Prof. W. Engewald - papa-gey.de

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HOCHSCHULE

ZITTAU/GÖRLITZ

University of Applied Sciences

Kolloquium

Prof. Dr. Werner Engewald

Universität Leipzig, Institut für Analytik

zum Thema

"Teil A: Anwendung der GC in der organischen

Spurenanalyse“

„Teil B: Organische Spurenanalyse mittels

GC/MS und HPLC/MS“

Zeit:

Donnerstag, 12.11.2009, ab 8.00 Uhr

Ort: Haus I, Raum 31

Alle Interessenten, KollegInnen und

StudentInnen sind sehr herzlich eingeladen!

Prof. Dr. rer. nat. habil. Manfred H. Gey


Chromatographische

Spurenanalyse

hochempfindlich, selektiv und effizient

W. Engewald

Universität Leipzig

Institut für Analytische Chemie


Maßeinheiten der Spurenanalyse

Nachzuweisende

Menge

Masse

g

Gehalt

pro g

Zahl der Moleküle

pro g (bei 300 Da)

mg

µg

ng

pg

fg

Milligramm

Mikrogramm

Nanogramm

Picogramm

Femtogramm

10 -3

10 -6

10 -9

10 -12

10 -15

1 ppth

1 ppm

1 ppb

1 ppt

1 ppqd

10 18

10 15

10 12

10 9

10 6

1 ppm

1 ppb

1 ppt

1 ppqd

part per million

billion

trillion

quadrillion

1 : 10 6

1 : 10 9

1 : 10 12

1 : 10 15

µg/g

ng/g

pg/g

fg/g

mg/kg

µg/kg

ng/kg

pg/kg

→ z. T. unvorstellbar kleine Mengen („Nadel im Heuhaufen“)

→ aber: Konzentration „Null“ gibt es nicht!


WE

Dimensionen der Kleinheit

Beispiel :

Eine Prise Kochsalz (Frühstücksei) : ca. 0,03 g = 30 mg (Milligramm)

(ca. 200 kleine Kristalle)

aufgelöst in

einem Liter Wasser : 30 mg/l : 30 mg Salz in 1 Million mg Wasser

= 30 ppm

(schmeckt nicht salzig !)

1000 Liter Wasser : 30 mg Salz in 1 Milliarde mg Wasser

Badewanne

30 µg/l = 30 ppb

(Mikrogramm)

Grenzwert der TVO für Pestizide : 0,1 µg/l = 100 ng/l = 0,1 ppb

1000 Kubikmeter Wasser : 30 mg Salz in 1 Billiarde mg Wasser

Schwimmbecken

= 30 ng/l = 30 ppt

50m L x 10 m B x 2m T

(Nanogramm)


Hauptprobleme der organischen Spurenanalyse

• Konzentrationsproblem

• Extrem kleine Gehalte

• Breiter Konzentrationsbereich

• Multikomponentenproblem

• Vielzahl von Verbindungen (Analyte, Begleitsubstanzen) mit sehr

unterschiedlichen und/oder sehr ähnlichen Eigenschaften in z. T. sehr

unterschiedlichen Mengen

• Multimatrixproblem (Objektvielfalt)

• Sehr verschiedenartige Matrices:

→ Anreicherung

→ spezifische Trennung

und Detektion

Luft, Wasser, Boden, Staub, Klärschlamm, Altöl, Blut, Milch, Urin,

Lebensmittel, biologisches Material

z. T. starke Matrix-Analyt-Wechselwirkungen

• Kalibrierproblem

• Methoden der instrumentellen Analytik sind Relativmethoden

→ Problem- und Objektbezogene Strategie

→ Vortrennung

→ Kalibrierung, Standards


Grundoperationen der organischen Spurenanalytik

• Repräsentative und problemorientierte Probenahme

Auswahl

Gewinnung

• Probenvorbereitung

Transport

Lagerung

• Extraktion (Abtrennung der Analyten von der Probenmatrix)

• Aufkonzentrierung

• Anreicherung ohne wesentliche Verluste, Vermeidung von

Verunreinigungen

→ Durchführung aller Operationen unter reinen Bedingungen:

- Reine Gefäße und Geräte

- Hochreine Lösungsmittel und Chemikalien

- Reine Atmosphäre

• Bestimmung

• Trennung der Einzelkomponenten

• Identifizierung

• Quantifizierung


Systematische Fehler

Gemessene Konzentration

Zu gering

falsch negativ

Mögliche Ursachen

Substanzverluste

(Probenahme und Anreicherung)

