Rasterkraftmikroskopische Untersuchungen an nativen biologischen ...

GRUNDLAGEN UND METHODEN
4 Reinigung und Rekonstitution von ScrY
Extraktion: Homogenisierung und Extraktion der Membranfraktion erfolgte mit 0,1 % (m/v) Natriumdodecylsulfat
(SDS) in Präparationspuffer (zweimal): Sediment II. Dieses wird wiederum
homogenisiert und mit 2 % (m/v) Genapol X80 in Präparationspuffer extrahiert (zweimal): Sediment
III. Wiederum Homogenisierung und Extraktion mit 0,2 % (m/v) Lauryldimethylaminoxid
(LDAO) in Präparationspuffer: Sediment IV, Überstand I (enthält ScrY). Homogenisierung und
Extraktion des Sediments IV mit 0,6 % (m/v) LDAO in Präparationspuffer (ScrY-haltiger Überstand
II).
Anionenaustausch-Chromatographie der beiden Überstände: Auftrag auf eine Anionenaustauscher-Säule
(DEAE EMD Fractogel 650 M, Merck). Waschen mit 0,6% LDAO in Präparationspuffer:
im Gegensatz zu früheren Protokollen (z. B. Forst et al., 1993) wurde eine viel größere
Menge Waschpuffer verwendet, nämlich statt dem 6- bis 8-fachen Säulevolumen das 60-fache,
um Verunreinigungen durch andere Proteine und Restlipid zu entfernen. Danach Detergenzaustausch
von LDAO zu β-D-Octylglucopyranosid (β-OG) mit 1,2 % β-OG in Präparationspuffer.
Die Elution des Porins erfolgt mit einem linearen Salzgradienten 0 bis 250 mM LiCl (1,2 % β-OG
in Präparationspuffer sowie LiCl, 8-faches Säulenvolumen). ScrY eluierte bei ca. 125 mM LiCl.
Die Überprüfung der Qualität der Fraktionen mit gereinigtem ScrY erfolgte mittels SDS-PAGE
(Gradienten-Gel, System Phast, Pharmacia). Die Bande von ScrY liegt bei ca. 53 kDa, wenn die
Probe gekocht wird. Die porinhaltigen Fraktionen wurden in einer Ultrafiltrationszelle aufkonzentriert.
Somit erhielt man etwa 5 bis 10 mg/ml Protein in 20 mM Tris / pH 7,7 / 10 mM MgSO 4 /
125 mM LiCl / 1,2 % β-OG / 3 mM NaN 3 .
4.2 Rekonstitution und 2D-Kristallisation
Der Puffer zur Verdünnung der Proteinlösung ist bei erhöhtem Detergenzanteil an den Elutionspuffer
der ScrY-haltigen Fraktionen aus der Proteinreinigung angelehnt: 20 mM Tris (pH 7,7), 10
mM MgSO 4 , 100 mM LiCl, 2 % β-OG.
Die Lipide wurden in vorher ausgeglühte Schliff-Röhrchen eingewogen und Stammlösungen in
Methanol (10 mg/ml) angesetzt (Dimyristoyl-L-α-Phosphatidylcholin, C14:0, T trans = 23 ◦ C,
DMPC und β-Palmitoyl-γ-Oleoyl-L-α-Phosphatidylcholin, C16:0/C18:1, T trans = −2 ◦ C, POPC).
Zur Herstellung der Lipid-Detergenz-Lösungen wird jeweils eine entsprechende Menge davon in
ein frisches, ausgeglühtes Glasröhrchen gegeben und im Rotationsverdampfer bei etwa 20 Torr
und 30 - 40 ◦ C getrocknet. Anschließend wird der Lipidfilm in Proteinpuffer, allerdings mit 20 %
β-OG, gelöst und anschließend mit detergenzfreiem Puffer auf 1 mg/ml Lipid bzw. 2 % β-OG
verdünnt.
Die Proteinlösung wurde zuächst durch einen Filter der Ausschlussgröße 100 nm gereinigt, um
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