im Jahr 1997 folgte die Entschlüsselung weiterer Genome von

apathogenen wie auch pathogenen Varianten der Spezies. Durch Vergleiche

der jeweiligen Genomsequenzen konnten Unterschiede in der genetischen

Organisation aufgezeigt und Hinweise auf die phylogenetische Entwicklung

von Bakterienstämmen gegeben werden. Die Analyse der Sequenzdaten hat

zu der Erkenntnis geführt, dass bakterielle Genome häufig aus einem Kerngenom

bestehen, aber daneben zusätzliche DNA-Sequenzen besitzen, die

möglicherweise über horizontalen Gentransfer in das Genom integriert

wurden [Abb. 14].

Kerngenom

Phagen

Plasmide

Genom-Inseln

Pathogenität Resistenz Sekretion Metabolismus Degradation Symbiose

Abb. 14 Genomstruktur von Bakterien (nach HACKER et al., 2001)

22 23


Hierbei könnte die Integration von Fremd-DNA über mobile genetische

Elemente (z.B. Plasmide, Bakteriophagen, Transposons), Mutationen und intragenomische

Umlagerungen wesentlich zur Ausbildung eines flexiblen

Genpools beitragen (DOBRINDT et al., 2004; HACKER & KAPER, 2000). Bei

der Entstehung von pathogenen Varianten durch horizontalen Gentransfer

[Abb. 15] spielen auch die sog. „Pathogenitätsinseln“ (große chromosomale

DNA-Regionen mit DNA-Sequenzen, die sich in ihrer Zusammensetzung stark

vom Kern-Genom unterscheiden), eine besondere Rolle (HACKER et al.,

1997). Hier sind gehäuft Gene für die Expression von bestimmten Virulenzbzw.

Fitnessfaktoren lokalisiert. Pathogene und apathogene E.-coli-Stämme

unterscheiden sich durch das Vorhandensein oder Fehlen dieser Faktoren auf

den vorhandenen genomischen Inseln (GROZDANOV et al., 2004).

Bakterien tauschen ihre

DNA aus

Die der Pathogenität zu Grunde

liegenden Virulenzgene befinden

sich häufig auf übertragbaren

DNA-Elementen. Es wird vermutet,

dass die Entstehung der

EHEC-Stämme durch horizontalen

Gentransfer via Plasmide

und Bakteriophagen erfolgte.

Während z.B. die evolutionäre

Trennung der Spezies E. coli und

Salmonella ssp. auf die Zeit vor

ca. 160 Millionen Jahren datiert

wird, liegt die Entstehung von

EHEC O157:H7 nur wenige Jahrzehnte

zurück (ARMSTRONG et

al.,1996). Wahrscheinlich wurden

u. a. durch Phagen die Toxin-

Determinanten von Shigella

dysenteriae auf E. coli O55 übertragen,

der dadurch zu einem

neuen Stamm E. coli O157:H7

mutierte, dem Auslöser der

enterohämorrhagischen Colitis

(LATHEM et al., 2003).

Transposon Pathogenitätsinsel Bakteriophage Plasmid

Bakterienruhr (EIEC)

Diarrhöen

(EPEC, EHEC, ETEC,

EAggEC, DAEC)

Kommensale E. coli

Hämolytisch-Urämisches

Syndrom (EHEC)

Meningitis (MENEC)

Harnwegsinfekte

(UPEC)

Abb. 15

Mobile genetische Elemente in der Evolution

pathogener E. coli. Enteropathogene (EPEC),

enterotoxische (ETEC), enterohämorrhagische (EHEC),

enteroinvasive (EIEC), enteroaggregative (EAggEC),

diffus adhärente (DAEC), uropathogene (UPEC),

Meningitis-assoziierte (MENEC) E. coli (nach KAPER

et al., 2004).

Alfred NISSLEs Hypothese zum Koli-Antagonismus

und sein „neues Heilprinzip“

Gegen Ende des 19. Jahrhunderts erlebte die mikrobiologische Forschung

(heute hieße das die Medizinische Mikrobiologie) einen enormen Aufschwung,

vor allem durch die bahnbrechenden Entdeckungen von Louis PASTEUR,

Robert KOCH, Theodor ESCHERICH, Paul EHRLICH, Ilja METCHNIKOFF u.v.a.

Indes blieb die Frage, ob die Darmflora als Ganzes oder aber bestimmte

Darmkeime einen eher positiven oder mehr negativen Einfluss auf den Wirt

haben, ebenso unbeantwortet wie die Frage nach den regulierenden Mechanismen

im Zusammenleben der Bakterien im Gastrointestinaltrakt untereinander.

Verschiedene Forschergruppen versuchten bereits damals, diesen

Geheimnissen auf die Spur zu kommen.

Prof. Dr. med. Alfred NISSLE

(1874 – 1965)

So war es nicht verwunderlich, dass sich der Freiburger

Hygieniker und Bakteriologe Alfred NISSLE

auf Grund seiner Untersuchungen an Darmkeimen

im „Routine-Labor“ weitere Fragen stellte, nämlich:

„Warum und wie beeinflussen sich Bakterien in

einer Mischkultur, wie im Darm vorhanden, gegenseitig

in ihrem Wachstum?“ oder „Warum bleiben

bei epidemieartigen Durchfallerkrankungen einige

wenige Menschen darmgesund?“ Nachdem sich

NISSLE etwa 4 Jahre mit diesen Fragen experimentell

auseinandergesetzt hatte, präsentierte er 1916

vor der Freiburger Medizinischen Gesellschaft seine

Ergebnisse in einem Vortrag mit dem Titel „Über

die Grundlagen einer neuen ursächlichen Bekämpfung

der pathologischen Darmflora“ (NISSLE, 1916) [Abb. 16]. Die methodische

Grundlage bildete ein von NISSLE entwickelter und im Prinzip noch

heute verwendeter Testansatz zur In-vitro-Bestimmung bakterieller Interferenz

(„Antagonismus-Test“) [Abb. 17]. Dabei werden Reinkulturen eines Infektionserregers

mit Reinkulturen eines Bakterienstammes aus der physiologischen

Darmflora (potentieller Antagonist) gemeinsam in Flüssigkultur gezüchtet.

Nach bestimmter Zeit, meist nach Übernacht-Kultur, werden Proben entnommen

und auf geeigneten Festnährböden die Keimzahlen der co-kultivierten

Bakterien bestimmt. Ist der physiologische Darmkeim in der Lage, das Hochwachsen

des Infektionserregers zu behindern oder zu unterbinden, so gibt das

Ausmaß der Wachstumshemmung die Stärke der antagonistischen Aktivität

24 25


wieder. NISSLE hatte für die Kennzeichnung solcher Darmkeime einen

„Antagonistischen Index“ entwickelt und fand unter den von ihm isolierten

Kolistämmen aus dem menschlichen Intestinaltrakt „stärker“ und

„schwächer“ antagonistisch wirksame Stämme. Er nutzte diese Methode

auch für die Bestimmung der antagonistischen Aktivität von verschiedenen

Kolibakterien untereinander. Kolistämme mit besonders starker Hemmwirkung

fand er während des Ersten Weltkrieges bei zwei Patienten im Freiburger

Verwundeten-Lazarett, die „niemals Neigung zu Darmerkrankungen

gezeigt hatten und speziell auch dann nicht an infektiösen Darmprozessen

erkrankt waren, als ein größerer Teil ihrer Umgebung daran erkrankte und sie

infolge des engen Zusammenlebens mit bereits Erkrankten der Gelegenheit

zur Infektion in reichlichstem Maße ausgesetzt waren“ (NISSLE, 1916). Diese

Stämme, die auch unter Laborbedingungen ihre antagonistische Wirksamkeit

behielten, wurden von NISSLE zuerst im Selbstversuch und an gesunden

Personen getestet, um ihre Unschädlichkeit beim Menschen nach oraler Verabreichung

festzustellen. Anschließend therapierte er versuchsweise Patienten,

zuerst solche mit infektiösen Diarrhöen, Paratyphus B, Shigellen-Ruhr

und Salmonellen-Dauerausscheider und später Patienten mit post-dysenterischen

Darmfunktionsstörungen („Colon irritabile“) oder chronischer habitueller

Obstipation (NISSLE, 1916, 1918). Obwohl es sich hierbei um Einzelfallbeobachtungen

handelte, war NISSLE von der klinischen Wirksamkeit seiner

Kolikulturen überzeugt und dehnte die Untersuchungen auch auf weitere

Darmerkrankungen, wie z.B. Colitis ulcerosa und dyspeptische Beschwerden,

aus (NISSLE, 1918, 1925).