• unvollständige Extraktion

• Matrixeffekte

• Adsorption

• Verflüchtigung

• Zersetzung

Ungeeignete Kalibration

Zu hoch

falsch positiv

Signalüberlagerungen

• ungenügende Trennung

• ungenügende Selektivität der Detektion

Kontamination

• Gefäße, Lösemittel, Chemikalien, Laborluft


Probenvorbereitung

• Ziel

Überführung der Analyten in eine für die analytische Bestimmung

geeignete Form

• Methoden

• Zerkleinern, Homogenisieren und Verjüngen von Festproben

• Aufschlußverfahren

Aufschluß:

Überführung schwerlöslicher Substanzen in säure- oder

wasserlösliche Verbindungen (chemische Veränderung der

Analyten/Matrix): versch. Varianten für Naß- und

Schmelzaufschluß, Veraschung, Verbrennung

• Extraktion

Überführung der Analyten in ein anderes LM (ohne chem. Veränderung)

• Anreicherung

Möglichst selektive Isolierung und Anreicherung der interessierenden

Spurenkomponenten aus der Matrix

→ Oft sehr zeitaufwendig und fehlerbehaftet


Extraktion

• Extraktion

Überführung eines oder mehrerer Analyten von einer Phase in eine andere

• Ziel

Überführung der Analyten in eine für die Bestimmung geeignete Form

• Spurenanalyse: Selektive Isolierung und Anreicherung der Spurenkomponenten

Analyt-Matrix-Trennung (Eliminierung von Interferenzen)

• Komplexe Gemische: Selektive Vortrennung (Fraktionierung)

• Varianten

• Liquid-Liquid-Extraction LLE

(Füssig-Flüssig-Extraktion)

• Feststoff-Extraktion

• Solid Phase Extraction SPE

(Festphasen-Extraktion)

• Headspace-Extraktion HSE

Extraktion aus

Wäßrigen Proben mit org. LM

Feststoffen

Flüssigen und gasförmigen Proben an festen Phasen

Kopfraum (Dampfraum) über festen oder flüssigen Proben

• Kriterien

off-line oder on-line Kombination mit Bestimmungsmethode, Anreicherungsfaktor,

Wiederfindungsrate, manueller Aufwand, Automatisierbarkeit, Probendurchsatz,

Miniaturisierung, Vermeidung von Kontamination sowie Analytverschleppung in folgende Proben

(carry-over)


Extraktionstechniken I

Phase I

(Probe)

fest

Phase II

Extr.-mittel

flüssig

Extraktionstechnik

• Solventextraktion

Soxhlet (versch. Varianten u. Weiterentwicklungen):

ASE beschleunigte LM-Extraktion: T extr.

> Tp Solv

MASE mikrowellenunterstützte Extraktion

USE Ultraschall-Extraktion

PHWE Pressurized Hot Water Extraktion

überkritisch

gasförmig

• SFE Superkritische Fluidextraktion

• Gasextraktion

- statische Headspace

- dynamische Headspace

- direkte Thermodesorption

• Wasserdampfdestillation


Phase I

(Probe)

Extraktionstechniken II

Phase II

Extr.-mittel

Extraktionstechnik

flüssig fest • adsorptive Extraktion:

- SPE Festphasenextraktion

- SPME Festphasen-Mikroextraktion,

Membrantechniken

gasförmig

flüssig

gasförmig

fest

flüssig

• LLE Liquid-Liquid-Extraktion

versch. Varianten: Perforatoren, Selektivextraktion

(Verknüpfung mit chem. Gleichgewichten)

• Stir bar sorptive Extraktion

•Gasextraktion

- Headspace-Probenahme

- P & T Purge and Trap

• adsorptive Anreicherung / Thermodesorption

/ LM-Desorption

• SPME (Adsorbensbeschichtung)

• SPME (flüssige Faserbeschichtung, z.B. PDMS)

• Stir bar sorptive Extraktion

• Absorption (Waschlösungen)


Anreicherung

• Anreicherung

Erhöhung der Analytkonzentration bzw. des Massenverhältnisses von

Spurenkomponenten zur Matrix

• Absolute Anreicherung

Überführung der Spurenstoffe aus einem großen Volumen in ein geringeres

Volumen (andere Flüssigkeit)

• Relative Anreicherung

Erhöhung der Stoffmengenkonzentration ohne Phasentransfer der Analyte (z. B.

