Versuch 9 - LDH

Proteinchemisches Praktikum SS 2012 Sabine Bauer, Carolin Absmeier
2.3 Bestimmung der Michaeliskonstante der Lactat-Dehydrogenase
Für die Bestimmung der Enzymaktivitiät benötigten wir zuerst die Michaelis Konstante Km der Lactat-
Dehydrogenase. Um diese ermitteln zu können setzten wir 10 Halbmikroküvetten nach folgendem
Pipetierschema an. Alles wurde wie auch im 1. Versuchsteil mit dem Spatel gut durchgemischt.
1. Tabelle für das Pipettierschema
Ansatz in µl 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Pyruvatkonzentration 0,01 0,015 0,02 0,03 0,05 0,075 0,1 0,15 0,2 0,25
in mM
Bidestilliertes Wasser 878 877 876 874 870 865 860 850 840 830
Pyruvat 5 mM 2 3 4 6 10 15 20 30 40 50
1M Imidazolpuffer 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50
NADH 12 mM 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20
LDH mit 3,3 µg/ml 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50
Gesamtvolumen 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000
Dann wurden in die Küvette mit dem ersten Gemisch 50 µl LDH pipettiert, kurz gründlich umgerührt und
die Küvette zügig ins Photometer gestellt. Nun wurde über 3 Minuten alle 15 Sekunden bei 366 nm der
Extinktionswert gemessen und in einer Tabelle notiert (vgl. Tabelle 1 unter Punkt 3.2). Ebenso wurde mit
den 9 anderen vorbereiteten Küvetten verfahren. Nach Beenden der 30 minütigen Messzeit wurde für jede
Lösung ein E-t Diagramm gezeichnet. Aus diesem Diagramm konnte dann die zeitliche Änderung der
Extinktion ΔE/Δt bestimmt werden. Mit Hilfe dieses Wertes wurde mit der Formel v=ΔE*vol /Δt*d*ε NADH
die Anfangsgeschwindigkeit berechnet. Wobei Vol hier das gesamte Küvettenvolumen (1 ml) und d die
Schichtdicke der Küvette (1 cm) darstellt. Ebenso wurden die Kehrwerte 1/v gebildet.
Die ermittelten Anfangskonzentrationen wurden anschließend gegen die Substratkonzentration in ein Michaelis-Menten-Diagramm
eingetragen. Außerdem wurde ein Lineweaver-Burk Diagramm erstellt indem
man 1/v gegen 1/[S] auftrug. Mit Hilfe dieses Diagramms konnten zum Schluss v max und Km ermittelt werden.
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