Abb. 16 Titelseite der Arbeit, in der NISSLE erstmals über den E.-coli-Antagonismus berichtete.

Ein weiteres E.-coli-Isolat von besonderer „antagonistischer Stärke“ gewann

NISSLE aus den Fäzes eines Pionierunteroffiziers, der während des Balkanfeldzugs

im Ersten Weltkrieg in der Region Dobrudscha stationiert war und

der „im Gegensatz zur großen Mehrzahl seiner Kameraden weder an Ruhr

noch anderen Darmkrankheiten gelitten hat“ (NISSLE, 1925). NISSLE züchtete,

von der asservierten Stammkultur ausgehend, die Keime auf Festagarplatten

und füllte die frisch abgeernteten Bakterienkulturen in Hartgelatinekapseln.

Damit schuf er die Grundlage für ein Arzneimittel, das als Wirkprinzip lebende

Kolibakterien enthält. NISSLE meldete für dieses Arzneimittel den Namen

„MUTAFLOR“ an, der am 1. März 1917 als Warenzeichen geschützt wurde.

Später erhielt der im Mutaflor ® enthaltene E.-coli-Stamm, im Gedenken an

Alfred Nissle, die Stammbezeichnung „Nissle 1917“, abgekürzt „EcN“. Der

gegen verschiedene pathogene E.-coli-Stämme sowie gegen Salmonellen,

Shigellen, Cholera-Vibrionen, Proteus und Candida in vitro gefundene

26 27


Antagonismus von E. coli Nissle 1917 [Abb. 17] wurde auch in vivo bei

gnotobiotischen Ferkeln [Abb. 18] und Ratten nachgewiesen. Selbst bei Neugeborenen

ist der antimikrobielle Effekt nachweisbar, worauf noch einzugehen

sein wird.

Abb. 17 Antagonismus von E. coli Nissle 1917 (EcN) gegen verschiedene Mikroorganismen.

EcN hemmt in vitro signifikant das Wachstum pathogener Bakterien und Pilze

(nach SONNENBORN & GREINWALD, 1991)

KBE [lg] / g

12

10

8

6

4

2

Relative Keimzahl (%)

100

50

0

EcN

1 2 3 4 5 6

Testorganismen

Antagonismus von EcN,

Co-Kultivierung mit:

1 Salmonella enteritidis

2 Shigella dysenteriae

3 E. coli O112 ab (EPEC)

4 E. coli O6:K15:H31 (UPEC)

5 Proteus vulgaris

6 Candida albicans

0 2 4 6 8 10 12

18 Tage

E. coli 542/88

EcN

N = 4

Einmalige Applikation von

1x10 8 Keimen

2x10 8 Keimen

Abb. 18 Beispiel für die antagonistische Wirkung von E. coli Nissle 1917 (EcN) im gnotobiotischen

Ferkel. Die orale Gabe von EcN schützt vor Infektionen mit enteropathogenen E. coli

(nach SCHULZE et al., 1992).

NISSLE selbst, aber auch andere Autoren, veröffentlichten in den Folgejahren

zahlreiche Erfahrungsberichte, die wichtige Hinweise für die Bestätigung

seiner Arbeitshypothese darstellen.

Das „Auf und Ab“ der Therapie mit lebenden

Mikroorganismen

NISSLE war zu seiner Zeit nicht der alleinige Protagonist für eine Therapie

mit lebenden Mikroorganismen. Die zunehmende Kenntnis über Infektionen

des Darmes und die damit im Zusammenhang stehenden Erkrankungen sowie

die Erfahrungen über die Möglichkeit, Immunitäten dagegen zu entwickeln,

ließen auch bei anderen Forschern die Idee reifen, zur Bekämpfung von Infektionserregern

„harmlose Bakterien“ aus der körpereigenen Flora zu nutzen.

Bereits um das Jahr 1900 und später wurden vor allem Laktobazillenkulturen

gezielt zur Therapie eingesetzt (BRUDZINSKI, 1900; DISTASO & SCHILLER,

1914; RETTGER & CHEPLIN, 1921; u.a.), nicht zuletzt auch ausgelöst durch

METCHNIKOFFs Bestseller „The prolongation of life“ (METCHNIKOFF, 1907).

NISSLE war aber jahrzehntelang der Einzige, der durch den Einsatz der von ihm

isolierten lebenden Kolikeime in Form des Präparats Mutaflor ® therapeutische

Erfolge erzielte.

Dennoch ebbte das allgemeine Interesse an dieser Therapiestrategie gegen

Mitte des vergangenen Jahrhunderts ab. Hauptgrund war der Beginn des

„Antibiotika-Zeitalters“. 1928 hatte Alexander FLEMING aus dem Schimmelpilz

Penicillium notatum eine antibakteriell wirksame Substanz isoliert, die ab

1940 zur therapeutischen Anwendung kam (Penicillin) und in der Folgezeit zu

einer Fülle von Derivat- und Neusynthesen weiterer Antibiotika führte, mit

dem Ergebnis einer äußerst erfolgreichen Eliminierung von Infektionskeimen

aus Entzündungsherden. Das Ziel, alle Infektionskrankheiten mit diesen antimikrobiellen

Substanzen zu beherrschen, schien erreichbar zu sein. Je näher

man sich aber dem Ziele glaubte, umso häufiger wurden therapeutische

Misserfolge dokumentiert und umso intensiver wurde entweder nach neuen

wirksamen Antibiotika oder nach solchen mit einem noch breiteren

Wirkungsspektrum gesucht. Schätzungsweise sind es heute 50.000 Tonnen

an Antibiotika, die weltweit jährlich von Mensch und Tier aufgenommen und

z.T. unverändert in die Umwelt wieder ausgeschieden werden. Ohne diese

Antibiotika wäre in den zivilisierten Ländern der heutige Gesundheits- und

Lebensstandard nur schwer vorstellbar. Aber, Antibiotika können auch krank

machen: Übelkeit, Durchfälle, Erschöpfung, Psychosen, Leber- und Nierenschäden,

Allergien, anaphylaktischer Schock sind nur einige der vielfach

dokumentierten Nebenwirkungen. Hinzu kommt, dass Mikroorganismen in

der Lage sind, sich schnell und effektiv an veränderte Umweltbedingungen

anzupassen. So können sie auf verschiedenen Wegen Resistenzen ausbilden

und sich so der Wirkung der Antibiotika entziehen. In Biotopen mit hoher

28 29


Antibiotikakonzentration – z.B. ist der Gastrointestinaltrakt eines Patienten im

Krankenhaus solch ein Biotop – ist die residente Mikroflora einem zunehmenden

Selektionsdruck durch antimikrobiell wirksame Substanzen ausgesetzt.

Das Ergebnis ist eine Häufung multiresistenter Keime im Hospitalmilieu

und ein Anstieg von nosokomialen Infektionen mit multiresistenten Erregern

weltweit. Diese Entwicklung und das langsam zunehmende Bewusstsein bei

Therapeuten und Patienten, mit der Anwendung von Antibiotika behutsamer

umzugehen sowie zusätzlich oder alternativ bewährte und positiv evaluierte

Methoden einzusetzen, haben in den letzten Jahren zu einer Renaissance der

Therapie mit lebenden Mikroorganismen geführt. Übereinstimmend mit der

internationalen Literatur wird diese Therapie auch als „probiotische Therapie“

bezeichnet. Die bei der probiotischen Therapie eingesetzten mikrobiellen

Lebendkeimpräparate werden als „Probiotika“ bezeichnet. Probiotika sind

definitionsgemäß apathogene lebende Mikroorganismen, die, wenn sie in

genügend hoher Zahl lebensfähig in den Gastrointestinaltrakt gelangen,

einen positiven Effekt auf den Wirtsorganismus ausüben (FAO/WHO, 2002).