Einengen)

• Selektive Anreicherung

Kombination der Anreicherung mit selektiver Abtrennung der

Spurenkomponenten aus der Matrix

• Charakterisierung eines Anreicherungsverfahrens

• Anreicherungsfaktor (Enrichment factor/rate EF/ER)

Analytkonz. nach Anreicherung

ER = =

Analytkonz. vor Anreicherung

Probevol. vor Anreicherung

Probevol. nach Anreicherung

• Wiederfindungsrate (x in %)


Wiederfindung (Recovery)

• Beurteilungskriterium für ein Analysenverfahren oder Teilschritt bezüglich der „Ausbeute“

an Analyten

• Dient der Erkennung von Analytverlusten bei der Probenvorbereitung, z.B.:

• Verluste an leichter flüchtigen Verbindungen bei Einengen oder Abdampfen des Lösungsmittels

• Verluste durch Zersetzung bei der Probenvorbereitung, Adsorption an Gefäßwänden,

unvollständige Desorption (z.B. SPE)

• Verluste beim Transfer zwischen Gefäßen

Ermittlung der Wiederfindungsrate WFR (recovery rate RR):

Durchführung von Wiederfindungsexperimenten:

Analyse repräsentativer Matrixproben nach Zusatz einer definierten Menge eines Standards

und Durchführung des gleichen Probenaufbreitungs- und Bestimmungsprozesses

RR = × 100%

x bestimmt

x theoretisch

Beachte:

Die Recovery ist konzentrationsabhängig!

Zugabe des Standards im gleichen Konzentrationsbereich wie zu analysierende

Gehalte

Möglichst vollständige Wiederfindung anzustreben (90-100%), aber auch niedrigere WFR

akzeptabel, wenn reproduzierbar


Grundbegriffe der Chromatographie

• IUPAC - Definition:

‣Chromatographie ist ein physikalisch-chemisches Trennverfahren, bei dem die

zu trennenden Substanzen zwischen zwei Phasen verteilt werden, von denen

eine, die stationäre Phase, festliegt, während die andere, die mobile Phase, sich

in einer bestimmten Richtung bewegt.

Detektorsignal

• Stationäre Phase

• bewirkt Verzögerung (Retention) der Komponenten

• Feststoff oder Flüssigkeit (mit großer Oberfläche)

t

• Mobile Phase

• bewirkt Stofftransport

• Gas (GC), Flüssigkeit (LC) oder überkritisches Fluid (SFC)

• Transport durch Druck, Schwerkraft oder Kapillarkräfte


Aufbau eines Gaschromatographen

• Gas Versorgung: hochreines Trägergas (He, H 2

, N 2

)

• Injektor: Probenaufgabe (gas, flüssig):

mittels Mikroliterspritzen, Autosampler, Gasventile

• Trennsäule: gepackte Säule oder Kapillarsäule

• Säulenofen: Thermostat ( 30 – 350 °C )

• Detektor: Universal oder elementspezifisch

• Datenaufnahmesystem


800000

750000

700000

650000

600000

550000

500000

450000

400000

350000

300000

250000

200000

150000

100000

50000

Fettsäuremethylester-Standardgemisch

Injektor: Trägergas: Helium; konst. Fluß; 1,3mL/min

KAS 4; 280°C

Split: 1:358

Säule: high polarity cyanophase (10m x 0,1mm x 0,1µm)

Temp.: 40°C; 43°C/min → 185°C; 9,5°C/min → 215°C

Detektion: MS (35 - 350amu); TIC

2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00

Zeit (min) →

Abundance

C 11:0

C 12:0

C 17:1

C 18:2

C 13:0

C 14:0

C 14:1

C 15:0

C 15:1

C 16:1

C 17:0

C 18:0; Kp 337°C

C 18:1

C 18:1

C 18:3

C 18:3

C 20:0; Kp 363°C

C 20:1

C 20:2

C 20:3

C 20:4

C 22:0; Kp 387°C

C 22:1

C 22:2

C 24:1

C 16:0


Trennsäulen

Gepackte Säulen

• Innendurchmesser von 2 bis 4 mm

• Säule ist vollständig mit Partikel gefüllt

Adsorbens → GSC

Trägermaterial mit stationäre Phase

(Flüssigkeit) belegt → GLC

•Säulenlänge nur 1 bis 6 m (Strömungswiderstand)

•Säulenmaterial: Kupfer, Stahl, Glas oder

Quarzglas

Kapillarsäulen

• Innendurchmesser


Trennsäulen in der Gaschromatographie

Bezeichnung

Gepackte Säule

Filmkapillare (WCOT)

Schichtkapillare

(PLOT)

Stationäre Phase

a) dünner Film einer Flüssigkeit

auf der Oberfläche

eines Trägermaterials

dünner Film einer hochsiedeten

Flüssigkeit an

der Innenwand

Adsorbensschicht an

der Innenwand

b) Feststoffpartikel

Retentionsmechanismus

a) Verteilung

b) Adsorption

Verteilung (Löslichkeit)

