Versuch F1

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Versuch F1

F1: Bindung von ANS an Rinderserumalbumin

BSA: Bovine serum albumine, Rinderserumalbumin

ANS: 1-Anilinonaphthalin-8-sulfonsäure

Fluoreszenzspektroskopie ist eine viel verbreitete Analysenmethode in der Biochemie. Durch

Auswahl der Anregungs- und Emissionswellenlänge kann eine hohe Spezifität und damit eine

große Sensitivität erreicht werden. Zum einen können geringe Mengen Fluorophor

nachgewiesen werden, was z.B. beim Confocal microscope oder bei

Einzelmoleküluntersuchungen genutzt wird. Zum anderen können auch (geringe) Änderungen

des Fluorophors oder seiner Umgebung verfolgt werden, was z.B. für die Untersuchung der

Tertiär- und Quartärstruktur von Proteinen oder für Ca 2+ -sensoren genutzt wird.

Hier wird Fluoreszenzmessung zur Bestimmung der Ligandenbindung eingesetzt. Die

Fluoreszenz von ANS hängt von der Polarität der Umgebung ab. In polarer Umgebung wird

die Fluoreszenz fast völlig gequencht (d. h. gelöscht). In unpolarer Umgebung fluoresziert

ANS effizient. Als Transportprotein im Blut kann BSA relativ unspezifisch viele kleine

Moleküle binden, insbesondere (teilweise) hydrophobe wie z.B. ANS. Die gebundenen ANS-

Moleküle fluoreszieren. Durch Messung der Gesamtfluoreszenz kann die Anzahl der

gebundenen ANS-Moleküle und die durchschnittliche Bindungskonstante bestimmt werden.

Für das erste gebundenen ANS Molekül gilt:

K

BSA ANS BSA *( ANS

1 BSA

*( ANS )

1

K

BSA ANS

d

1


) 1

1 1

K

1

K

Die zugegebene Protein- bzw. ANS-Menge teilt sich jeweils auf in freie und gebundene

Moleküle.

ANS ANS ANS

ges

frei

geb

BSA ges

BSA frei

BSA geb

Kd lässt sich dann ausführlicher schreiben und mit einer neu eingeführten Variable r

vereinfachen.

BSA

ges

BSA

* ANS

ANS

frei

K

d


BSA

* ANS

r

r

1

ANS K K

frei

d d

ANS

geb

r , ANS BSA

* ANS

2BSA

* ANS

2


3BSA

* ANS

3 ...


geb

BSA

mit

ges

Für den Fall, dass mehrere ANS an BSA binden,

K

BSA nANS BSA *( ANS )

n


kommt nach längerer Rechnung eine ähnliche Gleichung wie oben heraus:

r n r


ANS K K

frei

d d

Lösungen:

100 ml 100 mM K-Phosphat, pH 7.2

1 ml 200 M BSA in H 2 O

1 ml 1 mM ANS in H 2 O (aus bereitgestellter Stammlösung verdünnen)

Ethanol, p.a.

Messung:

1. Bestimmen Sie die genaue BSA-Konzentration durch Messung der Absorption einer auf ca.

10 M verdünnten Lösung.

2. Messen Sie das Emissionsspektrum von ANS in 0, 50, 75, 90 und 100% Ethanol.

Legen Sie dazu jeweils 4 ml der EtOH/H 2 O Mischung in der Küvette vor und geben ANS

Stammlösung zu einer Endkonzentration von 20 M zu. Dabei ist: Ex = 280 nm, Em = 400-

550 nm.

3. Stellen Sie eine Verdünnung von ANS in K-Phosphat mit 200 M her.

Messen Sie die relative Fluoreszenz (I rel ) von Lösungen (je 4 ml) mit 2 M BSA und 0.0, 0.4,

0.8, 1.2, 1.6, 2, 3, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 und 20 M ANS in K-Phosphatpuffer. Dabei ist:

Ex = 370 nm, Em = 475 nm.

Auswertung:

1. Berechnen Sie die Proteinkonzentration in M und in mg/ml ( = 43 600 M -1 cm -1 , MG = 65

000 g/mol).

2. Bestimmen Sie Em, max und die relative Intensität der Maxima.

3. Ziehen Sie die Hintergrundfluoreszenz (bei [ANS] ges = 0 M) ab. Tragen Sie I rel gegen

[ANS] ges auf. [ANS] ges ist die gesamte vorhandene ANS-Konzentration (die Sie zugegeben

haben) und setzt sich zusammen gemäß [ANS] ges = [ANS] frei + [ANS] geb . [ANS] geb setzt sich

aus dem ANS in allen Komplexen zusammen.

BSA ANS 2 BSA * ANS 3 BSA * ANS

...

ANS geb

*

2 3


Sieht kompliziert aus, aber da sie eh nicht wissen, in was für Komplexen ANS vorliegt,

sondern nur, dass jedes gebundene ANS gleich stark fluoresziert, ist das egal.

ANS ANS ) und

Bei kleiner ANS-Konzentration wird alles ANS gebunden (d.h. geb

ges

fluoresziert. Deshalb können Sie aus der Anfangssteigung die Fluoreszenz pro gebundenem

ANS ermitteln. Bsp.: Wenn Sie zu 2 M BSA 0.3 M ANS zugeben und einen Fluoreszenzanstieg

von 30 bekommen, dann entspricht ein Fluoreszenzanstieg von 100 1.0 M

gebundenem ANS: I = 100/M * [ANS] geb . Berechnen Sie damit nun auch die Beladung r.

Mit der Konzentration des gebundenen ANS kann man auch die des freien ANS ausrechnen:

ANS ANS ANS

frei

ges

geb

Tragen Sie r/[ANS] frei gegen r auf (Scatchard Plot):

r n r


ANS K K

frei

d d

Bestimmen Sie die Ausgleichsgerade und damit n/K d und -1/K d . Daraus wird n und K d

berechnet.


Fragen:

Erklären Sie die Begriffe Fluoreszenz, Phosphoreszenz, Lumineszenz, Lebensdauer (im

Bereich der Fluoreszenz), Quenching, Anregung und Emission, Anr./Em.-Wellenlänge,

Anr./Em.-Spektrum.

Was transportiert BSA im Blut? Warum braucht man ein extra Protein dafür (vergleiche

Glucose)?

Welche Bedeutung haben die ermittelten Werte für n und K d ?

Welche Werte von n würde man für ein hochspezifisches Bindeprotein erwarten?

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