Die Anforderungen, die an ein Probiotikum gestellt werden, das den

Anspruch eines Arzneimittels erhebt, sind hoch: gefordert sind der Nachweis

der klinischen Wirksamkeit bei definierten medizinischen Indikationen, Belege

zu Wirkungen und Wirkmechanismen sowie die Einhaltung spezieller Kriterien

zur Produktqualität (u.a. die Apathogenität und genetische Stabilität des

therapeutisch eingesetzten Mikroorganismus) [Abb. 19].

Der Nachweis der Apathogenität oder Avirulenz ist bei der Überprüfung von

E.-coli-Stämmen, die als Probiotika therapeutisch eingesetzt werden sollen,

von besonderer Bedeutung, da – wie bereits beschrieben – die Spezies

Escherichia coli eine Reihe von pathogenen Varianten beinhaltet. Aus diesem

Grunde wurde die Verwendung von Präparaten mit lebenden E.-coli-Bakterien

von einigen Autoren noch bis Mitte der 90er Jahre des letzten Jahrhunderts

pauschal abgelehnt (Expert’s Opinion Poll – MARGET et al., 1995). Diese

pauschale Ablehnung ist mittlerweile einer differenzierteren Betrachtungsweise

gewichen, was nicht zuletzt der Weiterentwicklung molekulargenetischer

Differenzierungs- und Identifizierungsmethoden zu verdanken ist.

Mit Hilfe dieser Techniken ist es möglich, pathogene E.-coli-Varianten eindeutig

von apathogenen Stämmen zu unterscheiden. Darüber hinaus zeigen

apathogene Stämme, wie E. coli Nissle 1917, im Gegensatz zu virulenten

E.-coli-Varianten in toxikologischen Untersuchungen sowohl an konventionell

als auch an keimfrei gehaltenen Tieren keinerlei schädliche Wirkungen.

Wirksamkeit

● Nachweis durch kontrollierte klinische Studien

Wirkung

● Unterdrückung von Wachstum und Kolonisation unerwünschter

Mikroorganismen

● Beitrag zur Optimierung des intestinalen Milieus und zum

luminalen Stoffwechsel

● Immunmodulation

Produktqualität

● Apathogenität

● Genetische Stabilität

● Lebensfähigkeit im Gastrointestinaltrakt

● Exakte Identifikation und Abgrenzung von nahe verwandten

Mikroorganismen

Abb. 19 Anforderungen an Probiotika: Nachweis der Wirksamkeit, Erkenntnisse zu den

Wirkmechanismen, nachgewiesene Produktqualität.

30 31


E. coli Nissle 1917: der weltweit am besten untersuchte

probiotische E.-coli-Stamm

Alle in Abb. 19 aufgelisteten Anforderungen an ein probiotisches Arzneimittel

werden von E. coli Nissle 1917 (EcN), der „Wirksubstanz“ von Mutaflor ® ,

voll erfüllt. Die jüngst geglückte Aufklärung der Genomstruktur (GROZDA-

NOV et al., 2004; SUN et al., 2005) hat gezeigt, dass das Fehlen von Pathogenitätsfaktoren

(z.B. von Enterotoxinen, Hämolysinen, Cytotoxinen, Invasinen,

pathogenspezifischen Fimbrien) [Abb. 20], kombiniert mit dem

Vorhandensein von sog. Fitness-Faktoren (z.B. Mikrozinen, Eisenaufnahmesystemen,

typischen Adhäsinen) [Abb. 21], die das Überleben und die Kolonisierung

im Darm ermöglichen, zu den probiotischen Eigenschaften von EcN

beitragen (BLUM-OEHLER et al., 2001; DOBRINDT, 2005).

Gencluster des Chromosoms, die für die phänotypischen Merkmale

von EcN kodieren

6 verschiedene Eisenaufnahme-Systeme

als

wichtige Fitnessfaktoren

2 antagonistisch

aktive Mikrozine

mch mcm fim

Fe 3+

cbt

Fe 3+ ent

Fe 3+

ybt

Chromosom

Fe 3+

3 kb

chu

Fe 3+

Fe 3+ aer

5 kb

cit

rfb

kps

foc

fla

csg

keine

Pathogenitätsfaktoren

3 verschiedene Typen von

Fimbrien ermöglichen

Adhärenz und Biofilmbildung

Flagellen (H1) sorgen für

aktive Fortbewegung

● Apathogener E.-coli-Klon (Serotyp O6 : K5 : H1)

● Genetische Stabilität

Keine: Enterotoxin-Produktion

Cytotoxin-Produktion

Pathogenen Adhäsionsfaktoren

Invasivität

Immuntoxizität

Serumresistenz (keine Sepsisgefahr)

Uropathogenität

Toxizität in keimfreien und konventionellen Tieren

2 stammtypische Plasmide

ohne Antibiotika-Resistenzgene,

nicht übertragbar

Spezielle immunmodulatorische

LPS-Variante vom Serotyp O6, bisher bei

keinem anderen Stamm nachgewiesen

Kapsel (K5)

Serotyp O6:K5:H1

Abb. 21 Phänotypische Charakteristika von E. coli Nissle 1917 und ihre Genloci auf dem

Bakterienchromosom (nach BLUM-OEHLER et al., 2001).

Abb. 20 Sicherheitsaspekte bei E. coli Nissle 1917

Die besondere Lipopolysaccharid(LPS)-Struktur, hervorgerufen durch eine

Punktmutation im wzy-Gen, dem Gen für die O-Antigen-Polymerase, ist

verantwortlich für die Serumsensitivität des Stammes, d. h. EcN wirkt immunmodulierend,

ohne immuntoxisch zu sein (GROZDANOV et al., 2002). Zudem

unterscheidet er sich von anderen E.-coli-Stämmen durch die Fähigkeit, auch

bei Körpertemperatur (37 °C) Biofilme zu bilden, wodurch die flächige

Persistenz des Keimes im Warmblüterdarm ermöglicht wird. Diese Eigenschaft

beruht auf dem Vorhandensein des ygaG-Gens, einem Teil des für die interbakterielle

Kommunikation ("Quorum Sensing") wichtigen Autoinducer-2-

Systems (homolog zur Autoinducer-Synthetase LuxS von V. fischeri) und der

Anwesenheit von „curly“-Fimbrien [Abb. 22].

Abb. 22 Biofilmbildung durch E. coli: E. coli Nissle 1917 ist im Gegensatz zu anderen E.-coli-Stämmen

in der Lage, auch bei 37 °C Biofilme auszubilden. Darstellung mit Laser Scanning Mikroskopie.

Höhenausmessung links, Dichtemessung rechts (U. DOBRINDT & H. MERKERT, pers. Mitteilung).

32 33


EcN ist nicht in der Lage, in Mukosazellen einzudringen. In Co-Kultivierung von

EcN mit invasiven Salmonella Typhimurium-Stämmen und anderen enteroinvasiven

Keimen vermindert seine Anwesenheit sogar die Invasivität der

pathogenen Keime in die Epithelzell-Monolayer (ALTENHÖFER et al., 2004;

OELSCHLAEGER et al., 2001) [Abb. 23].