Adsorption

Dimensionen

L

ID

Film/Schicht

1 - 6 m

2 - 4 mm

5 - 100 m

0,1 - 0,6 mm

0,1 - 10 µm

5 - 30 m

0,2 - 0,6 mm

5 - 50 µm


Wichtige stationäre Phasen

Polydimethylsiloxan

Poly-diphenyldimethylsiloxan

CH 3

Si

CH 3

O

n

z.B. DB-1, HP-1, OV-1,

RTX-1, CP Sil 5 CB

Si

O

CH 3

Si

CH 3

95%

5%

O

z.B. DB-5, HP-5, OV-5,

RTX-5, CP Sil 8 CB

20% Diphenyl/ 80%

Dimethyl

(RTX-20)

… …

35% Diphenyl/ 65%

Dimethyl

(HP-35, RTX-35)

Si

O

CH 3

Si

O

CH 3

50%

50%

z.B. DB-17, HP-17, RTX-50

Poly-cyanopropylphenyl-dimethylsiloxan

CN

CN

Polyethylenglycol PEG

)

3

CH 3

)

3

CH 3

CH 2 CH 2 O

n

(CH 2

6%

Si

O

Si O

CH 3

94%

Si

O

(CH 2 14%

Si O

CH 3

86%

z.B. DB-Wax, Carbowax,

Suplecowax, Stabilwax

z.B. DB-1301, HP-1301,

RTX-1301

z.B. DB-1701, RTX-1701,

CP Sil 19 CB


Der chromatographische Prozess

Theoretische Boden (Trennstufe):

gedachter Längsabschnitt, der für eine

Gleichgewichtseinstellung benötigt wird.

Multiplikative Verteilung

Folge vieler nichtstationärer Verteilungsvorgänge zwischen stationärer und mobiler

Phase (erfordert schnellen Stofftransport)

Aufenthalt in der stationären Phase (Retention) erfolgt entsprechend der

Verteilungskonstante K i


Prinzip der multiplikativen Verteilung

• Trennung zweier Verbindungen mit Verteilungskoeffizient K 1

= 2,0 und K 2

= 1,0

• Modell:

Betrachtung des kontinuierlichen Trennvorgangs als eine Folge von

Einzelschritten

Zerlegung der Trennsäule in Segmente (Trennstufen, theoretische Böden),

in denen jeweils eine Gleichgewichtseinstellung zwischen stationärer und

mobiler Phase erfolgen soll:

mobile Phase

stationäre Phase

Trennstufe (theoretischer Boden)

Volumenverhältnis der Phasen

β = V M

/ V S

= 1

Verteilungskoeffizient K = c stat

/ c mob

K 1

= 2,0 = 2:1 α = K 1

/ K 2

= 2

K 2

= 1,0 = 1:1


Prinzip der multiplikativen Verteilung

72 µg Verbindung 1 K 1

= 2,0

72 µg Verbindung 2 K 2

= 1,0

Start

72 72

1. Gleichgewichtseinstellung

24 36

48 36

Transport

48 36

24 36

2. Gleichgewichtseinstellung

16 18

32 18

8 18

16 18

Transport

32 18

16 18

16 18

8 18

3. Gleichgewichtseinstellung

10,6 9

21,4 9

10,6 18

21,4 18

2,7 9

5,3 9


Dosiertechnik


GC-Detektoren

Abkürzung Name Anwendung/ Selektivität

WLD (TCD)

Wärmeleitfähigkeitsdetektor

(thermal conductivity)

universell

FID Flammenionisationsdetektor Organische Verbindungen (C, H)

NPD Stickstoff/Phosphor Detektor Stickstoff-, phosphorhaltige

Verbindungen

ECD

FPD

Elektroneneinfangdetektor

(electron capture)

Flammenphotometrischer

Detektor

Halogenhaltige Verbindungen

Schwefelhaltige Verbindungen

PID Photoionisationsdetektor Aromaten

HID Heliumionisationsdetektor Gase

Kopplungstechniken

FTIR Fourier Transformation Infrarot

Detektor

AED

MS

Atomemissionsdetektor

Massenspektrometer

(MSD – mass selective detector)


Olfaktorischer Detektor („sniffing port“)

Nach GC Trennung in die verschiedenen Komponenten, wird der Geruch einer

jeden Komponente „erschnüffelt“.

Zerlegung des komplexe Geruch eines Parfums in verschiedene einzelne

Duftnoten

Analyse von Lebensmitteln, Düften und Aromen


WE

GC mit biologischem Detektor

Pheromone : Botenstoffe der Insekten

A.Butenandt (Nobelpreis 1939)

untersuchte in 50er Jahren die Sexuallockstoffe des Seidenspinners :

Weibchen sendet Substanz aus, die die Männchen in großer Entfernung

anlockt

→ Extrakte aus den Drüsen der Weibchen

→ Problem : welche Verbindung(en) wirken als Lockstoffe ?

E. Bayer 1959 : Biologische Objekte als Detektor

in eine Kammer am Ende der GC-Säule wurde ein Seidenspinnermännchen

plaziert

→ bei Elution der meisten Verbindungen keine Reaktion

→ bei Elution einer Verbindung Erregung, wirbelnder Tanz

Butenandt : Strukturaufklärung

(E,Z)-10,12-Hexadecadien-1-ol (Bombykol)


• Prinzip der statischen HS-GC

Headspace-GC HSGC

1. Thermostatisierung der Probe in einem

verschlossenen Gefäß bei höherer Temperatur

⇒ Verteilungsgleichgewicht der flüchtigen

Verbindungen zwischen Probe und Gasphase

2. Entnahme eines aliquoten Gasvolumens aus

dem Dampfraum und Überführung in den GC

mittels

- gasdichter Spritze

- pneumatischer Dosiervorrichtung

(Gleichdruck- oder Konstantdruckdosierung)

3. Kalibrierung zur quantitativen Analyse

interner oder externer Standard, Aufstockung


WE

Ethanolbestimmung in Blut (BAK)

1920 E.M.R. Widmark : „isotherme Destillation“

Blutprobe wird in einem Spezialgefäß 1 Stunde auf 60 °C erwärmt,

flüchtige Substanzen gelangen in eine Vorlage mit Bichromatlösung,

Ethanol wird oxidiert

Rücktitration des nicht verbrauchten Bichromates

wenig spezifisch (oxidierbare Substanzen)

1962 G. Machata (Universität Wien) : GC mit FID

Blutprobe wird auf gepackte Vorsäule dosiert, beim schnellen Aufheizen

gelangen flüchtige Verbindungen auf Trennsäule, während unverdampfbare

Rückstände auf Vorsäule verbleiben

Packung der Vorsäule muss periodisch ausgewechselt werden

1962 A. C. Curry et al : Headspace – GC

1967 G. Machata und Bodenseewerk Perkin Elmer & Co, Überlingen : F- 40

erstes automatisches System für Headspace-GC auf Messe ACHEMA

in Frankfurt / M vorgestellt

Problem : präzise und reproduzierbare Überführung der Analyten vom

Dampfraum der Probengefäße in GC-Säule : balanced–pressure sampling


Prinzip der HS-SPME

• Extraktion aus dem Gasraum (Kopfraum) über

flüssigen, festen oder heterogen Proben

• Dreiphasensystem aus

Probe (S), Gasraum (G) und Faserbeschichtung (F)

• Zwei Phasengleichgewichte (G-S und F-G):

Flüchtige Analyte verteilen sich zwischen den drei

Phasen in Abhängigkeit von Verteilungskoeffizient,

Temperatur und Volumenverhältnis der Phasen:

K =

GS

c

c

G

S

K =

FG

c

c

F

G

T K GS K FG


Pinus peuce

Rumelische Kiefer

Pinus strobus

Weymouthskiefer

Pinus schwerinii

Kulturhybride aus

Weymouthskiefer und

Himalaya Kiefer

Pinus monticola

Westamerikanische

Weymouthskiefer

Peak

Substanz

1

Tricyclen

6

α - Phellandren

2

3

4

5

α - Pinen

Camphen

β - Pinen

Myrcen

7

8

9

Limonen

β - Phellandren

Terpineolen

aus:

J. High Resol. Chromatogr. 18 (1995) 587-592


Massenspektrometrie (MS)

• Massenspektrometrie:

• Erzeugung gasförmiger Ionen aus der Probe

• Trennung dieser Ionen entsprechend ihrem Verhältnis von Masse zu Ladung m/z

im Hochvakuum

• Detektion dieser Ionen

• Massenspektrum:

• Darstellung der (relativen) Intensität der getrennten Ionen als Funktion des m/z-

Verhältnisses

• Massenspektrometer

• wichtigste Komponenten eines Massenspektrometers

Einlaßsystem Ionenquelle Trennsystem Detektor Computer

Vakuumsystem

Probeneinführung

Erzeugung von

gasförmigen Ionen

Trennung der Ionen

entsprechend ihrem

Verhältnis m/z

Detektion der

Ionen

Gerätesteuerung

Datenspeicherung

und -verarbeitung


Massenspektrum

• Darstellung der relativen Intensität (Häufigkeit, Abundance) der gebildeten Ionen

als Funktion ihrer Massenzahl MZ (eigentlich des Verhältnisses der Masse m

zur Ladung z)

Strichspektrum I = f (m/z) bzw. (MZ)