Relative Genexpression

200

150

ZO-2

Pinin

45

45

100

40

40

% Invasivität der Stämme

35

30

25

20

15

10

5

E. coli Nissle 1917

E. coli K-12

S. typhimurium C17

S. typhimurium LT2

% Invasivität von S. typhimurium

35

30

25

20

15

10

5

E. coli Nissle 1917

+ S. typhimurium C17

E. coli K-12 + S. typhimurium C17

E. coli Nissle 1917

+ S. typhimurium LT2

E. coli K-12

+ S. typhimurium LT2

50

0 30 60 90 120 min

Abb. 24 Einfluss von E. coli Nissle 1917 auf die Genexpression für das Desmosomen-Protein Pinin

und das Zonula-Occludens-Protein ZO-2 (nach CICHON et al., 2004)

0

0

Abb. 23 Hemmung der Invasion von Salmonella typhimurium in intestinale Epithelzellen (INT407)

durch E. coli Nissle 1917 (nach OELSCHLAEGER et al., 2001)

Die Annahme, dass die bereits erwähnte Mikrozinproduktion für diesen EcN-

Effekt verantwortlich sei, ließ sich nicht bestätigen. Eine eigens dafür hergestellte

Mikrozin-Negativmutante von EcN hatte den gleichen invasionshemmenden

Effekt wie der Wildtyp (ALTENHÖFER et al., 2004). Eine

Erklärungshilfe lieferten Untersuchungen zur Beeinflussung der Expression

von „Zellkitt“-Proteinen der Darmepithelzellen durch EcN und andere Darmbakterien.

Diese ergaben, dass EcN die Produktion des Desmosomen-Proteins

„Pininund des Tight-Junction-Proteins „ZO(zonula occludens)-2“ bei T84-

Zellkulturen stimuliert (CICHON et al., 2004) [Abb. 24]. Das Ergebnis ist eine

verbesserte Integrität des Zellverbands mit stabilisierter Barriere-Funktion

[Abb. 25]. Diese als „crosstalk“ bezeichneten Wechselwirkungen zwischen

Bakterien und Darmwand spielen auch bei der Beeinflussung der körpereigenen

Abwehr durch EcN eine Rolle.

Abb. 25 Wirkung von EPEC und E. coli Nissle 1917 (EcN) auf die „Dichtigkeit“des Darmepithels:

Expression des Zonula-Occludens-Proteins ZO-2 nach Inkubation von T84-Epithelzellen

mit EPEC und EcN (nach ZYREK et al., 2006).

34 35


Zu den phylogenetisch ältesten Abwehrmechanismen der Pflanzen- wie der

Tierwelt gehört die angeborene Fähigkeit zur Produktion von antimikrobiellen

Peptiden (AMP, z.B. Defensine, Cathelicidine) durch Epithelzellen der äußeren

und inneren Körperoberflächen. Sie sind unspezifisch gegen alle möglichen

Invasoren wie umhüllte Viren, Bakterien, Pilze, Protozoen oder andere Parasiten

gerichtet, zerstören die Zellmembran der Erreger durch Mikroporenbildung

und machen diese dadurch unschädlich. Defensinmangel, wie er bei Patienten

mit Morbus Crohn vorliegt (WEHKAMP et al., 2005), führt zur massiven

bakteriellen Besiedlung der Darmwand (SWIDSINSKI et al., 2002) und zur

Keiminvasion, z.B. durch die bei Morbus Crohn vermehrt nachgewiesenen

adhärent-invasiven E.-coli-Stämme (AIEC) (DARFEUILLE-MICHAUD, 2002).

EcN induziert die Expression von humanem β-Defensin-2 (HBD-2) und

von Cathelicidin LL37 in humanen Kolonepithelzellen in vitro [Abb. 26]

(WEHKAMP et al., 2004) sowie von Calprotectin im Darm gnotobiotischer

Ferkel in vivo (SPLICHAL et al., 2005).

Relative Genexpression / µg RNA

20

15

10

5

0

HBD-1

HBD-2

HD-5

HD-6

Kontrolle EcN EPEC E. coli K-12 UPEC E. coli PZ315

Abb. 26 Wirkung veschiedener E.-coli-Stämme auf die Induktion der antimikrobiellen Peptide HBD-1,

HBD-2, HD-5 und HD-6: E. coli Nissle 1917 zeigt die stärkste Induktion von HBD-2 in humanen

CaCo-2-Epithelzellen (nach WEHKAMP et al., 2002, 2004).

Zusätzlich zu den Ergebnissen über die Beeinflussung der angeborenen Infektabwehr

gibt es Erkenntnisse zur Modulation der adaptiven Immunantwort

nach EcN-Kontakt. In kontrollierten klinischen Studien zur gezielten Kolonisation

von ausgetragenen und frühgeborenen Kindern wurde durch orale

Verabreichung von EcN nicht nur eine frühzeitige Stimulierung der Reifung

des humoralen Arms des lokalen Immunsystems im Darm (Erhöhung des fäkalen

sIgA-Spiegels) (LODINOVA-ZADNIKOVA et al., 1992) gefunden, was zu

erwarten war, sondern auch die Proliferation von Lymphozyten des peripheren

Blutes nach Ex-vivo-Kontakt mit verschiedenen Antigenen signifikant

angeregt (CUKROWSKA et al., 2002) [Abb. 27].

SI

12

10

8

6

4

2

0

0

Proliferation von Blutlymphozyten

Kontroll-Kinder

[n = 27]

Kolonisierte Kinder

[n = 34]

#

**

# #

** **

14 0 14

#

*

Tage

Bakterielle Antigene:

EcN, hitzeinaktiviert

EcN, beschallt

E. coli O86,

hitzeinaktiviert

LPS von

E. coli O86

Abb. 27 Die gezielte Besiedlung des Darms frühgeborener Kinder mit E. coli Nissle 1917 (EcN)

stimuliert die Proliferation von Blutlymphozyten nach Ex-vivo-Inkubation mit verschiedenen

bakteriellen Antigenen (nach CUKROWSKA et al., 2002).

*p < 0,01 und ** p < 0,0001 (Tag 14 vs. Tag 0), # p < 0,05 (kolonisierte Kinder vs.

Kontroll-Kinder), SI = Stimulierungsindex.

In-vitro-Versuche mit menschlichen T-Lymphozyten haben gezeigt, dass EcN in

peripheren T-Zellen Zellzyklus und Zellvermehrung hemmt, nicht jedoch in

mukosalen T-Zellen (STURM et al., 2005). Diese differentielle Wirkung kann

als antiinflammatorischer Effekt interpretiert werden und könnte für die in

Tiermodellen für chronisch entzündliche Darmerkrankungen gezeigte Entzündungshemmung

mit verantwortlich sein (KAMADA et al., 2005; SCHULTZ

et al., 2004; GRABIG et al., 2006).

So, wie die therapeutischen Effekte eines jeden Arzneimittels an die Eigenschaften

der wirksamen Substanz gebunden sind, bilden die hier keineswegs

vollständig dargestellten Eigenschaften von EcN die Basis für seine vielfältigen

Wirkungen und liefern die Erklärung für seine Wirksamkeit bei verschiedenen

Indikationen.

36 37


Indikationsspektrum für E. coli Nissle 1917 und klinische

Studien mit Evidence-Based-Medicine-Charakter

NISSLE und andere hatten bereits in diversen Erfahrungsberichten ein erstaunlich

breites Indikationsspektrum für den Einsatz von EcN mitgeteilt. In einer

jüngst durchgeführten prospektiven Anwendungsbeobachtung zum Einsatz

von Mutaflor ® an 3.807 Patienten in 446 Prüfzentren (KRAMMER et al.,

2006) konnte diese breite Anwendungspalette bestätigt werden [Abb. 28].