Pyrrolidid-Derivat der Hydnocarpussäure

• Signale

• Basispeak:

• Molekülionenpeak:

• Isotopenpeaks:

• Fragmentpeaks:

http://www.lipidlibrary.co.uk/ms/ms19/index.htm

intensivster (größter) Peak im Spektrum;

dient als Intensitätsstandard (100%)

Signal mit höchster Massenzahl

Ionen mit gleicher chemischer Formel;

gebildet durch schwerere Isotope

Ionen von Bruchstücken oder Umlagerungsprodukten


Ionisierungstechniken in GC/MS

• EI Elektronenstoßionisation: „harte Ionisierungstechnik“

• +

Fragmentierung

• M e M 2e

+ → + ⎯⎯⎯⎯⎯→ F1 + F2 + F3

+ + +

Energiereiche

Radikalkationen

• Hohe Ionisierungs-

Energie (70 eV)


starke Fragmentierung

strukturspezifisch,

reproduzierbar


charakteristische

Fragmentierungsmuster

• Hoher Informationsgehalt der EI-Spektren → Spektrenbibliotheken

• Anwendung: Identifizierung

• CI Chemische Ionisation: „weiche Ionisierungstechnik“

• Ionisierung via Reaktandgas → Bildung stabiler Ionen

Quasimolekülionen: [M–H] – [M+H] +

Adduktionen

• Keine bzw. geringe Fragmentierung

• Anwendung: Selektive Spurenbestimmung von Targetverbindungen

PCI positive Ionen

NCI negative Ionen


Quadrupole Mass Analysator

+

+

+

+

Ions are scanned by varying the DC/Rf

voltages on the quadrupoles


Electron Impact (EI) Mass Spectrum of Hexane

Mass spectrum of hexane (70 eV)

Fragmentation of hexane


“Electron Impact” – Mass Spectra

n-Octane C 8 H 18 MW 114

2,2,4-Trimethyl pentane (iso octane) C 8 H 18 MW 114


EI

CI

From:Silverstein, Bassler, and Morrill


GC/MS-Techniken

Trennsystem

Trennung

Auflösung

Bemerkung

Q

IT

QqQ

Quadrupol

Ionenfalle (IonTrap)

Triple Quadrupol

Hochfrequente

elektrische

Wechselfelder

Nominalmasse

(low resolution)

MS n

MS–MS (Tandem-

MS)

Doppelfokussierende

Sektorfelder

Kombination

aus elektr. u.

magn. Feld

Hochauflösung

(high resolution)

TOF

Time of Flight

(Flugzeit-MS)

TOF-hs (high speed)

TOF-hr (high resolution)

Flugzeit im

feldfreien

Raum

Nominalmasse

Hochauflösung

schnelle GC,GC×GC

FT-ICR

Fourier-Transform-

Ionencyclotronenresonanz

Elektrische

Wechselfelder

Höchstauflösung

IRMS

Isotope ratio MS

Konstantes

Sektorfeld,

mehrere

Auffänger

Isotopenverhältnisse

Substanzspezifische

Isotopenanalytik


GC/MS-Aufnahmetechniken

• MS als Universaldetektor: „Scan-Mode

•Cyclische Registrierung der Massenspektren

→ Total-Ionenstrom-Chromatogramm (TIC)

•EI Massenspektren → Identifizierung: Spektrenbibliotheken

• Massenselektive Detektion (wählbar)

•Massenchromatogramm, Reconstructed Ion Chromatogram

Darstellung von Ionenspuren aus abgespeicherten Massenspektren im Scan-

Mode: Übersichtliche Präsentation der TIC-Daten (kein Empfindlichkeitsgewinn)

→ Erkennung und Auswertung von überlagerten Peaks

•Selected Ion Monitoring (SIM-Mode)

Selektive und empfindliche Registrierung von ausgewählten Massenzahlen

Keine kompletten Massenspektren

→ Spurenanalyse von Targetverbindungen


GC–MS Aufnahmetechniken I

Scan-Modus: MS als Universaldetektor

• Cyclischer Scan: fortlaufender Durchlauf des ausgewählten Massenbereiches (z.B.

40-400) in sehr kurzer Zeit

→ 1-10 Massenspektren pro Sekunde, die abgespeichert werden

• Generierung des Chromatogramms durch Darstellung der aufsummierten

Signalintensitäten gegen die Zeit

→ Totalionenstrom-Chromatogramm (TIC)

• Identifizierung der Substanzen durch Vergleich der gespeicherten Massenspektren

mit Spektrenbibliotheken

→ Suchalgorithmen, Spektrendeconvolution

• Massenfragmentographie (Reconstructed/Extracted Ion Chromatogram)

Registrierung ausgewählter Ionenspuren aus den Scan-Daten

→ Erkennung und Auswertung koeluierender Verbindungen in komplexen

Gemischen (massenselektive Detektion)


Total Ion Chromatography (TIC)

m/z

MS Spectrum

Chromatogram

Retention time


Total and Extracted Ion Chromatogramm


GC–MS Aufnahmetechniken II

MS als massenselektiver Detektor

Registrierung des Signals nur für eine oder einige wenige charakteristische Massenzahlen:

Im Chromatogramm werden nur Verbindungen registriert, deren Massenspektren die

eingestellten m/z-Werte aufweisen.

→ Suche nach bestimmten Strukturen mit bekannten Massenspektren

(target analysis)

2 Varianten:

a) Massenfragmentographie, Extracted Ion Chromatogram

Darstellung aus den gespeicherten Scan-Daten

b) SIM-Modus (Selected Ion Monitoring, Multiple Ion Recording)

Registrierung nur der eingestellten m/z-Werte (bis zu 6 Ionen):

10- bis 100-fach höhere Signalintensität als bei TIC

☺ Verbesserte Empfindlichkeit und Selektivität

→ Spurenanalyse von Targetverbindungen

Verlust an molekülspezifischer Information (keine kompletten Massenspektren)

→ zur Identifizierung werden 3 charakteristische Ionen pro Zielanalyt registriert


Identifizierung bei Selected Ion Monitoring (SIM)

• Im SIM werden keine kompletten Massenspektren registriert

→ Verlust an molekülspezifischer Information

• Zur Identifizierung werden drei charakteristische Ionen pro

Zielanalyt registriert:

• 1 Quantifier Ion (intensivster Peak)

• 2 Qualifier Ions

• Identität gilt als gesichert, wenn

• alle ausgewählten Ionen im vorgegeben Retentionszeitfenster

vorhanden sind und

• ihre Flächenverhältnisse denen des Kalibrierstandards entsprechen

→ zulässige Toleranzen?

• EU-Regularien für Pestizid-Rückstandsanalytik

(Identifizierungspunkte, Toleranzen)


GC/MS-SIM-Spurenanalyse von Dichlofluanid

Probe 1

Probe 2

Ion Expected Actual

m/z % (*) %

223,9 100,00 100,00

167,0 103,70 53,22

331,9 17,40 0,00

(*) Kalibrierstandard

Ion Expected Actual

m/z % (*) %

223,9 100,00 100,00

167,0 103,70 98,27

331,9 17,40 14,59

+ ?–

→ Substanz

nicht vorhanden

+

Quantifier Ion

Qualifier Ion

Qualifier Ion

Quantifier Ion

Qualifier Ion

Qualifier Ion

→ Substanz

vorhanden


EU-Richtlinien I

• Entscheidung der EU-Kommission vom 12.08.2002 zur Umsetzung der Richtlinie

96/23/EC (Kontrollsystem für pharmakologisch wirksame Rückstände in

lebensmittelliefernden Tieren) zur Durchführung von Analysenmethoden und der

Auswertung von Ergebnissen

• Geeignete Bestätigungsmethoden für org. Rückstände und Kontaminanden

• GC/MS und LC/MS nur nach chromatographischer online- oder offline-Trennung

• GC-ECD nur, wenn zwei Säulen mit untersch. Polarität verwendet werden

• Chromatographische Methoden sind ohne zusätzlichen spektroskopischen Nachweis

nicht als Bestätigungsmethoden geeignet

• Leistungskriterien und Anforderungen an GC:

• Geeignete interne Standards (stabilisotopenmarkierte Formen des Analyten oder

strukturell verwandte Verbindungen) müssen am Anfang des Extraktionsprozesses der

Probe zugesetzt werden bzw. Co-Chromatograpie (Aufstocken)

• Akzeptable Mindest-Retentionszeit der Analyten: mindestens das Doppelte der

Retentionszeit für das Totvolumen der Säule (k‘ ≥ 2)

• Toleranz der rel. Retentionszeit (Analyt/Standard) im Vergleich zur Kalibrierlösung:

GC ±0,5%; HPLC ±2,5%


EU-Richtlinien II

Anforderungen für den massenspektrometrischen Nachweis zur Identifizierung

(Bestätigung) von org. Rückständen und Kontaminanden

• Zulässige Höhentoleranzen für relative Ionenintensitäten angeben

(Full-Scan und SIM)

• Full-Scan: Aufzeichnung kompletter Massenspektren

Es müssen mind. 4 Ionen mit einer rel. Intensität von ≥ 10% des Basispeaks

vorhanden sein (einschl. Molekülionenpeak)