Nahezu die Hälfte der Patienten (n = 1.746; 47,1 %) wurde wegen eines

Reizdarmsyndroms (n = 679) bzw. wegen protrahierter (n = 339) oder

chronisch rezidivierender Diarrhöen (n = 728) mit Mutaflor ® behandelt. Die

Diarrhö war bei 209 Patienten nach einer Magen-Darm-Infektion und bei

252 nach Antibiotika-/Sulfonamid-Behandlung, also nach „klassischen“

Ursachen von Darmflorastörungen, aufgetreten. Patienten mit chronisch

entzündlichen Darmerkrankungen (n = 415), Obstipation (n = 253) und

Mykosen des Gastrointestinaltraktes (n = 281) folgten in der Häufigkeit der

Indikationsstellung. Weiterhin behandelt wurden Patienten mit Divertikulose,

Kollagener Kolitis, Neurodermitis, Halitosis, Nahrungsmittelunverträglichkeit

und Infektanfälligkeit, darunter auch Harnwegsinfekte. Die Wirksamkeit von

Mutaflor ® über alle Indikationen wurde von 78 % der Patienten und von

82 % der Therapeuten mit gut bis sehr gut bewertet, womit auch die

NISSLEschen Erfahrungen bestätigt wurden.

Unabhängig von dem enormen Erfahrungsschatz, der sich während der 90-

jährigen Anwendung des Präparates Mutaflor ® angesammelt hat, ist es eine

berechtigte Forderung, die postulierten Wirksamkeiten in konfirmatorischen

klinischen Studien nachzuweisen. Sie sind heute ein fester Bestandteil der

„Evidence-Based Medicine“ und wurden für das Präparat Mutaflor ®

indikationsbezogen durchgeführt. Einige Beispiele werden im Folgenden kurz

besprochen.

Diarrhö: Die akute infektiöse Diarrhö wird landläufig als eine selbstlimitierende

Erkrankung innerhalb der ersten 7 Tage angesehen. Es gibt aber in der

Literatur zu dieser Erkrankung auch Angaben, dass zwischen 12 und 30 %

der Patienten in der Folgezeit (bis zu einem Jahr nach der Durchfallepisode)

einen Reizdarm oder chronisch rezidivierende Diarrhöen entwickeln können.

Auf Grund der Kenntnis präklinischer Untersuchungen, wonach EcN sich an

der Stabilisierung der Darmbarriere beteiligt, schien es sinnvoll, Studien zur

akuten und zur protrahierten (seit max. 2 Wochen andauernden) Diarrhö

durchzuführen. Ein besonderes Interesse bestand, die klinischen Untersuchungen

an Säuglingen, Kleinkindern und Kindern durchzuführen, weil die

Folgen von Diarrhöen bei jungen Patienten dramatisch sein können.

113 Patienten (2-- 46 Monate alt) mit akuter Diarrhö erhielten nach Randomisierung

und im doppelblinden Verfahren je nach Alter täglich 1 x 1 ml

(Säuglinge), 2 x 1 ml (1--3 Jahre) oder 3 x 1 ml (3 -- 4 Jahre) Mutaflor ®

Suspension (mit 10 8 KBE/ml) oder Placebo. Unter Verum reduzierte sich die

Durchfalldauer drastisch auf 2,5 Tage, während für die Placebo-Gruppe eine

Chronisch rezidivierende Diarrhö

Reizdarmsyndrom

Protrahierte Diarrhö

Extraintestinale Indikationen

Darmmykosen

Andere (z. B. Nahrungsmittelunverträglichkeit/Malabsorption)

Chronische Obstipation

Chronisch entzündliche

Darmerkrankungen

Antibiotika-assoziierte/

pseudomembranöse Colitis

Divertikulose

Non-ulcer-Dyspepsie

Akute Diarrhö

Mutaflor ® Suspension

Placebo

Zeitgewinn:

2,3 Tage

p = 0,0007

0 1 2 3 4 5

Behandlungstage

2,5 Tage 4,8 Tage

Abb. 28 Haupteinsatzgebiete von Mutaflor ® nach einer prospektiven Anwendungsbeobachtung

(AWB) an 3807 Patienten (nach KRAMMER et al., 2006).

Abb. 29 Mutaflor ® Suspension reduziert bei der akuten Diarrhö die Durchfalldauer auf 2,5 Tage

(nach HENKER et al., 2006a).

38 39


mittlere Durchfalldauer von 4,8 Tagen gemessen wurde (p = 0,0007)

[Abb. 29]. Nur 3 (5,5 %) der Verumpatienten, aber 19 (32,8 %) der Placebopatienten

litten auch am 10. Tag noch an Diarrhö (HENKER et al., 2006a).

In einer weiteren, ebenfalls placebokontrollierten, randomisierten doppelblinden

Studie wurden 151 Patienten (1-- 47 Monate alt) mit protrahierter

Diarrhö entweder der Verum- oder der Placebo-Gruppe zugeordnet.

Zu Beginn erfolgte eine einmalige orale Rehydratation. Die Studienmedikation

entsprach nach Art und Menge derjenigen, die auch für die Behandlung der

akuten Diarrhö verwendet wurde (s.o.). Die mittlere Durchfalldauer vor

Therapiebeginn lag bei 5,8 Tagen. Auch bei dieser konfirmatorischen Studie

offenbarte sich die Effektivität einer Mutaflor ® -Behandlung. Die Durchfalldauer

ab Studienbeginn endete unter Mutaflor ® Suspension nach

2,4 Tagen im Vergleich zur Placebogruppe nach 5,7 Tagen (p = 0,0001)

[Abb. 30]. Die Erfolgsrate nach 21 Tagen betrug unter Verum 99 % (74/75)

und unter Placebo 72 % (55/76) (HENKER et al., 2006b).

Mittlere

Krankheitsdauer

vor Therapie:

5,8 Tage

Mutaflor ® Suspension

Placebo

Zeitgewinn:

3,3 Tage

p = 0,0001

0 1 2 3 4 5

Behandlungstage 2,4 Tage 5,7 Tage

Abb. 30 Mutaflor ® Suspension reduziert bei der protrahierten Diarrhö die Durchfalldauer

auf 2,4 Tage (nach HENKER et al., 2006b).

Fazit: Die enorme Verkürzung der Durchfallzeit um 2,3 bzw. 3,3 Tage sowie

die hohe Ansprechrate in beiden Studien liefern den Beweis der Wirksamkeit

von Mutaflor ® bei akuter und protrahierter Diarrhö und generieren einen

hohen Evidenzgrad.

Die antidiarrhöische Wirkung von E. coli Nissle 1917 wurde auch durch

zwei placebo-kontrollierte Studien an insgesamt 335 neugeborenen Kälbern

bestätigt. Die Tiere bekamen die Studienmedikation (Placebo oder EcN-

Suspension) während der ersten 10--12 Lebenstage einmal täglich oral verabreicht,

jeweils vor der ersten Fütterung. In der ersten Studie wurde die

Diarrhö-Inzidenz von 65,2 % (Placebo) auf 26,5 % (EcN) reduziert, in der

zweiten Studie von 63,0 % unter Placebo auf 12,2 % unter EcN (p < 0,001)

(VON BUENAU et al., 2005).

Chronisch entzündliche Darmerkrankungen: In Deutschland leiden

ca. 300.000 Menschen an chronisch entzündlichen Darmerkrankungen (CED),

etwa zu gleichen Teilen an Colitis ulcerosa und Morbus Crohn. Die Ursachen

für diese Erkrankungen sind nach wie vor unklar, obwohl sicher ist, dass es

sich um einen wie auch immer gearteten Barrieredefekt der Darmschleimhaut

handelt. Viele Gründe werden diskutiert und experimentell verfolgt. Im letzten

Jahrzehnt des vergangenen Jahrhunderts sind zellvermittelte Reaktionen des

Immunsystems und der Einfluss der gebildeten Botenstoffe stark unter die

Lupe genommen worden, mit dem Erfolg, einen enormen, kaum noch zu

überschauenden Wissenszuwachs über die komplexen Zusammenhänge bei

den CED erhalten zu haben. Bei der Fokussierung auf die Erhaltung oder

Reparatur der Darmbarriere sind vornehmlich drei Komplexe in den Mittelpunkt

der Betrachtungen gerückt:

1. die Darmflora, die sich an der Aufrechterhaltung der Darmbarriere beteiligt,

aber in diversen Tiermodellen für CED auch proinflammatorische

Effekte zeigt,

2. genetische Defekte, die zur Beeinträchtigung der Barrierefunktion der

Darmschleimhaut führen können (z.B. NOD-2-Polymorphismen),

3. der Mangel an die Barriere erhaltenden Bestandteilen/Substanzen (z. B.

Defensine, Cathelicidine, Muzine) und deren Induktions- oder Substitutionsmöglichkeiten.

Vor diesem Hintergrund ist der Einsatz von Probiotika zur Therapie von

chronisch entzündlichen Darmerkrankungen eine logische Konsequenz,

vor allem dann, wenn wie im Falle von EcN Wirkmechanismen bekannt sind,

die helfen, die Barriere zu stabilisieren. Für Mutaflor ® liegen heute 3 große

doppelblinde klinische Vergleichsstudien im double-dummy-Design und eine

Vergleichsstudie mit jugendlichen Patienten zur Remissionserhaltung der

Colitis ulcerosa vor.

40 41


Die erste an 103 Patienten über einen Zeitraum von 3 Monaten durchgeführte

Doppelblind-Studie brachte die Erkenntnis, dass Mutaflor ®

(1 x 2 Kapseln täglich), gemessen am Verlauf des klinischen Aktivitätsindex,

die gleiche Wirksamkeit bei der Aufrechterhaltung der Remission hat wie die

Standardmedikation mit dem Entzündungshemmer Mesalazin (5-Aminosalicylsäure,

1,5 g täglich). Auch die Rezidivraten waren nicht unterschiedlich,

was jedoch bei der relativen kurzen Beobachtungszeit zu erwarten war

(KRUIS et al., 1997).

In einer zweiten in Großbritannien durchgeführten ebenfalls doppelblinden

randomisierten Vergleichsstudie im double-dummy-Design wurden Patienten

mit einer aktiven Colitis ulcerosa (n = 116) eingeschlossen. Für die vergleichende

Beobachtung über ein Jahr wurden aber nur die Patienten einbezogen,

bei denen unter der Studienmedikation zuzüglich einer initialen

einwöchigen Gentamicinbehandlung eine Remission erreicht worden war.

Entsprechend britischer Standards wurde die tägliche Gabe von 3 x 0,4 g

Mesalazin mit 1 x 2 Kapseln Mutaflor ® verglichen. Im Verlauf der Beobachtungszeit

von 1 Jahr erlitten in der Mesalazingruppe 32/44 Patienten (73 %)

und in der Mutaflor ® -Gruppe 26/39 (67 %) ein Rezidiv. Dieser Unterschied

zwischen den Behandlungsarmen war nicht signifikant, was sich auch anhand

des Verlaufs der beiden Kaplan-Meier-Kurven feststellen lässt [Abb. 31]

(REMBACKEN et al., 1999).

Remission (%)

100

80

60

40

20

0

0

Mutaflor ®

Mesalazin

50 100 150 200 250 300 350

Abb. 31 Monozentrische randomisierte Doppelblindstudie Mutaflor ® vs. Mesalazin zur

Remissionserhaltung bei Colitis ulcerosa. Kaplan-Meier-Plot der Remissionsverläufe

(nach REMBACKEN et al., 1999).

Tage

In der dritten großen klinischen Studie, die in zehn europäischen Ländern durchgeführt

wurde, konnten 327 Patienten mit Colitis ulcerosa in der Remission in

die Studie aufgenommen werden und erhielten im bereits geschilderten

double-dummy-Design entweder 1,5 g Mesalazin oder 1 x 2 Kapseln

Mutaflor ® täglich für die Dauer von 1 Jahr. 222 Patienten (112 Patienten mit

Mesalazin, 110 Patienten mit Mutaflor ® ) schlossen die Studie protokollgerecht

ab. In der Mesalazingruppe erlitten 38/112 Patienten (33,9 %) und in

der Mutaflorgruppe 40/110 Patienten (36,4 %) ein Rezidiv [Abb. 32].

Die Äquivalenz zwischen beiden Medikamenten konnte mit der großen Wahrscheinlichkeit

von p = 0,003 statistisch gesichert werden, mithin sind beide

Präparate gleich wirksam (KRUIS et al., 2004a).

100%

80%

60%

40%

20%

0%

Rezidivrate innerhalb eines Jahres

Per-Protokoll-Analyse (N = 222)

Äquivalenz signifikant

mit p = 0,003

36,4%

Mutaflor ®

33,9%

Mesalazin

Abb. 32

Multizentrische randomisierte Doppelblindstudie

Mutaflor ® vs. Mesalazin zur

Remissionserhaltung bei Colitis ulcerosa.

Rezidivrate innerhalb eines Jahres anhand

der Per-Protokoll-Analyse von 222 Patienten

(nach KRUIS et al., 2004a).

In einer weiteren klinischen Studie über 1 Jahr Beobachtungszeit, die mit 36

jugendlichen Colitis-ulcerosa-Patienten im Alter zwischen 11 und 18 Jahren

durchgeführt wurde, zeigte sich ebenfalls die gleiche Wirksamkeit von Mesalazin

und Mutaflor ® bei der Remissionserhaltung. Hier erlitten 6/24 Patienten

(25 %) der Mutaflor ® -Gruppe und 3/10 (30 %) der Mesalazin-Gruppe ein

Rezidiv innerhalb eines Jahres (HENKER et al., 2006c).

In einer doppelblind angelegten Pilotstudie zur Erhaltung der Remission bei

28 Morbus-Crohn-Patienten durch Mutaflor ® wurden Patienten mit ausschließlichem

Dickdarmbefall und einem Crohn’s Disease Activity Index (CDAI) von

> 150 randomisiert auf zwei Gruppen verteilt. 16 Patienten erhielten Prednisolon

plus Mutaflor ® , 12 Patienten Prednisolon plus Placebo für die Dauer von

1 Jahr. In der Mutaflor-Gruppe erlitten in dieser Zeit 33,3 % und in der

42 43


Placebogruppe 63,6 % der Patienten ein Rezidiv. Darüber hinaus wurde in der

Verumgruppe ein Prednisolon-Einspareffekt beobachtet (MALCHOW, 1997).

Dieser mit einer kleinen Zahl von Patienten erhaltene Hinweis auf eine mögliche

remissionserhaltende Wirksamkeit bei Morbus Crohn konnte bisher

nicht in konfirmatorischen klinischen Studien bestätigt werden.

Fazit: Mutaflor ® ist bei Patienten mit Colitis ulcerosa in der Remission gleich

gut wirksam wie Mesalazin und zudem nebenwirkungsarm. Außerdem unterstreichen

die Ergebnisse aller Studien mit Mutaflor ® die Bedeutung der Darmflora

als pathogenetischer Faktor bei Colitis ulcerosa.

Obstipation: Die Obstipation ist wie die Diarrhö ein sehr stark mit dem

Reizdarm verwobenes Symptom. In welchem Ausmaß Mutaflor ® hier einzugreifen

vermag, war Gegenstand kontrollierter klinischer Studien.

In einer vergleichenden randomisierten Untersuchung (Mutaflor ® , täglich

3 x 1 Kapsel vs. Laktulose, 2 x 15 ml) an 108 ambulanten Patienten mit

chronischer Obstipation, die seit mindestens einem Jahr vorliegen musste,

erhöhte sich die wöchentliche Stuhlzahl in beiden Gruppen nach insgesamt

14-wöchiger Behandlung. Hierbei war die Steigerung der wöchentlichen

Stuhlfrequenz (Mutaflor ® 6,3 vs. Laktulose 5,5) signifikant unterschiedlich

(p < 0,026) zugunsten des E.-coli-Präparats (BRUCKSCHEN & HOROSIEWICZ,

1994). Unerwünschte Arzneimittelwirkungen (vor allem Blähungen) traten

unter der Laktulose-Behandlung dreimal häufiger auf als unter der Mutaflor ® -

Behandlung.