• SIM: System von Identifizierungspunkten

Bestätigung von verbotenen Stoffen erfordert mind. 4 Indentifizierungspunkte

Bestätigung von zugelassenen Stoffen erfordert mind. 3 Identifizierungspunkte

maximal können 3 separate Verfahren angewandt werden

MS-Verfahren

Niedrig auflösende MS (LR-MS)

LR-MS n Vorläufer-Ion

LR-MS n Übergangsprodukte

Hochauflösende MS (HRMS)

HR-MS n Vorläufer-Ion

HR-MS n Übergangsprodukte

Erzielte Identifizierungspunkte pro Ion

1,0

1,0

1,5

2,0

2,0

2,5


Massenspektrum bei Peaküberlagerung

TIC & SPECTRUM

TIC

Component 1

Component 2

Component 3

B. Rothweiler, Agilent Technologies


Spektrendeconvolution

TIC & Spektrum

Deconvoluted Peaks mit Spektren

TIC

Component 1

Component 2

Component 3

Deconvolution

Matrix

B. Rothweiler, Agilent Technologies


Spektrendeconvolution in GC/MS

• Deconvolution

Mathematische Techniken zur schnellen und genauen Extraktion einzelner Signale aus einer komplexen Matrix

• GC/MS

Extraktion „sauberer Massenspektren“ bei

• Überlagerung mit anderen Komponenten

• Hohen Untergrundsignalen

• Prinzip

Während oder nach der Spektrenaufnahme werden die Intensitätsverhältnisse

aller Massensignale ständig (als Funktion der Retentionszeit) miteinander verglichen

→ Erkennung und Zerlegung von „mixed mass spectra“

Voraussetzungen: (geringfügige) Unterschiede in den Massenspektren und Retentionszeiten

• Anwendung/Vorteile

Verringerung des Aufwandes sowie höhere Sicherheit bei der Identifizierung von Substanzen in komplex

zusammengesetzten Proben durch Vergleich mit Bibliotheksspektren

→ Identifizierung und Quantifizierung von Spurenkomponenten in Nachbarschaft zu intensiven Peaks

• Beispiel AMDIS (Automated Mass Spectral Deconvolution and Identification System)

→ Kann in Suchalgorithmen integriert werden


Tandem-MS (MS/MS-Techniken)

Prinzip der MS/MS

Kombination von 2 Massenanalysatoren über eine Kollisionszelle

IQ - 1. Massenanalysator - Kollisionszelle - 2.Massenanalysator

Molekülionen Auswahl charakterist. Stoßreaktionen mit Registrierung der

(Gemisch) „Vorläufer-Ionen“ Gasatomen gebildeten

(Precursor ions) (He, Ar, Xe, N 2 ) Produktionen

(Fragmentierung)

CID Collision Induced Dissociation

Eliminierung der Probenmatrix höheres Signal-zu-Rausch-Verhältnis und

verbesserte Selektivität; Strukturaufklärung, Quantifizierung von Targetverb.

Realisierung der MS/MS

• Tandem-in-space : Triple-Quadrupol-Massenspektrometer QqQ

Prozesse finden an unterschiedlichen Orten statt

• Tandem-in-time : Ionenfalle : Multistage-MS/MS (MS n )

Ionencyclotronresonanz-Massenspektrometer (ICS)

Prozesse erfolgen sequentiell (in zeitlicher Abfolge) am gleichen Ort


Tandem – MS II

MS/MS - Varianten

Modus Q1 Q2 Q3 Anwendung/Problem

product ion scan SIM CID Scan Welche Fragmente bildet das

ausgewählte Ion?

Fragmentierung nach weicher

Ionisation

precursor ion scan Scan CID SIM Aus welchem Vorläufer-Ion

stammt das ausgewählte Ion?

neutral loss Scan CID Scan Werden bestimmte Neutralteilchen

abgespalten ?

Multiple reaction SIM CID SIM Einzelintensitäten von

monitoring (MRM)

Produktspektren:

selected reaction

Selektive und empfindliche

monitoring (SRM)

Quantifizierung bei

komplexen Matrizes


Multiple Reaction Monitoring (MRM)

Analyten Ionisation Q1 Q2 Q3

(ESI,APCI) Precursor ion Collision cell Fragment ion

Auswahl (CID) Analyse

A

B

C

[A+Na] +

[A+H] +

[A+NH 4 ] +

[B+Na] +

[B+H] +

[B+NH 4 ] +

[C+Na] +

[C+H] +

[C+NH 4 ] +

X +

Y +

[B+H] + Y+

Z +

„doppelter SIM“

Detektion von precursor/product Ionenpaaren

(Dwellzeit 40 msec für jeden MRM Übergang)

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