In einer zweiten randomisierten klinischen Studie wurde Mutaflor ® gegen

ein Placebo getestet bei Patienten, die ebenfalls seit mindestens 1 Jahr

obstipiert waren. Der eigentlichen Studie wurde eine einwöchige Periode

(„run-in-Phase“) vorangestellt, bei der alle Patienten ein Placebo bekamen.

Von ursprünglich 134 Patienten konnten danach 64 nicht in die Therapiestudie

aufgenommen werden, weil sich ihr Problem bereits mit der Placebogabe

lösen ließ. Anschließend wurden die verbliebenen 70 Patienten

(wöchentliche Stuhlzahl ≤ 2) randomisiert in einem doppelblinden Design der

Verum- oder der Placebo-Gruppe zugeordnet. Zu Beginn erhielten die

Patienten zum Abführen einmalig 10 mg Bisacodyl, um vergleichbare Ausgangsverhältnisse

zu schaffen, danach zuerst 3 x 2 Mutaflor ® - oder Placebo-Kapseln

täglich und ab dem 3. Tag 1 x 4 Kapseln für den Rest der Studiendauer.

Nach 4 Wochen hatten die Patienten der Verumgruppe eine wöchentliche

Stuhlzahl von 4,9. Nach weiteren 4 Wochen erhöhte sich bei den Patienten

der Verumgruppe die wöchentliche Stuhlzahl auf 6,0 [Abb. 33]. In der Placebogruppe

zeigte sich nach 4 Wochen ein leichter Anstieg der Stuhlfrequenz, der

aber nach 8 Wochen wieder zurückging auf < 2 Stühle/Woche. Nach einem

„change over“ der Studienmedikation nach 4wöchiger Behandlung waren

es bei den mit Verum behandelten Patienten insgesamt nur zwei, die auf

Mutaflor ® nicht mit einer signifikanten Steigerung der wöchentlichen Stuhlzahl

reagierten. Dagegen verbesserte sich die wöchentliche Stuhlzahl bei

13 Patienten, die wegen Unwirksamkeit der Placebobehandlung in die

Verumgruppe wechselten, in den folgenden 4 Wochen auf 5,2 pro Woche

(MÖLLENBRINK & BRUCKSCHEN, 1994).

Stuhlfrequenz/Woche

10

Placebo

Mutaflor ®

8

6

4

2

0

p < 0,001

p < 0,001

0 4 8 Wochen

Abb. 33

Einsatz von Mutaflor ® bei

chronisch obstipierten Patienten.

Randomisierte Doppelblindstudie

Mutaflor ® vs. Placebo über

8 Wochen. Mutaflor ® führt zu

einer signifikanten Erhöhung

der wöchentlichen Stuhlfrequenz

(nach MÖLLENBRINK &

BRUCKSCHEN, 1994).

Fazit: Die Gabe von 4 Kapseln Mutaflor ® über mindestens 4 Wochen steigert

bei langfristig obstipierten Personen die wöchentliche Stuhlzahl auf die als

physiologisch bekannten Durchschnittswerte. Dies ist von besonderer Bedeutung

für Patienten mit Laxantienabhängigkeit sowie für Schwangere und

Stillende.

Kolonisationsprophylaxe bei Neugeborenen: Bereits ESCHERICH hatte

sich über die „Constanz der im Säuglingsdarm gefundenen Arten“ Gedanken

gemacht und „eine auffällige Reinheit in Bezug auf die bakteriologischen

Verhältnisse und ein merkwürdiges Bestreben ... dieselbe ungetrübt zu erhalten“

bemerkt. 30 Jahre später berichtete NISSLE über den Koliantagonismus, den

ESCHERICH vielleicht ahnen, aber noch nicht erkennen konnte, als Wirkmechanismus

zur Stabilisierung mikroökologischer Verhältnisse im Gastrointestinaltrakt.

Weitere 80 Jahre später wurde in kontrollierten klinischen

44 45


Studien an Neugeborenen nachgewiesen, dass bereits eine kurzzeitige tägliche

orale Gabe von 1 ml EcN-Suspension mit 10 8 KBE/ml während der ersten

fünf Lebenstage im Vergleich zu einer nichtbehandelten Kontrollgruppe

(SCHRÖDER, 1992) bzw. zu Placebo (LODINOVA-ZADNIKOVA & SONNENBORN,

1997) eine deutliche Reduzierung der Ansiedlung pathogener und potentiell

pathogener Keime [Abb. 34] im Säuglingsdarm bewirkt [Abb. 35]. Das „Zufallsprodukt

Darmflora“ kann so in physiologische Bahnen gelenkt werden.

Grampositive Isolate

Staphylococcus epidermidis

Staphylococcus aureus

Staphylococcus haemolyticus

Streptococcus agalactiae

andere hämolysierende Streptokokken

Abb. 34 Pathogene und potentiell pathogene Keime im Neugeborenendarm

(nach LODINOVA-ZADNIKOVA & SONNENBORN, 1997; SONNENBORN et al., 1990;

SCHRÖDER, 1992).

Prozent der Kinder mit pathogenen Keimen

100

80

60

40

20

0

kolonisierte Kinder

placebobehandelte Kinder

Gramnegative Isolate

Acinetobacter spp.

Citrobacter freundii

Enterobacter cloacae und andere

Escherichia coli, hämolysierend

Klebsiella pneumoniae, diverse Subspezies

Kluyvera ascorbata

Proteus mirabilis

Providencia alcalifaciens

Serratia liquefaciens

Yersinia enterocolitica

1. Tag 2. Tag 3. Tag 5. Tag 21. Tag 6. Monat Studiendauer

Neben dem kolonisationsprophylaktischen Effekt der gezielten Besiedlung

des Säuglingsdarms mit EcN hat die Verabreichung dieses probiotischen

E.-coli-Stammes einen deutlichen stimulierenden Einfluss auf die Entwicklung

des lokalen Darmimmunsystems und die Antikörperantwort im Blutserum

(LODINOVA-ZADNIKOVA et al., 1992). Die gezielte Darmbesiedlung mit EcN

führte bei 34 Frühchen in einer verblindeten, randomisierten, placebokontrollierten

klinischen Studie im Vergleich zur Kontrolle zu einem signifikanten

Anstieg der Proliferation von Blutlymphozyten bei Ex-vivo-Kontakt mit bakteriellen

Bestandteilen von EcN wie auch einem anderen nichtverwandten

E.-coli-Stamm (CUKROWSKA et al., 2002). Im Blut der mit EcN kolonisierten

Frühchen wurden im Vergleich zur Kontrolle sowohl signifikant höhere IgA-

Antikörperspiegel festgestellt, die gegen den oral verabreichten E.-coli-Stamm

gerichtet waren, als auch eine starke Erhöhung des Spiegels an unspezifischen

polyklonalen IgM-Antikörpern. Letzteres zeigt, dass die Darmbesiedlung mit

EcN neben der Stimulierung spezifischer zellulärer wie humoraler Immunantworten

gleichzeitig zu einer Aktivierung der unspezifischen natürlichen

Immunität führt [siehe Abb. 27].

Fazit: Eine Reihe von klinischen Studien mit Mutaflor ® Suspension zur

gezielten Kolonisierung des Darms bei frühgeborenen und ausgetragenen

Kindern hat gezeigt, dass die Gefahr einer frühen Besiedlung des Gastrointestinaltrakts

mit pathogenen und potentiell pathogenen Keimen durch die

Gabe von E. coli Nissle 1917 deutlich reduziert wird. Dies ist von besonderer

Bedeutung, da Neugeborene in den ersten Lebenswochen nur unvollständig

geschützt sind gegen Fehlbesiedlungen und nosokomiale Infektionen, z.B.

mit multiresistenten Hospitalkeimen.

Weitere Indikationen: Es liegen publizierte Daten von Pilotuntersuchungen

vor, z.B. für die Pseudomembranöse Kolitis (GOERG, 2001; GOERG & SCHLÖRER,

1998), Halitosis (HENKER et al., 2001), Divertikulose (FRIC & ZAVORAL, 2003),

Kollagene Kolitis (TROMM et al., 2004), Reizdarm (KRUIS et al., 2004b), die

das eingangs erwähnte breite Anwendungsspektrum von Mutaflor ® untermauern.

Abb. 35 Randomisierte Doppelblindstudie zur gezielten Kolonisierung des Darms neugeborener

Kinder mit Mutaflor ® . Mit Mutaflor ® ist eine Kolonisationsprophylaxe möglich, die signifikant

die Ansiedlung pathogener und potentiell pathogener Mikroorganismen reduziert

(nach LODINOVA-ZADNIKOVA & SONNENBORN, 1997).

46 47


Ausblick

Escherichia coli hat wie kein anderes Bakterium die Aufmerksamkeit der

Bakteriologen und Infektiologen seit nunmehr 120 Jahren und die der Biochemiker,

Molekularbiologen und Genetiker seit etwa 60 Jahren auf sich

gelenkt. Fundamentale allgemeingültige Erkenntnisse beispielsweise zur Stoffwechselregulation,

zum Gentransfer, zur Antibiotikaresistenz, aber auch zu

den molekularbiologischen Prinzipien der Pathogenese von Infektionserkrankungen

sind mit und an diesem außergewöhnlichen Mikroorganismus, der in

der Natur in vielen tausend Varianten vorkommt, erforscht worden. Die

mikroökologische Bedeutung von E. coli im Gastrointestinaltrakt – erstmals

beschrieben von ESCHERICH (1885) – wurde durch NISSLEs Entdeckung des

Koliantagonismus untermauert (NISSLE, 1916) und findet seitdem erfolgreich

therapeutische Anwendung durch Verwendung von E. coli NISSLE 1917 als

Wirkstoff des Präparats Mutaflor ® . Als ursprünglich physiologischer Darmbewohner

(„E.-coli-Wildtyp“) besitzt der EcN-Stamm Eigenschaften, vor allem

in Hinsicht auf Apathogenität, kombiniert mit Fitness und Kolonisationsfähigkeit,

die ihn in den letzten Jahren für Genetiker und Molekularbiologen,

Infektionsbiologen, Mediziner und andere Forscher zu einem weiteren

„beliebten Versuchstier“ unter den Kolibakterien gemacht haben. So wird

dieser besondere E.-coli-Stamm in der wissenschaftlichen Grundlagenforschung

gern als Referenzstamm für die verschiedensten Untersuchungen

und als Modellorganismus für die Untersuchung des „crosstalk“ zwischen

normalen Darmbakterien und den Epithelzellen des Wirtes genutzt.

Die moderne molekulare Gentechnik erlaubt die schnelle und gezielte Beeinflussung

der genetischen Ausstattung von Bakterien. Damit könnten maßgeschneiderte

Bakterienstämme, z.B. gentechnisch veränderte E. coli, mögliche

neue therapeutische Ansätze für die Behandlung einer Reihe von Erkrankungen

darstellen, wie etwa chronisch entzündliche Darmerkrankungen, bakteriell

verursachte Durchfallerkrankungen oder Darmfunktionsstörungen. Weiterhin

gibt es erste Versuche zur Prävention von HIV-Infektionen durch genetisch

modifizierte Kolibakterien.

E. coli Nissle 1917 ist prinzipiell in der Lage, den Darm zu besiedeln, besitzt

keine Virulenzfaktoren und ist apathogen. Der Stamm könnte so als „Transportvehikel“

für die intestinale In-situ-Synthese rekombinanter Therapeutika

verwendet werden. Möglich wäre eine gezielte therapeutische Beeinflussung

des bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen gestörten mukosalen

Immunsystems durch den Einsatz von E. coli Nissle 1917 als rekombinanter

Antigen-Carrier für immunmodulatorische Moleküle, z. B. antiinflammatorische

Cytokine. Neben einer lokalen Immunmodulation durch gezielte

Wirkstofffreisetzung im Darm ließe sich hierbei möglicherweise auch eine

systemische Beeinflussung von Autoimmunerkrankungen erzielen.

Eine mögliche Prävention von HIV-Infektionen könnte der Schutz der Schleimhäute

von Darm und Vagina, den häufigsten Übertragungswegen für AIDS-

Viren, mit Hilfe antiviraler Medikamente sein. Eine amerikanische Forschergruppe

an den National Institutes of Health in Bethesda erforscht den

E. coli Stamm Nissle 1917 als Carrier für die In-situ-Synthese eines antiviralen

Proteins (RAO et al., 2005).

Magen

Duodenum

log Bakterien / g Gewebe

10

9

8

7

6

5

4

Jejunum

Colon

Caecum

Rectum

Anus

Duodenum Jejunum Ileum Caecum Colon Rectum Vagina

Abb. 36 Nachweis eines rekombinaten Derivats von E. coli Nissle 1917 (EcN) in verschiedenen

Darmabschnitten und Organen bei Mäusen nach oraler bzw. rektaler Verabreichung

von 5 x 10 8 lebenden Zellen. EcN wurde so modifiziert, dass er ein antiviral wirkendes

Anti-HIV-Peptid sezernierte. Dies führte im Mausmodell zum Schutz vor einer Infektion

mit einem HIV-verwandten, mäusepathogenen Virus (nach RAO et al., 2005).

Ileum

48 49


Der Fusionshemmer lagert sich an einer für das Eindringen des Erregers in den

menschlichen Körper wichtigen Stelle auf der Oberfläche von HIV an und

blockiert das Eindringen des Virus in die Wirtszelle. In-vitro-Versuche mit

mononukleären Blutzellen zeigten, dass die Hemmung einer HIV-Infektion

mit zunehmender Konzentration des Fusionshemmers erfolgte. Erste Tierversuche

an Mäusen ergaben eine erfolgreiche Kolonisation unterer Darmabschnitte

und in geringen Konzentrationen auch der Vagina [Abb. 36]. Durch

eine stabile Besiedlung der Schleimhäute mit einem so genmodifizierten E. coli

Nissle 1917 könnte in der Zukunft ein längerfristiger Schutz vor AIDS erreicht

werden.

Auf der Basis eines E.-coli-Carriersystems wird auch an der Entwicklung und

Herstellung von rekombinanten Lebendimpfstoffen gearbeitet (PATON et al.,

2005). Im Gegensatz zu den klassischen Lebendimpfstoffen (Lebendvakzine),

die auf abgeschwächten Erregern beruhen, müssen Keime des E. coli

Stammes Nissle 1917 nicht erst attenuiert (infektionsmäßig abgeschwächt)

werden, da sie keine Virulenzfaktoren besitzen und apathogen sind. Ziel ist es,

lebende, apathogene, genetisch modifizierte Darmbakterien zur mukosalen

Immunisierung als mögliches Trägersystem für oral applizierbare heterologe

Antigene zu nutzen. Eine mukosale Immunisierung würde zu einer Aktivierung

des Immunsystems der Schleimhäute führen und somit Schutz vor

Pathogenen, wie z.B. Durchfallerregern (EHEC, ETEC) oder den Erregern der

Legionärskrankheit und Chlamydien bieten.

ESCHERICHs Wunsch „Mögen die hier gewonnenen Anschauungen nicht

ohne Nutzen und praktische Verwerthung bleiben …“ ist in Erfüllung gegangen,

wie die Ausführungen im vorliegenden Text aufzeigen konnten. Die von

ESCHERICH bereits bei der Entdeckung des Bakteriums gestellte Frage nach

dem „inneren Zusammenhang, … nach der Constanz in dem Vorkommen

gewisser Arten und wodurch dieselbe bedingt ist“, ist auch heute noch nicht

vollständig beantwortet und bedarf weiterer intensiver Forschungen.

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ISBN 3-00-018600-X

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